Đề tài Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang

CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU 1 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang CHÖÔNG 1 MÔÛ ÑAÀU 1.1 GIÔÙI THIEÄU CHUNG Söï ra ñôøi “Etude sur le vin” cuûa L.Pasteur ñaõ khi eán haàu heát caù c nhaø l aøm röôïu vang vaøo cuoái theá kyû XIX ñeàu tin raèng söï coù maët cuûa vi khuaån lactic trong röôïu la ø moät trong nhöõng nhaân toá baát lôïi cho quaù trình saûn xuaát vaø aûnh höôûng khoân g toát ñeán chaát löôïng saûn phaåm. Song, vaøo nhöõng naêm 2 0 cuûa theá k yû XX, nghieân cöùu cuûa 2 taùc giaû Ferre ù vaø Ribeùreau (1920) treân hai loaïi röôïu vang ñoû Burgundy vaø Boudea ux ñaõ chöùng minh ñöôïc raèng vai troø raát quan troïng cuûa quaù trình chuyeån hoùa acid malic trong saûn xuaát röôïu vang. Nhôø ñoù maø quaù trình leân men malolactic ñaõ ñöô ïc con ngöôøi chaáp nhaän vaø khuyeán khích söû duïng nhö moät quaù trình leân men phuï xaûy ra trong rö ôïu vang nhaèm muïc ñích chuyeån hoùa acid malic c où trong vang nho, ñaë c bieät laø ñoái vôùi vang ñoû. Quaù trình naøy goùp phaàn laøm giaûm vò chua gaét cuûa acid malic, giuùp caûi thieän höông vaø ñaûm baûo ñoä beàn veà m aët vi sinh cho saûn phaåm röôïu vang. Sau ñoù, moät loaït caùc noå l öïc tìm kieám caùc taùc nhaân gaây ra quaù trình leân men malolactic ñöôïc tieán haønh. Ngöôøi ta thaáy raèng, dòch nho vaø vang laø moät mo âi tröôøng m ang tính choïn loïc ñoái vôùi moät vaøi loaøi vi khuaån lactic. Nhöõng loaøi naøy hieän nay ñaõ ñöôïc bieát ñeán töông ñoái chính xaùc (Lafon-Lafourcade and Joyeux, 1979). Trong moät vaøi nghieân cöùu treân dòch nöôùc nho, caùc taùc giaû Fendant vaø Doâle; Maret vaø Sozzi (1977, 1979); Marel vaø coäng söï (1979) ñaõ ghi nhaän laïi söï co ù maët cuûa caùc lo aøi vi khuaån lactic leân men ñoàng hình thuoäc gioáng Lactobacillus (Lb. plantarum, Lb. casei) trong dòch nho. Trong suoát giai ñoaïn leân men ethanol, nhöõng loaøi naøy bò bieán maát cuøng vôùi caùc loaøi leân me n lactic dò hình (Lb. hilgardii, Lb. brevis). Caùc loaøi vi khuaån lactic coù trong canh tröôøng luùc naøy haàu heát ñeàu thuoäc gioáng Pediococcus (P. cerevisiae, P. pentosaceus) vaø moät loaøi trong gioáng Leuconostoc (Leuconostoc oenos). Nhö vaäy, nhöõng vi khuaån lactic ñoàng hình thuoäc gioáng Lactobacillus coù maët chuû yeáu trong dòch nho seõ bò tieâu d ieät raát nhanh sau khi baét ñaàu quaù trình leân m en röôïu vaø ñöôïc thay theá bôûi loaøi Leuconostoc oenos ôû giai ñoaïn cuoái CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU 2 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang cuûa quaù trình naøy. Ñoái vôùi vang Bordeaux vaø C harentes (Phaùp), Leuconostoc oenos naøy ñöôïc xem nhö laø taùc nhaân chính gaây leân men malolactic. Trong khi ñoái vôùi röôïu vang cuûa Ñöùc (Benda, 1982) vaø Australia (Pan vaø coäng söï, 1980) thì Pediococcus laïi chieám öu theá hôn. Söï khaùc bieät naøy ñöôïc taïo neân do nhieàu nguyeân nhaân khaùc nhau, chuû yeáu laø do tính chaát cuûa moãi loaïi vang nhö söï ña daïng veà thaønh phaàn, pH; khí haäu; cheá ñoä troàng vaø baûo quaûn nho nguyeân lieäu. Trong moät khoaûng thôøi gian daøi sau ñoù, con ngö ôøi ñaõ coá ga éng thuùc ña åy quaù trình leân men malolactic baèng nhieàu caù ch khaùc nhau, keå caû vieäc caáy gioáng vi khuaån lactic thuaàn khieát vaøo dòch nho vaø vang. Nhöng cho ñeán 1983, moät vaán ñeà caàn giaûi quyeát nhö löôïng sinh khoái cho vaøo canh tröôøng ñuû cho quaù trình leân men vaø ñaït ñöôïc chaát löôïng mong muoán cuõng nhö traïng thaùi sinh lyù cuû a vi khuaån trong ca nh tröôøng cuõng vaãn chö a ñöôïc bieát ñeán moät caùch roõ raøng. Veà sau, khi nghieân cöùu thöïc hieän quaù trình leân men malolatic trong phoøng thí nghieäm baèng caùch caáy gioán g vi khuaån töø beân ngoaøi vaøo, ñaëc bieät gaàn ñaây caù c nhaø saûn xuaát thöôøng söû duïng caùc cheá phaåm vi khuaån Leuconostoc oenos ñaõ qua saáy thaêng hoa, ngöôøi ta nhaän thaáy raèng loaøi naøy coù khaû naêng choáng chòu raát toát trong moâi tröôøng coù pH thaáp (pH 3,2), noàng ñoä ethanol cao (12%) vaø haøm löôïng SO2 laø 13 mg/L. Tuy nhieân, khi aùp duïng tröïc tieáp vaøo thöïc teá saûn xuaát thì keát quaû ñaït ñöôïc khoâng toát, khoaûng 90% löôïng gioáng caáy ban ñaàu bò cheát khi cho vaøo vang ñoû vaø thaäm chí nhieàu hôn ôû vang traéng. Do ñoù, ngöôøi ta ñaõ ñöa ra giaûi phaùp khaéc phuïc nhö sau: tröôùc khi söû duïng, caàn taùi hoaï t hoùa caùc teá baøo (reactivate) baèng c aùch cho chuùng vaøo moät moâi tröôøng thuaän lôïi ñeå coù theå ñaït ñöôïc traïng thaùi sinh lyù thích nghi cao hôn, taêng khaû naêng choáng chòu hôn vôùi moâi tröôøng nöôùc nho sau quaù trình leân men ethanol. Keát quaû ñaït ñöôïc theo phöông aùn naøy laø raát toát, khaû naêng s oáng soùt cuûa nhöõng chuûng taùi hoaït hoùa naøy r aát ca o. Moät khoù khaên khaùc tron g tieán trình nghieân cöùu vaø vaãn ñang laø vaán ñeà gaây tranh caõi laø vieäc xaùc ñònh thôøi ñieåm tieán haønh caáy gioáng vaøo canh tröôøng. Nhieàu taùc giaû nhö Kunkee vaø coäng söï (1967) ñaõ ñeà nghò caáy gioáng trong giai ñoaïn leân men röôïu. Moät soá khaùc laïi cho raèng thôøi ñieåm thích hôïp hôn ñeå caáy gi oáng laø tröô ùc hoaëc sau k hi leân men röôïu (Gallan der, 1979). Ribe ùreau- Gayon vaø coäng söï (1975) laïi ñeà nghò khoâng neân ñöa gioáng caáy vaøo thôøi ñieåm tröôùc khi löôïng ñöôøng hoaøn toaøn caïn kieä t. Töø nhöõng thaønh quaû ñaït ñöôïc, con ngöôøi vaãn ñang tieáp tuïc tìm toøi vaø khaùm phaù nhöõng giaûi phaùp môùi veà maët coân g n gheä ñeå hoaøn thieän vaø naâ ng cao hieäu qua û qu aù trình leân men malolactic bao go àm: CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU 3 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang
Vieäc nghieân cöùu öùng duï ng vi khuaån lactic coá ñònh ñeå chuyeån hoùa acid malic thaønh acid lactic trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy tónh (Spettoli vaø coäng söï, 1982), nuoâi caáy lieân tuïc (Cuenat vaø Villettaz, 1984), keå caû vieäc vieäc so saùnh naêng löïc chuyeån hoùa acid malic cuûa caùc chuûng nuoâi caáy khaùc nhau (Naouri vaø coäng söï, 1991).
Vaán ñeà chuyeån hoùa acid malic bôûi enzyme malo la ctic coá ñònh (EC 1.1.1.38 ) cuõng ñöôïc ñe à caäp ñeán raát nhieàu nhöng keát quaû nghieân cöùu khi söû duïng enzyme coá ñò nh treân gel haàu nhö khoâng thaønh coâng ( S. Gestrelius, 1982). Noùi toùm laïi, leân men ma l olactic laø moät quaù trình ñoùng moät vai troø quan tr oïng trong saûn xuaát röôïu vang, beân caïnh quaù trình leân men chính ñöôïc thöïc hieän bôûi naám men ñeå taïo neân chaát löôïng cho saûn phaåm thì quaù trình leân men malolactic ñoùng moät vai troø khoâng theå thieáu trong vieäc laøm bieán ñoåi caùc thaønh phaàn hoaù hoïc, goùp phaàn caûi thieän chaát löôïng veà maët giaù trò caûm quan cuûa saûn phaåm, mang laïi cho röôïu vang nhöõng höông vò ñaëc tröng. Vieäc tìm kieám nhöõng nhöõng giaûi phaùp ky õ thuaä t öùng duïng cho quaù trìn h naøy ñaõ ñöôï c con ngöôøi nghieân cöùu töø raát laâu vaø vaãn ñang ñöôïc tieáp tuïc. Nhöng ñeán nay, nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc cuõng chæ mang yù nghóa veà maët hoïc thuaät vaø chöa ñ öôïc aùp du ïng roäng raõi tro ng thöïc teá saûn xuaát. 1.2 KHAÙI NIEÄM CÔ BAÛN VEÀ QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 1.2.1 Ñònh nghóa Leân men malolactic (ML) laø moät quaù trình chuyeån hoaù L-malic acid (chöùa 2 nhoùm carboxyl trong phaân töû) thaønh L- hoaëc D-acid lactic (chæ chöùa moät nhoùm carboxyl) vaø carbon dioxide ñöôïc thöïc hieän bôûi caùc gioáng vi khuaån lactic bao goàm Lactobacillus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Ñaây thöïc c haát laø mo ät qua ù trình dò hoaù acid malic, khi ñoù L-malic ñöôïc decarbox yl hoaù thaønh L-lactic acid bôûi xuùc taùc laø enzyme malate carboxylase (EC1 .1.1.38). Quaù trình naøy xaûy ra beân trong teá baøo t heo phaûn öùng sau: Moät soá taùc giaû (Margalit, 1997) cho raèng ñaây thöïc chaát chæ laø moät phaûn öùng hoaù sinh vì quaù trình naøy ñôn giaûn chæ coù söï tham gia cuûa moät enzyme - xuùc taùc cho phaûn öùng taùch nhoùm CO2 cuûa cô chaát laø acid malic thaønh acid lactic. Keát quaû cuûa phaûn öùng naøy l aø vôùi moãi 1 gam acid CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU 4 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang malic seõ taïo thaønh ñöôïc 0,67 gam acid lactic vaø 0,33 gam CO2 nhöng laïi khoâng sinh ra naêng löôïng döôùi da ïng ATP maø teá ba øo coù theå söû duïng ñö ôïc. Tuy nhieân, neáu xeùt veà yù nghóa cuûa bieán ñoåi treân ñoái vôùi söï trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lactic thì chuùng ta coù theå xem ñaây laø mo ät quaù trình leân men bôûi vì nguyeân nhaân sau: cuõng gioáng nhö nhöõng quaù trình leân men thoâng thöôøng, muïc ñích cuûa vi sinh vaät thöïc hieän caùc chuyeån hoaù cô chaát cuõng chæ phuïc vuï c ho nhu caàu veà maët naêng löôïng ñe å chuùng coù theå sinh tröôûng vaø phaùt trieån (xem chi tieát ôû phaàn 2.1.2.2). Quaù trình leân men malolactic xaûy ra beân trong teá baøo cuõng coù yù nghóa töông töï. Khi thöïc hieän phaûn öùng treân, chaát cho ñieän töû chính laø acid malic co øn chaát nhaän ñieän töû cuõng chính laø NAD+ ñeå chuyeån thaønh NADH+H+ vaø chaát naøy seõ tham gia vaøo caùc chu trình sinh hoaù trong cô theå sinh vaät ñeå saûn sinh ra naêng löôïng cung c aáp cho teá baøo. Ngoaøi ra, cuõn g theo taùc giaû Margalit (1997), trong quaù trình leân men malolactic, vi khuaån lactic coù theå söû du ïng 3 c on ñöôøng khaùc nhau ñe å c huyeån hoaù acid malic:
Con ñöôøng chuyeån hoùa t röïc tieáp L-acid ma lic thaø nh L-acid lactic vaø carbo n dioxide nhôø enzyme malate car boxyla se. Cô cheá naøy coù m aët ôû haàu heát vi khuaån malolac tic.
Con ñöôøng thöù hai lieân quan ñeán vieäc phaân giaûi acid malic nhôø xuùc taùc c uûa heä “enzyme malic” thaønh oxaloace tate vaø tieáp tuïc thaønh acid pyruvic vaø CO2. L-lactate dehydrogenase, sau ñoù, seõ xuùc taùc cho phaûn öùng khöû acid pyruvic thaønh L-acid lactic. Cô cheá naøy ñöôïc tìm thaáy ô û Lactobacillus casei vaø Lactobacillus faecalis.
Con ñöôøng thöù ba laø ñöôïc tìm thaáy ôû Lactobacillus fermentum. Vi khuaån naøy coù khaû naêng chuyeån hoùa L-acid malic thaønh acid lactic ôû caû hai daïng ñoàng phaân L- vaø D-. Ngoaøi ra, coøn coù moät soá saûn phaåm trao ñoåi chaát trung gian nhö acetate, succinate vaø carbon dioxide. 1.2.2 Vò trí cuûa leân men malolactic trong quy trình saûn xuaát röôïu vang Trong coâng nghieäp saûn x uaát röôïu vang, quaù trình leân men mal olactic ñöôïc tieán haønh sau khi leân men chính, dòch leân men thu ñöôïc goïi l aø “vang non” ñöô ïc tieán haønh laéng gaïn caën vaø CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU 5 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang ñöôïc chuyeån sang boàn hay noài leân men tieáp theo. Quaù trình naøy dieãn ra raát chaäm nhaèm ñeå phaân giaûi nhöõng gam ñöôøng cuoái cuøng, song song vôùi quaù trình naøy laø vi khuaån lactic seõ phaân giaûi acid malic thaønh acid lactic laøm cho vang ñöôïc chuyeån töø vò chua gaét sang vò chua nheï deã chòu, CO2 coøn ñöôïc tieáp tuïc giaûi phoùng nhöng coù xu höôùng giaûm daàn, höông vò röôïu vang cuõng ñöôïc hoaøn thieän. Dung dòch leân men ôû traïng thaùi tónh laëng, xaùc naám men laéng xuoáng ñaùy boàn hay noài leân men. Tieáp theo, dòch vang ñöôïc tieán haønh laéng gaïn tieáp vaøi laàn, moãi laàn töø 20 ñeán 30 ngaøy ñeå oån ñònh thaøn h phaàn cuûa röôïu vang roài tieáp tuïc ñeán quaù trình uû chín. 1.3 MUÏC ÑÍCH VAØ ÖÙNG DUÏNG 1.3.1 Muïc ñích Leân men malolactic laø m oät quaù trình raát quan troï ng trong saûn xuaát c aùc lo aï i vang ñoû hoaëc caùc loaïi röôïu vang coù ñoä chu a cao ñöôïc saûn xuaát töø nhöõng gioáng nho troàng ôû caùc vuøng khí haäu laïnh. Quaù trình naøy hoaøn toaøn khoâng gaây nguy hieåm ñoái vôùi chaát löôïng vang vì trong quaù trình leân men vi khuaån lactic chæ söû duïng acid malic laø c hính maø khoâng taùc ñoäng gì tôùi ca ùc caáu töû va ø thaønh phaàn khaùc coù trong vang. E. Peymand ñaõ xeáp möùc ñoä nguy hieåm cho chaát löôïng röôïu vang do taùc ñoäng cuûa vi khuaån lactic theo chieàu t aêng daàn le ân nhö sau:
Leân men ñöôøng arabinose, acid citric vaø ñöôøng xylose taïo thaønh moät löôïng khoâng lôùn laém caùc acid bay hôi vaø l aøm giaûm chaát löôïng vang khoâng ña ùng keå.
Leân men acid tartaric, glycerin, glucose, fru ctose laøm thay ñoåi khaù roõ ca ù c hôïp phaàn coù trong vang vaø laøm giaûm chaát löôïng cu ûa vang. Möùc ñoä gaây xaáu hay aûnh höôûng khoâng toát chaát löôïng röôïu vang phuï thuoäc vaøo ñaëc tính cuûa chuûng vi khuaån lactic vaø ñaëc ñieåm cuûa vang. Quaù trình leân men malolactic coù ba yù nghóa qu an troïng trong saûn xuaát röô ï u vang: 1- Laøm giaûm ñoä acid cuûa dòch vang sau leân men Tröôùc heát, veà maët hoaù hoïc, quaù trình leân men ML laøm cho pH cuûa moâi tröôøng leân men taêng leân khoaûng 0,1 ñeán 0,3 ñôn vò vaø laøm giaûm ñoä acid toång (titratable acidity) xuoáng khoaûng 0,01 ñeán 0,03 g/L (tính theo acid tartaric) bôûi quaù trình decarboxyl hoaù moät goác acid vaø chuyeån acid malic thaønh acid lactic coù ñoä acid yeáu hôn. Tuy nhieân, khoâng phaûi taát caû acid malic ñeàu ñöôïc chuyeån hoaù hoaøn toaøn thaønh acid lactic maø chæ khoaûng 2/3 haøm löôïng cuûa chuùng ñöôïc chuyeån CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU 6 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang hoaù thaønh acid lactic. P haàn coøn laïi co ù theå bò phaân giaûi hoaëc oxi hoaù thaø nh CO2 vaø thoaùt khoûi dòch leân men. 2- Ñieàu chænh höông vò ñaëc tröng cho vang Söï chuyeån hoaù acid mali c thöôøng ñi keøm vôùi quaù trình leân men caùc loaïi ñö ôøng coøn laïi ñeå taïo ra raát nhieàu saûn phaåm laø nhöõng hôïp chaát deã ba y hôi nhö alcetaldehyde, diacetyl, acetoin, acetic acid, 2,3-butadiol, ethyl lactate vaø caùc röôïu baäc cao... Taát caû caùc hôïp chaát naøy taïo neân moät toå hôïp caùc höông vò ñaë c trö ng goùp phaàn laøm taêng p haåm chaát cuûa röôïu vang thaønh phaåm. 3- Laøm oån ñònh veà maët vi sinh cho röôïu vang thaønh phaåm Cuoái cuøng, veà maët baûo quaûn, quaù trình leân men malolactic goùp phaàn taïo neân tính oån ñònh veà chaát löôïng caûm quan vaø vi sinh. Ñieàu naøy coù nghóa laø söï hieän dieän cuûa quaù trình leân men malolactic coù khaû naêng öùc cheá söï sinh tröôûng cuû a caùc vi sinh vaät khaùc. S öï öùc cheá naøy ñöôïc giaûi thích bôûi 3 nguyeân nhaân :
Moät soá vi khuaån khoâng mong muoán coù khaû naên g söû duïng acid malic laø m nguoàn chaát dinh döôõng. Vì theá, vieäc giaûm haøm löôïng acid malic trong dòch leân men seõ mang laïi keát quaû toát ñe å giaûm thieåu ruûi ro veà maët vi sinh.
Vi khuaån malolactic sinh tröôûng tröôùc trong moâi tröôøng pH thaáp vaø chuùng söû duïng caùc chaát dinh döôõng nhö (amino acid, caùc base nitô, vitamin) laøm cho moâi tröôøng ngaøy caøng ngheøo naøn nhöõng chaát naøy. Töø ñoù giôùi haïn ñöôïc söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa nhöõng vi khuaån khaùc.
Moät soá vi khuaån malolactic coù theå saûn sinh ra ñoäc toá (bacteriocins) coù t heå öùc cheá sinh tröôûng cuûa nhöõng vi sinh vaät khaùc maø khoâng gaâ y aûnh höôûng gì veà maët c aûm quan vaø söùc khoûe con ngöôøi. Ngöôøi ta nhaän thaáy raèng ôû nhöõng loaïi röôïu vang khoâng coù quaù trình leân men malolactic hay quaù trình naøy khoâng ñöôïc kieåm soaùt chaët cheõ thì sau moät thôøi gian ñoùng chai vaø baûo quaûn thöôøng xaûy ra hieän töôïng bò ñuïc dòch vang hay ñoâi khi hình thaønh neân caën laéng hay suûi boït nheï coù khi keøm theo muøi laï gaàn gioáng vôùi muøi cuûa moùn döa caûi baép truyeàn thoáng cuûa Ñöùc (sauerkraut). Duø ít hay n hieàu thì ñieàu naøy cuõng laø m aûnh höôûng ñaùng keå ñeá n chaát löôïng cuûa röôïu vang thaønh phaåm. Vì vaäy, neáu quaù trình leân men malolactic ñöôïc thöïc hieän moät caùch coù kieåm soaùt thì nhöõng ruûi ro naøy coù theå ñöôï c loaïi tröø. CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU 7 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 1.3.2 Phaïm vi öùng duïng Hieän nay, quaù trình leân men malolactic ñöôï c x em nhö laø moät giaûi phaù p coâng ngheä quan troïng nhaèm caûi thieän chaát löôïng cuûa röôïu vang ñoû vaø moät soá röôïu röôïu vang traéng (ôû moät soá vuøng nhö Switzerland, Burgundy). Ngöôøi ta nhaän thaáy raèng haàu heát caùc loaïi vang ñoû vaø khoaûng 20% röôïu vang traéng treâ n theá giôùi ñeàu phaûi traûi qua quaù trình leân men naø y. Ñöùng treân phöông dieän thaønh phaàn hoaù hoïc, leân men malolactic chæ thích hôïp cho saûn xuaát caùc loaïi röôïu vang coù ñoä pH thaáp, töùc laø coù haøm löôïng acid cao. Haàu heát caùc röôïu vang ñoû (red wine) treân theá giôùi ñeàu ñöôïc saûn xuaát thoâng qua quaù trình leân men malolactic. Ví duï nhö caùc loaïi röôïu vang ñoû: Pinot Noir, Merlot vaø Cabernet ñeàu ñöôïc tieán haønh leân men malolactic gaàn nhö hoaøn toaøn. Quaù trình leân men malolactic xa û y ra haàu heát ô û vang ñoû bôûi vì ôû caùc vang naø y coù haøm löôïng a cid malic k haù cao. Acid ma lic coù theå bò phaân gia ûi bôûi vi khuaån lactic thaønh acid lactic laøm giaûm vò chua gaét khoù chòu cho vang. Haøm löôïng acid malic tr ong nho coøn tuyø thuoäc vaøo gioáng nho, ñieàu kieän troàng troït vaø thôøi tieát. Ñoái vôùi nhöõng loaïi röôïu vang ñöôïc saûn xuaát ôû vuøng coù khí haäu laïnh, ñaë c bieät laø Ñöùc, Phaùp vaø m ieàn ñoâng nöôùc Myõ, thöôø ng coù haøm löôïng acid malic khaù cao neân c aàn t höïc hieän quaù trình leân men malolactic. ÔÛ vuøng coù khí haäu aám aùp hôn thì ngöôïc laïi. Haàu nhö haøm löôïng a cid malic c uûa nho seõ giaûm cuøng vôù i quaù trình chín, do ño ù neáu söû duïng loaïi nho naøy ñeå leân men malolactic thì khoâng thích hôïp do hieäu quaû cuûa quaù trình laøm giaûm ñoä chua khoâng ñaùng keå ù maø theâm vaøo ñoù nhöõng chæ tieâu veà caûm quan mong muoán cuõng khoù co ù theå ñaït ñöôï c (Davis vaø coäng söï 1985 ; Henick-Kling, 1993). Ñoái vôùi vang traéng, tröø tröôøng hôïp ngoaïi leä laø vang ñi töø gioáng nho Pinot Chardonnay vaø vang saûn xuaát taïi Champagne, caùc nhaø saûn xuaát röôïu vang ñeàu cho raèng caùc loaïi vang naøy ñeàu khoâng thích hôïp ñeå le ân men malolactic (theo Ri beùreau-Gayon vaø co âng s öï, 1975). Va án ñeà quan troïng ñaàu tieân la ø do haøm löôïng acid tartaric coù tr ong nho nguyeân lieäu thöôøng cao hôn raát nhieàu so vôùi haøm löôïng acid malic vaø do ñoù, coù theå d aãn ñeán pH thaáp nhöng khoâng theå kích thích vi khuaån lactic leân men. Ñeå ngaên chaën vaø öùc cheá quaù trình leân men malolactic xaûy ra, ngöôøi ta thöôøng sulfite hoaù hoaëc l aøm laïnh dòch leân men sau giai ñoaïn leân men chính. Ngoaøi ra, moät soá loaïi röôïu vang ñöôïc saûn xuaát töø caùc loaïi traùi caây khaùc ngoaøi nho nhö quaû maâm xoâi (blackberr y) ha y quaû anh ñaøo (cherry) t hì khoâng caàn thieát thöïc hieän quaù trình leân men malolactic. Ngöôøi ta cho raèng, ñieàu quan troïng nhaát trong vieäc saûn xuaát caùc loaïi röôïu vang naøy ôû choã höông vò traùi caây (fr uitiness) raát ñaëc tröng c uûa chuùng. Qua ù trình leân men malolactic coù theå laøm giaûm ñi nhöõng höô ng vò ñaëc tröng naøy. Vì vaäy, khi saûn xuaát caùc loaï i röôïu vang daïng naøy caàn neân traùnh quaù trình leân men malolactic. CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 8 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang CHÖÔNG 2 TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 2.1. VI KHUAÅN LEÂN MEN MALOLACTIC 2.1.1 Phaân loaïi vaø hình thaùi vi khuaån malolactic Thuaät ngöõ “vi khuaån malolactic” (malo lactic ba cteria) ñöôïc duøng ñeå ch æ nhöõng gioáng vi khuaån coù khaû naêng leân men ñöôïc acid malic trong röôïu vang thaønh acid lactic. Coù 4 gioáng vi khuaån lactic raát quan troï ng trong saûn xuaát röôïu v ang: Lactobacillus, Oenococcus, Pediococcus, Leuconostoc. Oenococcus Pediococcus Lactobacillus Hình 2.1 Caùc gioáng vi k huaån leân men malolactic 1- Lactobaccilus. Caùc tröïc khuaån thuoäc gioáng Lactobacillus ñeàu laø vi khuaån gram döông. Chuùng thöôøng coù daïng hình que daøi hoaëc cuõng coù theå laø ngaén ga à n nhö hình caàu. Ñöôøng kính khoaûng 0,5 ÷ 0,7 µm vaø chieàu d aøi coù theå leâ n ñeán 8µm. Chuùng ñöùng rieâng leû, keát ñoâi hoaëc keá t thaønh chuoãi. Coù nhieàu loaøi trong Lactobacillus ñöôïc tìm thaáy trong vang, ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm: leân men lactic ñoàng hình vaø dò hình tuyø thuoäc vaøo khaû naêng leân men ñöôøng hexose vaø pentose. Caùc CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 9 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang loaøi leân men lactic ñoàng hình ñöôïc lieät keâ trong baûng 2.1 chæ taïo ra ñöôïc acid lactic töø ñöôøng. Nhöõng loaøi vi khuaån lactic dò hình ñöôïc lieät keâ trong baûng ñeàu laø nhöõng l oaøi dò hình baét buoäc, nghóa laø leân men ñöôøng taïo saûn phaåm laø acid lactic, chuùng coøn coù khaû naêng taïo ra nhieàu saûn phaåm nhö acid acetic, acid succinic, ethanol, carbon dioxide... pH hoaït ñoäng toái thích cho caùc tröïc khuaån Lactobacillus laø 5,5 ÷ 5,8. Chuùng khoâng theå sinh tröôûng ñöôïc tr ong moâi tröôøng co ù pH thaáp hôn 3,5. Baûng 2.1 Vi khuaån Lactobacillus leân men ñoàng hình vaø dò hình thöôøng gaëp trong röôïu vang Leân men ñoàng hình ñöôøng hexose Leân men dò hình ñöôøng hexose L. bavaricus L. casei L. homohoichii L. curvatus L. saki L. plantarum L. fermentum L. brevis L. buchneri L. fructovorans L. hilgardii 2- Pediococcus Thuoäc gioáng naøy laø caùc vi khuaån hình caàu, gram döông, khoâng sinh baøo töû, khoâng chuyeån ñoäng, ñöùng rieâng leû hoaë c keát ñoâi, keát ba, ke át boá n hoaëc keát thaønh chuøm, ñoâi khi thaønh chuoãi. Chuùng coù theå laø theå kò k hí hoaëc vi hieáu khí. Taát caû caùc loaøi vi khuaån lacti c thuoäc gioáng naøy ñeàu leân men lactic ñoàng hình, nghóa laø chuùng chæ coù theå leân men ñöôøng thaønh acid lactic. Khaùc vôùi caùc vi khuaån gram döông ñieån hình, chuùng khoâng chöùa acid teichoic trong thaønh teá baøo. Coù 4 loaøi Pediococcus coù khaû naêng phaùt trieån ôû pH 4,2 hoaëc thaáp hôn thöôøng gaëp trong röôïu vang laø: P. damnosus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. acidilactici. 3- Leuconostoc vaø Oenococcus Taát caû caùc vi khuaån Leuconostoc ñeàu leân men dò hình, caùc teá baøo thuoäc caùc gioáng naøy coù hình caàu hay hình tröùng daøi, ñöùng rieâng leû, keát ñ oâi hoaëc taïo thaønh chuoãi ngaén, coù khaû naên g taïo NH3 töø asparagin vaø khoâng coù enzyme catalase. Vieäc nghieân cöùu nuoâi caáy gioáng vi khuaån naøy raát khoù khaên vì chuùng ñ oøi hoûi moâi tröôøng nuoâi c aáy caàn vaøi chaát dinh döôõ ng ñaëc bieät nhö β-D- glucopyranosyl-D-pantothenic, nguoàn acid beùo söû duïng laø Tween 80 vaø chaát öùc cheá naám men cycloheximide. Ngöôøi ta coù theå nuoâi caáy chuùng trong dòch eùp caø chua, taùo hoaëc nho. Tuy nhieân, keát quaû nghieân cöùu cho thaáy raèng chæ coù mo ät loaøi cuûa Leuconostoc ñöôïc tìm thaáy vaø phaân laäp töø CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 10 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang vang nho, ñoù laø Leuconostoc oenos. Loaøi naøy coù ñaëc ñieåm hoaøn toaøn khaùc vôùi nhöõng loaøi vi khuaån khaùc thuoäc nhoùm naøy laø chuù ng coù theå phaùt trieån ôû noàng ñoä ethanol cao (>1 0%) vaø pH thaáp (<4,2). Do ñoù, vaøo naêm 1995 moät soá nhaø phaân loaïi vi sinh vaät hoïc ñaõ ñeà xuaát vaø ñaët vôùi teân môùi laø Oenoccocus oeni. Cho ñeán nay, caùch phaâ n loaïi naøy ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc chaáp nhaän vaø Oenoccocus oeni ñaõ trôû thaønh caùi teân chính thöùc cho loaøi vi khuaån naø y. Trong soá caùc gioán g vi khuaån keå treân, qu a raát nhi eàu nghieân cöùu ngöôøi ta t haáy raèng vi khuaån Oenococcus oeni laø loaøi coù khaû naêng sinh tröôûng maïnh meõ nhaát (chòu ñöïng vaø thích nghi toát nhaát trong moâi tröôøng röôïu vang). Ñoàng thôøi chuùng coøn coù khaû naêng caûi thieän höông vaø vò laøm taêng chaát löôïng cho saûn phaåm. Caùc chuûng vi khuaån coøn laïi tuy vaãn coù khaû naêng chuyeån hoùa acid malic laø giaûm vò chua cho röôïu vang nhöng c huùng khoâng coù khaû naên g ñieàu chænh höông vò (off-f lavour), thaäm chí coù theå laø nguyeân nhaân gaây ra caùc bieán ñoåi khoâng mong muoán trong giai ñoaïn taøng tröõ vaø baûo quaû n saûn phaåm. Vì theá, trong coâng nghieäp saûn xuaát röôïu vang Oenococcus oeni laø loaøi mang laïi nhieàu ñaëc tính mong muoán nhaát cho chaát löôïng röôïu vang vaø ñöôïc nhieàu nhaø saûn xuaát öu tieân löïa choïn. 2.1.2 Ñaëc ñieåm sinh lyù cuûa Oenococcus oeni 2.1.2.1 Nhu caàu veà chaát dinh döôõng 1- Nguoàn carbon Carbohydrate
Monosaccharide: pentose vaø hexose Con ñöôøng trao ñoåi caùc loaïi ñöôøng cuûa vi khuaån malolactic chöa ñöôïc gi aûi thích moät caùch ñaày ñuû, ñaëc bieät laø ñoái v ôùi chuûng oenococci (Gravie 1986). Tuy nhieân, ngöôøi ta coù theå döï ñoaùn raèng vi khuaån malolactic coù theå chuyeån hoùa ñöôøng theo caùc con ñöôøng töông töï nhö nhöõng vi khuaån leân men dò hình khaùc. Hình 2.2 Vi khuaån Oenococcus oeni CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 11 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Hình 2.3 Sô ñoà toùm taét caùc con ñöôøng trao ñoåi c haát ôû vi khuaån malolactic Ñöôøng pentose Vieäc chuyeån hoùa ñöôøng pentose (arabinose, ribose, xylose) ñöôïc thöïc hieän thoâng qua con ñöôøng pentose phosphate (Hình 2.4). Töø moät phaân töû ñöôøng ban ñaàu co ù theå chuyeån thaønh moät phaân töû acid pyruvic hoaëc acetyl phosphate; pyruvate bieán moät phaàn thaønh aldehyde acetic vaø CO2; acetyl phosphate coù theå bieán ñoåi thaønh acetate vaø ATP hoaëc bò khöû thaønh ethanol. Nhö vaäy, cöù moãi mol ñöôøng pent ose söû duïng seõ hình thaønh ñöôïc 1 mol lactate, 1 mol acetate vaø 2 mol ATP. Ñöôøng hexose Khaùc vôùi vi khuaån leân men lactic ñoàng hình, caùc vi khuaån thuoäc gioáng Oenococcus thuoäc loaïi leân men dò hình neân quy luaät chuyeån hoùa ñöôøng hexose cuûa chuùng chuû yeáu thoâng qua con ñöôøng phosphoketolase ñeå hình thaønh neân 1 mol lactate, 1 mol ethanol, 1 mol CO2, 1 mol ATP töø moät mol ñöô øng hexose. CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 12 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Hình 2.4 Sô ñoà toùm taét con ñöôøng pentose phosphate - Ñoái vôùi glucose So vôùi caùc loaïi ñöôøng khaùc, glucose laø cô chaát ñöôïc vi khuaån malolatic söû duïng nhieàu hôn caû. Glucose coù theå tham gia tröïc tieáp vaøo caùc chu trình nhö:
Con ñöôøng ñöôøng phaân: taïo thaønh 2 phaân töû acid pyruvic vaø 2 ATP.
Con ñöôøng pentose phosphate: taïo thaønh acid lactic, CO2 vaø acid acetic (hoaëc ethanol) vaø ATP.
Con ñöôøng phosphoketolase: taïo thaønh acid lactic, ethanol, CO2 vaø ATP. - Ñoái vôùi fructose Ô Û vi khuaån Oenococcus oeni, coù 2 con ñöôøng trao ñoåi fructose: leân men lactic dò hình (heterolactic fermentation) vaø leân men keát hôïp: dò hình/mannitol (mixed heterolactic/mannitol fermentation) (Richter vaø coäng söï 2003). Trong ñoù, ôû con ñöôøng thöù nhaát, vi khuaån naøy söû duïng fructose nhö nguoàn cô chaát tham gia vaøo con ñöôøng ñöôøng phaân bìn h thöôøng (con ñöôøng EMP). Ngöôïc laïi, ôû con ñöôøng thöù hai (chuû yeáu laø con ñöôøng mannitol) thì fructose ñoùng vai troø laø chaát nhaän ñieän töû cuoái cuøng vaø bò khöû thaønh m annitol (xem hình 2.6) CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 13 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Hình 2.5 Con ñöôøng E MP chuyeån hoùa glucose t haønh acid pyruvic CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 14 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Baûng 2.2 Caùc enzyme t ham gia vaøo quaù trình trao ñoåi ñöôøng ôû Leuconostoc oenos (Veiga-Da-Cunha vaø coän g söï, 1993) Hình 2.6 Sô ñoà mo ät soá con ñöôøng chuyeån hoùa gl ucose vaø fructose ôû vi khuaån L. oenos CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 15 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang
Disaccharide: trehalose vaø saccharose Söï chuyeån hoùa caùc disac charide hieän nay vaãn chöa ñöôïc nghieân cöùu ñaà y ñuû. Haàu heát caùc taùc giaû ñeàu cho ra èng vi khuaån lactic seõ ñoàng hoùa caù c loaïi ñöôøng naøy baèng c aùch thuûy phaân chuùng thaønh monosaccharide tröôùc, sau ñoù caùc ñöôøng ñ ôn naøy tieáp tuïc tham gia vaøo caùc chuoãi chuye ån hoùa nhö ñaõ trình baøy ôû tr eân. Hình 2.7 Söï sinh tröôûng cuûa O. oeni trong caùc moâi tröôøng ñöôøng khaùc nhau (10 g/l) glucose ( ) , fructose ( ), saccharose ( ) Hình 2.7 cho thấy söï aûn h höôûng cuûa caùc loaïi ñö ôøng khaùc nhau ñeán söï s inh tröôûng cuûa vi khuaån O. oeni. Löôïng sinh khoái ñöôïc xaùc ñònh giaùn tieáp bôûi chæ soá OD ôû 600nm. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy, trong soá caùc dung dòch ñöôøng söû duïng (glucose, fructose, saccharose) ôû cuøng noàng ñoä (10 g/L), vi khuaån söû duïng ñöôøng gluco se laø toát nhaát. Ñöôøng fructose cho pha lag daøi nhaát. Ñöôøng saccharose cho pha lag nga én hôn ñöôøng fructose, nhöng löôïng sinh khoái taïo thaønh sau 180 giôø thì thaáp hôn caû hai loaïi ñöôøng treân.
Polysaccharide Moät soá loaøi vi khuaån malolactic coù khaû naêng dò hoùa caùc loaïi polysaccha ride beân caïnh quaù trình sinh toång hôïp caùc chaát naøy. Khi nghieân cöùu treân loaøi Oenococcus oeni, Guilloux Benatier vaø coäng söï (2000) ñaõ tìm thaáy ñöôïc hoaït tính β(1→3) glucanase ngoaïi baøo. Enzyme naøy xuùc taùc cho phaûn öùng thuûy phaân glucan taïo thaønh glucose. Ñaây cuõng laø moät daá u hieäu quan troïng goùp phaàn vaøo vieäc giaûi thích cho söï taêng haøm löôïng caùc monosacchride trong suoát quaù trình leân men malolactic beân caïnh nhöõng lyù do ñaõ ñöôïc ñaët ra tröôùc ñoù nhö söï thuûy phaân saccharose, CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 16 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang trehalose, phenolic glucoside vôùi xuùc taùc acid (Costello vaø coäng söï 1985; Davis vaø coäng söï 1986a, b).  Acid höõu cô: malate, citrate, pyruvate Hình 2.8 Sô ñoà chuyeån hoùa moät soá acid höõu cô t rong vang bôûi vi khuaån malolactic
Acid malic Oenococcus oeni coù theå phaân giaûi acid malic thaønh acid lactic vaø CO2 nhôø phaûn öùng decarboxyl hoùa vôùi xuùc t aùc enzyme malate carbo xylase. Phaûn öùng naøy khoâng tröïc tieáp sinh ra naêng löôïng cho teá baøo döôùi daïng ATP nhöng noù laø cô sôû cho söï hình thaønh löïc vaän chuyeån proton (proton motive force) qua ma øng teá baøo (ñö ôïc ñeà caäp chi tieát hôn ôû phaàn 2.2.1.2), töø ñoù teá baøo coù theå sinh toång hôïp ñöôïc naêng löôïng. Maëc duø vaäy, naêng löôïng toång hôïp töø söï chuyeån hoùa acid malic khoâng nhieàu baèng naêng löôïng ñöôïc taïo thaønh bôûi caùc con ñöôøng phoå bieán nhö ñöôøng phaân, trao ñoåi acid citric, pentose phosphate, phosphateketolase... Do ñoù, ñeå ñaûm baûo cho teá baøo coù theå sinh tröôûng vaø phaùt trieån moät caùch thuaän lôïi, nhu caàu veà glu cose vaãn ñoùng vai troø coát yeáu. Tuy nhieân, moät soá nghieân cöùu cuõng cho thaáy neáu trong ñieàu kieän khoâng sinh tröôûng (non-growing co nditions), caùc vi khuaån malolactic, ñaëc bieät laø Oenococcus oeni seõ tieán haønh phaân giaûi acid malic tröôùc thaønh acid lactic roài môùi chuyeån hoùa gluc ose. CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 17 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang
Acid citric Citric acid cuõng ñöôïc xem laø nguoàn cô chaát quan troïng trong quaù trình toång hôïp naêng löôïng cuûa caùc loaøi vi khuaån lactic thuoäc gioáng Leuconostoc vaø Oenococcus. Söï chuyeån hoùa acid citric ôû vi khuaån O. oeni ñöôïc thöïc hieän qua nhieàu phaû n öùng phöùc taïp hôn söï chuyeån hoùa acid malic (chæ qua moät phaûn öùng) vaø dieãn ra sau qua ù trình l eân men malolactic. Ghi chuù: I Citrate lyase VII Acetoin reductase II Oxaloacetate decarboxylase VIII Lactate dehydrogenase III Pyruvate decarboxylase IX Pyruvate dehydrogenase complex IV α-acetolactate synthase X Acetate kinase V α-Acetolatate decarboxylase XI Decarboxyl hoùa khoâng enzyme VI Diacetyl reductase XII Aspartate aminotranferase Hình 2.9 Quaù trình chuyeån hoùa acid citric vaø söï toång hôïp diacetyl ñöôïc t höïc hieän bôûi vi khuaån malolactic (Nguo àn: Ram os and Santos, 1996) Trong khoaûng pH thích hôïp cho O. oeni phaùt trieån (pH 3,5-5,5), acid citric toàn taïi döôùi daïng phaân ly taïo thaønh mo noanion HO-C(CH2COOH)2-COO- (H2Citrate-). Chaát naøy seõ ñöôïc vaän CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 18 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang chuyeån vaøo trong teá ba øo bôûi moät loaïi protein vaän chuyeån ñaëc bieät (citra te transporter). Khi ñaõ vaøo beân trong teá baøo, H2Citrate- seõ ñöôïc vi khuaån söû duïng vaø chuyeån hoùa qua nhieàu phaûn öùng khaùc nhau ñeå hình thaønh neân saûn phaåm cuoái cuøng laø acetic acid, acetoin vaø CO2. Trong quaù trình naøy teá baøo tieâu toán moät ion H+ ñeå keát hôïp vôùi moät ion H2Citrate- taïo thaønh acid citric. Keát quaû laø naêng löôïng ñöôïc hình thaønh theo cô cheá töông töï nhö cô cheá toång hôïp naêng löôïng ñöôïc trình baøy ôû phaàn 2.2.1.2.
Acid pyruvic Oenococcus oeni coù theå söû duïng tröïc tieáp pyruvate nhö nguoàn cung caáp carbon (2 pyruvate → 1 lactate + 1 acetate + 1 CO2). Theo Nicole Warner vaø coäng söï (200 5), keát quaû nghieân cöùu khi nuoâi caáy chuûng vi k huaån naøy trong moâi trö ôøng coù chöùa p yruvate thu ñöôïc nhö sau: löôïng sinh khoái (tính theo khoái löôïng chaát khoâ) ñaït 4,0 g/mol pyruvat vaø löôïng ATP taïo thaønh laø 0,5mol/mol pyruvate. Tuy nhieân, khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng chöùa glucose, löôïng sinh khoái ñaït ñöôïc l aø 8,3 g/mol gl ucose. Ñieàu naøy chöùng minh ñöôïc raèng vi khuaå n malolactic coù theå söû duïng ñöôïc acid pyruvic ñeå sinh tröôûng vaø löôïng sinh khoái taïo thaønh khi söû duïng acid pyruvic chæ baèng moät nöûa so vôùi khi söû duïng glu cose. Cô cheá chuyeån hoùa acid pyruvic coù theå bieåu dieãn toùm taét theo sô ñoà sau: Hình 2.10 Sô ñoà chuyeå n hoùa pyruvate thaønh acetate vaø lactate  Polyol Caùc polyol ñeàu khoâng thí ch hôïp cho söï sinh tröôûng cuûa haàu heát caùc loaøi vi khuaån malolactic ngoaïi tröø Lact. plantarum (theo Liu vaø coäng söï, 1995). Cô cheá chuyeån hoùa caùc loaïi polyol cuõng chöa ñöôïc bieát ñeán moät caùch roõ ra øng. CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 19 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang
Söï chuyeån hoùa glycerol Ñoái vôùi glycerol, coù hai con ñöôøng phaân giaûi hôïp chaát naøy bôûi vi khuaån malolactic. Moät laø phaûn öùng dehydrate glycerol thaønh hôïp chaát 3-hydroxyprionaldehyde bôûi xuùc taùc enzyme glycerol dehydrase hay glycerol kinase. Hai laø phaûn öùng dehyrate hoùa khoâng enzyme ñeå hình thaønh neân acrolein vôùi taùc nhaân chính laø nhieät hay ñieàu kieän baûo quaû n daøi haïn trong moâi tröôøng acid. Veà maët naêng löôïng, söï c huyeån hoùa ñoàng thôøi ñöôøng vaø glycerol ra át quan troïng ñoái vôùi caùc tröïc khuaån lactobacilli trong vieäc hình thaønh neân ATP töø hôïp chaát trao ñoåi trung gian ñoåi trung gian laø a cetyl phosphate (Veiga-da-Cunha vaø Foster, 1992).
Söï chuyeån hoùa mannitol Ngöôïc laïi vôùi glycerol, mannitol coù theå xem nhö laø nguoàn carbon chính vaø nguoàn naêng löôïng cung caáp cho söï sinh tröôûng cuûa loaøi vi khuaån lactic ñoàng hình Lact. plantarum (Davis vaø coäng söï 1988; Liu vaø coäng söï 1995). Tuy nhieân, söï phaân giaûi mannitol bôûi loaøi vi khuaån naøy chæ ñöôïc tieán haønh trong ñieàu kieän coù oxi (hoâ haáp hieáu khí) hoaëc coù maët cuûa caùc chaát nhaän ñieän töû nhö citrate vaø α-ketoacid (hoâ haáp kò khí) (Chen vaø McFeeters 1986). Vi khuaån lactic ñoàng hình coù theå söû duïng mannitol laøm cô chaát. Mannitol ñöôïc vaän chuyeån chuû ñoäng vaøo teá baøo thoâng qua cô cheá phosphoryl hoùa thaønh mannitol 1-phosphate nhôø xuùc taùc cuûa enzyme mannitol phosphotransferase. Sau ñoù, manitol 1-phosphate bò oxy hoùa thaønh fructose 6-phosphate bôûi xuùc taùc cuûa enzyme m annitol 1-phosphate dehydrogenase. Chaát naøy ñoùng vai troø laø saûn phaåm trao ñoåi trung gian (glycolysis intermediate) tham gia vaøo con ñöôøng ñöôøng phaân ñeå taïo thaønh caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuoái cuøng nhö ethanol, acid lactic... vaø sinh toång hôïp ATP.  Acetaldehyde Moät soá chuûng thuoäc gioáng Oenococcus oeni (vaø Lactobacillus, tröø Pediococcus) coù theå söû duïng acetaldehyde ôû ca û hai daïng töï do vaø lieân k eát vôùi SO2 (Acetaldehyde-bound SO2) (Osborne vaø coäng söï, 2000). Ñieàu naøy coù yù nghóa quan troïng trong saûn xuaát röôïu vang vì acetaldehyde (ñöôïc hình thaønh chuû yeáu bôûi quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám men) laø hôïp chaát deã bay hôi taïo muøi khoâng mong muoán vaø laøm taêng cöôøng ñoä maøu cho vang ñoû (do chaát naøy coù khaû naêng choáng laïi aûnh höôûng cuûa SO2 trong moâi tröôøng, töø ñoù thuùc ñaåy phaûn öùng ngöng tuï anthocyanin vaø catechin thaønh tannin taïo saéc toá beàn,) ( theo Timberlake vaø Bridle 1967a, Somer vaø CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 20 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Wescombe 1987). Cô ch eá chuyeån hoùa acetaldehyde thaønh ethanol ñaõ ñöôï c mieâu taû theo phaûn öùng sau: Baûng 2.3 Khaû naêng phaâ n giaûi acetaldehyde cuûa moät soá chuûng vi khuaån malolactic Chuù thích: (+) coù khaû naêng; (–) khoâng coù khaû naê ng 2 – Nguoàn nitô  Caùc acid amin Vai troø cuûa ca ùc acid ami n ñoái vôùi quaù trình sinh tröôûng cuûa vi khuaån m alolactic vaãn ñang ñöôïc nghieân cöùu. Töø caùc keát quaû nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy, nhu caàu veà caùc acid amin ñoái vôùi töøng chuûng khaùc nhau laø khoâng gioáng nhau nhöng nhìn chung haàu heát caùc chuûng ñeàu caàn asparagine nhö moät acid amin thieát yeáu ñeå sinh tröôûng. Theo Versari vaø coäng söï (1999), vieäc boå sung thaønh phaàn acid amin vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy raát caàn cho söï sinh tröôûng toái thích cuûa vi khuaån malolactic. Khi laøm thí nghieäm treân caùc chuûng thuoäc loaøi Oenococcus oeni trong moâi tröôø ng nuoâi caáy toång hôïp ôû p H 5,0, taùc giaû ñaõ thaáy raèng isoleucine, acid glutamic, tryptophan vaø arginine laø nhöõng amino acid thieát yeáu cho söï sinh tröôûng cuûa loaøi naøy. Maët khaùc, söï thieáu huït caùc thaønh phaàn nhö glycine, phenyl alanine, proline vaø tyrosine seõ aûnh höôûng nhieàu ñeán quaù trình leân men malolactic nhöng ít aûnh höôûng CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 21 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang ñeán sinh tröôûng cuûa vi khuaån lactic. Söï aûnh hö ôûng cuûa caùc a cid amin ñ eán sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolactic cuõng n hö caùc cô cheá vaän chuyeå n chuùng cuõng ñ aõ vaø ñan g ñöôïc nghieân cöùu. Moät soá caùc acid amin quan troïng cho söï sinh tröôûng vaø trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån malolactic:
Arginine Arginine ñoùng vai troø raá t quan troïng trong qu aù trình trao ñoåi chaát vaø n aêng löôïng cuûa vi khuaån malolactic noùi c hung. Söï chuyeån hoùa arginine chuû yeáu thoâng qua con ñöô øng ADI (arginine deiminase pathway). Thoâng qua con ñöôøng ADI, moät phaân töû arginine bò deimine hoùa taïo thaønh citrulline, sau ñoù hôïp chaát naøy tieáp tuï c bò bieán ñoåi thaønh Ornithine vaø thaûi ra ngoaøi maøng teá baøo. Quaù trình naøy cung c aáp ATP cho teá baøo qua cô cheá: Arginine + H2O Arg. deiminase Citrulline + NH3 Citrulline + Pi Orn. transcarbamylase Ornithine + Carbamyl-Pi Carbamyl-Pi + ADP Carbamate kinase ATP + NH3 + CO2 Hình 2.11 Töông quan veà toác ñoä phaân giaûi ar ginine ( ) vaø hình thaønh citrulline ( ) ñoái vôùi vi khuaån Oenococcus oeni Moät soá loaøi vi khuaån malolactic khaùc nhö Lact. hilgardii ngoaøi chuyeån hoùa arginine theo con ñöôøng naøy, chuùng co øn coù theå chuyeån hoùa t heo con ñöôøng ADP (arginine decarboxylase pathway). Tuy nhieân, söï chuyeån hoùa arginine ôû nhöõng loaøi naøy ñöôïc xem nhö khoâng ñieån hình cho vi khuaån malolactic. CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 22 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang
Asparagine vaø glutamine Asparagine ñöôïc xem laø acid amin thieát yeáu cho söï sinh tröôûng cuûa haàu heát caùc chuûng thuoäc loaøi O. Oeni. Söï chuye ån hoùa asparagine (xem hình 2.12) trong teá ba øo vi k huaån lactic nhö sau: Hình 2.12 Sô ñoà chuoãi chuyeån hoùa asparagine vaø glutamine ôû vi khuaån l actic Ñaàu tieân, asparagine ñöôï c vaän chuyeån vaøo trong teá baøo nhôø protein vaän c huyeån vaø tieâu toán naêng löôïng döôùi daïng ATP. Sau ñoù asparagine tieáp tuïc ñöôïc deamine hoùa thaønh acid aspartic nhôø xuùc taùc asparaginase (E 3.5.1.1). Töø ñaây, acid aspartic tieáp tuïc ñöôïc chuyeån hoùa tieáp theo 3 con ñöôøng chính:  Söï chuyeån hoùa aspartic vôùi xuùc taùc enzyme aspa rtase thaønh acid fumaric. Acid naøy tieáp tuïc ñöôïc chuyeån h oùa tieáp thaønh acid malic (bôûi enzyme fumarase ) hay acid succinic (bôûi enzyme suc cinate dehydrogenase).  Söï chuyeån hoùa acid aspartic thaønh oxaloacetate (nhôø enzyme aspartate aminotransferase) roài thaønh pyruvate (nhôø enzyme oxaloacetate decar boxyl ase). CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 23 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang  Phaûn öùng decarboxyl hoù a acid aspartic thaønh alanine bôûi xuùc taùc enzyme aspatate decarboxylase. Caàn löu yù raèng ño ái vôùi O. oeni, trong tröôøng hôïp sinh tröôûng nhôø acid malic, ôû haøm löôïng thaáp (<0,3 mmol/L) aci d aspartic coù theå thuùc ñ aåy söï sinh tröôûng cuûa c huùng trong khi ôû haøm löôïng cao hôn (>6 mmol/L) thì söï sinh tröôûng nhôø acid malic laïi bò öùc cheá (xem baûng 2.4), song coù theå laøm taêng kh aû naêng söû du ïng ñöôøng gl ucose (S.Q. Liu, 2002). Baûng 2.4 AÛnh höôûng c uûa L-aspartic ñeán sinh tröôûng cuûa vi khuaån malol actic Löôïng sinh khoái taïo thaønh mg/mL Chuûng Canh tröôøng 1 0,3 mmol/L Canh tröôøng 2 10 mmol/L Tæ leä öùc cheá sinh tröôûng (%)
Cysteine vaø methionine Nghieân cöùu cuûa Pripis-Nicolau vaø caùc coäng söï (2004) treân caùc chuûng thuoäc loaøi O. oeni cho thaáy moät soá chuûng coù k haû naêng söû duïng methionine ñeå taïo thaønh moät l öôïng lôùn ca ùc chaát mu øi nhö 3-(methylsulphanyl) propionic acid vaø 3-(m ethylsulphanyl)propan-1-ol (2 hôïp chaát trung gian trong quaù trình chuyeån hoùa methionine ngoaøi 2 saûn phaåm chính laø methanethiol vaø dimethyl disunfide). Chính söï hình thaønh neân 2 hôïp chaát naøy ñaõ taïo neâ n söï khaùc bieät ñoái vôùi caùc loaøi leân men l actic tr ong söõa vaø leân men malo lactic trong röôïu vang.
Serine Moät soá chuûng thuoäc loaøi Oenococcus oeni coù theå phaân giaûi serine thaønh NH3 vaø pyruvate bôûi enzyme serine dehydratase (deaminase). CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 24 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang  Protein vaø polypeptide Moät soá nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy raèng: ca ùc caàu khuaån Oenococcus oeni coù khaû naêng toång hôïp ñöôïc protease ngoaïi baøo (Rol lan vaø coän g söï, 1993). Theo Leitao (2000), hoaït tính cuûa protease coøn tuøy thuoäc vaøo töøng chuûng vaø khoâng phoå bieán ôû taát caû caùc c huûng. Sau ñoù, nghieân cöùu cuûa Manca de Nadra vaø coäng söï (1997, 1999) ñaõ chöùng minh söï taïo thaønh caùc peptide vaø acid amin trong suoát quaù trình leân men malolactic ôû caû vang ñoû vaø vang traéng bôûi chuûng O. oeni X2L (chuûng naøy ñöôï c xe m laø co ù khaû naêng toång hôïp protease ngoaïi baøo). Tuy nhieân, taát caû nhöõng nghieân cöùu noùi treân cuõng chöa laøm saùng toû ñöôïc khaû naêng thuûy phaân caùc protein cuûa caù c vi khuaån lactic trong röôïu vang maëc duø khaû n aêng naøy ñaõ ñöôï c con ngöôøi bieát raát roõ ñoái vôùi vi khuaån lactic trong söõa. 3- Nguoàn khoaùng (Mn, Mg, K, Na) Ñoái vôùi O. oeni, nhu caàu veà caùc loa ïi khoaùng cuûa töø ng chuûng khaùc nhau cuõn g khaùc nhau. Tuy nhieân moät ñieàu ñaùng lö u yù la ø trong caùc loaïi kh oaùng söû duïng thì nguyeâ n toá Mn ñöôïc xem laø nguyeân toá raát quan troïng caàn thieát cho söï sinh tröôûng cuûa O. oeni. Keát quaû nghieân cöùu cuûa taùc giaû S. Theobald vaø coäng söï (2005) treân caùc chuû ng O. oeni ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng cô baûn (Basal medium) vaø moâi tröôøng dòch caø chua (TJM) cho thaáy (xem ba ûng 2.5): Baûng 2.5 Löôïng sinh khoái thu ñöôïc öùng vôùi c aùc moâi tröôøng chöùa caùc loaïi khoaùng khaùc nhau Chuù thích baûng: Caùc teá baøo vi khuaån O. oeni ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng cô baûn (BM) coù boå sung moät loaïi khoa ùng. Moâi tröôøng naøy coù thaøn h phaàn nhö sau: 5 g/L pepton, 20 g/L trypton, CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 25 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 5 g/L dòch chieát naám men, 5 g/L glucose, 5g/L fru ctose, 3g/L acid citric, 1g/L Tween 80, 0,5 g/L MgSO4.7H2O. Haøm löôïng moãi loaïi khoaùng boå sung vaøo moâi tröôøng BM töông öùng vôùi haøm löôïng cuûa noù trong dòch eùp caø chua. Chæ soá OD5 46nm duøng ñeå xaùc ñònh löôïng sinh khoái thu ñöôïc coù trong dòch canh tröôøng t aïi thôøi ñieåm sau 10 nga øy nuoâi caáy.
Trong soá caùc cation ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy (Ca, Zn, K, F e, Mn, Mg, Cu) chæ coù Mn kích thích söï taêng tröôûng cuûa teá baøo sau 10 ngaøy nuoâi caáy: so vôùi maãu ñoái chöùng (H2O) chæ soá OD5 46 nm = 0,77 thì maãu boå sung Mn coù OD5 46 nm = 0,95. Trong tröôøng hôïp khoâng söû duïng Mn maø söû duïng hoãn hôïp caùc cation coøn laïi thì chæ soá OD54 6 mm = 0,82.
Söï coù maët cuûa ngu yeân t oá Ca cuõng goùp phaàn kíc h thích söï taêng sinh khoái (OD546 nm = 0,83).
Trong tröôøng hôïp söû duïng ñaày ñuû caùc cation trong moâi tröôøng cho chæ soá OD54 6 nm raát cao (1,83).
Trong taát caû caùc tröôøn g hôïp, vieäc söû duïng moâi tröôøng TJM (moâi tröôøng n öôùc eùp caø chua) ñem laïi keát quaû cao nhaát. Keát luaän:
Mangan laø nguye ân toá kíc h thích söï sinh tröôûng vaø taêng sinh khoái ñoái vôùi O. oeni.
Caùc ngu yeân toá khaùc nhö: Ca, K, Mg cu õng ca àn thieát nhöng ôû möùc ño ä thaáp h ôn.
Caùc nguyeân toá co øn laïi haàu nhö khoâng aûnh höôûng ñaùng keå ñeán söï sinh tröôûng cuûa O. oeni. 4- Nguoàn vitamin Nhieàu taùc giaû khaúng ñònh vai troø cuûa acid pantothenic ñeán söï sinh tröôûng cuûa O. oeni. Khi ñöôïc cung caáp ñuû haøm löôïng acid pantothenic caàn thieát, caùc caàu khuaån naøy seõ tieán haønh leân men ñöôøng glucose theo con ñöôøng le ân men lact ic dò hình taïo thaønh lactate, ethanol vaø CO2. ÔÛ haøm löôïng acid pantothenic thaáp hôn (haøm löôïng giôùi haïn) seõ taïo thaønh moät löôïng lôùn caùc erythritol, acetate vaø glycerol. Khi ñoù, con ñöô øng leân men ethanol seõ ñ öôïc thay theá bôûi con ñöôøng taïo thaønh caùc hôïp chaát naøy. Tuy nhieân, söï coù maët cuûa acid pantothenic laïi khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men ñöôøng ribose. AÛnh höôûng cuûa acid pantothenic ñeán quaù trình leân men ethanol lieân quan tôùi söï thay ñoåi haøm löôïng caùc CoA-SH vaø acetyl-CoA. Hai chaát n aøy laø c aùc cosubstrates (daïng coenzyme lieân keát CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 26 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang vôùi cô chaát) cuû a caùc enz yme phosphotransacetylase vaø acetaldehyde dehydrogenase trong chuoãi toång hôïp ethanol cuûa vi khuaån lactic. Trong tröôøng hôïp nuoâi caáy caùc teá baøo O. oeni trong moâi tröôøng coù ñuû löôïng caàn thieát acid pantothenic, haøm löôïng CoA-SH cao hôn khoaûng 10 laàn so vôùi trong moâi tröôøng thieáu acid pantothenic. Do ñoù, neáu trong ñieàu kieän thieáu loaïi vitamin naøy, haøm löôïng caùc cosubstra te seõ giaûm ñaùng keå vaø k hoâng ñuû ñeå tham gia xuù c taùc vôùi 2 enzyme keå treân. Heä quaû laø chuoãi ph aûn öùng toång hôïp bò öùc c heá vaø ñöôïc thay theá bôûi con ñöôøng taïo thaønh acid acetic vaø erythritol. Hình 2.8 Vai troø cu ûa aci d pantothenic leân söï taïo thaønh ethanol ñoái vôùi O. oeni 2.1.2.2 Söï sinh toång hôïp naêng löôïng 1 - Sinh toång hôïp naêng löôïng nhôø quaù trình chuyeån hoùa ñöôøng Vi khuaån lactic noùi chung coù theå toång hôïp naêng löôïng nhôø vaøo quaù trình leân men lactic. Quaù trình leân men lactic ñoàng hình coù theå cung caáp cho teá baøo 2 mol ATP töø 1 mol glucose trong khi quaù trình leân men la ctic dò hình chæ cung caáp ñöôï c 1 mol ATP. Quaù trình leân men ñöôøng pentose cuõng coù theå giaûi phoùng 2 mol ATP töø moät mol ñöôøng (Kandler, 1983). Söï trao ñoåi chaát ñoàng thôøi (co-metabolism) vôùi glucose-fructose ôû vi khuaån Oenococcus oeni coù theå cung caáp ATP cho teá baøo döôùi daïng cô chaát ñöôïc phosphoryl hoùa nhôø xuùc taùc cuûa enzyme acetate kinase (Salou vaø coäng söï, 1994). CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 27 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Quaù trình trao ñoåi chaát ñoàng thôøi vôùi glucose-ci trate ôû loaøi naø y vaø moät soá vi khuaån lactic khaùc söû duïng ñöôïc citrate cuõng cung caáp raát nhieàu naêng löôïng daïng ATP duø raèng citrate khoâng theå söû duïng ñöôïc bôûi chuùng neáu trong moâi tröôøng thieáu glucose. Hình 2.9 cho thaáy ôû O. oeni neáu trong moâi tröôøng c où chöùa ñoàn g thôøi glucose vaø citrate thì sinh tröôûng toát hôn neáu chæ co ù glucose. Hình 2.9 Aûnh höôûng c uûa söï chuyeån hoùa ñoàng t hôøi glucose-citrate leân söï sinh tröôûng cuûa O. oeni ôû 10oC vaø pH 4,8. C aùc maãu thí nghieäm treân moâi tröôøng glucose 45m M: coù boå sung citrate 10mM ( ), 20 mM ( ) vaø k hoâng coù citrate ( ). 2 - Sinh toång hôïp naêng löôïng nhôø quaù trình chuyeån hoùa acid malic Quaù trình leân men malol actic cuõng coù theå saûn sinh ra naêng löôïng cho teá baøo be ân caïnh quaù trình leân men ñöôøng vaø söï ñoàng leân men gluco se-citrate nhö ñaõ ñeà caäp ôû treân. Hieän nay, coù nhieàu quan ñieåm khaùc nhau veà söï sinh toång hôïp naêng löôïng töø acid malic, trong ñoù taäp trung vaøo 2 giaû thuyeát chính: söï taïo thaønh naêng löôïng töø quaù trình trao ñoåi chaát trung gian taïo acid pyruvic vaø söï phaùt sinh naêng löôïng töø löïc chuyeå n vaän proton (proton motive force) theo cô cheá hoùa thaám (chemiomostic mechanism).
Giaû thuyeát thöù 1 ñöôïc Kunkee vaø caùc coäng söï (Morenzoni 1974; Kunkee 1975, 1991; Pukruskpan vaø Kunkee 1977; Zhuorong vaø Kunkee 1993) giaûi thích nhö sau: phaûn öùng chuyeån hoùa malol actic k hoâng xaûy ra moät caùch ho aøn toaøn, nghóa laø khoâng phaûi taát caû acid malic ñeàu ñöôïc chuyeån hoùa thaønh acid lactic vaø CO2, maø moät phaàn nhoû taïo thaønh caùc CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 28 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang hôïp chaát trao ñoåi trung gian nhö pyruvate vaø NADH. Pyruvate kích thích söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolactic bôûi noù coù vai troø nhö laø moät chaát nhaän hydro cuoái cuøng hay coù theå chuyeån hoùa thaønh acetyl phosphate nhôø söï xuùc taùc cuûa enzyme ph osphoroclastic (pyruvate formatylyase). Acetyl phosphate sau ñoù goùp phaàn hình thaønh neân ATP hoaëc ñoùng vai troø laø chaát nhaän hydro ñeå oxi hoùa NADH. Keát qu aû la ø NAD ñöôïc taïo ra nhieàu hôn seõ aûnh höôûng ñeán quaù t rình leân men ñöôøng ban ñaàu vì NAD caàn thieát cho caû leân men lactic ñoàng hình laãn dò hì nh.
Giaû thuyeát thöù 2 thuoäc veà thuyeát hoùa thaám (chemiosmotic theory). Theo ñoù, naêng löôïng ñöôïc taïo thaønh töø söï dòch chuyeån cuûa doøng prot on (H+) qua caáu truùc m aøng membrane dieãn ra ñoàng thôøi vôùi söï vaän chuyeån cuûa doøng saûn phaåm cuoái töø beân tr ong teá baøo ra ngoaøi. Malate ñöôïc chuyeån vaøo teá baøo ôû daïng monoanion vaø ñöôïc decarboxyl hoùa thaønh lactate nhôø xuùc taùc cuûa enzyme malate carboxyl ase. Lactate sau ñoù keát hôïp vôùi proton H+ thaønh acid lactic vaø ñöôïc chuyeån ra ngoa øi teá baøo. Söï ma át maùt H+ beâ n trong teá baøo bôûi qua ù trình treân ñaõ goù p phaàn taïo neân mo ät söï cheânh leäch veà ñieän tích vaø pH ôû beân trong vaø beân ngoaøi maøng teá baøo. Khi ñoù, teá baøo coù xu höôùng caân baèng söï cheânh leäch ñieän tích naøy baèng caùch nhaän H+ töø moâi tröôøng vaøo nhôø caùc caáu truùc F0F1-ATPase hình naám coù cuoán g, moãi caáu t ruùc naøy seõ toång hôïp neân moät phaân töû ATP khi moä t ñoâi H+ ñöôïc ñaåy qu a. Hình 2.10 Cô cheá toång hôïp naêng löôïng töø quaù tr ình chuyeån hoùa acid mal ic theo thuyeát hoùa thaám CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 29 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 3 - Sinh toång hôïp naêng löôïng nhôø quaù trình chuyeån hoùa arginine Söï chuyeån hoùa arginine cuõng ñöôïc xem laø moät quaù trình saûn sinh ra naêng löôïng theo con ñöôøng ADI (Arginine deiminase pathway). Töø co n ñöôøng naøy, 1mo l ATP ñöôïc taïo thaønh töø moãi mol arginine. Söï taïo thaønh naêng löôïng ñöô ïc giaûi thích döïa treân cô cheá vaän chuyeån ñoàng thôøi cô chaát vaø saûn phaåm thoâng qua heä thoáng ñoàng vaän chuyeån (the same transport system). Ñeå thöïc hieän ñöôïc ñieàu naøy, cô c haát vaø saûn phaåm phaûi c où caáu truùc hoùa hoïc töông töï nhau hoaëc laø d aãn xuaát cuûa nhau. Khi ñoù a ginine (ñoùng vai troø laø c ô chaát) ñöôïc vi khuaån vaä n chuyeån töø beân ngoa øi vaøo beân trong teá baøo, so ng song ñoù saûn phaåm o rthinine ñöôïc vaän chuyeån töø beân trong ra beân ngoaøi maøng teá baøo. Keát quaû laø taïo neân 2 doøng gr adient noàng ñoä, moät doøng gradient cô chaát ∆S vaø moät doøng gradient saûn phaåm ∆P. Nhôø vaøo hieän töôïng naøy maø söï vaän chuyeån cô chaát khoâng caàn tieâu toán naêng löôïng, naêng löôïng ñoù seõ ñöôïc teá baøo söû duïng vaøo muïc ñích khaùc. Naêng löôïng coù theå ñöôïc taïo neân töø quaù trình ñoàng vaän chuyeån cô chaát vaø saûn phaåm nhôø söï thay ñoåi veà ñieän tích beân trong vaø beân ngoaøi teá baøo. Thaät vaäy, tro ng quaù trình trao ñoåi arginine, moâi tröôøng beân trong teá baøo trôû neân coù tính kieàm (do söï deimine hoùa taïo thaønh NH3, trong khi moâi tröôøng beân ngoaøi ñieän tích haàu nhö khoâng thay ñoåi. Keát quaû laø hình thaønh neân moät hieäu ñieän theá trong vaø ngoaøi maøng teá baøo (∆ψ) maø beân trong tích ñieän aâm. Hôn theá nöõa, trong quaù trình hình thaønh saûn phaåm teá ba øo coù tieâu toán moät löôïn g ion H+ taïo neân söï cheânh leäch veà pH (∆pH). Söï cheânh leäch veà ∆ψ vaø ∆pH ôû 2 beân maøng teá baøo chaát l aø ñieàu kieän caàn thieát ñeå taïo neân moät löïc vaän chuyeån proton (PMF) vaøo beân trong teá baøo ma ø nhôø ñoù naêng löôïng ñöôï c toång hôïp döôùi daïng ATP. Hình 2.11 Con ñöô øng A DI chuyeån hoùa ar ginine vaø sinh toång hôïp naêng löô ï ng CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 30 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 2.1.3 Moät soá gioáng vi khuaån leân men malolactic 2.1.3.1 Vi khuaån leân men malolactic trong töï nhieân Trong ngheà laøm röô ïu va ng truyeàn thoáng, qu aù trì nh leân men malolactic x aûy ra hoaøn toaøn töï phaùt bôûi moät soá vi khuaån lactic coù saün trong nho vaø thieát bò laøm röôïu. Khi ñoù, trong quaù trình leân men röôïu seõ coù söï phaùt trieån ñoàng thôøi cuûa caû naám men vaø vi khuaån; vaø trong moät moâi tröôøng soáng caïnh tranh nhö vaäy, loaøi naøo coù khaû naêng phaùt trieån (veà soá löôïng) moät caùch vöôït troäi hôn thì seõ chieám öu theá. Moät ñieàu ñaùng löu yù ôû ñaây laø tröôùc khi leân men ngöôøi ta thöôøng sulfite hoùa phaàn thòt vaø voû nho neân söï phaùt trieån cuûa vi khuaån chæ coù theå dieãn ra chuû yeáu sau quaù trình leân men chính (leân men ethanol) keát thuùc, luùc ñoù haøm löôïng ñöôøng coøn laïi laø raát ít, chuùng seõ söû duïng acid m alic nhö laø nguo àn carbon chính ñeå sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Baûng 2.6 Danh saùch lieä t keâ caùc vi khuaån lactic k haùc nhau hieän dieän trong dòch nho tröôùc vaø sau khi leân men ethanol (cfu/ml) (Lonvaud-Funel vaø coäng söï, 1991) Chuù thích: KXÑ: khoâng xaùc ñònh 1- Leuconostoc vaø Oenococcus Trong nhieàu tröôøng hôïp, caùc vi khuaån lactic leân men dò hình hình caàu laø taùc nhaân leân men malolactic nhieàu hôn caû . Ngöôøi ta tìm thaáy co ù moät loaøi thuoäc gioáng Leuconostoc thöôøng gaëp nhaát trong dòch nho laøø Leuconostoc mensenteroides. Moät loaøi khaùc thuoäc gioáng Oenococcus chæ xuaát hieän vôùi soá löôïng raá t ít trong dòch nho nhöng coù theå sinh tröôûng raát toát vaø chieám soá löôïng vöôït troäi so vôùi nhöõng loaøi khaùc sau quaù trình l eân men ethanol (Lonvaud-Funel vaø coän g söï, 1991). Ñoù la ø Oenococcus oeni. Theo E.Peymand, khi khaûo saùt 398 chuûng nghieân cöùu cuûa gioáng Leuconostoc vaø Oenococcus ôû pH 3,0 ñaõ thu ñöôïc 36% soá chuûng l eân men acid malic vaø coù 7% soá chuûng leân men ñöôøng; ôû pH 3,2 chæ coù 31% soá chuûng leân men acid malic vaø 12% soá chuûng leân men ñöôøng. ÔÛ CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 31 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang pH cao hôn soá chuûng leân men ñöôøng nhieàu hôn vaø leân men acid malic ít hôn. Ñieàu naøy chöùng toû raèng, caùc ca àu khuaån l eân men lactic dò hình sinh tröôûng ñöôïc trong moâi tröôøng pH caøng thaáp thì seõ caøng chuyeån hoùa toát acid malic. Ngoa øi ra, c uõng theo taùc giaû naø y, nhöõng chuûng khoâng leân men acid citric vaø ñöôøng arabinose cuõng laø taùc nhaân leân men malolactic ñaùp öùng ñöôïc mong muoán. Ñieàu quan troïng laø trong leân men malolactic vi khuaån naøy söû suïng acid malic laø cô chaát chính, chuùng cuõng coù th eå leân men moät phaàn gluc ose vaø khoâng sinh ra caùc acid bay hôi. Trong soá caùc caàu khuaån naøy ngöôøi ta tìm ñöôïc moät loaøi mang teân Oenococcus oeni. Ñaây laø loaøi coù khaû naêng chòu pH thaáp nhaát vaø coù theå phaân giaûi hoaøn toaøn acid malic tröôùc khi söû duïng ñöôøng. 2- Lactobacillus Thuoäc gioáng naøy coù caùc loaøi thöôøng co ù maët vaø chieám soá löôïng ñaùng keå trong dòch nho nguyeân lieäu nhö Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. hilgardii, Lb. brevis. Do sinh tröôûng yeáu trong moâi tröôøng vang (bò taùc ñoäng maïnh cuûa pH, ethanol vaø SO2) neân caùc loaøi naøy coù khuynh höôùng giaûm daàn vaø laàn löô ït bò ö ù c cheá sau qua ù trình leân men ethanol. Caùc tröïc khuaån leân men lactic dò hình thuoäc gioáng Lactobacillus coù trong dòch leân men hay trong vang khoâ ñeàu coù t heå taïo thaønh moät löôïng khaù lôùn acid bay hôi. Do vaäy, chuùng laø nhöõng loaøi khoâng mong muoán t rong saûn xuaát röôïu vang. 3- Pediococcus Caùc vi khuaån leân men ñoàng hình thuoäc gioáng Pediococcus coù khaû naêng phaân giaûi acid malic ñoàng thôøi vôùi leân men ñöôøng glucose coøn soùt laïi trong vang khoâ taïo thaønh moät löôïng acid lactic maø khoâng sinh ra saûn phaåm phuï. Caùc loa øi Pediococcus thöôøng gaëp trong dòch nho laø P. cerevisiae, P. pentosaceus, P. damosus. Cuõng nhö Lactobacillus chuùng haàu nhö bieán maát sau quaù trình leân men ethanol. 2.1.3.2 Vi khuaån leân men malolactic trong coâng nghieäp 1- Caùc daïng cheá phaåm vi khuaån malolactic trong coâng nghieäp Trong saûn xuaát, ngöôøi ta thaáy raèng coù vaøi loaøi vi khuaån thuoäc gioáng Pediococcus vaø Lactobacillus hieän dieän trong dòch vang, duy chæ coù moät loaøi vi khuaån thuoäc gioáng Oenococcus, CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 32 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Oenoccocus oeni hay Leuconostoc oenos, laø loaøi vi khuaån lactic coù lôïi th öôøng xuaát hieän nhieàu nhaát. Chuùng coù khaû naêng thích nghi cao vaø phaùt trieån raát toát trong moâi tröôøng naøy neân thöôøng ñöôïc caùc nhaø saûn xuaát lö ï a choïn ñeå tieán haønh leân men ML (Lonvaud-Funel vaø coäng söï, 1991). Töø nhöõng naêm ñaàu 198 0, nhieàu nhaø saûn xuaát gioáng vi khuaån lactic röôïu vang ñaõ cho ra ñôøi caùc cheá phaåm gioáng vi khuaån malolactic daïng c anh tröôøng bao goàm c aùc chuûng thuoäc ca ùc loa øi Lactobacillus plantarum, Lactobacillus hilgadii, Oenococcus oeni. Caùc cheá phaåm naøy coù theå ñöôïc saûn xuaát döôùi daïng moät canh tröôøng chöùa moät chuûng hay hoãn hôïp nhieàu chuûng khaùc nhau. Öu ñieåm cuûa vieäc öùng duïng caùc cheá phaåm vi sinh vaät trong saûn xuaát röôïu vang laø giuùp kieåm soaùt ñöôïc toát hôn thôøi gian vaø möùc ñoä leân men malolactic, ñoàng thôøi quaù trình naøy khoâng ñôn giaûn chæ vôùi muïc ñích laøm giaûm ñoä chua ga ét cuûa röôïu vang thaønh phaåm maø coøn mang laïi nhieàu lôïi ích khaùc cho chaát löôï ng röôïu vang. Ñieàu naø y ñ aõ ñöôïc trình ba øy ôû phaàn 1.3.1. Caùc cheá phaåm canh tröôøng thöôøng saûn xuaát döôùi 2 daïng: daïng söû duïng ngay (fresh starter culture) hay daïng saáy thaêng hoa (freeze-dried preparation). Tuy nhieân, ñöùng veà maët thöông maïi cheá phaåm daïng saáy thaê ng hoa thöôøng ñöôïc öa thích hôn. Nguyeân nhaân laø da ïng fresh thöôøng phaûi ñöôïc laøm ra vaø baù n tröïc tieáp taïi caùc cô sôû saûn xuaát röôïu vang ñaët ôû vuøng troàng nho (winegrowing regions) coøn ñoái vôùi daïng saáy thaêng hoa thì linh ñoäng hôn vaø chaát löôïng oån ñònh hôn. Tuy nhieân, daïng naøy coù nhöôïc ñieåm laø chi phí naêng löôïng cho saûn xuaát vaø baûo qua ûn cheá phaåm cao hôn. 2- Saûn xuaát canh tröôøng gioáng Oenococcus oeni (Production of starter culture) Tuyeån choïn gioáng döïa treân caùc tieâu chí ñöôïc neâu trong phaàn 2.2. Quaù trình nhaân gioáng coù theå ñöôïc thöïc hieän theo caùc phöông phaùp leân men theo chu kyø, leân men baùn lieân tuïc vaø leân men lieân tuïc coù hoaëc khoâng coù hoài löu teá baøo. Moãi phöông phaùp leân men ñeàu coù nhöõng öu vaø nhöôïc ñieåm khaùc nhau aû nh höôûng tröïc tieáp ñeán naêng suaát cuûa thieát bò vaø hoaït tính sinh lyù cuûa teá baøo gioáng. Thoâng thöôøng quaù trình saáy thaêng hoa caùc saûn phaåm noùi chung luoân ñöôïc cho laø giaûi phaùp khoâng mang laïi tính kinh teá cho nhaø saûn xuaát do trang thieát bò ñaét tieàn, chi phí naêng löôïng cao... Nhöng trong lónh vöïc öùng duïng naø y, noù ñö ôïc ñaùnh giaù cao bôûi caùc öu ñieåm: khaû naêng tröõ raát laâu, deã söû duïng vaø phaân phoái. Hôn nöõa, hoaït tính vi khuaån sau saáy thaêng hoa cuõng ít bò bieán ñoåi trong moät khoaûng thôøi gian nhaát ñònh tuøy vaøo ñieàu kieän baûo quaûn. CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 33 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Thoâng thöôøng, trong ñieà u kieän baûo qua ûn ôû nhieät ñoä -15o C, khoâng coù O2 vaø aåm thì hoaït tính cuûa cheá phaåm coù theå ñö ôïc ñaûm baûo trong voøng 8 thaùng (Gewurzmul ler, Stuttgart). Tuy nhieân, ta cuõng coù theå ñöa cheá phaåm ra ngoaøi ôû nhieät ñoä 20o trong vaøi ngaøy vaø sau ñoù tieáp tuïc laëp laïi ñieàu kieän baûo quaûn laïnh ñoâng thì hoaït tính gioáng cuõng khoâng bò aûnh höôûng ñaùng keå. Theo caùch naøy caùc cheá phaåm daïng saáy thaêng hoa coù theå ñöôïc vaän chuyeån vaø phaân phoái trong ñieàu kieän khoâng caàn la ïnh. Hình 2.12 Sô ñoà khoái quy trình saûn xuaát canh tröôøng gioáng saáy phun 3- Söû duïng cheá phaåm Vieäc ñöa gioáng vi khuaån thuaàn chuûng vaøo dòch leân men ñeå tieán haønh leân men malolactic laø töông ñoái khoù khaên bôûi vì trong dòch leân men, caùc thaønh phaàn dinh döôõng cho vi khuaån phaùt CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 34 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang trieån raát haïn cheá. Beân caïnh ñoù, ôû moät soá vang caàn leân men coù pH thaáp, haøm löôïng coàn vaø SO2 cao cuõng coù theå kìm haõ m vi khuaån phaùt trieån. Vì vaäy, vaán ñeà ñaët ra ñaàu tieân khi söû duïng cheá phaåm laø phaûi taùi hoaït hoùa vi khuaån malolactic tröôùc khi caáy vaøo dòch leâ n men. Sô ñoà hình 2.13 giôùi thieäu quy trình taùi hoaït hoùa canh tröôøng gioáng saáy thaêng hoa ñeå c huaån bò cho qua ù trình leâ n men malolactic. Hình 2.13 Qu y trình taùi hoaït hoùa cheá phaåm tröôù c khi tieán haønh leân men malolactic 4- Löïa choïn cheá phaåm canh tröôøng gioáng thuaàn khieát vaøo leân men malolactic Baûng 2.7 Moät soá ñieàu ki eän leân men caàn cho vieäc löïa choïn loa ïi cheá phaåm c anh tröôøng gioáng Loaïi vang Thoâng soá Ñieàu kieän giôùi haïn Ñieàu kieän thöôøng Ñieàu kieän lyù töôûng Nhieät ñoä 18oC pH <3,1 3,2 3,2 Ethanol 13,5% 12,5-13,5% <12,5% Vang traéng SO2 toång >30 ppm 15-30 ppm Khoâng coù SO2 Nhieät ñoä 18oC pH 3,1 Ethanol 14% 13-14% <13% Vang ñoû SO2 toång >30ppm 15-30ppm Khoâng coù SO2 Thôøi ñieåm caáy gioáng Trong giai ñoaïn leân men ethanol Cuoái giai ñoaïn leân men ethanol Sau giai ñoaïn leân men ethanol (vang coøn ñuïc) Ghi chuù: caùc ñieàu kieän neâu treân thöôøng ñöôïc nhaø saûn xuaát gioáng ghi chi ti eát treân treân bao bì. CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 35 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Ngaøy nay, caùc cheá phaåm canh tröôøng gioáng vi khuaån leân men malolactic ñaõ raát phoå bieán vaø thoâng duïng. Haàu heát ch uùng ñeàu thuoäc loaøi O. oeni coù hoaït tính leân men malolactic cao, choáng chòu toát vôùi moâi tröôøng pH thaáp vaø noàng ño ä et hanol cao. Tuy nhieân, vieäc löïa choïn moät cheá phaåm canh tröôøng phuø hôïp cho quy trình saûn xuaát röôïu vang cuõng heát söùc quan troïng. Do ñoù nhaø saûn xuaát caàn nghieân cöùu kyõ veà thaønh phaàn dòch leân men (ethanol, SO2, pH) vaø ñieàu kieän leân men tröôùc khi choïn c heá phaåm (xem baûng 2.7) . 2.2 YEÂU CAÀU TUYEÅN CHOÏN VI KHUAÅN MALOLACTIC TRONG SAÛN XUAÁT Ngaøy nay, ngöôøi ta ñaõ d uøng vi khuaån lactic thích hôïp (ví duï Oenococcus oeni) ñöôïc nhaân gioáng tröôùc vaø bo å sung vaøo dòch leân men. Nhöõng chuûng vi khuaån naøy ñaõ ñ öôïc nghieân cöùu raát kyõ veà caùc ñaëc tính sinh hoaù vaø sinh lyù. Nhöõng tieâu ch í ñeå tuyeån choïn gioáng ba o goàm: Tieâu chí thöù 1: tieâu chí baét buo äc chung cho caùc gioáng leân men malolacti c
Khaû naêng chòu pH thaáp
Khaû naêng chòu ethanol c ao
Khaû naêng chòu ñöôï c nhieät ñoä thaáp
Leân men giôùi haïn ñöôøng pentose vaø hexose Tieâu chí thöù 2: tuøy theo yeâu caàu coâng ngheä cuï theå
Soá löôïng teá baøo coøn soáng sau quaù trình nhaân gioáng trong moâi tröôøng tieâu c huaån
Thôøi gian nhaân gioáng tro ng moâi tröôøng tieâu chuaå n
Toång löôïng sinh khoái thu ñöôïc bôûi qua ù trình nhaân gioáng trong mo âi tröôøng tieâu chuaån
Khaû naêng thích nghi tro ng moâi tröôøng tieâu chuaå n
Khaûo saùt ñoäng hoïc qu aù trình phaân giaûi acid mal ic trong moâi tröôøng ñeä m tartaric (pH 4,5) vaø trong moâi tröôøng tieâu chuaån Tieâu chí thöù 3: daønh cho caùc yeâu ca àu ñaëc bieät veà chaát löôïng röôïu vang
Söï töông taùc cu ûa vi khuaå n malolactic vôùi naám me n trong quaù trình leân men ethanol
Söï töông taùc cu ûa vi khuaå n malolactic vôùi caùc vi khuaån lactic khaùc
Khaû naêng choáng bacterio phage
Khaû naêng choáng laïi caùc c haát baûo veä thöïc vaät (pesticides)
Khoâng hình thaønh caùc a min sinh hoïc (biogenic amines)
Khaû naêng hình thaønh diacetyl vaø acetoine
Khaû naêng le ân men giôùi h aïn ñöôøng hexose vaø pent ose thaønh caùc acid deã ba y hôi CHÖÔNG 2: TAÙC NHAÂN LEÂN MEN MALOLACTIC 36 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang
Khoâng taïo thaønh acid ac etic
Leân men giôùi haïn caùc aci d höõu cô co ù trong vang ( ví duï succinate, citrate)
Khoâng phaân giaûi glycerol
Ñieàu chænh caùc chæ tieâu veà caûm quan (höông vaø vò) cho vang. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 37 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang CHÖÔNG 3 QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 3.1 THAØNH PHAÀN HOÙA HOÏC CUÛA DÒCH LEÂN MEN SAU QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN CHÍNH Quaù trình leân men phuï hay leân men malolactic thöôøng ñöôïc thöïc hieän ôû giai ñoaïn taøng tröõ trong saûn xuaát vang ñoû. Do ñoù, trong phaàn naøy c huùng toâi chæ ñeà caäp ñeán thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa dòch leân men vang ñ oû sau quaù trình leân men chính. Baûng 3.1 Thaønh phaàn c uûa dòch nho vaø röôïu van g thoâng thöôøng (Vine R. P. vaø coäng söï, 1997) HÔÏP CHAÁT % trong dòch nho % trong röôïu vang Nöôùc 75,0 86,0 Ñöôøng (fructose, glucose vaø moät ít saccharose) 22,0 0,3 Alcohols (ethanol vaø haøm löôïng veát cuûa terpenes, glycerols vaø röôïu baäc cao) 0,1 11,2 Acid höõu cô (tartaric, malic vaø moät ít lactic, succinic, oxalic,...) 0,9 0,6 Khoaùng (potassium, calcium vaø moät ít sodium, magnesium, iron,...) 0,5 0,5 Phenols (caùc flavonoid nhö laø caùc chaát maøu cuøng vôùi caùc nonflavonoid nhö laø cinnamic acid vaø vanillin) 0,3 0,3 Caùc hôïp chaát chöùa nitô (protein, amino acid, humin, amide, ammonia,...) 0,2 0,1 Caùc hôïp chaát höông (caùc ester nhö laø ethyl caproate, ethyl butyrate,...) Veát Veát TOÅNG 100,0 100,0 CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 38 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa dòch nho sau leân men chính bao goàm: moät soá hôïp chaát chieát coù nguoàn goác töø nho nguyeân lieäu nhö caùc loaïi ñöôøng pentose vaø hexose chöa leân men hoaøn toaøn, caùc acid höõu cô (acid tar taric, acid malic) vaø caù c hôïp chaát polyphenol (an thocyanin vaø caùc acid phenolic) vaø caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa naá m men. Ñaây laø caùc chaát do naám men taïo ra trong quaù trình trao ñoåi chaát vaø ñöôïc chuùng tieát vaøo moâi tröôøng leân men. Nhieàu saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa naám men goùp phaàn taïo ra höông ( bo uquet) vaø vò cho röôïu vang thaønh phaåm Trong leân men ethanol, coù 2 saûn phaåm ñöôïc naám men taïo ra vôùi haøm löôïng cao nhaát laø röôïu ethylic vaø CO2. Ngoaøi ra coøn laø caùc saûn phaåm phuï vaø caùc saûn phaåm trung gian töø quaù trình dò hoùa glucid, trao ñoåi protein vaø lipid. Caùc saûn phaåm thöôøng gaëp laø caùc acid höõu cô (acid succinic, acid pyruvic), caùc alcohol (ethanol, po lyol vaø röô ïu baäc cao), c aùc hôïp chaát carbonyl (aldehyde, diacetyl, acetoin), caùc ester (ethylacetate, isoamylacetate...), caùc acid beùo maïch trung bình (hexanoic, decanoic, dodecanoic...). Hình 3.1 Sô ñoà chuoãi p haûn öùng sinh toång hôïp c aùc saûn phaåm trao ño åi chaá t töø naám men CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 39 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 3.1.1 Caùc acid höõu cô 1 – Caùc acid höõu cô khoâng bay hôi (non-volatile acid) a) b) c) d) e) Hình 3.2 Caùc acid khoân g bay hôi trong röôïu van g: a) acid citric, b) acid t artaric, c) acid m alic, d) acid succinic, e) acid l actic
Acid tartaric Coù hai loaïi acid chính thöôøng coù maët trong dòc h nho laø acid tartaric vaø acid malic. Haøm löôïng cuûa chuùng coù theå leân ñeán 90% haøm löôïng caùc acid coù maët trong d òch nho vaø chuùng taïo neân vò chua ñaëc tröng cho dòch nho. Tæ leä haøm löôïng cuûa hai loaïi acid naøy coøn phuï thuoäc vaøo gioáng nho, ñieàu kieän troà ng troït, khí haäu vaø thôøi ñieåm thu hoaïch nho. Acid tartaric ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc taïo moâi tröôøng pH thaáp cho dòch nho vaø vang. Haøm löôïng cuûa chuùng haàu nhö khoâng thay ñoåi trong suoát quaù trình leân men do naám men khoâng söû duïng ñöôïc acid tartaric. Do vaäy, acid naøy raát caàn thieát cho vang ñeå ñaûm baûo ñoä beàn veà maë t vi sinh vaø oån ñònh ñoä chua cho saûn phaåm.
Acid malic Cuøng vôùi acid tartaric, acid malic cuõng goùp phaàn laøm giaûm pH moâi tröôøn g nöôùc nho vaø taïo neân vò chua gaét cho vang. Haøm löôïng acid malic trong dòch nho khoaûng 3 ÷ 4,5 g/L. Haàu heát naám men ñeàu coù theå söû duïng acid malic laøm cô chaát. Möùc ñoä chuyeån h oùa acid malic coøn tuø y thuoäc vaøo töøng loaøi. Ví duï, Saccharomyces cerevisiae coù theå phaân giaûi ñöôïc 3 ÷ 45% löôïng acid CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 40 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang malic coù trong dòch nho trong khi Schizosaccharomyces pombe vaø Schizosaccharomyces malidevorans coù theå chuyeån hoùa gaàn nhö hoaøn toaøn acid naøy thaønh ethanol vaø CO2 (Radler 1993). Acid malic coù vò chua gaét raát khoù chòu, d o ñoù, ñeå naâng cao gia ù tr ò caûm quan cu ûa röôïu vang, ngöôøi ta tieán haønh loaïi acid malic trong dòc h leân men.
Acid succinic Acid succinic hoaøn toaøn vaéng maët trong dòch quaû nho. Tuy nhieân, ngöôøi ta thaáy raèng sau quaù trình leân men chính haøm löôïng acid naøy coù t heå leân ñeán 2 g/L (Radler 1993, Coulter vaø coäng söï 2004). Acid succinic coù theå gaây vò chua ñaéng cho vang vaø ñöôïc taïo thaønh bôûi naám men thoâng qua chu trình tri-carboxylic acid (TCA).
Caùc ketoacid Ñaïi dieän cho nhoùm naøy bao goàm caù c acid nhö acid pyruvic, oxaloacetic , α-ketoglutaric ... Haøm löôïng acid pyrvi c coù trong vang khoaû ng 11 ÷ 460 mg/L vaø α- ketoglutaric khoaûng 2 ÷ 341mg/L. Tæ leä haøm löôïng 2 acid naøy phuï thuoä c vaøo ñieàu kieän aùp suaát CO2 trong quaù trình leân men, neáu leân men trong ñieàu kieän dö aùp suaát CO2 thì haøm löôïng acid pyruvic giaûm nhöng haøm löôïng α-ketoglutari c laïi taêng leân. Ngöôøi ta nhaän thaáy raèng, söï taïo thaønh 2 loaïi acid naøy coøn phuï thuoäc vaøo chuûng naám men do söï khaùc nhau veà hoaït tính enzyme caboxylase giöõa caùc chuûng. Neáu p yr uvate carboxylase hoaït ñoäng caøng maïnh thì acid pyruvic taïo thaønh caøng ít. Ñieàu naøy raát coù y ù nghóa trong saûn xuaát röôïu vang vì acid pyruvic tích tuï trong dòch leân men coù theå lieân keát vôùi SO2 laøm giaûm hoaït tính khaùng khuaån cuûa chaát n aøy.
Acid lactic Acid lactic thöôøng xuyeân coù maët trong quaù trình leân men röôïu vang. Haøm löôïng cuûa chuùng coù theå leân ñeán 2,5 g/L ñoái vôùi vang traéng vaø 4,5 g/L ñoái vôùi vang ñoû. Acid lactic toàn taïi trong röôïu vang ôû 2 daïng L(+) vaø D(-).
Acid citric Acid citric ñöôïc taïo thaønh trong ñieàu kieän leân men vang bình thöôøng nhöng vôùi haøm löôïng khoâng lôùn, naèm trong kh oaûng 0,3-0,8 g/L. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 41 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Baûng 3.2 Thaønh phaàn caùc moät soá a cid höõu cô chính trong dòch nho ñoû vaø röôïu vang ñoû (Romero, 1993) Acid höõu cô Dòch nho ñoû Röôïu vang ñoû Acid citric Acid tartaric Acid malic Acid succinic Acid lactic Acid acetic 0,25 – 0,35g/L 4,07 – 7,65g/L 1,99 – 2,91g/L Raát ít Raát ít Raát ít 0,17 – 0,40g/L 2,60 – 5,7g/L 0,06 – 3,13g/L 0,48 – 1,22g/L 0,07 – 4,89g/L 0,30 – 1,44g/L 2 – Caùc acid höõu cô bay hôi Caùc acid bay hôi thöôøng gaëp ôû vang laø caùc ac id höõu cô maïch ngaén nhö: acid acetic, propionic, isobutyric, butyric, isovaleric, capronic, caprilic, valeric. Haøm löôïng caùc acid naøy khoaûng 500-1000 mg/L (chieám 10-15% haøm löôïng acid toång trong vang). Trong ñoù chuû yeáu laø acid acetic, chieám 90% haøm löôïng caùc a cid ba y hôi (Fowles 1992, Henschke vaø Jiranek 1993, Radler 1993). Moät soá naá m men coù theå söû duïng acid acetic laøm cô chaát dinh döôõng vaø nhö vaäy trong quaù trình leân men, haøm löôïng acid bay hôi naøy seõ giaûm daàn. 3.1.2 Caùc alcohol vaø polyol 1 – Ethanol Ethanol laø saûn phaåm chính ñöôïc taïo thaønh töø quaù trình leân men kî khí cuûa naám men trong moâi tröôøng dòch nöôùc nho. Haøm löôïng ethanol trong saûn xuaát röôïu vang coù theå ñaït ñöôïc khoaûng 15%. Haøm löôïn g ethanol cao ha y thaáp coøn tuøy thuoäc vaøo gioáng naám men, tyû leä gioáng caáy, haøm löô ïng ñöôøng, ñieàu kieän leân men (nhieät ñoä, pH, möùc ñoä ye ám k hí, möùc ñoä sulfite hoùa moâi tröôøng...). 2 – Glycerol Glycerol ñöôïc taïo thaønh töø quaù trình leân men ethanol (Gancedo vaø coäng söï 1968, Scanes vaø coäng söï 1993). Glycerol hieän dieän trong vang khoâ (dry wine) vaø vang baùn ngoït (semi-sweet wine) vôùi haøm löôïng kho aûng 5 ÷ 14 g/L, coøn ñoái vôùi vang nho nhieãm naám moác Botrylis cinerea (botrytised wine) thì haøm löôïng glycerol coù theå leân ñeán 25 g/L (Rankine vaø Bridson 1971, Nieuwoudt vaø coäng söï 2002). Vang ñoû coù haøm löôïng glycerol cao hôn vang traéng (Nieuwoudt vaø coäng söï 2002). Söï khaùc nhau veà haøm löôïng chaát naøy trong vang coøn phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 42 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang coâng ngheä cuï theå (nhieät ñoä leân men, möùc ñoä sulfite hoùa,...) vaø ñaëc bieät laø phuï thuoäc vaøo töøng chuûng naám men söû duïn g. Aûnh höôûng quan troïng nhaát cuûa glycerol ño ái vôùi saûn xuaát röôïu vang laø chaát naøy laøm taêng khaû naêng chòu aùp suaát thaåm thaáu cuûa naám men t rong ñieàu kieän leân men coù noàng ñoä ñöôøng c ao (Pronk vaø coäng söï 1996). Ngoaøi ra ôû haøm löôïng c ao, glycero l coù theå laøm ta ê ng vò ngoït vaø ñoä nhôùt cuûa vang. 3 – Caùc röôïu baäc cao Caùc röôïu baä c cao ñöôïc taï o thaønh töø caùc phaûn öùng khöû amin hoaëc chuyeån amin cuûa caùc acid amin, cuõng coù theå taïo t haønh töø phaûn öùng khöû cacboxyl cuûa caùc ketoacid vaø khöû ca ùc aldehyde trong quaù trình leân men ethanol. Moät soá nghieân cöùu cuõng chöùng minh ñöôïc raèng caùc röôïu baäc cao coøn ñöôïc toång hôïp töø caùc phaûn öùng chuyeån hoùa carbohydrate trong quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men. Caùc loaïi röôïu baäc cao t höôøng coù maët trong vang laø n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol, 2-methyl butanol, 3-methyl butanol, n-hexanol, röôïu β-phenyl ethylic... Haøm löôïng ca ùc röôïu naøy coù trong vang phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän leân men dò ch nho. Cuï theå:  Trong ñieàu kieän leân men coù O2 seõ taïo ra caùc röôïu baäc cao coù haøm löôïn g lôùn hôn ôû ñieàu kieän leân men k î khí hoaëc leân men döôùi aùp löï c CO2.  Leân men döôùi aùp suaát C O2 seõ giaûm ñöôïc haøm lö ôïng röôïu baäc cao, ñaëc bi eät laø 2 loaïi röôïu isobutyric vaø amylic, naâng cao ñöôïc haøm l öôïng cuûa β-phenylethylic. Ñieàu naøy coù taùc duïng c aûi thieän chaát löôïng röôïu vang, vì r öôïu isobutyric vaø amylic aûnh höôûng xaáu ñeán muøi vaø vò cuûa vang vaø 2 loaïi röôïu naøy laïi chieám tôùi 90% khoái löôïng taát caû röôïu baäc cao coù trong va ng. (Löông Ñöùc Phaåm)  Vieäc boå sung caùc muoái amoni vaøo moâi tröôøng ngheøo nitô coù theå laøm giaûm haøm löôïng caùc röôïu baäc cao ñi 1,4 ÷ 1,7 laàn. Khi theâm α-alanine, acid α-amylo butyric, leucine, isoleucine vaø valine vaøo moâi tröôøng thì seõ thuùc ñaåy quaù trình sinh toång hôïp caùc röôïu baäc cao coù caáu truùc töông öùng vôùi caùc acid amin ñoù, ngoaøi ra, coøn taïo ra haøng loaït caùc röôïu baäc cao khaù c. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 43 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Hình 3.3 Caùc phaûn öùng hình thaønh röôïu baäc cao ôû naám men 3.1.3 Caùc hôïp chaát carbonyl 1 – Caùc aldehyde Caùc a ldehyde hay gaëp ôû vang laø ald ehyde acetic, propionic, butyric, valeric,... ÔÛ noàng ñoä cao caùc aldehyde naøy coù muøi raát gaét. Khi pha loaõng, tröø aldehyde acetic, caùc aldehyde coøn laïi coù muøi deã chòu cuûa caùc mu øi höông traùi caâ y töï nhieân (Löô ng Ñöùc Phaåm, 2005). Acetaldehyde laø thaønh phaàn carbonyl ñöôïc taïo thaønh töông ñoái phoå bieán ñöôïc tìm thaáy trong röôïu vang vôùi haø m löôïng khoaûng 10 ÷ 75 mg/L. Ngöôõng c aûm nhaä n cuûa noù la ø 100 m g/L CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 44 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Hình 3.4 Sô ñoà con ñöôø ng chuyeån hoùa a cid citric thaønh diacetyl, ace toin vaø 2,3-buthanediol (Schreier 1979, Berg vaø coäng söï 1955). Söï coù maët cuûa acetaldehyde laø yeáu toá hoaøn toaøn khoâng mong muoán trong saûn x uaát röôïu vang vì chaát na ø y taïo thaønh töø phaûn öùng oxi hoùa ethanol, do vaäy chuùng coù theå laøm tieâu hao moät löôïng ethanol sinh ra bôûi naám men trong ñieàu kieän thích hôïp (khi coù maët cuûa oxy khoâng khí). Söï hieän dieän cuûa aldehyde coøn giuùp nhaø saûn xuaát ñaùnh giaù ñöôïc möùc ñoä oxi hoùa cuûa dòch leân men vaø ñöa ra giaûi p haùp khaéc phuïc khi caàn t hieát. Maët khaùc, do trong caáu truùc phaân töû coù nhoùm C=O neân acetaldehyde coù theå laøm giaûm haøm löôïng SO2 töï do trong dòch leân men baèng caùch taïo lieân keát vôùi chaát naøy, töø ñoù laøm gia ûm taùc duïng öùc cheá cuûa chaát naø y leân vi sinh vaät. Beân caï nh ñoù, acetaldehyde coøn coù khaû naêng choáng laïi taùc ñoäng cuûa SO2 leân caùc chaát maøu neân taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho caùc phaûn öùng ngöng tuï polyphenol trong vang nhö tanin, catechin, anthocyanin taïo thaønh caùc phöùc chaát maøu beàn vöõng. 2 – Acetoin vaø diacetyl Caùc nghieân cöùu cho thaáy hai chaát naø y ñeàu coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán chaát löôïng röôïu vang maëc duø soá löôï ng cuûa chuùng taïo r a trong vang khoâng lôùn laé m: acetoin töø 2 ÷ 84 mg/L vaø diacetyl töø 0,1 ÷ 1,8 mg/L. Haøm löôïng acetoin vaø diacetyl taïo thaønh coøn phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu vaø chuûng naám men söû duïng. Neáu noàng ñoä ñöôøng caøng cao (2,5 ÷ 10,0g/100 mL) thì diacetyl seõ tích tuï caøng nhieàu. Söï coù maët cuûa chuùng trong vang coù hai khaû naêng: aûnh höôûng lôùn ñeán höông vò vang vaø nhöõng bieán ñoåi hoùa sinh. Diacetyl ôû noàng ñoä thaáp laøm cho vang coù muøi ñaëc tröng, nhöng ôû haøm löôïng lôù n hôn 1mg/l seõ laøm cho vang coù muøi vò chua oxy hoùa. Söï taïo thaønh diacetyl vaø acetoin trong leân men coøn coù moái quan heä töông taùc vôùi haøm löôïng sulfite hoùa tro ng dòch quaû. Neáu dòch quaû khoâng ñöôïc sulfite hoùa thì coù theå daãn ñeán söï taïo thaønh acetoin coù haøm löôïng toái ña vöôït quaù 2 laàn so vôùi dòch quaû ñöôïc sulfite hoùa. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 45 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 3.1.4 Caùc ester Caùc ester ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình leân men röôïu vang vôùi moät löôïng ñaùng keå vaø ñöôïc xem nhö laø nhöõng hôïp chaát quan troïng trong vieäc hình thaønh höông vò ñaëc tröng cho vang. Söï sinh toång hôïp caùc ester c où theå ñöôïc minh hoïa toù m taét treân hình 3.5. Trong soá caùc ester ñöôïc taïo thaønh töø naám men, ethylacetate laø chaát coù haøm löôïng cao vaø vöôït troäi hôn nhöõng ester coøn laïi cuõng nhö nhöõng hôïp chaát höông khaùc (xem baûng 3.1). Haøm löôïng cuûa ethylacetate coù trong vang khoaûng 22,5 ÷ 63,5 mg/L. Noù goùp phaàn taïo neân höông vò traùi caây töï nhieân cho vang. Haøm löôïng cuûa chuùng coøn tuøy thuoäc vaøo gioáng naám men, ñieàu kieän leân men vaø möùc ñoä oxi hoùa cuûa moâi tröôøn g. Neá u moâi tröôøng coù theá oxi hoùa khöû caøn g cao thì löôïng acetic taïo thaønh caøng nhieàu. Acid acetic seõ phaûn öùng vôùi ethanol do naám men taïo ra ethylacetate. Tuy nhieân, neáu möùc ñoä oxi hoùa cuûa moâi tröôøng quaù cao thì cuõng coù theå laøm giaûm hieäu suaát sinh toång hôïp ethanol cuûa naám men. Vì vaäy, ta caàn phaûi ñaûm baûo ñieàu kieän leân men ñöôïc kieåm soaùt ôû möùc ñoä oxi hoùa vöøa phaûi. Hình 3.5 Sô ñoà caùc con ñöôøng hình thaønh caùc ester cuûa naám men trong l eân men röôïu vang CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 46 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Trong leân men vang tích tuï caû caù c ester coù ñoä soâi thaáp laãn ester coù ñoä soâi cao (ester ethyl cuûa caùc acid caprotan ic, caprilatic, caprinic, isoamulcaproic vaø caù c acid beùo linolevic, linolenovic...). Soá löôïng caùc ester naøy phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän leân men hieáu khí hay kò khí vaø leân men döôùi aùp löïc CO2 hay khoâng co ù aùp löïc CO2. Vang non ñöôïc leân m en döôùi aùp lö ïc CO2 seõ laøm cho haøm löôïng caùc e ster coù ñoä soâi cao nhieàu hôn (Löông Ñöùc Phaåm, 2005). Baûng 3.3 Thaønh phaàn caùc hôïp chaát mu øi coù trong vang nho Ghi chuù: * ethanol 10%; * * röôïu vang; *** vang ñoû; **** beer, ***** synthetic water, ****** nöôùc. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 47 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 3.1.5 Lipid Lipid trong vang do coù hai nguoàn goác: töø quaû vaø töø söï trao ñoåi chaát cuûa naám men. Loaïi quaû coù chöùa chaát beùo thì sau leân men chính, caùc chaát beùo naøy ít bò bieán ñoåi seõ ñöôïc chuyeån vaøo trong vang non. Treân beà maët quaû nho thöôøng coù phuû moät lôùp saùp vaø lôùp saùp naøy coù theå rôi vaøo dòch quaû. Thaønh phaàn c hính cuûa chaát saùp naøy l aø ester giöõa a cid linolevic vaø caùc röôïu. Trong vang, ngöôøi ta tìm thaáy haøm löôïng acid beùo coù nhieàu hôn trong dòch quaû do keát quaû cuûa quaù trình sinh toång hôïp chaát beùo cuûa naám men. Thaät vaäy, trong dòch nöôùc nho chöa leân men haøm löôïng lipid toång laø 50mg/ l coøn trong dòch leân men chính haøm löôïng lipid t ôùi 73 ÷ 113 mg/l. 3.1.6 Caùc hôïp chaát chöùa löu huyønh 1– Sulfuahydryl Caùc hôïp chaát coù mang nhoùm –SH (sulfuahydryl ) sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám men vaø ñöôïc naám men tieát vaøo moâi tröôøng trong quaù trình leân men. Caùc hôïp chaát naøy bao goàm caùc chaát nhö glutati on vaø cysteine ñöôïc tieát vaøo moâi tröôøng seõ laøm gi aûm theá oxi hoùa – khöû (chæ soá naøy raát quan troïng trong quaù trình leân men vaø taøng tröõ röôïu vang). Söï thay ñoåi theá oxi hoùa – khöû (Eh) trong quaù trình leân men phuï thuoäc vaøo toác ñoä sinh saûn cuûa naám men vaø möùc ñoä taêng sinh khoái. Eh baét ñaàu giaûm ôû thôøi ñieåm naám men sinh saûn, khi nhu caàu oxi caàn laø toái ña. Ngöôøi ta nhaän thaáy r aèng, trong dòch le ân ñöôïc sulfite hoùa theá oxi hoùa – khöû giaûm khaù maïnh. Caùc hôïp chaát –SH thuoäc loaïi caùc chaát coù tính khöû cao. Söï co ù maët cuûa nh öõng chaát naøy goùp phaàn vaøo vieäc baûo veä, tr öôùc heát laø caùc ca áu töû hö ông khoûi bò taùc duïng cuû a caùc taùc nhaân oxy hoùa. Haøm löôïng caùc chaát khöû naøy khoâng gioáng nhau ôû caùc loaïi quaû ngu yeân lieäu vaø ôû caùc loaïi vang leân men trong ñieàu kieän thöôøng cuõng nhö vang leân men trong ñieàu kieän döôù i aùp löïc CO2. Vang non thu nhaän baèng phöông phaùp leân men döôùi aùp löïc CO2 thì haøm löôïng caùc hôïp chaát sulfuahydryl taêng leân khoaûng 245 m g/L, trong ñoù haøm löôïng glutation khöû laø 98 m g/L. Nhöng trong leân men bình thöôøng caùc haø m löôïng cu ûa ca ùc hôïp chaá t treân töông öùng chæ ña ït 113 vaø 6mg/L. 2– Sulfuahydro (H2S) Hôïp chaát naøy coù khaû naêng taïo muøi khoù chòu cho vang. Neáu haøm löôïng cuûa noù vöôït quaù 0,005 mg/L thì coù theå l aø m giaûm chaát löôïng caûm quan cuûa vang. Söï sinh toång hôïp H2S bôûi naám men trong leân men ethanol tuøy thuoäc vaøo töøng chuûng naám men söû duïng vaø nhieät ñoä moâi tröôøng. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 48 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Naám men coù theå chuyeån hoùa S vaø SO2 thaønh H2S. Cysteine, acid aspartic, glutamic, glycerin, histidine, ornithine, serine, threonine kích thích taïo thaønh H2S. Caùc chaát methionine, acid pantothenic, vitamin B6 laïi kìm haõm söï tích tuï H2S. Söï taïo thaønh H2S cuûa moãi chuûng naám men phuï thuoäc vaøo ñaëc tính di truyeàn. Coù theå duøng hoãn hôïp caùc chuûng n aám men coù khaû naêng vaø khoâng coù khaû naêng khöû sulfate trong leân men seõ laøm giaûm söï noàng ñoä H2S ñöôïc taïo thaønh trong moâi tröôøng. Baûng 3.4 Thaønh phaàn caùc hôïp chaát löu huyønh c où trong vang 3– Sulfur dioxide (SO2) Trong quaù trình leân me n, naám men seõ söû duïng moät löôïng nhoû sulfate trong moâi tröôøng vaø khöû chaát naøy thaønh sulfite. Moät soá naám men coù khaû naêng sinh toång hôïp sulfur dioxide töø α- cysteine hoaëc glutation. Caùc chuûng naám men thuoäc loaøi Saccharomyces bayanus coù theå taïo ra sulfur dioxide nhieàu hôn caùc chuûng thuoäc loaøi Saccharomyces cerevisiae. Haøm löôïng sulfate trong dòch leân men caøng cao thì sulfur dioxide taïo thaønh caøng nhieàu. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 49 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang (a) (b) 3.1.7 Caùc hôïp chaát polyphenol 1- Caùc chaát maøu trong vang bao goàm 2 nhoùm: anthocyane vaø flavones Anthocyanes Caùc hôïp chaát anthocyanes coøn ñöôïc goïi laø caùc a nthocyanosides vì laø mono hay diglucoside cuûa goác ñöôøng glucose, galac tose hay rhamnose keát hôïp vôùi anthocyanidin (anthocyanidol) taïo maøu ñoû, xanh, tím vaø caùc maøu trung gian. Maøu cuûa anthocyanin phuï thuoäc vaøo pH cuûa moâi tröôøng. ÔÛ pH acid, anthocyane cho maøu ñoû, pH acid yeáu thì daïng khoâng maøu chieám öu theá. ÔÛ pH cao, anthocyane chuyeån sang maøu x anh da trôøi roài xanh luïc. Coù nhieàu loaïi hôïp chaát anthocyane, thöôøng gaëp nhaát l aø pelar gonidol, cyanidol vaø de finidol. Catechin Leucoanthocyanne Anthocyanidol ( khoâng maøu) (khoâng maø u) (ñoû, xanh) Perlargonidol Apigenidol (ít gaëp ) C yannidol (maøu xanh) Delfinidol Peonidol Xirinhidol Hình 3.6 Caùc loaïi anthocyanidin (a) vaø anthocya nes (b) CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 50 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang Hình 3.8 Caáu truùc phaâ n töû cuûa a cid tannic Flavones Caùc flavones cuõng coù baûn chaát laø glucoside taïo maøu cho dòch nho vaø vang. Thuoäc nhoùm naøy coù kaempferol (monoglu conosate), quercetine (monoglucoside, monogluconoside) vaø myricetine (monoglucoside). Myricetine khoâng coù trong nho xanh. R ≡ R’ ≡ H : Kaempferol R ≡ OH ; R’ ≡ H : Quece tine R ≡ R’ ≡ OH : Miricetine Hình 3.7 Coâng thöùc caá u taïo cuûa caùc hôïp chaát Fl avones 2- Tannin Trong caùc thaäp ky û qua, thaønh phaàn polyphenolic trong nho raát ñöôïc ñöôï c quan taâm do noù aûnh höôûng ñeán giaù trò caûm quan cuûa röôïu vang (maøu saéc vaø muøi vò) vaø caùc giaù trò dinh döôõng khaùc (theo quan ñieåm veà y hoïc, tannin ñöôïc xem laø chaát choáng oxi hoùa, choáng khoái u vaø beänh maïch vaønh). Tannin xuaát phaùt töø chöõ “tanning” coù nghóa laø thuoäc da vì tannin coù khaû naêng phaûn öùng vaø keát tuûa vôùi c aùc protein coù trong da ñoä ng vaät (Hagerman, 2002 ). Coù 2 daïng tannin:
Tannin thuûy phaân: coù nguoàn goác töø caùc acid phenolic nhö laø ac id gallic vaø a cid ellagic.
Tannin ngöng tuï: laø pol ymer cuûa flavan- 3-ol (epicatechin, catechin vaø gallocatechin) vaø f lavan-3,4-diol. Tannin coù ôû trong nho vaø röôïu vang chuû yeáu laø caùc tannin ngöng tuï. Tannin coù theå ñöôïc theâm vaøo röôïu vang döôùi daïng a cid tannic (Hình 3.8) ñeå phaûn öùng vaø keát tuûa vôùi protein vaø ñeå caûi thieän ñoä trong cuû a röôïu vang. Trong suoát quaù trình uû, söï thay ñoåi haøm löôïng tannin ngöng tuï seõ aûnh höôûng ñeán maøu saéc vaø tính chaát caûm quan cuûa röôïu vang, vaø khi ñoù, khoái löôïng phaân töû cuûa tannin coù theå taêng leân. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 51 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 3.2 CAÙC BIEÁN ÑOÅI DIEÃN RA TRONG QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 3.2.1 Caùc bieán ñoåi sinh hoïc 3.2.1.1 Söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolactic 1- Söï hieän dieän cuûa loaïi vi khuaån malolactic khaùc nhau trong dòch leân men chính Trong hoãn hôïp dòch nho tröôùc khi leân men coù chöùa raát nhieàu loaøi vi khuaån lactic khaùc nhau. Sau quaù trình leân men chính (noàng ñoä ethanol ñaït 13%) thì haàu nhö chæ coøn Oenococcus oeni phaùt trieån vôùi soá löôïng k hoaûng 106 cfu/mL (xem baûng 2.6). Nhö vaäy, O. oeni laø vi khuaån thích hôïp ñeå thöïc hieän quaù trình leân men malolactic hôn caû. Vi khuaån naøy coù k haû naêng chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän khaéc nghieät cu û a moâi tröôøng leân men. 2- Söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolactic vôùi caùc phöông phaùp leân men khaùc nhau Trong tröôøng hôïp quaù trình leân men malolactic xaûy ra moät caùch töï phaùt (khoâng thöïc hieän vieäc caáy gioáng vi khuaå n malolactic vaøo dòch l eân men röôïu vang ha y dòch nho), vi khuaån malolactic coù saün trong nho hay thieát bò leân men seõ phaùt trieån sau quaù trình leân men chính (töùc trong giai ñoaïn taøng tröõ vang). Söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa chuùng trong ñieàu kieän treân coù nhöõng thuaän lôïi laø trong dòch vang luùc naøy coù chöùa moät soá hôïp chaát ñöôïc giaûi phoùng töø quaù trình töï phaân cuûa xaùc naám men. Caùc chaát naøy coù taùc duïng kích thích söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolactic. Vì vaäy, trong ngheà laøm röôïu vang töø laâu ngöôøi ta ñaõ gi öõ quan ñieåm cho raèng taøng tröõ vang treân xaùc naám men men hay boå sung caùc saûn phaåm töø quaù trình töï phaân cuûa naám men seõ laøm taêng chaát löôïng vang thaønh phaåm. Tuy nhieân, coù moät soá nhaø nghieân cöùu laïi cho raèng chính nhöõng hôïp c haát töø quaù trình töï phaân xaùc naám men cuõng taïo ñ ieàu kieän thuaän lôïi cho caùc vi khuaån khoâng mong muoán phaùt trieån vaø laø nguyeân nhaân laøm giaûm chaát löôïng röôïu vang. Beân caïnh ñoù, vieäc leân men malolactic bôûi moät soá loaøi vi khuaån lactic coù saün trong nguyeân lieäu cuõng coù theå ga ëp khoù khaê n do phaàn lôùn caùc vi khuaån naøy khoâng chòu ñöôï c noàng ñoä ethanol cao sau quaù trình leân men chính. Do ñoù, quaù trình leân men malolactic hoaëc khoâng dieãn ra hoaëc seõ dieãn ra raát chaäm vaø keùo daøi. Töø nhöõng nhöôïc ñieåm keå treân, ngöôøi ta thaáy raèng neáu thöïc hieän quaù trình leân men malolactic baèng phöông phaùp leân men töï nhieân seõ daãn ñeán heä quaû laø quaù trình leân men raát khoù kieå m soaùt vaø chaát löôïng saûn phaåm seõ khoâng o ån ñònh. Trong coâng nghieäp saûn x uaát röôïu vang hieän nay, ngöôøi ta aùp du ïng phöông phaùp leân men co ù kieåm soaùt baèng caùch ca áy canh tröôøng vi khuaån m alolactic thuaàn khieát vaøo dòch vang sau khi keát CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 52 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang thuùc quaù trình leân men chính hoaëc caáy hoãn hôïp naám men vaø vi khuaån malolactic tröôùc khi baét ñaàu quaù trình leân men ethanol. Öu ñieåm cuûa caùc phöông phaùp naøy laø r uùt ngaén thôøi gian leân men malolactic, töø ñoù la ø m ruùt ngaén thôøi gian leân men phuï, ñoàng thôøi mang laïi chaát löôïng röôïu vang toát hôn vaø oån ñònh hôn. Trong tröôøng hôïp c aáy gi oáng vi khuaån malol actic cuøng vôùi naám men (xem hình 3.9b) ngöôøi ta tieán haønh nhö sau: caáy gioáng (hoãn hôïp naám men vaø vi khuaån) vaøo dòch nho vaø cho leân men röôïu ôû nhieät ñoä 25 oC vaø pH ban ñaàu laø 4,8. ÔÛ t aát caû ca ùc maãu thöû nghi eäm ñeàu thaáy raèng, soá löôïng teá ba øo vi khuaån malolactic ñöôïc ñöa vaøo va ng ñeàu giaûm nhanh ôû nhöõng giôø ñaàu vaø sau 48 giôø leân men thì trong vang coù tôùi 25-90% soá teá baøo maát khaû naêng sinh saûn. Tuy nhieân, töø ngaøy leân men thöù 15 ñeán ngaøy thöù 30, chuùng baét ñaàu oån ñònh, thích öùng daàn vôùi moâi tröôøng vaø sinh tröôûng. Nhö vaäy, thôøi gia n caàn thieát ñeå vi khuaån malolactic thích öùng ñöôï c vôùi moâi tröôøng vang coù theå keùo daøi töø 8 ñeán 3 0 ngaøy. Trong tröôøng hôïp caáy gioáng vi khuaån malolactic (ñöôïc taùi hoaït hoùa tröôùc) vaøo canh tröôøng sau leân men ethanol thì vi khuaån lactic coù theå sinh tröôûng vaø phaùt trieån nhanh hôn. Töø ñoù, thôøi gian leân men coù theå ñöôï c ruùt ngaén hôn. 3- Ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolactic Ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolactic trong moâi tröôøng vang ba o goàm 4 pha: Pha thích nghi (pha lag): trong tröôøng hôïp leân men coù caáy gioáng vi khuaån malolactic töø beân ngoaøi vaøo, pha lag töông ñöông vôùi giai ñoaïn vi khuaån malolactic thích nghi vôùi moâi tröôøng. Vaän toác sinh tröôûng trong giai ñoaïn naøy coi nhö baèng khoâng. Soá löôïng teá baø o vi khuaån malolactic luùc naøy khoâng ta êng nhö ng söï trao ñoåi chaát cuû a chuùng laïi dieãn ra ma ïnh meõ. Haøm löôïng caùc nucleotide, protein, ñaëc bieät laø caùc enzyme tham gia vaøo quaù trình trao ñ oåi chaát ñöôïc toång hôïp vôùi toác ñoä raát nhanh. Song, ñieàu khoâng thuaän lôïi xaûy ra trong giai ñoaïn naøy laø chaát dinh döôõng trong dòch leân men haàu nhö ñaõ ñöôïc naám men söû duïng gaàn heát, ñoàng thôøi naám men laïi giaûi phoùng ra ethanol gaây öùc cheá vaø kìm haõm söï trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån malolactic. Vì vaäy neáu muoán pha thích nghi xaûy ra nhanh thì ta phaûi caáy vaøo moâi tröôøng leân men moät löôïng gioáng lôùn bao go àm caùc teá baøo treû, k hoûe vaø coù khaû naêng thích nghi cao. Pha sinh tröôûng luõy thöøa (pha log): trong pha naøy haàu heát caùc vi khuaån malolactic ñaõ qua pha thích nghi seõ sinh tröôûng vôùi toác ñoä sinh tröôûng laø cöïc ñaïi. Soá löôïn g teá baøo seõ taêng theo qu y luaät caáp soá nhaân. Taát caû caùc chaát dinh döôõng trong moâi tröôøng ñöôïc vi khu aån söû duïng chæ nhaèm CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 53 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang TAØNG TRÖÕLEÂN MEN MALOLACTIC LEÂN MEN ETHANOL XÖÛ LYÙ NGUYEÂN LIEÄU Nấm men (a) (b) (c) Nấm men Bổ sung chế phẩm vi khuẩn malolactic LEÂN MEN ETHANOL TAØNG TRÖÕ LEÂN MEN MALOLACTIC XÖÛ LYÙ NGUYEÂN LIEÄU Hình 3.9 Söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån malolacti c vaø caùc vi sinh vaät khaùc trong röôïu vang leân men malolactic töï nhieân (a) vaø le ân men malolacti c coù kieåm soaùt: caáy gioáng tröôùc ( b) vaø sau (c) khi leân men ethanol. CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 54 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang vaøo muïc ñích chính laø xaây döïng vaät chaát teá baøo vaø sinh saûn. Khi ñoù caùc chaát dinh döôõng seõ töø töø giaûm ñi vaø xu aát hieän moä t soá saûn phaåm trao ñoåi c haát khoâng caàn thieát coù k haû naêng ga ây ö ùc cheá teá baøo. Nhö vaäy, caùc ñieàu ki eän thuaän lôïi cho sinh tröôûng daàn da àn bò ma át ñi vaø baét ña àu chuyeån sang pha oån ñònh. Pha oån ñònh: trong pha naøy soá löôïng teá baøo soáng laø oån ñònh vaø maät ñoä qu aàn theå laø toái ña. Acid malic haàu nhö ñöôïc phaân giaûi hoaøn toaøn, caùc chaát dinh döôõng khaùc (coøn raát ít) cuõng ñöôïc vi khuaån tieáp tuïc söû duïng. Pha suy vong: trong pha naøy caùc teá baøo soáng baé t ñaàu giaø ñi, giaûm daàn vaø teá baøo cheát taêng daàn, xuaát hieän hieän töôïng töï phaân do caùc enz yme prot ease noäi baøo. 3.2.1.2. Söï sinh tröôûng vaø trao ñoåi chaát cuûa naám men Trong giai ñoaïn tieán haønh leân men malolactic, taùc nhaân vi sinh vaät chính laø vi khuaån malolactic. Söï hieän dieän cuûa naám men khoâng ñoùng vai troø roõ reät vì trong giai ñoaïn naøy haàu nhö naám men khoâng sinh tröôûng hoaëc sinh tröôûng raát yeáu vaø böôùc vaøo pha suy vong nhöôøng choã cho vi khuaån malolactic phaùt trieån. Moät phaàn naám men cheát ñi coù theå bò töï phaân. Hieän töôïng töï phaân cuûa naám men laø hieän töôïng caùc thaønh phaà n cuûa xaù c teá baøo naám me n bò phaân gia ûi döôùi taù c duïng cuûa enzyme thuûy phaân (hydrolase) cuûa chính baûn thaân teá baøo. Trong quaù trình naøy, haàu heát caùc protein, carbohydrate, acid nucleic, lipid vaø caùc vaät chaát cuûa teá baøo ñeàu bò phaân giaûi thaønh nhöõng chaát coù phaân töû löôïng thaáp hôn vaø hoøa tan vaøo moâi tröôøng. Ñieàu kieän ñeå hieän töôïng töï phaân teá baøo xaûy ra laø teá baøo ñaõ cheát nhöng vaãn coøn giöõ ñöôïc hoaït tính cuûa caùc enzyme hydrolase. Trong saûn xu aát röôïu vang truye àn thoáng, ngöôøi ta co ù theå taän duïng xaùc naám men töï phaân laøm nguoàn cung c aáp moät soá chaát dinh döôõng caàn thieát cho vi khuaån leân men malolactic phaùt trieån. 3.2.1.3. Töông taùc sinh hoïc giöõa naám men vaø vi khuaån malolactic Söï töông taùc giöõa naám men vaø vi khuaån malolactic coù yù nghóa quan troï ng trong saûn xuaát röôïu vang. Beân caïnh vieäc nghieân cöùu tuyeån choïn nhöõng gioáng vi khuaån malolactic coù khaû naêng thích nghi cao vaø leân men malolactic toát, ngöôøi ta coøn nghieân cöùu nhöõng töông taùc coù lôïi giöõa naám men vaø vi khuaån nhaèm muïc ñích taêng cö ôøng khaû naêng choáng ch òu cuûa vi khuaån tröôùc nhöõng aûnh höôûng baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Trong vaøi thaäp kyû qua, ñaõ coù khaù nhieàu nghieân cöùu cuûa caùc taùc giaû xoay quanh vaán ñeà töông taùc sinh hoïc giöõa naám men vaø vi khuaån malolactic (Fornachon, 1968; Beel man vaø coäng söï, 1982; L emaresquier, 1987; Lonvaud-Funel vaø coäng söï, CHÖÔNG 3: QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN MALOLACTIC 55 Leân men malolactic trong saûn xuaát röôïu vang 1988a,b; Henschke, 1993; Henick-Kling vaø Park, 1994). Taát caû nhöõng n ghieân nghieân cöùu naøy ñeàu ñaõ chæ ra ñöôïc caùc loaïi töông taùc khaùc nhau (kích thích, kìm haõm