Đề tài Lên menethanol với vi khuẩn Zymomonas mobilis

Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 1 MUÏC LUÏC Trang Phaàn thöù nhaát : Tình hình saûn xuaát vaø söû duïng ethanol treân theá giôùi ....................3 Phaàn thöù hai : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis.......................6 Chöông 1 : Giôùi thieäu veà loaøi vi khuaån Zymomonas mobilis .............................6 1. Söï xuaát hieän cuûa Zymomonas ............................................................................6 2. Lòch söû phaân laäp....................................................................................................8 3. Ñaëc ñieåm nhaän daïng.............................................................................................9 4. Danh phaùp Zymomonas mobilis...........................................................................10 5. Hình thaùi ...............................................................................................................11 6. Sinh lyù ...................................................................................................................11 6.1. Moät soá moâi tröôøng thoâng duïng..........................................................................12 6.2. Ñieàu kieän sinh tröôûng ........................................................................................13 Chöông 2 : Cô cheá chuyeån hoùa ñöôøng thaønh ethanol vôùi Z. mobilis ..................18 1. Con ñöôøng Entner – Doudoroff (KDPG).............................................................19 2. Söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï .........................................................................25 3. Moät soá kyõ thuaät di truyeàn treân Zymomonas mobilis .........................................29 Chöông 3 : Phöông phaùp leân men ethanol vôùi Z. mobilis ...................................33 1. Ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men..........................................................................33 2. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men.....................................................35 2.1. Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu...........................................................35 2.2. Aûnh höôûng cuûa cô chaát ......................................................................................36 2.2.1.Cô chaát laø hexose (glucose vaø fructose) ........................................................36 2.2.2. Cô chaát laø hoãn hôïp glucose vaø xylose ..........................................................37 2.2.3. Cô chaát laø arabinose ......................................................................................41 2.3. Aûnh höôûng cuûa caùc moâi tröôøng khaùc nhau.......................................................42 2.4. Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä glucose ......................................................................46 2.5. Aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu...............................................................................46 2.6. Aûnh höôûng cuaû ion Na+ vaø Cl- ..........................................................................47 2.7. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ....................................................................................49 2.8. Aûnh höôûng cuûa moâi tröôøng kî khí ...................................................................49 2.9. Aûnh höôûng cuûa Fufural......................................................................................50 2.10. Aûnh höôûng cuûa caùc thaønh phaàn nitô, kali, photpho .......................................52 2.11. Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä ethanol ....................................................................52 2.12. Aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung ethanol .............................................................55 Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 2 3. Phöông phaùp thöïc hieän ........................................................................................55 3.1. Vi khuaån töï do....................................................................................................55 3.1.1. Leân men giaùn ñoaïn ........................................................................................56 3.1.2. Leân men lieân tuïc ............................................................................................56 3.1.3. Leân men baùn lieân tuïc ....................................................................................60 3.2. Vi khuaån coá ñònh ...............................................................................................61 3.2.1. Leân men giaùn ñoaïn ........................................................................................61 3.2.2. Leân men lieân tuïc coá ñònh teá baøo trong caáu truùc ion gel ...............................61 3.2.3. Leân men lieân tuïc coá ñònh teá baøo trong caáu truùc non- covalent gel ..............63 3.2.4. Leân men lieân tuïc – coá ñònh teá baøo trong caáu truùc cryogel ..........................64 3.2.5. Leân men lieân tuïc coá ñònh teá baøo baèng phöông phaùp haáp phuï......................66 4. ÖÙng duïng leân men ethanol trong saûn xuaát coâng nghieäp.....................................69 4.1. Saûn xuaát ethanol töø baõ mía vôùi Z. mobilis .....................................................71 4.2. Saûn xuaát ethanol töø dòch thuûy phaân tinh boät vôùi Z. mobilis ..........................72 Chöông 4 : So saùnh leân men ethanol vôùi naám men Saccharomyces cerevisiae vaø leân men ethanol vôùi vi khuaån Z. mobilis ......................................................... 76 1. Leân men vôùi S. cerevisiae.................................................................................... 76 2. Leân men vôùi Z. mobilis ...................................................................................... 77 3. So saùnh leân men Z. mobilis vôùi S. cerevisiae .................................................... 78 4. So saùnh leân men Z. mobilis vôùi caùc chuûng vi sinh vaät khaùc.............................. 84 Keát luaän ................................................................................................................... 85 Taøi lieäu tham khaûo.................................................................................................... 86 Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 3 Phaàn thöù nhaát : TÌNH HÌNH SAÛN XUAÁT VAØ SÖÛ DUÏNG ETHANOL TREÂN THEÁ GIÔÙI “Ethanol, röôïu etylic…” Nhöõng teân goïi töø raát laâu ñaõ trôû neân quen thuoäc vôùi moïi ngöôøi, trong ñôøi soáng cuõng nhö trong saûn xuaát. Vò cay noàng, höông thôm ñaëc tröng cuûa ethanol ñaõ ñöôïc con ngöôøi bieát tôùi vaø vaän duïng raát nhieàu trong vieäc taïo neân nhieàu saûn phaåm ñoà uoáng, trong soá ñoù thaäm chí coù nhöõng saûn phaåm ñaõ trôû neân gaén lieàn vôùi giaù trò tinh thaàn cuûa moät coäng ñoàng, moät quoác gia. Khoâng döøng ôû ñoù, vôùi söï phaùt trieån ngaøy caøng to lôùn cuûa caùc ngaønh coâng nghieäp hoùa chaát, coâng nghieäp höõu cô… ethanol laïi caøng ñöôïc con ngöôøi tin duøng laøm moät dung moâi phoå bieán, höõu duïng vaø ít ñoäc haïi. Khi neàn coâng nghieäp tieáp tuïc saûn xuaát ra haøng hoùa vaø cung caáp dòch vuï, ngưôøi ta caøng quan taâm nhieàu hôn vieäc môû rộng phaïm vi söû duïng cho caùc nguoàn naêng löôïng. Vieäc giaù caû gia taêng vaø khoâng oån ñònh cuûa thò tröôøng daàu moû theá giôùi ñaõ thuùc ñaåy caùc nhaø khoa hoïc nghieân cöùu saûn xuaát ra nhieân lieäu thay theá laø ethanol. Thu nhaän ethanol töø sinh khoái laø phöông phaùp hieäu quaû ñeå xuùc tieán veà nguoàn nhieân lieäu. Vieäc chieát taùch ethanol töï nhieân mang laïi nguoàn nhieân lieäu coù chaát löôïng toát vôùi giaù caû “kinh teá”. Gaàn ñaây, ethanol ñaõ trôû thaønh moät phaàn cuûa thò tröôøng khí ñoát Myõ. Vieäc saûn xuaát ethanol khoâng nhöõng giaûm söï phuï thuoäc cuûa Myõ vaøo nguoàn daàu moû nhaäp khaåu maø coøn khuyeán khích quoác gia naøy taäp trung vaøo saûn xuaát ethanol nhö laø moät nguoàn nhieân lieäu thay theá. Ethanol coù theå chòu ñöôïc söï neùn hôn xaêng. Söû duïng nhieân lieäu ethanol coøn goùp phaàn giaûm oâ nhieãm moâi tröôøng, CO2 giaûi phoùng ra coù theå taùi söû duïng nhôø con ñöôøng quang hôïp. Vaø moät laàn nöõa, ethanol laïi trôû thaønh taâm ñieåm cuûa moïi söï chuù yù bôûi vì noù ñaùp öùng khaù toát caùc mong ñôïi cuûa nhöõng nhaø nghieân cöùu. Ñaây chính laø lyù do taïi sao vieäc saûn xuaát ethanol khoâng ngöøng môû roäng, caùc phöông phaùp cuõng nhö quy trình saûn xuaát ngaøy caøng ñöôïc naâng cao vaø hoaøn thieän. Thò tröôøng nhieân lieäu ethanol seõ gia taêng moät caùch ñaùng keå trong töông lai gaàn do EU vaø caùc toå chöùc quoác teá khaùc ñang khuyeán khích söû duïng nguoàn nhieân lieäu sinh hoïc trong caùc phöông tieän vaøo vieäc vaän chuyeån. Söû duïng nguoàn naêng löôïng taùi söû duïng seõ goùp phaàn quan troïng giaûm löôïng CO2 thaûi ra, do ñoù thuùc ñaåy vieäc ñaët ra caùc luaät leä cuûa nghò ñònh Kyoto. Hôn nöõa, chaát thaûi coâng nghieäp coù theå Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 4 chuyeån thaønh saûn phaåm coù giaù trò vaø laøm giaûm söï phuï thuoäc cuûa con ngöôøi vaøo nhieân lieäu hoùa thaïch.  Lôïi ích töø ethanol sinh hoïc (coàn sinh hoïc)  Laø nguoàn nhieân lieäu coù theå taùi söû duïng  Ethanol chaùy sinh ra naêng löôïng lôùn nhöng ít gaây oâ nhieãm.  Giaûm löôïng CO2 thaûi ra  Ethanol coù khaû naêng choáng kích noå cao.  Coù theå saûn xuaát treân quy moâ lôùn vaø khoâng caïn kieät.  An toaøn veà naêng löôïng : ít phuï thuoäc vaøo nguyeân lieäu daàu thoâ  Môû roäng thò tröôøng cho neàn noâng nghieäp Hình 1 : Saûn löôïng ethanol treân theá giôùi Ethanol thöôøng ñöôïc söû duïng ôû daïng hoãn hôïp 10% ethanol vaø 90% xaêng daàu (Daishou, 2004). Khoaûng 90% löôïng ethanol hieän nay ñöôïc saûn xuaát töø ñöôøng vaø caùc loaïi cuû coù chöùa tinh boät, phaàn coøn laïi ñöôïc saûn xuaát baèng phöông phaùp toång hôïp. Thò tröôøng saûn xuaát ethanol treân theá giôùi chuû yeáu taäp trung ôû Brazil vaø Anh, chieám 62% saûn löôïng theá giôùi (Hamelinck vaø coäng söï, 2005). Caùc saûn phaåm noâng nghieäp ña daïng ñöôïc söû duïng nhö moät nguoàn nguyeân vaät lieäu thoâ nhö : mía (chuû Myõ : 20 tyû lít/naêm Chaâu AÙ : 5.5 tyû lít/naêm Chaâu AÂu : 4.7 tyû lít/naêm Chaâu UÙc : 0.2 tyû lít/naêm Brazil : 13.5 tyû lít/naêm Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 5 yeáu ôû Brazil, AÁn Ñoä, Thaùi Lan), baép ngoït (Anh, Trung Quoác), luùa mì (Phaùp, Canada, Thuïy Ñieån), khoai mì (Thaùi Lan) …vaø hieäu suaát ethanol cuõng thay ñoåi trong moät giôùi haïn roäng phuï thuoäc vaøo nguoàn nguyeân lieäu söû duïng (FIBGE, 2001). Yeâu caàu quan troïng cho moät chuûng vi sinh vaät hieäu quaû laø coù theå leân men nhieàu loaïi ñöôøng khaùc nhau töø caùc caáu truùc thöïc vaät ñeå saûn xuaát ethanol. Ban ñaàu, caùc nhaø khoa hoïc söû duïng naám men leân men cellulose trong thöïc vaät, tuy nhieân naám men chæ söû duïng ñöôïc 2 trong 3 hôïp chaát cuûa cellulose. Naêm 1994, chuûng vi khuaån Zymomonas mobilis ñaõ ñöôïc phaùt hieän ra trong traùi caây, moät loaïi vi khuaån maø coù theå leân men ñöôïc caû 3 hôïp chaát cuûa cellulose. Hieän nay nhieàu loaøi vi sinh vaät coù khaû naêng leân men ethanol nhöng naám men Saccharomyces cerevisiae vaø vi khuaån Zymomonas mobilis laø hai öùng cöû vieân toát nhaát trong coâng nghieäp saûn xuaát ethanol. Z. mobilis troäi hôn naám men ôû khaû naêng chòu ñöôïc noàng ñoä ñöôøng cao, töø ñoù khuyeán khích caùc nhaø nghieân cöùu taäp trung khai thaùc khaû naêng cuûa Z. mobilis trong vieäc söû duïng sucrose, glucose, vaø fructose nhôø con ñöôøng trao ñoåi chaát Entner – Doudoroff . Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 6 Phaàn thöù hai : LEÂN MEN ETHANOL VÔÙI VI KHUAÅN ZYMOMONAS MOBILIS Chöông 1 Giôùi thieäu veà loaøi vi khuaån Zymomonas mobilis  1. Söï xuaát hieän cuûa Zymomonas Röôïu taùo vaø röôïu leâ Vaøo ñaàu theá kyû 20, nhu caàu cuûa ngöôøi tieâu duøng veà röôïu taùo ñaõ thay ñoåi. Hoï yeâu caàu röôïu taùo phaûi trong, ngoït thay vì chaùt ñaéng vaø ñuïc nhö tröôùc. Caùc nhaø saûn xuaát gaëp phaûi khoù khaên lôùn, ñoù laø röôïu taùo ngoït deã daãn ñeán hieän töôïng leân men laàn hai, töùc laø “beänh röôïu taùo”. Trieäu chöùng ñaàu tieân laø söï thoái hoûng vaø söï thoaùt khí. Vaøi ngaøy sau ñoù, aùp suaát khí trong chai taêng voït laøm noå chai. Söï phaùt trieån cuûa moät loaøi vi khuaån ñaõ laøm thay ñoåi muøi höông vaø laøm giaûm vò ngoït cuûa röôïu taùo. Röôïu taùo trôû neân ñuïc, seàn seät vaø sau ñoù trôû neân trong hôn do coù söï keát laéng. Moät vaøi yeáu toá deã daãn ñeán beänh röôïu taùo nhö : ñoä acid thaáp, haøm löôïng ñöôøng dö vaø nhieät ñoä toàn tröõ cao. Barker vaø Hiller ñaõ phaân laäp gioáng vi khuaån treân vaøo naêm 1911 vaø goïi chuùng laø gioáng A. Chuùng leân men glucose vaø fructose maïnh meõ taïo thaønh ethanol vaø CO2 nhöng khoâng leân men ñöôïc ñöôøng sucrose, maltose vaø lactose. Naêm 1943, Barker ñaõ nghieân cöùu vaø phaân laäp ra hai gioáng vi khuaån töø nhöõng maãu röôïu taùo bò beänh, ñeán naêm 1948 oâng ñaët teân chuùng laø gioáng B vaø gioáng C. Trong khi gioáng B vaø C chæ taïo neân muøi höông dòu cho röôïu taùo thì gioáng A laïi taïo ra muøi höông ñaëc tröng maïnh meõ. Naêm 1950, Millis ñaõ phaân laäp ñöôïc 33 gioáng vi khuaån töø röôïu taùo vaø röôïu leâ, trong ñoù coù 27 gioáng laø töông töï gioáng B vaø 6 gioáng laø töông töï gioáng C. Millis ñaõ tieán haønh xaùc ñònh vaøi ñaëc tính hoùa sinh cuûa moät gioáng töø röôïu taùo vaø moät gioáng töø röôïu leâ. Caû 2 gioáng naøy ñeàu taïo ra xaáp xæ 1.87 mol ethanol, CO2, H2S, acetaldehyd vaø acid lactic öùng vôùi moãi mol glucose. Millis coøn nghieân cöùu nhöõng bieán ñoåi trong caùc maãu röôïu taùo vôùi söï coù maët cuûa naám men röôïu taùo bò beänh trong quaù trình leân men bôûi naám men. OÂng thaáy naám men ban ñaàu giaûm daàn khi vi khuaån gaây beänh röôïu taùo phaùt trieån nhöng sau ñoù laïi taêng trôû laïi sau ngaøy thöù 45. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 7 Ñeå ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa beänh röôïu taùo, Barker vaø Hiller ñeà nghò röôïu taùo phaûi coù ñoä acid cao vaø nhieät ñoä toàn tröõ thaáp. Coøn Grove laïi ñeà nghò neân boå sung vaøo röôïu taùo (voán coù vò cay, chua gaét) acid tartaric hoaëc naám men bia. Barker ñaõ ñeà nghò cheá ñoä thanh truøng röôïu taùo laø 60oC. Carr cho raèng söï hö hoûng cuûa röôïu taùo gioáng hieän töôïng “framboiseù” ôû Phaùp gaây neân bôûi Z. anaerobia. Coøn Guittoneau vaø coäng söï tìm thaáy muøi traùi caây vaø vò röôïu taùo “framboiseù” nhôø vaøo noàng ñoä acetaldehyd cao. Bidan ñaõ phaân laäp ñöôïc vi khuaån lactic vaø vi khuaån acetic töø röôïu taùo “framboiseù”. OÂng cho raèng söï taïo thaønh hôn 100mg acetaldehyd cho moãi lít röôïu taùo laø do nhieàu chuûng vi sinh vaät gaây neân. Nhöng theo quan ñieåm cuûa Auclair, hieän töôïng “framboiseù” cuûa röôïu taùo laø do ñieàu kieän kî khí baét buoäc vaø giaù trò pH thaáp cuûa röôïu taùo gaây ra. Pollard laïi cho raèng hieän töôïng “framboiseù” naøy laø keát quaû leân men cuûa 2 gioáng: vi khuaån kî khí gaây beänh röôïu taùo Zymomonas vaø vi khuaån hieáu khí acid acetic. Leân men nhöïa caây thuøa (Agave sap) Hình 2 : Caây thuøa Hình 3 : Röôïu thuøa (Pulque) Töø naêm 1923 ñeán 1924, khi soáng ôû Mexico, Lindner ñaõ nghieân cöùu leân men aguamiel. Aguamiel laø moät loaïi nhöïa cuûa caây thuøa, noù ñöôïc söû duïng ñeå leân men röôïu thuøa, moät loaïi thöùc uoáng coù coàn chöùa khoaûng 4 – 6% ethanol. Lindner ñaõ khaùm phaù ra raèng chuûng vi sinh vaät gaây leân men laø moät gioáng vi khuaån maø oâng ñaët teân laø Termobacterium mobile, ngaøy nay laø moät chuûng thuoäc Zymomonas mobilis. Bia Shimwell ñaõ phaân laäp ñöôïc Zymomonas laàn ñaàu tieân töø bia, töø beà maët saân phôi naám men bia vaø töø nhöõng baøn chaûi cuûa caùc thieát bò röûa thuøng bia. Gaàn ñaây, ngöôøi ta thaáy raèng Zymomonas laø nguoàn gaây oâ nhieãm nghieâm troïng trong saûn xuaát bia. Trong nhöõng thuøng hoaëc keùt bia, söï nhieãm Zymomonas xaûy ra do moâi tröôøng kî khí vaø söï coù maët cuûa caùc hôïp chaát ñöôøng coù trong bia. Vi khuaån naøy taïo ra dung dòch nhôùt vaø muøi taùo thoái do söï hình thaønh acetaldehyd vaø khí H2S. Khi thôøi tieát aám aùp, söï hö hoûng chæ xaûy ra trong voøng töø 2 – 3 ngaøy. Vì vaäy, Harrison ñaõ phaùt bieåu raèng Zymomonas laø moät gioáng vi sinh vaät quan troïng raát phoå bieán gaây neân söï Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 8 phaù huûy traàm troïng nhöõng keùt bia lôùn vôùi toác ñoä cöïc nhanh ôû caùc nhaø maùy bia. Tuy nhieân, hieän töôïng naøy laïi khoâng xaûy ra ôû caùc loaïi bia nheï nhö bia Ñöùc. Leân men nhöïa caây coï Röôïu vang coï laø moät thöùc uoáng coù coàn phoå bieán ôû vuøng nhieät ñôùi töø söï leân men töï phaùt töø thaønh phaàn nhöïa cuûa caây. Röôïu vang coï chöùa khaù nhieàu chuûng vi sinh vaät phöùc taïp, trong ñoù Zymomonas laø moät gioáng vi khuaån quan troïng khoâng theå thieáu. Chuùng giuùp leân men coàn vaø taïo boït cho röôïu nhôø söï hình thaønh khí CO2 . CO2 cuøng vôùi moät löôïng nhoû acid lactic vaø acid acetic goùp phaàn laøm taêng ñoä acid cuûa loaïi röôïu vang naøy. Beân caïnh ñoù, muøi vaø vò cuûa röôïu vang coï cuõng chòu aûnh höôûng bôûi thaønh phaàn acetaldehyd vaø muøi traùi caây ñaëc tröng do Zymomonas gaây neân. Gioáng Zymomonas naøy raát thích nghi vôùi moâi tröôøng giaøu chaát dinh döôõng cuûa nhöïa caây coï do coù chöùa sucrose, glucose, fructose, acid amin. Zymomonas coù theå chòu ñöôïc noàng ñoä coàn cao vaø pH thaáp trong ñieàu kieän yeám khí. Leân men nöôùc mía Gongalves de Lima vaø coäng söï ñaõ phaân laäp Zymomonas töø quaù trình leân men nöôùc mía, loaïi mía naøy ñöôïc troàng ôû mieàn Baéc Brazil. Maät ong chín Ruiz-Argueso vaø Rodriguez-Navarro ñaõ phaân laäp Zymomonas töø maät ong chín hoaëc töø con ong. Hai gioáng vi sinh vaät chuû yeáu coù trong maät ong chín laø Gluconobacter vaø Lactobacillus. 2. Lòch söû phaân laäp Baûng 1 : Moät soá nguoàn phaân laäp Z. mobilis Nguoàn phaân laäp Moâi tröôøng Ñieàu kieän, keát quaû Taùc giaû Heøm bia Thaïch gelatin Xuaát hieän khuaån laïc sau 11 ngaøy ôû 22oC. Barker vaø Hillier, 1912 Bia tieät truøng Thaïch agar (2% glucose ) Yeám khí Shimwell, 1937 Dòch nöôùc taùo Moâi tröôøng loûng (1% chaát chieát men, 0.001% actidione) Yeám khí, pH = 4.5, 25oC Millis, 1951-1956 Röôïu vang coï Zairese 3 canh tröôøng chöùa dòch chieát naám men (Difco) khaùc nhau. Khuaån laïc sau 4 -5 ngaøy ôû 30oC coù daïng hình haït ñaäu, ñöôøng kính töø 1 – 4mm, maøu xanh saäm. Swings vaø Deley, 1974 Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 9 3. Ñaëc ñieåm nhaän daïng ­ Laø moät loaïi vi khuaån gram aâm, coù roi daøi töø 1 – 1.4µm ­ Khoâng hình thaønh baøo töû ­ Moät soá loaøi coù töø 1 -4 tieân mao. ­ Khoâng phaùt trieån treân moâi tröôøng thaïch hoaëc nöôùc thòt dinh döôõng. ­ Laø loaøi vi khuaån vi hieáu khí (kî khí khoâng baét buoäc) ­ Coù theå leân men ñöôøng glucose vaø fructose ­ Taïo ra soá mol ethanol vaø CO2 baèng nhau ­ Soá löôïng nucleotide: 2056416 ­ Soá gen : 1998 ­ Soá gen ARN: 60 ­ Chöùa khoaûng 47.5 – 49.5% guanine vaø cytosine (G+C). Hình 4 : Vi khuaån Zymomonas mobilis Thaønh phaàn moâi tröôøng thích hôïp ñeå phaùt hieän vi khuaån (tính theo phaàn traêm khoái löôïng / theå tích) goàm : ­ Dòch chieát malt : 0.3 ­ Dòch chieát naám men : 0.3 ­ Glucose : 2 ­ Peptone : 0.5 ­ Actidione : 0.002 ­ pH = 4 Canh tröôøng treân ñöôïc cho vaøo chai coù ñaäy naép ren dung tích 25ml vôùi nhöõng oáng Durham, 20ml/chai roài ñem ñi tieät truøng. Boå sung ethanol vaøo sao cho noàng ñoä ethanol cuoái cuøng xaáp xæ 3% (v/v). Söï coù maët cuûa Zymomonas ñöôïc nhaän bieát khi coù khí bay leân ôû 25 – 30oC sau 2 – 6 ngaøy. Keát quaû döông tính coù theå laø do nhöõng vi khuaån hoaëc moät vaøi naám men daïi, cho neân caàn phaûi coù thuoác nhuoäm maøu gram, coù theå söû duïng phöông phaùp nhuoäm maøu mieãn dòch huyønh quang coù ñoä nhaïy phaùt hieän 160 – 2500 teá baøo/ ml. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 10 4. Danh phaùp Zymomonas mobilis Moät khoùa phaân loaïi cho gioáng vi khuaån naøy caàn döïa treân heä thoáng phaân tích caùc döõ lieäu veà kieåu hình, phaân tích thaønh phaàn caùc caëp base nitô trong chuoãi ADN, möùc ñoä lieân quan giöõa caùc boä gen (ADN töông ñoàng), söï gioáng nhau veà phoå saéc kyù protein, phoå hoàng ngoaïi cuûa nhöõng teá baøo nguyeân… Gioáng : Zymomonas (Kluyver vaø van Niel, 1936) Loaøi : Zymomonas mobilis (Kluyver vaø van Niel, 1936) Hoï : Sphingomonadaceae Boä : Sphingomonadales Lôùp: Proteobacteria; Alphaproteobacteria  Loaøi phuï Zymomonas mobilis subsp. mobilis (Kluyver vaø van Niel, 1936; De Ley vaø Swings, 1976) Chuûng tieâu bieåu : ATCC 10988 (coøn coù caùc teân khaùc nhö NCIB 8938, NNRL B-806, DSM 424, IMG 1655, L192) (Phoøng nghieân cöùu vi sinh vaät, Ñaïi hoïc Delft). Chuûng tieâu bieåu veà kieåu hình : Z6 (coøn coù caùc teân khaùc nhö ATCC, 29191, NCIB 11199).  Loaøi phuï Zymomonas mobilis subsp. pomaceae (Millis, 1951 – 1956; De Ley vaø Swings, 1976) Chuûng tieâu bieåu : ATCC 29192 (coøn coù teân khaùc nhö NCIB 11200) (Barker, 1948). Baûng 2 : Danh phaùp moät soá chuûng thuoäc loaøi Z.mobilis ñaïi dieän hieän nay Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 11 5. Hình thaùi 5.1. Hình thaùi teá baøo vi khuaån : ­ Zymomonas mobilis laø loaøi vi khuaån gram aâm, hình que, kích thöôùc 1.4 – 2.0  4.0 – 5.0 µm, thöôøng xeáp thaønh ñoâi, ñoâi khi xeáp thaønh hình chuoãi ngaén. ­ Coù roi vaän chuyeån daøi töø 2 - 6µm, daøy 1 – 1.5µm ­ Haàu heát ñeàu khoâng chuyeån ñoäng, moät soá ít coù khaû naêng chuyeån ñoäng nhôø coù töø 1 – 4 tieân mao. 5.2. Hình daïng khuaån laïc : Trong moâi tröôøng raén tieâu chuaån (goàm 2% agar, 0.5% dòch chieát men, 2% glucose), khuaån laïc coù hình haït ñaäu, ñeàu, meùp ñoàng nhaát, maøu traéng hoaëc kem, ñöôøng kính khuaån laïc coù theå ñaït töø 1 -2mm sau 2 ngaøy. Treân beà maët moâi tröôøng yeám khí, khuaån laïc lan toûa roäng, daïng loài, ñöôøng kính töø 3 -4 mm. 5.3. Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa teá baøo : Baûng 3 : Thaønh phaàn caáu taïo cuûa teá baøo vi khuaån Zymomonas Thaønh phaàn Haøm löôïng (theo chaát khoâ) Protein  Pha logarit  Pha oån ñònh ADN ARN Carbohydrate Poly- -hydroxybutyrate Polphosphate Löu huyønh NH3 Acid amin ATP  Pha logarit  Trong ñieàu kieän thieáu thöùc aên 65 – 69% 54% 17 – 22% 2.7% 4 – 5% 0% 0% 0.5% 0.1 – 0.5  mol/mg 0.02 – 0.2  mol/mg 1 – 5 g/mg 0 – 0.4  g/mg 6. Sinh lyù 6.1. Moät soá moâi tröôøng thoâng duïng cho söï sinh tröôûng cuûa Zymomonas Moâi tröôøng loûng tieâu chuaån : goàm 0.5% dòch chieát men, 2% glucose. Trong moâi tröôøng loûng tieâu chuaån, ngöôøi ta quan saùt thaáy coù söï sinh tröôûng toát cuûa Zymomonas vaø söï thoaùt khí sau 24 giôø. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 12 – Moâi tröôøng raén tieâu chuaån : coù thaønh phaàn nhö treân, boå sung theâm 2% agar. Gioáng Zymomonas neân ñöôïc caáy chuyeàn 2 – 3 tuaàn moät laàn. – Moâi tröôøng nöôùc taùo goàm : dòch nöôùc taùo,1% dòch chieát naám men (Difco), 10% gelatin, pH = 5.5 ñöôïc chöùa trong chai coù naép ren. Ta coù theå quan saùt ñöôïc khuaån laïc trong voøng 17 tuaàn. – Moâi tröôøng bia goàm : dòch bia coù 2% glucose, neân caáy chuyeàn gioáng haèng tuaàn. Ñeå giöõ gioáng, ta coù theå coá ñònh vi khuaån trong chaát mang laø gelatin trong dòch bia (Shimwell, 1950) – Moâi tröôøng MYPG : bao goàm 0.3% dòch chieát malt, 0.3% dòch chieát men, 0.5% pepton, 2% glucose vaø 2% agar. Moâi tröôøng toång hôïp : goàm 2% glucose, 0.1% K2HPO4, 0.1% (NH4)2S50, vaø 0.05% MgSO4.7H20 trong nöôùc maùy (Kluyver vaø Hoppenbrouwersm). Tuy nhieân Zymomonas khoâng theå sinh tröôûng trong nhöõng moâi tröôøng toång hôïp ñôn giaûn, chuùng yeâu caàu phaûi coù söï cung caáp nguoàn nitô höõu cô hoaëc boå sung theâm vaøi yeáu toá sinh tröôûng khaùc nhö caùc vitamin sau :  -aminobenzoic acid, biotin, folic acid, cyanocobalamin, lipoic acid, nicotinic acid, pyridoxine, thiamine, riboflavin (1 µg/ ml), guanine, adenine, hypoxanthine, cytosine vaø uracil (60 µg/ ml) (Van Pee vaø coäng söï, 1974). – Moâi tröôøng do Gibbs vaø Demoss taïo ra goàm : 98ml dung dòch 1% glucose, 1% tryptone, 1% dòch chieát men (Difco), 0.5% KH2PO4 cuøng vôùi 2 ml dung dòch muoái 0.8% MgSO4.7H20, 0.16% MnSO4.4H20, 0.04% NaCl vaø 0.04% FeSO4 .7H20 (Gibbs vaø Demoss,1951). Zymomonas coù theå phaùt trieån ôû 25 – 30oC. Haàu heát caùc nhaø nghieân cöùu thích nuoâi caáy Zymomonas trong ñieàu kieän yeám khí, nhöng ñieàu kieän naøy chæ caàn thieát cho söï nuoâi caáy treân beà maët thaïch nghieâng hoaëc treân ñóa Petri. Beân caïnh ñoù, Zymomonas khoâng sinh tröôûng vaø phaùt trieån trong caùc moâi tröôøng sau :  Moâi tröôøng coù chöùa 0.5% chaát chieát men  Moâi tröôøng bia  Moâi tröôøng bia + 0.5% chaát chieát men  Moâi tröôøng pepton nöôùc luoäc thòt  Moâi tröôøng pepton nöôùc luoäc thòt+ 0.5% chaát chieát men  Moâi tröôøng nöôùc thòt dinh döôõng (hoaëc thaïch dinh döôõng)  Moâi tröôøng nöôùc thòt dinh döôõng (hoaëc thaïch dinh döôõng) + 0.5% chaát chieát men Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 13 6.2. Ñieàu kieän sinh tröôûng : 6.2.1. Sinh tröôûng ôû caùc giaù trò pH khaùc nhau Söï sinh tröôûng cuûa Zymomonas phuï thuoäc vaøo giaù trò pH ñöôïc theå hieän nhö sau : pH = 2.5 – 3.4 : ngöøng sinh tröôûng pH = 3.5 – 3.6 : sinh tröôûng keùm pH = 3.5 – 7.5 : sinh tröôûng toát Keát quaû treân ñaõ chöùng minh raèng khaû naêng khaû naêng chòu ñöôïc pH acid laø ñaëc tröng ñieån hình cuûa Zymomonas . Ñieàu naøy cuõng khoâng gaây ngaïc nhieân vì trong töï nhieân, loaøi vi khuaån naøy coù theå soáng trong moâi tröôøng röôïu vang coï, röôïu taùo coù pH < 4. Baûng 4 : Söï sinh tröôûng cuûa Zymomonas trong moâi tröôøng loûng tieâu chuaån öùng vôùi nhöõng giaù trò pH ban ñaàu khaùc nhau (Khaûo saùt treân 41 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977) pH ban ñaàu % soá chuûng sinh tröôûng 3.05 3.5 3.7 3.85 5 – 7 7.50 8.0 0 43 71 90 100 87 0 6.2.2. Sinh tröôûng ôû caùc giaù trò nhieät ñoä khaùc nhau Qua nhieàu nghieân cöùu, ngöôøi ta nhaän thaáy söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa Zymomonas nhö sau : Nhieät ñoä < 30oC : ngöøng sinh tröôûng Nhieät ñoä = 40oC : sinh tröôûng keùm Nhieät ñoä  30oC : caû hai loaøi Zymomonas pomaceae vaø Z. mobilis ñeàu sinh tröôûng toát. Rieâng loaøi Zymomonas pomaceae raát nhaïy caûm vôùi nhieät, khoâng theå sinh tröôûng ôû 34oC. Beân caïnh ñoù, caùc nhaø khoa hoïc coøn ruùt ra moät soá keát luaän veà aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán söï leân men : Nhieät ñoä 4 -5oC sau 28 ngaøy : khoâng thaáy daáu hieäu cuûa söï leân men Nhieät ñoä 14 – 18oC : söï leân men xaûy ra sau 4 ngaøy Nhieät ñoä phoøng 16 – 26oC : söï leân men xaûy ra sau 2 ngaøy Vaäy khoaûng nhieät ñoä toái öu cho söï leân men laø 25 – 31oC. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 14 Baûng 5 : Söï sinh tröôûng cuûa Zymomonas trong moâi tröôøng loûng tieâu chuaån öùng vôùi nhöõng giaù trò nhieät ñoä nuoâi caáy khaùc nhau (Khaûo saùt treân 41 chuûng Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977) Nhieät ñoä nuoâi caáy (oC) % soá chuûng sinh tröôûng 30 34 36 38 40 100 97 97 74 5 Zymomonas bò tieâu dieät ôû 60oC trong voøng 5 phuùt. Grove (1914) laïi cho raèng vi khuaån gaây beänh röôïu taùo bò tieâu dieät ôû 55oC trong 5phuùt. 6.2.3. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa ethanol Z. mobilis coù khaû naêng chòu ñöôïc coàn, vì vaäy noù ñöôïc phaân laäp töø thöùc uoáng coù coàn vôùi noàng ñoä ethanol 2 – 10%. Z. mobilis coù theå chòu ñöôïc noàng ñoä ethanol laø 5.5% trong moâi tröôøng loûng tieâu chuaån. Tuy nhieân, söï sinh tröôûng cuûa loaøi vi khuaån gaây beänh röôïu taùo laïi bò kìm haõm bôûi noàng ñoä ethanol laø 6.5%. ÔÛ noàng ñoä ethanol 7% coù 73% chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis sinh tröôûng, coøn vôùi noàng ñoä ethanol 10% thì coù 47% soá chuûng Z. mobilis sinh tröôûng (khaûo saùt treân 41 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977). 6.2.4. Sinh tröôûng ôû noàng ñoä glucose cao Kluyver vaø Hoppenbrouwers (1931) thaáy raèng caùc chuûng Z. mobilis trong röôïu thuøa coù theå sinh tröôûng ôû moâi tröôøng coù 25% glucose. Khaûo saùt treân 41 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis (Swings vaø De Ley, 1977) cho thaáy : o Vôùi noàng ñoä glucose laø 20% coù 100% soá chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis sinh tröôûng trong 34 giôø. o Vôùi noàng ñoä glucose laø 30% coù 88% soá chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis sinh tröôûng trong 2 – 5 ngaøy, rieâng chuûng Z1 vaø Z2 sinh tröôûng chæ trong voøng 1 ngaøy. o Vôùi noàng ñoä glucose laø 40% coù 54% soá chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis sinh tröôûng sau pha lag, keùo daøi töø 4 – 20 ngaøy. 6.2.5. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa KCN Neáu duøng canh tröôøng loûng tieâu chuaån coù chöùa 0.0075% KCN thì ngöôøi ta thaáy caùc chuûng Z. mobilis ATCC 29192, NCIB 8777, NCIB 10065, CP3, CP4 vaø Ag 11 khoâng sinh tröôûng, coøn caùc chuûng Zymomonas mobilis ATCC 10988, 410, NCIB 8227, vaø 409 thì sinh tröôûng sau 5 ngaøy vaø 12 chuûng khaùc thì khoâng bò kìm Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 15 haõm bôûi noàng ñoä KCN vaø coù theå phaùt trieån sau 1 – 2 ngaøy (khaûo saùt treân 41 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977). 6.2.6. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa NaCl Trong canh tröôøng loûng tieâu chuaån coù chöùa 0.5% NaCl ngöôøi ta thaáy chæ coù 2 chuûng Z. mobilis var.pomaceae ATCC 29192 vaø NCIB 8777 laø khoâng sinh tröôûng, 71% soá chuûng Z. mobilis ñeàu coù theå sinh tröôûng vôùi noàng ñoä NaCl 1%, nhöng khoâng coù chuûng Zymomonas naøo coù theå sinh tröôûng ôû noàng ñoä NaCl 2% (khaûo saùt treân 41 chuûng Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977). Grove (1923) ñaõ tìm ra raèng vi khuaån gaây beänh röôïu taùo bò kìm haõm bôûi noàng ñoä 0.7% NaCl. 6.2.7. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa 0.01% Acti-dione Chaát khaùng sinh naøy laø thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng Difco duøng cho söï phaân laäp Zymomonas. Millis ñaõ boå sung Acti-dione (cycloheximide) vaøo moâi tröôøng nöôùc taùo phaân laäp. Ngöôøi ta thaáy raèng naám moác thì nhaïy caûm vôùi 0.01% Acti-dione, coøn vi khuaån thì khoâng. Taát caû caùc chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis ñeàu coù theå sinh tröôûng trong voøng 4 ngaøy (khaûo saùt treân 41 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977). 6.2.8. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa 0.01% thallium acetate Trong moâi tröôøng raén tieâu chuaån, söï sinh tröôûng cuûa Z. mobilis bò kìm haõm. 6.2.9. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa 0.001% cadmium sulfate Trong moâi tröôøng chöùa 0.001% cadmium sulfate coù 63% soá chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis sinh tröôûng ñöôïc (khaûo saùt treân 41 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977). 6.2.10. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa oxgall Trong toång soá 17 chuûng nghieân cöùu thuoäc loaøi Z. mobilis chæ coù Zymomonas ATCC 10988 vaø loaøi phuï 410 cuûa noù laø coù theå phaùt trieån trong moâi tröôøng coù noàng ñoä 0.2% oxgall. ÔÛ noàng ñoä 1% oxgall, caû 2 chuûng naøy ñeàu bò kìm haõm. Zymomonas coù khaû naêng chòu ñöôïc noàng ñoä oxgall cao hôn trong moâi tröôøng raén. Vôùi moâi tröôøng raén coù noàng ñoä oxgall 0.2%, taát caû caùc chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis ñeàu coù theå sinh tröôûng, ngoaïi tröø chuûng Zymomonas pomaceae ATCC 29192, coøn ôû noàng ñoä oxgall 1% thì coù 53% soá chuûng nghieân cöùu phaùt trieån. Coù 41% soá chuûng phaùt trieån sau töø 2 ñeán 9 ngaøy ôû noàng ñoä 1.5% oxgall (Swings vaø De Ley, 1977). Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 16 6.2.11. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa nhaân toá vibriostatic 0/129 Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy taát caû caùc chuûng Z. mobilis ñeàu nhaïy caûm vôùi hôïp chaát 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine) trong moâi tröôøng raén tieâu chuaån (khaûo saùt treân 41 chuûng Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977). 6.2.12. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa thuoác nhuoäm Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy Zymomonas raát nhaïy caûm vôùi thuoác nhuoäm. Hình 4 theå hieän keát quaû toùm taét veà söï sinh tröôûng cuûa Zymomonas trong moâi tröôøng raén tieâu chuaån vôùi nhieàu thuoác nhuoäm khaùc nhau (khaûo saùt treân 41 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis - Swings vaø De Ley, 1977). Söï kìm haõm sinh tröôûng cuûa moät vaøi chuûng Z. mobilis bôûi thuoác nhuoäm coøn phuï thuoäc vaøo moâi tröôøng söû duïng laø raén hay loûng. Chuûng VP2 coù khaû naêng khaùng cöï maïnh meõ vôùi thuoác nhuoäm. Nhìn chung, taát caû caùc chuûng ñeàu nhaïy caûm vôùi brilliant green. Malachite green ñöôïc söû duïng vôùi noàng ñoä laø 0.025% trong moâi tröôøng phaân laäp. Tuy nhieân, vôùi loaïi thuoác nhuoäm naøy, ngöôøi ta thaáy raèng thaäm chí vôùi noàng ñoä 0.0005% vaãn coù moät vaøi chuûng khoâng theå phaùt trieån, vì theá khoâng neân boå sung malachite green vaøo moâi tröôøng phaân laäp chuûng vi sinh vaät naøy (Millis, 1951). 6.2.13. Sinh tröôûng vôùi söï hieän dieän cuûa moät soá chaát khaùng sinh Caùc nghieân cöùu ñöôïc tieán haønh treân moâi tröôøng raén tieâu chuaån coù söû duïng dòch chieát naám men (Difco) hoaëc chaát khaùng sinh Oxoid. Hình 5 bieåu hieän khaû naêng nhaïy caûm cuõng nhö khaû naêng khaùng cöï vôùi 20 loaïi chaát khaùng sinh cuûa 38 chuûng thuoäc gioáng Zymomonas. Chuûng 70.7 theå hieän khaû naêng nhaïy caûm maïnh nhaát – bò kìm haõm bôûi 11 loaïi chaát khaùng sinh. Coøn chuûng VP2 nhö ñaõ ñeà caäp treân thì laïi coù khaû naêng khaùng cöï maïnh meõ hôn, chæ bò kìm haõm bôûi 5 loaïi chaát khaùng sinh (Swings vaø De Ley, 1977). Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 17 Hình 5 : Bieåu ñoà bieåu dieãn söï nhaïy caûm cuûa Z. mobilis vôùi thuoác nhuoäm Hình 6 : Bieåu ñoà bieåu dieãn söùc ñeà khaùng vaø söï nhaïy caûm cuûa Zymomonas vôùi moät soá chaát khaùng sinh Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 18 Chöông 2 : Cô cheá chuyeån hoùa ñöôøng thaønh ethanol bôûi Zymomonas mobilis  Treân quy moâ coâng nghieäp, hieän nay coù hai caùch ñeå saûn xuaát ethanol. Caùch thöù nhaát laø toång hôïp ethanol töø etylen, caùch thöù hai ñöôïc trình baøy cuï theå sau ñaây laø saûn xuaát ethanol baèng phöông phaùp leân men röôïu. Leân men röôïu laø moät quaù trình sinh hoïc, trong ñoù töø cô chaát ban ñaàu laø caùc daïng ñöôøng leân men ñöôïc seõ chuyeån hoùa thaønh ethanol vaø khí CO2 thoâng qua hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa moät soá vi sinh vaät ñaëc bieät (naám men, vi khuaån) ôû ñieàu kieän kî khí. Naêm 1912, Barker vaø Hillier laø nhöõng nhaø khoa hoïc ñaàu tieân nghieân cöùu veà söï leân men cuûa gioáng vi khuaån Zymomonas (moät gioáng vi sinh vaät gaây beänh röôïu taùo). Tuy nhieân hoï chæ nghieân cöùu söï leân men naøy treân caùc cô chaát laø glucose hoaëc fructose, khoâng coù sucrose, maltose hoaëc lactose. Hoï cho raèng khí taïo thaønh trong quaù trình leân men haàu heát laø CO2, coù moät vaøi acid taïo thaønh nhöng khoâng ñeà caäp gì ñeán acid lactic. Hoï coøn öôùc tính laø coù khoaûng 1.9 mol ethanol taïo thaønh öùng vôùi moãi mol glucose haáp thu. Nguoàn cacbon ñöôïc söû duïng cho quaù trình leân men chæ goàm glucose, fructose vaø sucrose. Söï leân men glucose baét ñaàu sau 10 giôø ôû 30oC vaø ngaøy caøng maïnh meõ hôn sau 2 ngaøy. Glucose ñöôïc leân men hoaøn toaøn, beân caïnh söï taïo thaønh ethanol, ngöôøi ta coøn thaáy coù söï xuaát hieän cuûa acid lactic. Trong soá caùc saûn phaåm trung gian coù acetaldehyde taïo thaønh, tuy nhieân chuùng khoâng phaûi laø saûn phaåm cuoái cuøng cuûa quaù trình leân men. Trong vi khuaån Z. mobilis , D-glucose vaø D-fructose ñöôïc vaän chuyeån theo cô cheá khueách taùn xuùc tieán. Vì dung dòch coù noàng ñoä glucose cao khoâng phaûi laø taùc nhaân kìm haõm caùc enzyme cuûa con ñöôøng Entner – Doudoroff neân glucose ñöôïc chuûng vi khuaån naøy chuyeån hoùa thaønh ethanol moät caùch nhanh choùng. Vì theá, aùp suaát thaåm thaáu ngoaïi baøo cuûa dung dòch glucose coù theå nhanh choùng ñöôïc caân baèng vôùi dung dòch ñöôøng noäi baøo. Khaû naêng chòu noàng ñoä muoái keùm cuûa Z. mobilis ñaõ daãn ñeán vaán ñeà khoù khaên trong quaù trình leân men ræ ñöôøng voán laø nguoàn nguyeân lieäu chöùa noàng ñoä muoái cao. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 19 1. Con ñöôøng Entner – Doudoroff (KDPG) (2- keto-3 deoxi-6- photphatgluconat pathway) Hình 7 : Con ñöôøng Entner – Doudoroff Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 20 Ñoái vôùi nhoùm vi sinh vaät kî khí, quaù trình sinh naêng löôïng khoâng keøm theo vieäc lieân keát vôùi oxi khoâng khí. Ngaøy nay, ngöôøi ta hieåu raèng oxi hoùa khoâng chæ coù nghóa laø lieân keát vôùi oxi maø coøn bao goàm caû quaù trình maát hydro (RH2 + A  R + AH2), quaù trình taùch hydro ra sau khi keát hôïp vôùi nöôùc (A + H2O  B  C) hoaëc quaù trình naát electron vaø laøm taêng theâm hoùa trò döông (Fe2+  Fe3+ + e, Cu+  Cu2+ + e …). Naêng löôïng giaûi phoùng ra töø caùc phaûn öùng oxi hoùa seõ ñöôïc giöõ laïi trong moät soá hôïp chaát giaøu naêng löôïng coù maët trong teá baøo vi sinh vaät. Ñoù laø caùc hôïp chaát nhö : nucleozit triphotphat (ATP, UTP …), caùc axyl photphat, caùc daãn xuaát cuûa acid cacbonic (Axetyl- CoA …). Hôïp chaát giaøu naêng löôïng quan troïng nhaát laø ATP (adenozin triphotphat). Noù chöùa 2 lieân keát cao naêng (), moãi lieân keát chöù khoaûng 1200 cal (trong khi moãi lieân keát photphat bình thöôøng chæ chöùa khoaûng 300 cal). ATP ñöôïc coi nhö “tieàn teä” cuûa naêng löôïng trong teá baøo. Chuùng ñöôïc tieâu duøng trong taát caû caùc phaûn öùng trao ñoåi caàn naêng löôïng. Caùc phaân töû giaøu naêng löôïng naøy ñöôïc hình thaønh trong teá baøo cuûa vi sinh vaät. Coù theå noùi söï hình thaønh lieân keát cao naêng giöõa P vaø O coøn goïi laø quaù trình photphoryl hoùa, laø phöông thöùc chuû yeáu ñeå tích luõy naêng löôïng caàn thieát cho teá baøo. Söï maát hydro cuûa cô chaát coù theå theo 4 con ñöôøng khaùc nhau: oxi hoùa phi sinh hoïc (söï chaùy) vaø oxi hoùa sinh hoïc (EDP, EMP, HMP). ÔÛ moãi con ñöôøng ñeàu coù chöùc naêng maát hydro, sinh naêng löôïng vaø saûn sinh caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát phaân töû nhoû cung caáp laøm nguyeân lieäu cho caùc phaûn öùng sinh toång hôïp. Hydro taùch ra ñöôïc vaän chuyeån vaø cuoái cuøng ñöôïc tieáp nhaän bôûi oxy ñeå taïo ra nöôùc. Trong ñieàu kieän hieáu khí hay kî khí, glucose ñeàu ñöôïc chueån thaønh piruvat qua 10 phaûn öùng, trong ñoù chæ coù 3 phaûn öùng (1, 3 vaø 10) laø moät chieàu, coøn laïi ñeàu laø hai chieàu. Tröø glucose vaø piruvat, caùc chaát trung gian ñeàu ôû daïng photphoryl hoùa. Goác photphoryl ôû ñaây coù 3 chöùc naêng :  Giuùp cho chaát trung gian mang ñieän tích aâm cao khoâng theå thoaùt ra ngoaøi.  Laø vò trí gaén enzyme  Laø vò trí cung caáp lieân keát photphat cao naêng () EDP laø con ñöôøng giuùp cho Z. mobilis chuyeån hoùa glucose thaønh piruvat khoâng qua con ñöôøng EMP (con ñöôøng Ñöôøng phaân- Glycolysis). Tröôùc heát, döôùi taùc duïng cuûa enzyme hexokinase vaø tieâu hao moät phaân töû ATP, phaân töû glucose ñöôïc chuyeån thaønh glucose- 6- photphat. Sau ñoù, glucose- 6- ñöôïc chuyeån thaønh 6-- gluconat nhö con ñöôøng Pentose photphat (con ñöôøng HMP). Tieáp theo, chaát naøy bò loaïi nöôùc nhôø P- gluconat- dehydase thaønh KDPG, KDPG bò phaân giaûi Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 21 thaønh piruvat vaø 3- - glixeraldehyde nhôø moät aldolase ñaëc hieäu. Cuoái cuøng, 3- - glixeraldehyde laïi ñi vaøo con ñöôøng EMP ñeå cho piruvat. Do ñoù caân baèng chung cuûa con ñöôøng KDPG laø : Glucose 2 piruvat + ATP + NADH2 + NADPH2 Hình 8 : Sô ñoà chuyeån hoùa töø glucose- 6- photphat thaønh glyxeraldehyde- 3-photphat vaø piruvat ATP ôû ñaây ñöôïc taïo thaønh ôû 2 phaûn öùng (7) vaø (10). Phaûn öùng (6) laø phaûn öùng oxi hoùa : Glixeraldehyde- 3-photphat + NAD+ + Pi 1,3- diphotpho- glyxerat + NADPH 1,3- diphot- phoglyxerat + ADP ATP + 3- photphoglyxerat 1,3- diphotpho- glyxerat chöùa moät  ôû C1. Vôùi söï coù maët cuûa arsenat, goác AsO4, do töông töï vôùi goác PO43-, ñaõ lieân keát caïnh tranh vôùi  ôû C1, keát quaû laø söï taïo thaønh ATP ôû ñaây bò kìm haõm. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 22 Phaûn öùng (9) laø loaïi nöôùc : 2- photpho- glyxerat photphoenol piruvat (PEP) + H2O PEP + ADP Piruvat + ATP Söï taïo thaønh ATP ôû 2 phaûn öùng treân goïi laø photphoryl hoùa ôû möùc ñoä cô chaát vì photphat cao naêng  tröôùc ñoù laø moät phaàn cuûa phaàn töû chaát trao ñoåi (1,3- diphotpho- glyxerat vaø PEP). Khi coù maët ADP, chaát trao ñoåi seõ chuyeån  cho ADP : X + ADP Xylose + ATP . Nghieân cöùu veà caùc saûn phaåm trung gian cuûa quaù trình thuûy phaân cho thaáy glucose-6-photphat dehydrogenase vaø phosphoglycerolmutase laø hai enzyme giôùi haïn (limiting enzymes) vaø enzyme phosphofructokinase khoâng coù trong con ñöôøng Entner – Doudoroff cuûa Z. mobilis. Pyruvate decarboxylase (Pdc) vaø alcohol dehydrogenase (Adh) laø hai enzyme chuû löïc tham gia vaøo söï hình thaønh ethanol. Vaø Pdc laø enzyme duy nhaát caàn thiamin pyrophotphat cho söï hoaït ñoäng, trong khi Adh I cuûa Z. mobilis laïi caàn nguyeân toá Zn gioáng nhö Adh IV cuûa naám men, coøn Adh II thì hieám khi caàn nguyeân toá Fe vaø khoâng caàn nguyeân toá Zn. Söï coù maët cuûa Adh II nhaèm thuùc ñaåy quaù trình leân men ñöôïc dieãn ra lieân tuïc vôùi noàng ñoä ethanol cao. Baûng 6 : Heä thoáng caùc enzyme ñöôøng phaân trong Zymomonas mobilis Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 23 Trong Z. mobilis , caùc enzyme cuûa con ñöôøng Entner – Doudoroff coù theå khaùng cöï toát hôn vôùi ethanol, cho neân heä thoáng teá baøo töï do cuûa Z. mobilis coù theå nhanh choùng haáp thu glucose vaø saûn xuaát ethanol nhieàu hôn 15% w/v. Maøng teá baøo cuûa Z. mobilis coù chöùa nhieàu loaïi acid beùo giuùp noù khaùng cöï laïi vôùi nhöõng taùc ñoäng baát lôïi cuûa ethanol. Caùc loaïi acid beùo chính laø : acid myristic, acid palmitic, vaø acid cis-vaccenic. Trong caùc loaïi phospholipid thì chieám soá löôïng nhieàu nhaát laø phosphotidyl ethanolamine. Noàng ñoä acid cis-vaccenic vaø söï coù maët khoâng thöôøng xuyeân cuûa hopanoid trong maøng teá baøo giuùp noù khaùng cöï vôùi noàng ñoä ethanol cao. Beân trong maøng teá baøo cuûa Z. mobilis coù caùc enzyme oxi hoùa khöû vôùi cofactor laø NADH vaø NADPH, ngoaøi ra coøn coù caùc enzyme catalase, superoxide dismutase vaø peroxidase. ÔÛ ñaây, vieäc vaïân chuyeån electron thoâng qua chuoãi hoâ haáp khoâng ñi ñoâi vôùi quaù trình phosphoryl oxy hoùa khöû. Caûø hai enzyme glucose- fructose oxido-reductase vaø glucose dehydrogenase ñeàu xuùc taùc cho phaûn öùng taïo thaønh acid gluconic. Döôùi söï xuùc taùc cuûa enzyme mannitol dehydrogenase vaø oxidase vôùi cofactor laø NAD(P)H coù hình thaønh caùc saûn phaåm phuï nhö : acetaldehyde, acetoin, vaø acid acetic. Vieäc saûn xuaát ra acetaldehyde bôûi Z. mobilis khi coù maët cuûa oxy laø do söï taêng hoaït tính cuûa enzyme NADH oxidase daãn ñeán keát quaû laø giaûm khaû naêng cuûa NADH trong phaûn öùng khöû acetaldehyde thaønh ethanol vôùi söï xuùc taùc cuûa Adh. Z. mobilis khoâng coù enzyme acetaldehyde dehydrogenase ñeå xuùc taùc cho phaûn öùng oxy hoùa acetaldehyde thaønh acid acetic. Z. mobilis coù caûø hai enzyme acid vaø alkaline phosphatases. Trong khi hoaït tính cuûa acid phosphatase thì cao nhaát khi coù Mg2+, coøn hoaït tính cuûa alkaline phosphatase laïi cao nhaát khi coù nguyeân toá Zn(II). Trong suoát quaù trình leân men sucrose, coù 3 daïng chuyeån hoùa fructose daãn ñeán söï hình thaønh fructose töï do, oligosaccharide vaø caùc polymer maïch daøi cuûa fructose vaø levan.  Moät soá phöông trình caân baèng mol cho quaù trình leân men: 1 mol glucose 1.8 mol ethanol + 1.9 mol CO2 + 0.15 mol lactic acid (Kluyver vaø Hoppenbrouwer) 1 mol glucose 1.93 mol ethanol + 1.8 mol CO2 + 0.053 mol lactate (Gibbs vaø DeMoss, 1951) 1 mol glucose 1.58 mol ethanol + 1.7 mol CO2 + 0.2 mol lactate (Belaich vaø Senez, 1965) Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 24 1 mol glucose 1.63 mol ethanol + x mol CO2 + 0.02 mol lactate (Dawes vaø coäng söï , 1970) Nhaän xeùt thaáy ethanol vaø acid lactic ngaøy caøng giaûm khi vi khuaån ngaøy caøng sinh tröôûng. Cho neân, vaøo nhöõng naêm ñaàu 1930, ngöôøi ta tieân ñoaùn raèng cô cheá leân men cuûa Zymomonas cuõng töông töï nhö gioáng naám men Saccharomyces. Theo Schreder vaø coäng söï coù 98% glucose chuyeån hoùa thaønh CO2 vaø ethanol, chæ coù moät löôïng ít acetaldehyde, acetylmethylcarbinol, acid acetic, acid lactic vaø glycerol ñöôïc taïo thaønh.  Acid pyruvic bò khöû CO2 thaønh acetaldehyde. Acetaldehyde ñöôïc tích luõy trong quaù trình leân men glucose. Glucose-6-photphat (G6P) vaø hexose diphotphat bò khöû photphat (dephosphorylated) tröôùc quaù trình leân men. Quaù trình phosphoryl hoùa xaûy ra. Theo lyù luaän cuûa Neuberg vaø Kobel, söï leân men glucose ôû ñaây khoâng tuaân theo con ñöôøng ñöôøng phaân (glycolysis pathway) nhö keát quaû nghieân cöùu cuûa hai nhaø khoa hoïc Gibbs vaø DeMoss vôùi chuûng Z. mobilis ATCC 10988..  Ñeán naêm 1954, hai nhaø khoa hoïc Gibbs vaø DeMoss ñaõ khaùm phaù ra cô cheá leân men chính cuûa vi khuaån Zymomonas töø nguoàn cô chaát glucose vaø fructose laø con ñöôøng Entner-Doudoroff.  Caân baèng oxi hoùa khöû cuûa glucose vaø fructose bò phaù vôõ, giuùp taïo ra vaø duy trì phaân töû NAD+, laø loaïi phaân töû coù nhieàu hôn NADP+ do khoâng coù maët cuûa enzyme NAD+ - NADP+ transhydrogenase. Vôùi moãi phaân töû ñöôøng hexose tieâu thuï thì coù 2 phaân töû NADH+ ñöôïc taïo thaønh, moät phaân töû NADH+ ñöôïc taïo thaønh nhôø enzyme G6P-dehydrogenase vaø moät phaân töû NADH+ ñöôïc taïo thaønh nhôø enzyme glyceraldehyde-3-photphat dehydrogenase. Caùc coenzyme bò khöû seõ ñöôïc oxi hoùa trôû laïi nhôø enzyme ethanol dehydrogenase vaø acetaldehyde – moät hôïp chaát sau naøy cuõng bò khöû thaønh ethanol vaø moät löôïng toái thieåu caùc hôïp chaát khaùc nhôø moät enzyme keùm hoaït ñoäng laø lactate dehydrogenase.  Hình 7 cho thaáy hieäu suaát ATP toång quaùt laø : töông öùng vôùi moãi phaân töû glucose leân men thì coù moät phaân töû ATP ñöôïc taïo thaønh.  Con ñöôøng enzyme hoaøn chænh phaù vôõ phaân töû gluconate ñaõ coù saün, tuy nhieân gluconate khoâng phaûi laø moät nguoàn cacbon hay moät nguoàn naêng löôïng.  Phaûn öùng chuû ñaïo cuûa con ñöôøng Entner – Doudoroff laø phaûn öùng taùch nöôùc cuûa 6-phosphogluconate thaønh 3-deoxy-2-oxo-6-phosphogluconate nhôø Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 25 enzyme 6-phosphogluconate dehydratase. Triose photphat sau ñoù ñöôïc chuyeån hoùa thaønh pyruvate.  Vì söï kî khí cuûa con ñöôøng Entner – Doudoroff lieân quan ñeán caân baèng oxy hoùa khöû giöõa glucose 6-photphat dehydrogenase, glyceraldehyde 3-photphat dehydrogenase vaø ethanol dehydrogenase. Do Z. mobilis thieáu enzyme phosphofructokinase, moät enzyme chuû choát trong con ñöôøng ñöôøng phaân EMP (Raps & DeMoss, 1962) neân Z. mobilis trao ñoåi chaát khoâng ñi theo con ñöôøng EMP maëc duø coù enzyme fructose 1,6-diphotphat aldolase (DeMoss & Gibbs, 1952),  Söï coù maët cuûa gluconokinase vaø söï vaéng maët cuûa gluconate dehydrogenase chöùng toû raèng glucose ñöôïc trao ñoåi chaát nhôø 6-phosphogluconate vaø heä thoáng caùc enzyme cuûa con ñöôøng Entner – Doudoroff. 2. Söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï : 2.1. Saûn phaåm phuï laø Acrolein : Allyl alcohol, ñöôïc xem laø nhöõng cô chaát ñoäc haïi vôùi teá baøo, noù ñöôïc oxy hoùa thaønh acrolein nhôø söï xuùc taùc cuûa enzyme alcohol dehydrogenase, vaø ethanol laø chaát kìm haõm caïnh tranh vôùi phaûn öùng oxy hoùa naøy. Hình 9 : Phaûn öùng taïo acrolein 2.2. Saûn phaåm phuï laø Acetaldehyde : Z. mobilis laø moät trong soá ít caùc vi khuaån sôû höõu enzyme pyruvate decarboxylase gioáng nhö trong naám men vaø vì vaäy coù theå saûn xuaát ethanol baèng caùch giaûm acetaldehyde. Nhöõng loaøi vi khuaån khaùc leân men ethanol cuõng coù enzyme naøy laø Zymomonas anaerobia (D. J. McGill, D. W. Ribbons & E. A. Dawes), Zymosarcina ventriculi (Arbuthnott, Bauchop & Dawes, 1960) vaø Erwinia amylovora (A. Haq & E. A. Dawes). Enzyme ethanol dehydrogenase xuùc taùc cho phaûn öùng khöû acetaldehyde. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 26 2.3. Saûn phaåm phuï laø sorbitol : Enzyme glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) coù trong teá baøo vi khuaån xuùc taùc phaûn öùng taïo thaønh sorbitol, ñoàng thôøi xuùc taùc phaûn öùng chuyeån hoùa glucose vaø fructose thaønh glucono-δ-lactone vaø sorbitol. GFOR giöõ moät chöùc naêng sinh lyù raát quan troïng cho teá baøo vi khuaån vì sorbitol hình thaønh giuùp Z. mobilis khaùng cöï vôùi aùp suaát thaåm thaáu cao gaây ra bôûi moâi tröôøng leân men coù noàng ñoä ñöôøng cao. 2.4. Saûn phaåm phuï laø acid lactic : Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol trong quaù trình leân men glucose bôûi loaøi Zymomonas mobilis lieân quan ñeán ñieàu kieän sinh tröôûng, thoâng thöôøng khoaûng 95% cô chaát (5% w/v glucose) ñöôïc chuyeån hoùa thaønh ethanol vaø CO2, coøn 5% cô chaát ñöôïc söû duïng cho toång hôïp sinh khoái teá baøo . Neáu taïo ñieàu kieän taêng hieäu suaát chuyeån hoùa leân 98% thì seõ laøm giaûm hieäu suaát sinh tröôûng (töùc laø giaûm sinh khoái teá baøo). Khi sinh tröôûng trong ñieàu kieän giôùi haïn glucose trong thieát bò chemostat, vôùi pH = 6, hieäu quaû chuyeån hoùa quan saùt thaáy giaûm töø 95% (vôùi D = 0.2h-1) xuoáng coøn 80% (vôùi D = 0.042h-1). Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol giaûm chæ coù theå giaûi thích laø do söï thay ñoåi phuï thuoäc vaøo pH trong quaù trình trao ñoåi chaát pyruvate, daãn ñeán hình thaønh acid lactic laø moät saûn phaåm phuï cuûa quaù trình leân men. ÔÛ ñoä pha loaõng D = 0.042 h-1, khi giaûm pH töø 6.0 xuoáng 5.5 daãn ñeán giaûm noàng ñoä acid lactic töø 10.8 xuoáng 7.5 g/L . Söï sinh toång hôïp acid lactic phuï thuoäc vaøo söï coù maët cuûa dòch chieát naám men hoaëc tryptone trong moâi tröôøng muoái khoaùng chöùa 5% (w/v) glucose. Coøn vôùi ñoä pha loaõng D = 0.15 h-1, noàng ñoä dòch chieát naám men giaûm töø 3 ñeán 1 g/L, pH = 6 thì noàng ñoä acid lactic giaûm 3 laàn. Acid lactic seõ khoâng ñöôïc taïo ra trong moâi tröôøng muoái khoaùng treân coù boå sung NH4Cl ñöôïc xem laø nguoàn döï tröõ nitô duy nhaát. Coøn trong moâi tröôøng muoái xaùc ñònh (defined salts medium) thì hieäu suaát chuyeån hoùa cöïc ñaïi lyù thuyeát laø 98%. Khi chemostat ñöôïc söû duïng cho söï leân men töøng meû coù oån ñònh pH (pH- stat batch) thì acid lactic saûn xuaát ra coù söï töông quan toát vôùi hoaït ñoäng cuûa chemostat, tuy nhieân cô cheá gaây ra vaãn chöa roõ raøng. 2.5. Söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï glycerol 3-photphat, dihydroxyacetone vaø glycerol ôû Zymomonas mobilis Vi khuaån gram aâm Z. mobilis laø vi khuaån duy nhaát leân men ñöôøng kî khí baèng con ñöôøng Entner – Doudoroff, coù enzyme pyruvate decarboxylase vaø Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 27 alcohol dehydrogenase tham gia xuùc taùc pyruvate thaønh ethanol. Khi Z. mobilis söû duïng glucose laøm nguoàn cacbon chính trong söï taêng tröôûng kî khí cuûa mình, chæ coù moät soá ít caùc saûn phaåm phuï ñöôïc hình thaønh, do ñoù hieäu suaát saûn xuaát ethanol hieån nhieân cao, chieám 95% hieäu suaát lyù thuyeát. Tuy nhieân khi leân men fructose, ñaëc bieät vôùi noàng ñoä cao, söï taêng tröôûng chaäm laïi, saûn löôïng sinh khoái taïo thaønh chæ baèng moät nöûa so vôùi glucose vaø hieäu suaát ethanol chæ baèng 90% hieäu suaát lyù thuyeát. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích laø do söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï dihydroxyacetone vaø glycerol. Coù hai giaû thuyeát ñaët ra giaûi thích cho söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï laø : – Enzyme 2-keto-3-desoxy-6-phosphogluconate (KDPG) aldolase hoaëc moät aldolase ñaëc tröng naøo ñoù xuùc taùc phaûn öùng taùch fructose 6-photphat taïo thaønh dihydroxyacetone (Sprenger) vaø sau ñoù noù bò khöû taïo thaønh glycerol. – Dihydroxyacetone photphat bò khöû taïo thaønh glycerol-3-photphat, sau ñoù hôïp chaát naøy bò dephosphoryl hoùa taïo thaønh glycerol (Viikari vaø Korhola). 1, KDPG aldolase; 2, Glycerol dehydrogenase; 3, Caùc enzyme ñöôøng phaân; 4, Triosephotphat isomerase, 5, Glycerol 3-photphat dehydrogenase; 6, Glycerol phosphatase; 7, Dihydroxyacetone phosphatase. Hình 10 : Hai con ñöôøng hình thaønh caùc saûn phaåm phuï dihydroxyacetone, glycerol 3-photphat vaø glycerol. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 28 Hình 11 : Con ñöôøng hình thaønh saûn phaåm phuï dihydroxyacetone, glycerol vaø glycerol 3-photphat Baûng 7 : Hoaït tính cuûa enzyme dihydroxyacetone reductase vaø glycerokinase cuûa Z. mobilis  Glycerol-3-photphat vaø saûn phaåm phuï dihydroxyacetone, glycerol ñöôïc sinh toång hôïp trong Z. mobilis nhôø thöù töï xuùc taùc cuûa caùc enzyme sau : triosephotphat isomerase, dihydroxyacetone phosphatase, dihydroxyacetone reductase vaø glycerokinase.  Maëc duø dihydroxyacetone reductase coù aùi löïc thaáp vôùi cô chaát cuûa noù laø dihydroxyacetone (Km = 2.5 mM) nhöng trong cô theå soáng coù theå hình thaønh ñeán Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 29 43 mM dihydroxyacetone. Dihydroxyacetone bò khöû thaønh saûn phaåm phuï glycerol, laø chaát caïnh tranh vôùi ethanol, cho neân khi boå sung 28 mM dihydroxyacetone vaøo moâi tröôøng luùc baét ñaàu quaù trình leân men daãn ñeán keát quaû laø giaûm löôïng sinh khoái ñeán 15%. Baûng 8 : Noàng ñoä cuûa saûn phaåm trao ñoåi chaát trong teá baøo Z. mobilis ZM4 3. Moät soá kyõ thuaät di truyeàn treân Zymomonas mobilis nhaèm caûi thieän khaû naêng leân men ethanol Vaán ñeà khoù khaên ôû Z. mobilis laø : ­ Khoâng coù khaû naêng chuyeån hoùa caùc polysaccharide phöùc taïp nhö : cellulose, hemicellulose vaø tinh boät thaønh ethanol. ­ Taïo ra caùc saûn phaåm phuï nhö : sorbitol, acetoin, glycerol vaø acid acetic. ­ Hình thaønh moät loaïi polymer levan ngoaïi baøo. Ñeå giaûi quyeát nhöõng vaán ñeà treân, ngöôøi ta tieán haønh caùc kyõ thuaät di truyeàn treân Z. mobilis nhaèm môû roäng phaïm vi öùng duïng cuûa Z. mobilis, coù nghóa laø gen maõ hoùa cho caùc enzyme thuûy phaân töø caùc loaøi vi khuaån coù lieân quan seõ ñöôïc phaùt trieån thaønh doøng voâ tính roài sau ñoù ñöôïc caáy truyeàn vaøo Z. mobilis. Moät ñieàu thuù vò nöõa laø, moät loaïi operon ñöôïc quan taâm (saûn xuaát ethanol) ñöôïc taïo ra baèng caùch keát noái hai gen pdc (pyruvate decarboxylase) vaø adhII (alcohol dehydrogenase) cuûa Z. mobilis ñöôïc caáy truyeàn vaøo caùc chuûng vi khuaån khaùc laøm cho chuùng coù hoaït tính leân men ethanol. Ngoaøi ra, nhôø caùc phöông phaùp gaây ñoät bieán coå ñieån coù choïn loïc, ngaøy nay ngöôøi ta ñaõ taïo ra caùc theå ñoät bieán Z. mobilis coù ñaëc tính leân men ñöôïc caûi thieän vaø khoâng coù söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 30 Beân caïnh ethanol, Z. mobilis coøn ñöôïc söû duïng trong saûn xuaát L-alanine vaø L-lactic acid. Gen maõ hoùa sinh toång hôïp  - carotene ñöôïc phaùt trieån thaønh doøng voâ tính vaø caáy truyeàn vaøo Z. mobilis. Nhôø moät soá öùng duïng cuûa levan trong coâng nghieäp thöïc phaåm vaø döôïc phaåm, töø ñoù Z. mobilis ñöôïc quan taâm khai thaùc nhieàu hôn trong vieäc saûn xuaát levan ôû quy moâ lôùn. Vaø Z. mobilis coøn ñöôïc ñaùnh giaù laø chuûng vi sinh vaät coù tieàm naêng trong saûn xuaát caùc saûn phaåm leân men coâng nghieäp. Maëc duø laø taùc nhaân leân men ethanol nhöng Z. mobilis laïi khoâng thích hôïp cho chuyeån hoùa sinh khoái vì noù chæ coù theå leân men glucose, fructose vaø sucrose. Tuy nhieân, trong thaäp kyû vöøa qua, caùc nhaø nghieân cöùu ôû Phoøng Thí Nghieäm Nguyeân lieäu Taùi söû duïng Quoác gia (Khoa Naêng löôïng, Myõ) ñaõ thaønh coâng trong vieäc taïo ra nhöõng chuûng vi khuaån coù theå leân men xylose vaø arabinose. Chuûng taùi toå hôïp ñaàu tieân leân men xylose (Zhang vaø coäng söï. 1995a) ñöôïc caáy gheùp 4 gen cuûa E. coli laø : xylose isomerase (xylA), xylulose kinase (xylB), transketolase (tktA), vaø transaldolase (talB) (Zhang vaø coäng söï.1995a). Xylose isomerase vaø xylulose kinase chuyeån hoùa xylose thaønh xylulose-5-photphat, moät hôïp chaát trung gian quan troïng trong con ñöôøng Pentose photphat. Xylulose-5- photphat sau ñoù ñöôïc chuyeån hoùa thaønh caùc hôïp chaát trung gian cuûa con ñöôøng Entner – Doudoroff baèng caùc enzyme transketolase vaø transaldolase. 5 gen phaân laäp töø E.coli ñöa vaøo voøng plasmid laø : L-arabinose isomerase (araA), L-ribulose kinase (araB), L-ribulose-5-photphat-4-epimerase (araD), transketolase (tktA) vaø transaldolase (talB). 3 enzyme ñaàu tieân chòu traùch nhieäm cho vieäc chuyeån hoùa arabinose thaønh xylulose-5-photphat. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 31 Hình 12 : Con ñöôøng trao ñoåi chaát glucose, xylose vaø arabinose ôû Z. mobilis  Chuûng taùi toå hôïp CP4 troäi hôn chuûng cha meï CP4 veà toác ñoä vaø khaû naêng chuyeån hoùa hoaøn toaøn glucose thaønh ethanol.  Chuûng Y02 coù theå saûn xuaát ñöôïc 9.5% ethanol veà khoái löôïng hoaëc 11.9% ethanol veà theå tích sau 17.4 giôø so vôùi 31.8 giôø cuûa CP4 thuaàn chuûng.  Enzyme alcohol dehydrogenase isozymes ñöôïc laøm maát hoaït tính ôû caùc chuûng ñoät bieán naøy, khoâng coøn khaû naêng xuùc taùc cho söï oxy hoùa caùc allyl alcohol taïo ra saûn phaåm acrolein ñoäc haïi.  Moät soá chuûng ñöôïc caûi tieán veà khaû naêng haáp thu cô chaát, coù theå saûn xuaát ethanol töø dung dòch syrup nöôùc mía 25%.  Neáu nhö tröôùc ñaây caùc chuûng daïi thuoäc loaøi Z. mobilis daïi sinh tröôûng vaø leân men ethanol töø maät ræ keùm do noàng ñoä muoái cao thì ngaøy nay caùc chuûng taùi toå hôïp ñaõ ñöôïc caûi thieän khaû naêng leân men gaáp 2 laàn, chòu ñöôïc muoái vaø pH thaáp.  Z. mobilis ZM4 laø moät chuûng taùi toå hôïp coù khaû naêng chòu ñöôïc nhieät ñoä cao (42oC).  Moät vaøi chuûng taùi toå hôïp Z. mobilis coù khaû naêng söû duïng mannitol nhö laø nguoàn cacbon chính cho quaù trình sinh tröôûng vaø leân men nhôø ñöôïc caáy gen maõ hoùa enzyme mannitol dehydrogenase. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 32 Baûng 9 : Heä thoáng caùc enzyme ñöôïc maõ hoùa trong Z. mobilis Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 33 Chöông 3 Phöông phaùp leân men ethanol vôùi Zymomonas mobilis  1. Ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men  Con ñöôøng trao ñoåi chaát laø con ñöôøng maø taát caû caùc quaù trình leân men ñeàu ñöôïc dieãn ra vôùi söï sinh toång hôïp adenosine triphotphat - ATP, laø chaát cung caáp naêng löôïng cho teá baøo hoaït ñoäng. Döôùi nhöõng ñieàu kieän sinh lyù thích hôïp thì teá baøo vi khuaån Z. mobilis caàn coù moät naêng löôïng khoaûng 42 vaø 50 kJ/mol ñeå sinh toång hôïp ATP , tuy nhieân thöïc teá thöôøng noù caàn khoaûng 63 kJ/mol.  Theo con ñöôøng Embden-Meyerhof ôû naám men Saccharomyces cerevisiae thì coù 2 mol ATP vaø 2 mol NADH taïo thaønh öùng vôùi moãi mol glucose haáp thu.  Theo con ñöôøng Entner – Doudoroff ôû vi khuaån Zymomonas mobilis thì chæ coù 1 mol ATP vaø 2 mol NADH öùng vôùi moãi mol glucose haáp thu vaø acid pyruvic laø saûn phaåm trung gian cuûa con ñöôøng naøy.  ÔÛ caû 2 con ñöôøng treân ñeàu coù söï giaûm naêng löôïng töï do khoaûng –235 kJ/mol glucose ñöôïc leân men .  Ñoái vôùi caùc phaûn öùng hoùa hoïc, ñoäng hoïc cuûa moät quaù trình phaûn aùnh toác ñoä phaûn öùng ôû möùc phaân töû, coøn trong cô theå vi sinh vaät ñoäng hoïc laïi phaûn aùnh töông taùc giöõa teá baøo soáng vaø moâi tröôøng nuoâi caáy.  Z. mobilis raát nhaïy caûm vôùi acid acetic (ñaëc bieät vôùi pH ngoaïi baøo thaáp). Acid acetic laø moät thaønh phaàn ñieån hình coù trong caùc saûn phaåm thuûy phaân cuûa cellulose. Tuy nhieân cô cheá kìm haõm cuûa acid acetic leân quaù trình leân men vaãn chöa ñöôïc giaûi thích roõ raøng. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 34 Hình 13 : Cô cheá vaän chuyeån Hac, Ac- vaø H+ qua maøng teá baøo Zymomonas mobilis  Neáu noàng ñoä acid acetic cao thì seõ coù söï tieâu hao ATP ñeå duy trì pH noäi baøo (pHin). Hieän töôïng naøy xaûy ra laø do söï gia taêng doøng proton vaøo teá baøo nhôø cô cheá khueách taùn cuûa daïng proton acid acetic (HAc).  Khi pH ngoaïi baøo thaáp (pHext), HAc khueách taùn qua maøng teá baøo , bò phaân ly moät phaàn do pHin cao hôn. Vì pHin > pHext , ñoái vôùi Z. mobilis (cuõng nhö vôùi caùc chuûng vi sinh vaät leân men ethanol khaùc), pH coù xu höôùng caân baèng trôû laïi nhôø daïng phaân ly cuûa acid acetic (Ac-). Vì theá chuùng ta caàn quan taâm ñeán doøng vaøo cuûa HAc vaø doøng ra cuûa Ac- . Caùc nhaø nghieân cöùu cho raèng söï vaän chuyeån cuûa 2 yeáu toá naøy ñöôïc xuùc tieán bôûi gradient noàng ñoä.  Caùc keát quaû thí nghieäm cho thaáy neáu khoâng coù acid acetic, toác ñoä leân men ethanol cöïc ñaïi tính theo theå tích khi leân men lieân tuïc ôû pH 5.0 laø 3.54 g/L. h. Trong suoát quaù trình leân men lieân tuïc keùo daøi, hieäu quaû chuyeån hoùa ñöôøng thaønh ethanol (döïa treân toång löôïng ñöôøng haáp thu) luoân ñöôïc duy trì > 85%. Neáu coù acid acetic vôùi noàng ñoä 0.25% (w/v), toác ñoä leân men giaûm coøn 1.17 g/L.h ôû pH 5.5.  Ion H+ deã daøng thaåm thaáu vaø khueách taùn qua maøng teá baøo (doøng vaøo H+ ñöôïc xuùc tieán bôûi gradient noàng ñoä). Cô cheá vaän chuyeån töï ñoäng cuûa ion H+ nhaèm duy trì möùc sinh lyù thích hôïp cho teá baøo. Caàn löu yù raèng pHin luoân cao hôn pHext trong suoát quaù trình leân men cuûa Z. mobilis .  pH noäi baøo cuûa cuûa Z. mobilis khoaûng 6.4 vaø gradient pH baét ñaàu giaûm daàn tröôùc khi möùc ATP giaûm maïnh. Trong khi ñoù, gradient pH vaãn tieáp tuïc taêng maõi ñeán khi möùc ATP caïn kieät. Gradient pH ñöôïc taïo moät phaàn laø do quaù trình Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 35 thuûy phaân ATP bôûi ATPases lieân keát vôùi maøng teá baøo vaø do söï baøi tieát ra moâi tröôøng caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát nhö : acid acetic, acid lactic…  Moät ñieàu quan troïng laø chæ coù 1 mol ATP ñöôïc taïo ra töø 1 mol glucose haáp thu baèng con ñöôøng Entner – Doudoroff. Moät phaàn ñaùng keå löôïng ATP naøy ñöôïc chuyeån hoùa thaønh ADP vaø tham gia phosphoryl hoùa ñoàng thôøi UDP. Vì vaäy, noàng ñoä ATP noäi baøo coù saün cho quaù trình thuûy phaân xuùc taùc bôûi ATPases seõ ít hôn.  Moät soá nghieân cöùu gaàn ñaây veà ñaëc tính cuûa caùc enzyme trong Z. mobilis cho raèng glucokinase coù theå söû duïng UTP, GTP, vaø CTP toát nhö ATP trong caùc phaûn öùng phosphoryl hoùa glucose ban ñaàu. UTP laø moät nucleoside triphotphat chính trong teá baøo khi leân men. Ngoaøi ra, glucokinase bò kìm haõm khoaûng 35% bôûi 0.05 mM glucose 6-photphat vaø 71% bôûi 0.2 mM glucose 6-photphat. 2. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men 2.1. Noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu Ñeå tìm ra noàng ñoä ñöôøng toái öu cho söï leân men, ta tieán haønh leân men tónh töông öùng vôùi caùc noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu khaùc nhau. Baûng 10 theå hieän khaû naêng leân men ethanol cuûa 4 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis öùng vôùi caùc noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu khaùc nhau. Hieäu suaát leân men cöïc ñaïi öùng vôùi 15% (w/v) noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu vôùi chuûng ATCC 10988 vaø ATCC 12526, neáu gia taêng noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu töø 15– 20% seõ laøm giaûm hieäu suaát leân men cuûa caùc chuûng naøy. Tuy nhieân, chuûng IFO 13756 vaø NRRL Β 4286 laïi coù hieäu suaát leân men taêng ôû 20% (w/v) noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu nhöng khoâng coù söï gia taêng ñaùng keå trong vieäc haáp thu cô chaát. Vôùi 25 % (w/v) taát caû caùc chuûng ñeàu giaûm khaû naêng haáp thu cô chaát vaø leân men ethanol. Baûng 10 : Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu leân saûn xuaát ethanol vôùi caùc chuûng Z. mobilis khaùc nhau Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 36 Chuù thích : P : % (v/v) ethanol taïo thaønh; Su : % (w/v) cô chaát haáp thu g/gs : tyû soá gam ethanol taïo thaønh/ gam cô chaát haáp thu E : % hieäu suaát lyù thuyeát 2.2. Aûnh höôûng cuûa cô chaát 2.2.1. Cô chaát laø ñöôøng hexose (glucose hoaëc fructose) Tröôøng hôïp leân men rieâng leû glucose hoaëc fructose : Chuûng taùi toå hôïp Zymomonas mobilis CP4 (pZB5) ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng leân men giaùn ñoaïn vaø lieân tuïc coù söï ñieàu chænh pH vôùi cô chaát laø glucose hoaëc fructose ñöôïc xem laø nguoàn cacbon cuõng nhö laø nguoàn naêng löôïng chuû yeáu. Baûng 11 : Thoâng soá cuûa quaù trình leân men vôùi cô chaát glucose hoaëc fructose Thoâng soá Glucose Fructose Toác ñoä haáp thu ñöôøng rieâng cöïc ñaïi (g ñöôøng/g teá baøo.giôø ) 8.5 2.1 Toác ñoä saûn xuaát ethanol rieâng cöïc ñaïi (g ethanol/g teá baøo.giôø) 4.1 1.0 Hieäu suaát sinh tröôûng trung bình (g sinh khoái teá baøo DCM/g ñöôøng) 0.055 0.034 Giaù trò hieäu suaát ATP (YATP) (g sinh khoái teá baøo /mol ATP) 9.9 5.1 Tröôøng hôïp leân men ñoàng boä hoãn hôïp glucose vaø fructose :  Söï kìm haõm caïnh tranh enzyme fructokinase bôûi glucose ñöôïc cho laø moät cô cheá cuûa vieäc Z. mobilis öu tieân haáp thu glucose töø hoãn hôïp glucose vaø fructose vaø tích luõy fructose khi sinh tröôûng treân cô chaát laø sucrose. Vôùi cuøng moät noàng ñoä trong hoãn hôïp glucose vaø fructose thì fructose ñöôïc Z. mobilis haáp thu chaäm hôn vaø söï kìm haõm enzyme fructokinase bôûi glucose ñöôïc dieãn ra maõnh lieät trong teá baøo vi khuaån. Moät ñieàu thuù vò laø khi boå sung glucose vaøo canh tröôøng cuûa chuûng Z. mobilis CP4-M2, moät chuûng thieáu enzyme glucokinase, thì söï kìm haõm treân xaûy ra hoaøn toaøn vaø ngay laäp töùc.  Ngoaøi ra khi theâm moät chaát töông töï glucose nhöng khoâng tham gia trao ñoåi chaát thì cuõng coù nhöõng aûnh höôûng kìm haõm leân söï trao ñoåi chaát fructose gioáng nhö vaäy. Ñieàu naøy chöùng toû raèng söï caïnh tranh chuyeån hoùa vôùi fructose cuûa glucose ñoùng vai troø raát quan troïng trong quaù trình söû duïng cô chaát laø glucose vaø fructose.  Beân caïnh ñoù, enzyme glucose-fructose oxidoreductase xuùc taùc phaûn öùng hình thaønh sorbitol töø fructose, ñaây laø moät chaát giuùp Z. mobilis chòu ñöôïc aùp suaát thaåm thaáu trong moâi tröôøng coù noàng ñoä ñöôøng cao. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 37 Hình 14 : Cô cheá tích luõy vaø chuyeån hoùa glucose vaø fructose ôû Z. mobilis 2.2.2. Cô chaát laø hoãn hôïp glucose - xylose Toác ñoä sinh tröôûng, söû duïng cô chaát rieâng, cuõng nhö saûn löôïng sinh khoái vaø saûn xuaát ethanol treân cô chaát laø xylose cuûa chuûng Zymomonas mobilis ZM4 (pZP5) taùi toå hôïp thaáp hôn treân cô chaát laø glucose hoaëc hoãn hôïp glucose – xylose. Quan saùt söï leân men ñieån hình cuûa chuûng ZM4 (pZB5) treân cô chaát laø hoãn hôïp glucose – xylose, ta thaáy Z. mobilis haáp thu ñöôøng glucose tröôùc, coøn xylose thì ñöôïc haáp thu sau vôùi toác ñoä chaäm hôn vaø coù söï trao ñoåi chaát khoâng ñoàng boä sau khi glucose ñaõ ñöôïc söû duïng heát. Toác ñoä vaø hieäu suaát trao ñoåi chaát treân xylose giaûm ñöôïc giaûi thích laø do nhieàu nguyeân nhaân nhö :  Trao ñoåi chaát thay ñoåi do duy trì chöùc naêng lieân quan ñeán plasmid.  Taïo ra moät soá saûn phaåm phuï nhö : xylitol, acetate, lactate, acetoin vaø dihydroxyacetone.  Do taùc nhaân kìm haõm laø xylitol photphat. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 38 Nhöng ngaøy nay, nhieàu chuûng Z. mobilis kyõ thuaät coù theå chuyeån xylose thaønh ethanol baèng caùch keát hôïp caùch söû duïng 2 con ñöôøng trao ñoåi chaát Entner- Doudoroff vaø pentose pathways nhôø vieäc caáy gheùp heä thoáng caùc enzyme xylose isomerase vaø xylulokinase trong vieäc tích luõy xylose vaø caùc enzyme transketolase vaø transaldolase trong cô cheá trao ñoåi chaát pentose. Hình 15 : Söï leân men cuûa chuûng taùi toå hôïp ZM4 (pZB5) treân caùc cô chaát khaùc nhau A : söû duïng xylose (60.5g/l) B : söû duïng glucose (64.8g/l) C : söû duïng hoãn hôïp glucose (60g/l) vaø xylose (61.5g/l) ●- Xylose; - glucose; ■- ethanol; - sinh khoái. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 39 Hình 16 : Söï taïo thaønh ethanol, sinh khoái vaø saûn phaåm phuï cuûa chuûng taùi toå hôïp ZM4 (pZB5) treân caùc cô chaát khaùc nhau A : söû duïng xylose (27.5g/l) B : söû duïng hoãn hôïp glucose (26.8g/l) vaø xylose (32g/l) ●- Xylose; - glucose; ■- ethanol; - sinh khoái. - xylitol; - acetic acid; □, glycerol; - acetoin. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 40 Baûng 12 : Thoâng soá ñoäng hoïc cuûa Z. mobilis ZM4 (pZB5) treân moâi tröôøng coù chöùa xylose, glucose hoaëc hoãn hôïp glucose-xylose Noàng ñoä xylose (g/l) Noàng ñoä glucose (g/l) Noàng ñoä hoãn hôïp glucose – xylose (g/l) Thoâng soá ñoäng hoïc 27.8 40.3 60.5 27.5 64.8 26.8–32.0 60.0–61.5 b-Trao ñoåi chaát glucose/ xylose μmax (h−1)a 0.13 0.12 0.11 0.43 0.42 0.42 0.22 qmax,glucose (g/g/h) 9.34 10.63 9.10 8.60 qmax,xylose (g/g/h) 3.06 3.24 3.38 2.49 1.41 qmax,p (g/g/h) 1.39 1.37 1.40 4.48 5.11 4.73 4.62 Trao ñoåi chaát xylose qs (g/g/h) 3.01 2.13 qp (g/g/h) 1.36 0.91 Toång hieäu suaát Yx/s (g/g) 0.019 0.014 0.010 0.036 0.027 0.031 0.015 μmax (h−1)a 0.45 0.42 0.41 0.48 0.47 0.46 0.46 Chuù thích : aμmax (h−1), toác ñoä sinh tröôûng rieâng cöïc ñaïi qs (g/g/h), löôïng cô chaát haáp thu rieâng qp (g/g/h), toác ñoä saûn xuaát ethanol rieâng Yx/s (g/g), hieäu suaát sinh toång hôïp sinh khoái Yp/s (g/g), hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol b – Thoâng soá ñoäng hoïc cho pha söû duïng xylose sau khi glucose ñaõ ñöôïc söû duïng heát trong suoát quaù trình ñoàng leân men hoãn hôïp glucose – xylose. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 41 Baûng 13 : Söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï vaø phaàn traêm ATP maát ñi cuûa chuûng Z. mobilis ZM4 (pZB5) treân moâi tröôøng xylose, glucose hoaëc hoãn hôïp glucose – xylose. Noàng ñoä xylose (g/l) Noàng ñoä glucose (g/l) Noàng ñoä hoãn hôïp glucose – xylose (g/l) Saûn phaåm (g/l) 27.8 40.3 60.5 27.5 64.8 26.8– 32.0 60.0– 61.5 Ethanol 12.6 17.0 25.1 13.3 30.5 27.0 55.7 Xylitol 1.37 2.68 4.86 0 0 0.45 0.91 Dihydroxyacetone 0.68 1.34 2.10 0 0.14 0.25 0.88 Glycerol 0.36 0.80 1.26 0 0.10 0.14 0.45 Acid acetic 0.47 0.67 1.21 0.08 0.17 0.23 0.68 Acetoin 0.12 0.15 0.18 0.22 0.32 0.25 0.52 Acid lactic 0.017 0.016 0.022 0.008 0.014 0.022 0.035 Möùc ATP cöïc ñaïi lyù thuyeát (mmol)a 185.2 268.5 403.1 152.6 359.6 361.9 742.7 Möùc ATP maát ñi (mmol)b 32.0 64.8 106.4 0 5.3 11.6 35.3 % ATP maát 17.3 24.1 26.4 0 1.5 3.2 4.8 a Noàng ñoä ñöôøng ñöôïc chuyeån thaønh ñôn vò micromoles/lít baèng caùch chia noàng ñoä xylose (g/l) cho 0.15 vaø chia noàng ñoä ñöôøng glucose (g/l) cho 0.18. b Soá ATP maát ñi do söï hình thaønh caùc saûn phaåm phuï ñöôïc tính toaùn döïa treân noàng ñoä cuûa dihydroxyacetone, glycerol vaø xylitol trong suoát quaù trình leân men. 2.2.3. Cô chaát laø arabinose : Chuûng vi sinh vaät coù theå chuyeån hoùa nhanh vaø hieäu quaû caùc ñöôøng D- xylose vaø L-arabinose, caùc ñöôøng naøy thöôøng ñöôïc tìm thaáy trong hemicellulose taùch ra töø nguyeân lieäu lignocellulose. Caùc chuûng vi sinh vaät kyõ thuaät coù theå sinh tröôûng vaø saûn xuaát ethanol töø arabinose vôùi hieäu suaát 98% so vôùi lyù thuyeát chöùng toû raèng arabinose ñöôïc chuyeån hoùa haàu nhö hoaøn toaøn. Söï leân men hieäu quaû L- arabinose thaønh ethanol ñaït ñöôïc nhôø söï keát hôïp con ñöôøng pentose photphat vaø Entner-Doudoroff. Nhìn chung, phaûn öùng toång quaùt cho ta thaáy 3 mol L-arabinose ñöôïc chuyeån hoùa thaønh 5 mol ethanol : 3 L-arabinose + 3ADP + 3 Pi 5 ethanol + 5CO2 + 3ATP + 3H2O (mol) Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 42 Hieäu suaát ethanol lyù thuyeát laø 0.51 g ethanol/ g L-arabinose hoaëc 1.67 mol ethanol/ mol L-arabinose. Do coù ít cô chaát ñöôïc söû duïng cho hình thaønh sinh khoái, saûn xuaát ethanol töø vieäc leân men L-arabinose vôùi loaøi Z. mobilis kyõ thuaät thì hieäu quaû hôn baát kyø chuûng vi sinh vaät naøo khaùc vaø cuõng coù giaù trò töông ñöông vôùi vieäc leân men töø D-xylose. Maëc duø hieäu suaát ethanol lyù thuyeát döïa treân löôïng ñöôøng haáp thu laø gaàn baèng nhau treân caû 2 moâi tröôøng hoaëc chæ coù arabinose hoaëc hoãn hôïp glucose vaø arabinose nhöng arabinose vaãn khoâng ñöôïc haáp thu hoaøn toaøn, nguyeân nhaân coù theå laø do söï giaûm pH trong quaù trình leân men khoâng chænh pH. Trong moâi tröôøng hoãn hôïp glucose – arabinose, pH cuoái cuøng khoaûng 4.6, coøn trong moâi tröôøng chæ coù arabinose thì pH cuoái cuøng laø 4.9. Noàng ñoä arabinose dö cao hôn trong moâi tröôøng hoãn hôïp laø do söï kìm haõm haáp thu arabinose cuûa pH thaáp. Coù hôn 27g/lít ethanol ñöôïc saûn xuaát ra trong moâi tröôøng coù noàng ñoä glucose vaø arabinose ban ñaàu cao vôùi pH = 5.25. Nhö vaäy trong hoãn hôïp glucose vaø arabinose, arabinose ñöôïc haáp thu vôùi toác ñoä chaäm hôn nhieàu so vôùi glucose vaø chæ coù glucose laø gaàn nhö caïn kieät. ÔÛ Z. mobilis, glucose ñöôïc vaän chuyeån nhôø aùi löïc yeáu, toác ñoä cao, cô cheá khueách taùn glucose xuùc tieán (glucose-facilitated diffusion - Glf), khoâng tieâu hao naêng löôïng. Cô cheá naøy coù giôùi haïn cô chaát heïp vaø bò kìm haõm caïnh tranh bôûi moät chaát töông töï nhö D-xylose. Nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây cho raèng ñaây laø cô cheá khueách taùn chuû yeáu, quan troïng caàn cho söï vaän chuyeån glucose vaø fructose. Vì theá ñaây laø lyù do cho raèng L-arabinose cuõng ñöôïc vaän chuyeån baèng cô cheá naøy nhöng noù raát deã bò aûnh höôûng bôûi noàng ñoä glucose cao. Do bò kìm haõm caïnh tranh bôûi glucose neân arabinose seõ bò haáp thu chaäm hôn, cho neân khi glucose caïn kieät, arabinose seõ ñöôïc haáp thu nhanh choùng ngay sau ñoù. 2.3. Aûnh höôûng cuûa caùc moâi tröôøng khaùc nhau 2.3.1. Moâi tröôøng toång hôïp : Moâi tröôøng toång hôïp bao goàm : sucrose, dòch chieát naám men, ammonium sulphate, potassium dihydrogen ortho photphat vaø magnessium photphat. Hình 14 vaø baûng 15 döôùi ñaây cho thaáy caùc thoâng soá cuûa quaù trình leân men cuûa 4 chuûng Z. mobilis ôû caùc ñieàu kieän toái öu trong moâi tröôøng toång hôïp. Chuûng NRRL Β 4286 vaø IFO 13756 theå hieän hieäu suaát leân men thaáp trong 12 giôø ñaàu nhöng sau ñoù laïi cao hôn so vôùi caùc chuûng khaùc (ATCC 10988 vaø ATCC 12526). Nhöng IFO 13756 nhanh choùng leân men sau 12 giôø vaø keát thuùc sau 48 giôø roài sau ñoù noàng ñoä ethanol giaûm daàn. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích laø do söï oxy hoùa Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 43 ethanol thaønh acid acetic (Belaich vaø Senez, 1965; Swings vaø De Ley, 1977). Trong 4 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis NRRL Β 4286 theå hieän hieäu quaû leân men cao nhaát trong moâi tröôøng toång hôïp. Söùc saûn xuaát ethanol rieâng cuûa chuûng naøy ñaït cöïc ñaïi vaø ñaït cöïc tieåu vôùi chuûng ATCC 10988. Hình 17 : Leân men ethanol treân moâi tröôøng toång hôïp vôùi chuûng Z. mobilis 2.3.2. Moâi tröôøng nöôùc mía : Moâi tröôøng nöôùc mía cuõng ñöôïc chuaån bò nhö moâi tröôøng toång hôïp vôùi noàng ñoä ñöôøng khöû trong nöôùc mía khoaûng 18% (w/v). Hình 15 vaø baûng 15 theå hieän caùc thoâng soá cuûa quaù trình leân men cuûa 4 chuûng Z. mobilis treân moâi tröôøng nöôùc mía. Chuûng NRRL Β 4286 leân men toát trong moâi tröôøng toång hôïp nhöng laïi leân men keùm hôn trong moâi tröôøng nöôùc mía so vôùi caùc chuûng khaùc. Chuûng naøy theå hieän söï trì hoaõn trong 12 giôø ñaàu, coøn caùc chuûng khaùc thì khoâng coù. Chuûng ATCC 10988 leân men nhanh choùng vaø döøng haún sau 48 giôø, ñaït hieäu suaát 82–94% ethanol. Theo baùo caùo cuûa Lyness vaø Doelle (1981) thì hieäu suaát ethanol ñöôïc leân men vôùi chuûng Z. mobilis ñaït 60–88 % trong 20 -29 giôø. Vôùi chuûng ATCC quaù trình leân men keùo daøi 66 giôø ñaït hieäu suaát 10.3% ethanol. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 44 Hình 18 : Leân men ethanol treân moâi tröôøng nöôùc mía vôùi chuûng Z. mobilis 2.3.3. Moâi tröôøng maät ræ : Maät ræ laø moät nguoàn cô chaát coâng nghieäp coù chöùa sucrose vaø löôïng muoái ñaùng keå. Theo Rogers vaø coäng söï (1982), coù khoaûng 2% nguoàn cacbon chuyeån hoùa thaønh sinh khoái. Caùc thaønh phaàn oån ñònh chính cuûa pH laø caùc acid yeáu vaø caùc acid amin hoaït ñoäng ôû pH 3 vaø 5, hoaëc caùc muoái photphat coù taùc duïng nhö chaát ñeäm chænh pH 6 vaø 7. Z. mobilis coù theå chòu ñöôïc giôùi haïn pH roäng töø 3.5 ñeán 7.5, toái öu laø khoaûng 5.0 – 7.0. Ñieàu kieän toát nhaát ñeå saûn xuaát ethanol laø noàng ñoä ñöôøng khöû trong maät ræ khoaûng 200g/lít, 30oC, canh tröôøng tónh vaø thôøi gian leân men laø 48 giôø. Maät ræ laø moät saûn phaåm phuï cuûa neàn coâng nghieäp ñi töø nguyeân lieäu trong noâng nghieäp, thöôøng ñöôïc söû duïng trong caùc nhaø maùy röôïu nhôø thaønh phaàn coù chöùa caùc ñöôøng leân men vaø ñaây laø nguoàn cacbon toát cho trao ñoåi chaát ôû vi sinh vaät. Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol giaûm ôû noàng ñoä ñöôøng cao do coù söï gia taêng aùp suaát thaåm thaáu, maø ñaây laø nhaân toá quan troïng ñeå hình thaønh caùc saûn phaåm phuï nhö : sorbitol vaø levan. Moâi tröôøng maät ræ ñöôïc chuaån bò baèng caùch pha loaõng maät ræ theo yeâu caàu. Baûng14 theå hieän leân men ethanol vôùi chuûng Z. mobilis treân cô chaát maät ræ vôùi noàng ñoä ñöôøng ban ban ñaàu 10% (w/v). Caùc chuûng ATCC 10988 (3.05% v/v) vaøNRRL Β 4286 (3.29 % v/v) theå hieän söùc saûn xuaát cöïc ñaïi trong khi IFO 13756 theå hieän söùc saûn xuaát cöïc tieåu (1.97 % v/v). Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 45 Baûng 14 : Leân men ethanol ôû caùc noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu khaùc nhau vôùi cô chaát laø maät ræ vôùi chuûng Z. mobilis ATCC 10988 Baûng 14 cho thaáy naêng suaát saûn xuaát ethanol ñaït cöïc ñaïi (3.35%, v/v) vôùi noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu 15% (w/v), luùc naøy söï haáp thu cô chaát ñaït cöïc ñaïi (42% w/v). Coøn vôùi noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu cuûa maät ræ treân 15% (w/v) thì söï leân men ethanol giaûm daàn. Nhìn chung, vôùi taát caû 4 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis laø ATCC 10988, ATCC 12526, NRRL B 4286 vaø IFO 13756, khaû naêng saûn xuaát ethanol töø maät ræ cuûa chuùng raát keùm so vôùi caùc cô chaát khaùc. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do noàng ñoä cao cuaû caùc ion Mg2+ vaø K+ coù trong maät ræ gaây öùc cheá moät phaàn quaù trình leân men (Skotnicki vaø coäng söï, 1982). Baûng 15 : Leân men ethanol vôùi caùc loaïi moâi tröôøng khaùc nhau vôùi chuûng Z. mobilis Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 46 2.4. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä glucose : Moâi tröôøng phoå bieán nhaát ñöôïc söû duïng trong vieäc kieåm tra khaû naêng leân men ethanol cuûa Z. mobilis laø moâi tröôøng glucose vôùi dòch chieát naám men, ammonium sulfate vaø magnesium sulfate (Karsch vaø coäng söï 1983, Struch vaø coäng söï 1991, Agrawal vaøVeeramallu 1990, Oaxaca and Jones 1991, Falcao de Morais vaø coäng söï 1993, Nowak and Roszyk 1997, Rios vaø coäng söï 1991). Ngöôøi ta tieán haønh so saùnh saûn löôïng ethanol taïo thaønh bôûi 2 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis treân moâi tröôøng glucose vôùi noàng ñoä glucose thay ñoåi töø 100 – 250 g glucose/ lít. Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol dao ñoäng trong khoaûng 91.8 – 96% so vôùi hieäu suaát lyù thuyeát vaø haøm löôïng glucose söû duïng cao hôn öùng vôùi caû 2 chuûng ngay caû trong ñieàu kieän noàng ñoä ñöôøng cao. Z. mobilis coù heä thoáng khueách taùn xuùc tieán neân coù khaû naêng caân baèng nhanh choùng noàng ñoä glucose noäi baøo vaø ngoaïi baøo. Baûng 16 : Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol vaø söû duïng glucose bôûi 2 chuûng thuoäc loaøi Z. mobilis trong leân men tónh (30oC, thôøi gian leân men 48 giôø vaø 72 giôø cho noàng ñoä glucose laø 250g/l) Chuûng Glucose (100g/l) Glucose (150g/l) Glucose (200g/l) Glucose (250g/l) Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol (% lyù thuyeát ) % Glucose söû duïng Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol (% lyù thuyeát ) % Glucose söû duïng Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol (% lyù thuyeát ) % Glucose söû duïng Hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol (% lyù thuyeát ) % Glucose söû duïng 3881 93.8a 98.2 91.8a 98.5 93.6a 97.9a 95.9 91.2a 3883 94.3b 98.5 93.4b 98.6 94.2b 99.0b 96.0 98.2b 2.5. AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu : Ñeå tìm ra pH toái öu cho söï leân men ethanol vôùi loaøi Z. mobilis , pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng leân men ñöôïc chænh ôû nhöõng giaù trò khaùc nhau vaø tieán haønh quaù trình leân men trong 72 giôø. Keát thuùc quaù trình naøy, caùc maãu ñöôïc thu laïi vaø öôùc löôïng noàng ñoä ethanol vaø noàng ñoä ñöôøng soùt. Baûng 17 cho thaáy aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu leân caùc thoâng soá leân men cuûa caùc chuûng Z. mobilis khaùc nhau. Ta thaáy hieäu quaû leân men ñaït cöïc ñaïi ôû pH 7 vaø thaáp nhaát ôû pH 4, chöùng toû neáu gia taêng pH ban ñaàu thì söï haáp thu cô chaát vaø hieäu quaû leân men cuõng taêng. Do ñoù pH toái öu cho söï leân men ethanol vôùi chuûng Z. mobilis ñöôïc choïn laø 7. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 47 Baûng 17 : Aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu leân saûn xuaát ethanol öùng vôùi caùc chuûng Z. mobilis khaùc nhau 2.6. Aûnh höôûng cuûa ion Na+ vaø ion Cl- Nhöôïc ñieåm cuûa taát caû caùc loaøi Z. mobilis laø khaû naêng khaùng cöï ñoái vôùi caùc ion voâ cô (Rogers vaø coäng söï. 1984), caùc ion voâ cô naøy laïi thöôøng xuyeân coù trong caùc nguoàn nguyeân lieäu coâng nghieäp nhö ræ ñöôøng vaø caùc saûn phaåm thuûy phaân cuûa lignocellulose vôùi noàng ñoä coù theå gaây kìm haõm (Binkley vaø Wolfrom 1953; Ranatunga vaø coäng söï. 2000). Nhieàu taùc giaû ñaõ baùo caùo raèng hieäu suaát ethanol giaûm khi coù maët cuûa caùc muoái Na vaø Ca (Bajpai vaø Margaritis 1984; Fein vaø coäng söï. 1984; Spangler vaø Emert 1986; Stevnsborg vaø Lawford 1986; Kirk vaø Doelle 1992; Sreekumar vaø Basappa 1992; Vigants vaø coäng söï. 1998). NaCl vaø KCl laøm giaûm toác ñoä haáp thu cô chaát khi vi sinh vaät sinh tröôûng treân glucose (Sreekumar vaø Basappa 1992; Park vaø Baratti 1993) vaø laøm taêng khaû naêng sinh toång hôïp sorbitol, fructo- oligosaccharide vaø levan khi leân men sucrose (Kirk vaø Doelle 1992; Vigants vaø coäng söï. 1998). Roi gaây caûn trôû söï laéng vaø gaây khoù khaên trong vieäc taùi söû duïng teá baøo trong caùc boàn leân men coå truyeàn. Trong suoát quaù trình saûn xuaát ethanol vôùi Z. mobilis, söï hình thaønh roi trong boàn leân men coá ñònh teá baøo gaây nhieàu khoù khaên veà ñieàu khieån quaù trình (Krug vaø Daugulis 1983; Daugulis vaø coäng söï. 1985). Cô cheá hình thaønh roi vaãn coøn chöa ñöôïc bieát ñeán roõ raøng vaø noù ñöôïc giaûi thích laø do aûnh Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 48 höôûng bôûi aùp löïc cuûa caùc ion hoaëc söï gia taêng möùc photphat (Fein vaø coäng söï. 1984) vaø ion Ca2+ (Spangler vaø Emert 1986; Stevnsborg vaø Lawford 1986). Trong khi NaCl laø nguyeân nhaân chung gaây kìm haõm söï leân men cuûa Z. mobilis , coøn nhöõng aûnh höôûng coù lieân quan cuûa caùc ion Na+ vaø Cl- vaãn chöa ñöôïc giaûi thích roõ raøng. Toùm laïi, tham gia kìm haõm söï sinh tröôûng, haáp thu glucose vaø saûn xuaát ethanol laø do caû hai loaïi ion aâm vaø ion döông, coøn söï hình thaønh roi thì haàu nhö bò aûnh höôûng hoaøn toaøn bôûi ion Cl-. Vôùi 0.175 mol/l NaCl trong caùc khoaûng thôøi gian töø 0, 3, 6, 9, 16 vaø 24 giôø (a–f), 0.175 mol/l Cl- (nhö NH4Cl) (g) vaø 0.175 mol/l Na+ (nhö Na2SO4.10H2O) (h) Hình 20 : Thay ñoåi kieåu hình theo thôøi gian cuûa Z. mobilis Hình 19 : AÛnh höôûng cuûa 0.175 mol/l NaCl, Na+ (nhö Na2SO4.10H2O) vaø Cl- (nhö NH4Cl) leân söï taêng tröôûng cuûa Z. mobilis Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 49 2.7. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä  Nhieät ñoä toái öu cho quaù trình leân men laø 30oC.  Khi nhieät ñoä taêng daàn ñeán nhieät ñoä toái öu thì toác ñoä hình thaønh saûn phaåm cuõng taêng. Vôùi noàng ñoä cô chaát cao trong dòch leân men , khi nhieät ñoä taêng thì toác ñoä haáp thu cô chaát taêng. Baûng 18 : Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân toác ñoä sinh tröôûng rieâng cöïc ñaïi ôû Z. mobilis ATCC 29191 trong nuoâi caáy tónh ( moâi tröôøng chöùa 2% glucose vaø pH 5.5) Nhieät ñoä (oC) max (giôø -1) 30 33 36 0.27 0.38 0.26  Nhieät ñoä taêng aûnh höôûng ñeán sinh tröôûng cuûa teá baøo, toác ñoä haáp thu cô chaát vaø hình thaønh saûn phaåm.  Khi nhieät ñoä cuûa moâi tröôøng leân men taêng töø 30 – 36oC , ôû noàng ñoä glucose khoâng ñoåi trong hoãn hôïp nhaäp lieäu thì noàng ñoä sinh khoái giaûm vaø toác ñoä haáp thu glucose taêng daàn.  Khi taêng nhieät ñoä khoaûng 2 – 3oC seõ coù nhieàu glucose chuyeån hoùa thaønh ethanol hôn, hieäu suaát chuyeån hoùa taêng töø 82% to 90%. Tuy nhieân, nhieät ñoä cao quaù möùc seõ coù nhieàu glucose thaát thoaùt trong canh tröôøng, hieäu suaát chuyeån hoùa giaûm coøn 65%. Ñaëc bieät, ôû 35oC, kieåu hình cuûa teá baøo vi khuaån coù nhieàu thay ñoåi hôn daãn ñeán maät ñoä teá baøo giaûm vaø khoù khaên trong ñieàu khieån quaù trình. 2.8. Aûnh höôûng cuûa moâi tröôøng kî khí Zymomonas mobilis sinh thöôûng hieáu khí vôùi noàng ñoä glucose 20g/l (giôùi haïn cacbon) trong thieát bò chemostat bò kìm haõm bôûi söï gia taêng ñoàng thôøi hai yeáu toá laø hieäu suaát sinh thöôûng (Yx/s) vaø hieäu suaát sinh tröôûng cöïc ñaïi (Yx/smax) vaø söï giaûm ñoàng thôøi 2 yeáu toá laø toác ñoä haáp thu cô chaát rieâng (qs) vaø toác ñoä haáp thu naêng löôïng döï tröõ (me). Söï gia taêng veà aùp suaát rieâng phaàn cuûa oxy cho thaáy coù söï chuyeån tieáp thích nghi töø traïng thaùi kî khí sang hieáu khí xaûy ra trong 4 tröôøng hôïp sau : Kî khí : 0 mmHgO2 Oxy bò haïn cheá : 7.6- 230 mmHgO2 Trung gian : 273 mmHgO2 Dö oxy : 290 mmHgO2 Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 50 Noàng ñoä sinh khoái oån ñònh (Yx/s) vaø möùc ATP noäi baøo gia taêng khi aùp suaát rieâng phaàn cuûa oxy taêng töø 7.6 ñeán 120 mm HgO2, cuøng vôùi söï giaûm ñoàng thôøi thoâng soá qs vaø toác ñoä saûn xuaát acid rieâng. Hoaït ñoäng cuûa enzyme ATPase ôû maøng teá baøo giaûm daàn khi taêng aùp suaát rieâng phaàn cuûa oxy vaø trôû neân keùm hoaït ñoäng nhaát ôû 273 mm HgO2, luùc ñoù aùp suaát rieâng phaàn cuûa oxy ñaït cöïc ñaïi maø vaãn duy trì ñöôïc traïng thaùi oån ñònh. Hoaït ñoäng cuûa caùc enzyme glucokinase, glucose-6-photphat dehydrogenase, glyceraldehyde-3-photphat dehydrogenase, vaø alcohol dehydrogenase cuõng giaûm daàn khi aùp suaát rieâng phaàn cuûa oxy taêng treân 15 mmHg, ngoaïi tröø enzyme pyruvate decarboxylase khoâng bò taùc ñoäng bôûi ñieàu kieän hieáu khí. Söï kìm haõm sinh thöôûng ôû aùp suaát 290 mm HgO2 laø ñaëc tröng cho söï giaûm ñaùng keå hoaït ñoäng cuûa enzyme pyruvate kinase vaø möùc ATP tích luõy. Keát luaän : vôùi noàng ñoä glucose thaáp vaø ñieàu kieän giôùi haïn oxy thì laøm cho saûn löôïng sinh khoái gia taêng, ñieàu naøy phaûn aùnh söï taùi söû duïng laïi giaùn tieáp ATP thì ñöôïc öa thích hôn laø söï gia taêng naêng löôïng taïo ra cuoái cuøng. 2.9. Aûnh höôûng cuûa Furfural : Furfural laø moät chaát ñoäc kìm haõm söï sinh tröôûng vaø khaû naêng saûn xuaát ethanol cuûa chuûng Zymomonas mobilis CP4 (pZB5). Ñieàu naøy ñaõ ñöôïc nghieân cöùu baèng caùch laàn löôït theâm 0.475 g/l vaø1.9 g/l furfural vaøo moâi tröôøng leân men. Söï kìm haõm cuûa furfural theå hieän ôû vieäc giaûm 30% vaø 60% (w/v) trong saûn xuaát sinh khoái vaø 19% vaø 76% trong saûn xuaát ethanol. Thaønh phaàn phöùc taïp cuûa caùc hôïp chaát lignocellulose trong chaát xô thöïc vaät laø vaán ñeà khoù khaên trong vieäc chuyeån hoùa goã thaønh ethanol. Ngöôøi ta thaáy raèng vieäc nghieân cöùu nhöõng aûnh höôûng cuûa caùc saûn phaåm töø quaù trình thuûy phaân leân caùc thoâng soá cuûa quaù trình leân men vaø töø ñoù coù höôùng giaûi quyeát vôùi nhöõng hôïp chaát ñoäc haïi. 3 yeáu toá toàn taïi caàn phaûi tieàn xöû lyù laø : quaù trình nghieàn xeù, söï noå hôi vaø thuûy phaân acid loaõng. Nhìn chung, phaàn goã dö seõ ñöôïc xöû lyù ôû khoaûng nhieät ñoä töø 200 – 220oC, thôøi gian naáu töø 3 – 5 phuùt vôùi 2 - 3% SO2 (v/v). Coøn ôû ñieàu kieän nhieät ñoä 170oC thì naáu trong voøng 15 – 60 phuùt vôùi 0.01-0.1% (v/v) cuûa H2SO4 (Um cuøng coäng söï, 2001). Caùc thaønh phaàn cuûa hemicellulose ñöôïc chuyeån hoùa thaønh pentose vaø nhöõng saûn phaåm khaùc theo phöông trình phaûn öùng sau : Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 51 Pentosan -----(H2O)-- pentose (xylose)---(- 3 H2O) furfural Hình 21 : Phaûn öùng chuyeån hoùa fufural Hydroxymethylfurfural (HMF) coøn ñöôïc sinh ra töø caùc loaïi ñöôøng 6 cacbon trong ñieàu kieän nhieät ñoä cao vaø moâi tröôøng acid. Trong suoát quaù trình sinh tröôûng cuûa Z. mobilis, qua quan saùt döôùi kính hieån vi, ngöôøi ta thaáy söï thay ñoåi kieåu hình moät phaàn bò kìm haõm bôûi noàng ñoä cuûa caùc aldehyde. Teá baøo sau 6 giôø coù xu höôùng keùo daøi ra hoaëc hình thaønh nhöõng chuoãi ngaén hôn so vôùi teá baøo ban ñaàu, vaø sau 24 giôø noù phoàng to ra vaø coù daïng hình troøn (Zaldivar, 1999). Shahab vaø Hadi (1995) laïi cho raèng furfural ban ñaàu phaûn öùng vôùi caëp base nitô trong chuoãi ADN daãn ñeán söï phaù vôõ thoâng qua söï khöû purin vaø pyridin töï phaùt. Toác ñoä tieâu thuï cô chaát, Qs, ñöôïc theå hieän ôû baûng 19. Ethanol ñöôïc hình thaønh sau 15 giôø. Tuy nhieân noàng ñoä ethanol cuoái cuøng bò giaûm gaàn 19.04% vaø 76.19% neáu söû duïng 0.475 g/l vaø 1.9 g/l furfural theo thöù töï. Moâi tröôøng dinh döôõng nuoâi caáy coù boå sung furfural vaø ñöôïc uû trong 38 giôø. Baûng 19 : Caùc thoâng soá leân men Furfural (g/l) Qs Cô chaát (g /h) Qetoh Saûn phaåm (g /h) Yxs Sinh khoái teá baøo/cô chaát (g/g) Yps Saûn phaåm/ cô chaát (g/g) µ (h/r) 0 0.475 1.9 0.45 0.40 0.17 0.22 0.18 0.05 0.00271 0.00261 0.00226 0.5 0.45 0.3 0.089 0.063 0.024 Söï kìm haõm cuûa furfural leân quaù trình leân men giaûm daàn cuøng vôùi söï gia taêng noàng ñoä sinh khoái teá baøo (Boyer cuøng coäng söï, 1992; Navarro, 1994). Tuy nhieân söï saûn xuaát sinh khoái khoâng bò kìm haõm hoaøn toaøn bôûi noàng ñoä furfural 0.475 g/l vaø 1.9 g/l. Chaát ñoäc naøy aûnh höôûng ñeán pha log cuûa söï sinh tröôûng vi sinh vaät. Toác ñoä taêng tröôûng rieâng (µ) giaûm 29% (w/v) vaø 73% (w/v) neáu söû duïng 0.475 g/l vaø 1.9 g/l furfural theo thöù töï. Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 52 2.10. Aûnh höôûng cuûa thaønh phaàn nitô, kali vaø photpho trong moâi tröôøng dinh döôõng  Noàng ñoä sinh khoái taïo ra thaáp khi haøm löôïng nitô quaù nhieàu. Toác ñoä hình thaønh saûn phaåm trong ñieàu kieän haøm löôïng nitô vöøa ñuû cao hôn trong ñieàu kieän haøm löôïng nitô ñaït quaù möùc.  Caàn taêng haøm löôïng nitô trong moâi tröôøng leân men khi noàng ñoä glucose taêng. Tuy nhieân, söï giôùi haïn veà haøm löôïng nitô trong moâi tröôøng leân men khoâng aûnh höôûng ñaùng keå ñeán hieäu suaát sinh toång hôïp saûn phaåm.  Trong phöông phaùp leân men lieân tuïc, khi toác ñoä pha loaõng taêng daàn, khi gia taêng haøm löôïng nitô seõ daãn ñeán noàng ñoä sinh khoái trong thieát bò leân men cuõng gia taêng, nhöng löôïng sinh khoái taïo ra trong ñieàu kieän tröôøng nitô giôùi haïn ít hôn so vôùi trong ñieàu kieän nitô quaù möùc.  Haøm löôïng nitô vöøa ñuû cho quaù trình leân men phuï thuoäc vaøo toác ñoä pha loaõng vaø phaûi gia taêng toác ñoä pha loaõng thì môùi ñaït muïc tieâu chuyeån hoùa hoaøn toaøn glucose thaønh ethanol. Döôùi ñieàu kieän haøm löôïng nitô quaù möùc, toác ñoä haáp thu rieâng glucose vaø toác ñoä saûn xuaát rieâng ethanol seõ gia taêng thuaän nghòch vôùi toác ñoä pha loaõng.  Haøm löôïng kali : giôùi haïn veà haøm löôïng kali maø Z. mobilis coù theå chòu ñöôïc thì khaù heïp. Cuõng nhö nitô, giôùi haïn veà haøm löôïng kali phuï thuoäc vaøo noàng ñoä glucose trong doøng nhaäp lieäu vaø phaûi gia taêng haøm löôïng kali (trong muoái KCl) khi noàng ñoä glucose taêng. 2.11. Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä ethanol Neáu coù ethanol ban ñaàu trong moâi tröôøng dinh döôõng thì seõ laøm giaûm saûn xuaát sinh khoái, haáp thu cô chaát, saûn xuaát ethanol, hieäu suaát vaø heä soá chuyeån hoùa ñöôøng. Tuy nhieân khoâng aûnh höôûng ñaùng keå ñeán saûn xuaát levan vaø heä soá hieäu suaát sinh khoái (g sinh khoái/ g ñöôøng haáp thu). Cuï theå : Vôùi moâi tröôøng laø sucrose coù 2.5% ethanol ban ñaàu thì hieäu suaát ethanol giaûm 48.8%, hieäu suaát sinh khoái giaûm 25% vaø toång löôïng ñöôøng haáp thu giaûm 28.3%. Vôùi moâi tröôøng laø glucose coù 3% ethanol ban ñaàu thì haáp thu ñöôøng giaûm 60 – 65% (Moreau vaø coäng söï, 1997). Tích luõy ethanol trong quaù trình leân men ñi ñoâi vôùi vieäc giaûm toác ñoä chuyeån hoùa ñöôøng thaønh ethanol bôûi Z. mobilis vaø naám men. Hieän töôïng naøy ñaëc bieät quan troïng trong suoát quaù trình saûn xuaát ethanol thöông maïi vaø gia taêng thôøi gian chuyeån hoùa cô chaát thaønh ethanol vaø giôùi haïn noàng ñoä ethanol cuoái cuøng ñaït ñöôïc. Söï kìm haõm naøy laø do taùc ñoäng tröïc tieáp cuûa ethanol leân caùc enzyme chuû choát cuûa Ñoà aùn chuyeân ngaønh : Leân men ethanol vôùi vi khuaån Zymomonas mobilis GVHD : PGS. TS Leâ Vaên Vieät Maãn SVTH : Vaên Thò AÙnh Minh Trang 53 con ñöôøng ñöôøng phaân vaø saûn xuaát ethanol. Cô cheá kìm haõm coù theå laø öùc cheá ngöôïc (öùc cheá do saûn phaåm cuoái) hoaëc öùc cheá hoaït ñoäng cuûa caùc enzyme. Ethanol gaây ra söï kìm haõm phuï thuoäc vaøo khoái löôïng ñeán quaù trình leân men vôùi möùc kìm haõm coù theå ño ñöôïc ôû noàng ñoä 0.4 M (2%, wt/vol) trong cô theå soáng vaø 3.3 M (15%, wt/vol) trong oáng nghieäm. Söï khaùc nhau naøy ñöôïc giaûi thích laø do noàng ñoä ethanol trong teá baøo cao hôn trong moâi tröôøng. Tuy nhieân maøng teá baøo cuûa Z. mobilis coù theå cho ethanol thaám qua moät caùch deã daøng vaø noàng ñoä ethanol noäi baøo khoâng cao ñeán möùc kìm haõm söï hoaït ñoäng cuûa caùc enzyme. Moät soá caùc yeáu toá khaùc trong moâi tröôøng noäi baøo coù theå laøm gia taêng söï nhaïy caûm cuûa enzyme vôùi ethanol. Söï kìm haõm ethanol laøm cho maøng teá baøo bò roø ræ daãn ñeán keát quaû moät soá cofactor vaø coenzyme bò maát. Boå sung magieâ vaø nucleotide seõ laøm gia taêng toác ñoä leân men khi coù ethanol. Söï roø ræ cuûa ion Mg (phaân töû kích thöôùc nhoû) vaø nucleotide (phaân töû kích thöôùc trung bình) chæ laø moät daáu hieäu cuûa söï gia taêng tính thaám cuûa maøng teá baøo, maø coù theå gaây ra bôûi caùc ion khaùc, caùc cofactor vaø caùc saûn phaåm trung gian cuûa con ñöôøng ñöôøng phaân. Ña soá caùc enzyme trong con ñöôøng Entner-Doudoroff caàn Mg laøm cofactor nhö : glucokinase, glucose-6-photphat, dehydrogenase, phosphoglycerate kinase vaø enolase. Neùt ñaëc hieäu cuûa ion kim loaïi cho söï baûo veä vaø söûa chöõa söï kìm haõm bôûi ethanol thì cuõng töông töï nhö neùt ñaëc hieäu cuûa ion kim loaïi cho nhöõng enzyme naøy, coù nghóa laø khoâng theå thay theá ion Mg bôûi ion khaùc nhö ion canxi. Vì theá söï roø ræ ion Mg seõ gaây kìm haõm quaù trình leân men. Khoâng gioáng nhö S. cerevisiae, alcohol dehydrogenase cuûa Z. mobilis khoâng caàn Mg. Caùc cofactor kim loaïi khaùc caàn cho söï leân men