Đề tài Lên men Gellan

Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 3 MỤC LỤC Lời nói đầu ……………………………………………………………………. 4 I. TỔNG QUAN……………………………………………..………………… 5 1. Giới thiệu……………………………………………….……………..5 2. Cơ chế tạo gel của gellan………………………………………..…..…6 3. Cơ chế tổng hợp gellan…………..………………………………….…8 II. NGUYÊN LIỆU………………………………………………………….…...10 1. Mật rỉ…………………………………………………………………..10 2. Giống vi sinh vật………………………………………………… .…....14 III. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ………………………………………………….17 IV. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ…………………………………..18 1. Nhân giống…………………………………………………………... 18 2. Chuẩn bị môi trường………………………………………………… 19 3. Tiệt trùng……………………………………………………………. 20 4. Lên men………………………………………………………………..21 5. Ly tâm lần 1………………………………………………..……….. 30 6. Kết tủa………………………………………………………………...31 7. Deacyl hóa…………………………………………………………… 32 8. Ly tâm lần 2………………………………………………….……… 33 9. Sấy…………………………………………………………………... 33 10. Nghiền……………………………………………………………….. 33 V. SẢN PHẨM………………………………………………………………… 34 VI. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ………………………….………..……………38 Tài liệu tham khảo………………………………………………….…………….44 Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 4 LỜI NÓI ĐẦU Trong những thập kỉ gần đây, trong thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp hóa chất việc sử dụng polysaccharide có nguồn gốc từ vi khuẩn ngày càng gia tăng. Thật ra, việc nghiên cứu những polymer sinh học từ lên men vi khuẩn đã bắt nguồn từ những năm 1880 với thành công đầu tiên là glycopolymer dextran, tiếp đến là xanthan (Jana & Ghosh 1997; Sanchezet al. 1997), Từ những năm 1969, việc nghiên cứu tiếp tục tập trung vào những polysaccharide mới có khả năng tan trong nước, và đã tìm ra được một polymer có tiềm năng quan trọng là gellan. Gellan đã bổ sung vào dòng những polysaccharide có nguồn gốc từ vi sinh vật đang được kiếm tìm, đóng vai trò quan trọng vì những tính chất mới của nó: là những chất tạo gel khi gia nhiệt và làm lạnh. Gellan được sản xuất và tiếp thị bởi một số công ty ở châu Âu, châu Mỹ… dưới những tên thương mại như: 'Gelrite', 'Phytagel' và 'Kelcogel' Chúng em xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đã tạo điều kiện cho chúng em có dịp tìm hiểu và thực hiện đề tài tiểu luận lên men“Gellan” trên quy mô công nghiệp, để chúng em đáp ứng yêu cầu và nắm vững hơn những kiến thức của môn học Công nghệ lên men. Trong quá trình thực hiện mặc dù chúng em đã cố gắng hết sức nhưng bài báo cáo vẫn còn nhiều sai sót, cảm ơn thầy đã tận tình giúp đỡ và đưa ra những nhận xét để chúng em hiểu rõ được vấn đề hơn. Nhóm thực hiện Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 5 I/ TỔNG QUAN 1. Giới thiệu: Gellan là polymer có khối lượng phân tử khoảng 500 000 Dalton, được sử dụng trong thương mại dưới dạng bột màu trắng, tan trong nước tạo gel, không tan trong ethanol. Gellan là exopolysaccharide được tách từ quá trình lên men tĩnh, hiếu khí của vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis. Cấu tạo của một đơn vị lặp lại dưới dạng mạch thẳng của gellan gồm : - β-1,3- D-glucose - β-1,4-D-glucuronic acid Tỉ lệ 2:1:1 - α-1,4- L-rhamnose Gellan có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, dược phẩm, y học… Hàm lượng acyl là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến độ bền của gel. Dựa vào hàm lượng acyl, người ta phân loại Gellan thành 2 loại: - High acyl gellan ( native gellan). - Low acyl gellan: Deacylated gellan. Gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra những gel có tính chất khác nhau. Gellan tự nhiên cho ra gel mềm, đàn hồi , thuận nghịch nhiệt và yếu do nhiều nhóm acetyl và glyceryl ngăn chặn sự liên kết chặt chẽ giữa các chuỗi polymer của gellan trong việc hình thành nhiều chuỗi xoắn ốc, và ngăn cản sự gói chặt chuỗi xoắn đôi bằng liên kết ngang. Quá trình deacyl hóa gellan cho ra gel chắc, giòn và thuận nghịch nhiệt do sự vắng mặt của nhiều nhóm acetyl và glyceryl. Hình 1: Công thức cấu tạo của native gellan Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 6 Hình 2: Công thức cấu tạo của Low acyl gellan 2. Cơ chế tạo gel của Gellan Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 7 Hình 3: Cơ chế tạo gel của gellan. Khi ở nhiệt độ cao, gellan tồn tại dưới dạng những sợi cuộn. Khi hạ nhiệt độ xuống, các sợi duỗi ra và xoắn kép với nhau tạo ra sợi kép. Và các sợi kép này tiếp tục liên kết với nhau tạo nên các tinh thể gellan. Sự hình thành gel của gellan xảy ra nhanh chóng khi nâng và hạ nhiệt độ của dung dịch gellan với sự có mặt của các cation. Ở nhiệt độ thấp, các sợi kép của gellan sẽ hình thành những vòng xoắn có trật tự, trong khi ở nhiệt độ cao xuất hiện các polysaccharide dạng sợi đơn làm giảm độ nhớt của dung dịch. Nhiệt độ chuyển tiếp là khoảng 30 - 35 0 C. Dưới nhiệt độ chuyển tiếp, cấu trúc của dịch trở nên cứng dần và kết quả là hình thành gel. Các sợi xoắn liên kết với nhau bằng các mối nối và hình thành nên mạng lưới không gian ba chiều bằng cách tạo phức hợp với các cation và liên kết hydro với nước. Sự bổ sung các cation hóa trị một và hóa trị hai trong suốt quá trình làm lạnh sẽ làm tăng số cầu muối tại mối nối, vì thế cải thiện được tính chất tạo gel của gellan. Sự hình thành gel của gellan rất nhạy với sự có mặt của loại cation. Những cation hóa trị một như Na, K và các cation hóa trị hai như Ca, Mg thì thúc đẩy sự tạo gel. Và điểm nóng chảy của gel sẽ tăng lên khi tăng độ mạnh của ion. Các ion đối như cation tetramethylammonium (TMA) sẽ kìm hãm sự tạo gel. Sự bổ sung các cation thúc đẩy quá trình tạo gel sẽ dẫn đến sự tinh thể hóa những sợi này và hình thành gel bền. lượng lớn nhóm thế L-glycerate sẽ hạn chế sự tinh thể hóa ở một số vùng, vì thế sản xuất ra gel mềm hơn và đàn hồi.  Khả năng tạo gel phụ thuộc vào: a. Liên kết giữa các phân tử:. - Độ bền gel phụ thuộc chủ yếu vào lực liên kết giữa các phân tử. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 8 Nếu chiều dài của vùng liên kết dài, lực liên kết giữa các chuỗi sẽ đủ lớn để chống lại áp lực và chống lại chuyển động nhiệt của các phân tử, gel tạo thành sẽ chắc bền. Nếu chiều dài của vùng liên kết ngắn và các chuỗi không được liên kết với nhau mạnh, các phân tử sẽ tách rời dưới tác dụng của áp lực hay sự tăng nhiệt độ (làm cho các chuỗi polymer chuyển động nhiệt), gel sẽ yếu và không ổn định. b. Cấu trúc các phân tử: - Những phân tử có nhánh không liên kết với nhau chặt chẽ, vì vậy không tạo những vùng liên kết có kích thước và sức mạnh đủ lớn để tạo thành gel. Chúng chỉ tạo cho dung dịch có độ nhớt và độ ổn định. - Những phân tử mạch thẳng tạo gel chắc bền hơn. c. Điện tích phân tử: Đối với các polysacchride tích điện, lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm tích điện cùng dấu sẽ ngăn cản sự tạo thành liên kết. - Ngoài ra còn phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và sự có mặt của các yếu tố khác trong dung dịch. 3. Cơ chế tổng hợp gellan Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 9 Hình 4: cơ chế tổng hợp gellan. Gellan được cấu tạo từ các monomer: β-1,3- D-glucose; β-1,4-D-glucuronic acid; α-1,4- L-rhamnose nên trước khi tổng hợp được gellan, vi khuẩn phải tổng hợp các monomer này trước. Quá trình tổng hợp : Glucose từ môi trường lên men được được vi khuẩn hấp thụ qua thành tế bào. Dưới tác dụng của enzyme glucose kynase, glucose sẽ chuyển thành glucose-6-phosphate, tiếp theo enzyme Phosphoglucomutase sẽ chuyển glucose-6-phosphate thành glucose-1- phosphate. Từ glucose-1-phosphate, sẽ chia thành hai con đường sinh tổng hợp khác nhau:  Dưới tác dụng của enzyme Uridine Glucose Phosphorylase (UGP), glucose-1- phosphate sẽ tạo thành Uridine-5’-diphosphate-D-glucose (UDP-D-Glucose). Tiếp theo dưới tác dụng của Uridine Glucose Dehydrogenase sẽ tạo thành Uridine -5’- diphosphate Glucuronic acid.  Dưới tác dụng của enzyme Thymidine Glucose Phosphorylase (TGP), glucose-1- phosphate sẽ tạo thành Thymidine-5’-diphosphate-D-glucose (TDP-D-glucose). Tiếp tục enzyme thymidine Rhamnose synthetase sẽ tổng hợp TDP -D-glucose thành Thymidine-5’-diphosphate Rhamnose. Như vậy, từ Uridine-5’-diphosphate-D-glucose, Uridine-5’-diphosphate Glucuronic acid, Thymidine-5’-diphosphate Rhamnose sẽ tổng hợp thành gellan. (Theo tài liệu” N.B. Vartak, C.C. Lin, J.M. Cleary, M.J. Fagan, M.H. Saier,Glucose metabolism in 'Sphingomonas elodea': Pathway engineering via construction of a Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 10 glucose-6-phospate dehydrogenase insertion mutant, Microbiology, 141 (1995) 2339– 2350,) II/ NGUYÊN LIỆU: 1. Mật rỉ a. Khái quát về mật rỉ Rỉ đường là phế liệu có độ nhớt cao chứa đựng nhiều đường không kết tinh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường. Những đặc tính quan trọng phù hợp với quá trình lên men bao gồm: - Chứa hàm lượng đường cao - Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trưởng. - Hàm lượng đường khá cao ( thường nằm trong khoảng 40-50%), Lượng đường này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng độ thích hợp. - Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất trong quá trình lên men là hệ keo trong rỉ đường. Keo càng nhiều, khả năng hoà tan của oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng rỉ đường là phải phá hệ keo này. - Vì rỉ đường là chất dinh dưỡng khá lý tưởng nên chúng dễ bị vi sinh vật xâm nhập và phát triển, thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm chất lượng của rỉ đường.Vì vậy, trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri 2 o /ooo so với trọng lượng mật rỉ để bảo quản. Thành phần hoá học của rỉ đường Thông thường tỉ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm khoảng 3-3,5% trọng lượng mía. Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ sản xuất đường… mà thành phần rỉ đường dao động như sau: Nước: 15-20% ; Chất khô: 80-85% Trong đó có 60% là đường (40% saccharose , 20% fructose và glucose), 40% còn lại là chất phi đường. Trong thành phần phi đường có khoảng 30-32% hợp chất hữu cơ và 6-10% hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ, theo Mắc-Dinit, gồm có: K2O: 3,5% Fe2O3: 0,2% MgO: 0,1% Sulfate: 1,6% CaO: 1,5% SiO2: 0,5% P2O5: 0,2% Chloride: 0,4% Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa nitơ. Những hợp chất chứa nitơ phần lớn ở dạng amin như: acid aspactic, acid glutamic, leucin, isoleucin. Nitơ tổng số chiếm khoảng 0,3-0,5% (ít hơn so với lượng nitơ có trong rỉ đường củ cải). Những hợp chất không chứa nitơ như: pectin, chất nhầy furfurol và oxymethylfurfurol…. Các chất khử không lên men được như các chất màu: Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 11 - Hợp chất caramel: hợp chất được tạo ra do sự mất nước của đường saccharose dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Khi pH của dung dịch đường ổn định, cường độ màu sẽ tỉ lệ thuận với nhiệt độ. o Phức chất của phenol- Fe2+: phức chất này có màu vàng xanh. Hợp chất này không bị loại hết trong giai đoạn làm sạch nước mía và tồn tại trong mật rỉ. o Melanoidin: đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử với acid amin, trong đó chủ yếu là acid aspartic. o Melanin: đây là sản phẩm oxy hoá khử của acid amin dạng vòng có trong mật rỉ, trong đó chủ yếu là tyrosin dưới sự xúc tác của enzyme polypherroloxydase khi có mặt của oxy và Cu2+. Ngoài ra trong rỉ đường có một số vitamin (tính theo microgam trên 1 gam rỉ đường) như sau: Thiamine: 8,3 Folic acid: 0,038 Riboflavin: 2,5 Pyridosine: 6,5 Nicotimic acid: 21 Biotin: 12 Pantothenic acid: 21,4 Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 12 Bảng1: So sánh thành phần của rỉ đường mía và rỉ đường củ cải (tính trên rỉ đường chứa 75% chất khô – theo Baker, 1979) Thành phần Đơn vị tính Mía Củ cải Đường tổng số Chất hữu cơ không phải đường Chất tro sulfate hóa Chất hữu cơ tổng số Protein (N x 6,25) Na K Ca Cl P Biotin Folic acid Inositol Pantothenate Ca Piridosin Riboflavin Thiamine Nicotinic acid Cholin Chất khô Sucrose Raffinose Glucose Fructose Đường nghịch đảo Chất hữu cơ phi đường - Chứa Nitơ - Không chứa Nitơ Nitơ tổng Tro pH % % % % % % % % % mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg %kl mật rỉ %kl chất khô 48 – 56 9 – 12 10 – 15 60 – 65 2 – 4 0,1 – 0,4 1,5 – 5,0 0,4 – 0,8 0,7 – 3,0 0,6 – 2,0 1,2 – 3,2 Khoảng 0,04 Khoảng 6000 54 – 65 2 – 6,5 Khoảng 2,5 Khoảng 1,8 20 – 800 600 – 800 75 – 83 32 – 45 - 5 – 11 6 – 15 - 5 10 0,4 – 1,5 7 -11 4,5 – 6 48 – 52 12 – 17 10 – 12 63 – 65 6 – 10 0,3 – 0,7 2 – 7 0,1 – 0,5 0,5 – 1,5 0,02 – 0,07 0,04 – 0,13 Khoảng 0,2 5800 – 8000 50 – 100 Khoảng 5,4 Khoảng 0,4 Khoảng 1,3 20 – 45 400 – 600 76 – 84 58 – 64 0 – 4,2 - - 0 – 1,2 19 5 1,7 – 2,4 8,5 – 17,1 6,2 – 8,4  pH và độ đệm của rỉ đường: Bình thường, pH của rỉ đường từ 6,8 đến 7,2. Rỉ mới sản xuất ra có thể có pH = 7,2 – 8,9. Hiện nay, hầu hết các nhà máy đường của ta đều xử lý bằng lưu huỳnh nên pH của Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 13 rỉ đường thường thấp hơn và vào khoảng 5,6 – 6,0. Độ kiềm của rỉ vào khoảng 0,5 – 20 (10 kiềm tương đương 1 ml dung dịch H2SO4 1N trung hòa hết 100 g rỉ). Độ kiềm gây bởi các muối Canxi của acid carbonic và các acid hữu cơ khác. Đệm được biểu thị bằng thể tích dung dịch H2SO4 1N cần thiết để điều chỉnh dung dịch gồm 100 g rỉ + 100 g nước tới pH 4,5. Tùy theo pH của mật rỉ, độ đệm có thể từ 14 đến 45.  Vi sinh vật trong rỉ đường: Rỉ đường nhận được từ sản xuất luôn chứa một lượng vi sinh vật. Trong đó nguy hiểm nhất là vi khuẩn lactic và acetic. Mức độ nhiễm khuẩn được xác định bằng sự tăng độ chua, khi đó rỉ đường “tự lên men”. Mức tăng độ chua ( khi tự lên men sau 24h) trong phạm vi 0,2 – 0,50 xem là bình thường. Thực tế trong 1g rỉ đường chứa tới 100000 vi sinh vật không nha bào và 15000 vi sinh vật có khả năng tạo bào tử ở rỉ đường bị nhiễm nặng, con số vi sinh vật có thể đạt tới 50000 và 500000. Tuy nhiên đối với rỉ đường có nồng độ trên 70% hầu hết vi sinh vật trong rỉ đường đều chịu nằm yên nhưng khi pha loãng chúng sẽ bắt đầu hoạt động và làm giảm hàm lượng đường dẫn đến tăng tổn thất. Trong quá trình sản xuất cần có biện pháp xử lý phù hợp nhằm diệt bớt và hạn chế hoạt động của các loại tạp khuẩn này. Trong khi chuẩn bị lên men, rỉ đường được trộn với nước để giảm nồng độ đường xuống còn 15% và sau đó được đem tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur, ta thu được hỗn hợp gọi là dịch lên men.  Ưu điểm khi sử dụng rỉ đường trong nguyên liệu: - Giá rẻ - Khối lượng lớn, dồi dào - Sử dụng tiện lợi - Nguồn cung cấp khá phổ biến Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 14 Bảng2: So sánh Thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men của 2 loại gellan: 2. Giống vi sinh vật: Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 được chọn sử dụng để tổng hợp gellan. Đây là nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que, chịu nhiệt, hiếu khí, lớp vỏ ngoài có màu vàng, kích thước khoảng 0.8µm x 1.5-40 µm. Một số Sphingomonas có thể chuyển động và không có khả năng lên men. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 15 Hình 5: Hình ảnh của vi khuẩn S. paucimobilis ATCC-31461 cấy trên erlen. Bảng 3: Một số đặc điểm của S. Paucimobilis ATCC-21461 STT Một số đặc tính Kết quả 1 Gram Gram ( - ) 2 Kích thước (µm) 1.5 – 5.0 3 Chuyển động Có 4 Sinh bào tử Không 5 Sinh trưởng ở 30 o C + Khả năng sinh acid từ (ASS) 6 Fructose - 7 Melezitose - 8 N-aceylglucosamine + 9 Khả năng hóa lỏng gellan + Kiểm tra lên men đường 10 2-ketogluconate + 11 L- Arabinose W 12 L-serine - Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 16 Chỉ tiêu chọn giống vi sinh vật) – Khả năng sinh độc tố: không có. – Khả sinh tổng hợp gellan: càng mạnh càng tốt. – Khả năng thích nghi của giống phải cao, tốc độ sinh trưởng mạnh. – Điều kiện nuôi cấy: đơn giản, là môi trường đặc trưng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn và tổng hợp gellan. Môi trường dễ kiếm, giá thành không quá cao. – Sự ổn định của giống theo thời gian: càng lâu càng tốt. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 17 III/ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ Hình 6: Quy trình công nghệ của sản xuất gellan . Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 18 IV/ GIẢI THÍCH SƠ ĐỒ 1. Nhân giống: Mục đích: Chuẩn bị giống cho quá trình lên men. Quá trình nhân giống giúp gia tăng số lượng tế bào( tăng sinh khối), tích lũy đủ số lượng tế bào cần thiết để cấy giống vào môi trường lên men. a. Giữ giống: S. paucimobilis ATCC-31461 được giữ trên môi trường YPG bao gồm (g/l): - Chất chiết nấm men: 3 - Peptone: 5 - Glucose 30. - NaCl: 5 - Agar :20 Chỉnh pH=7. Con giống sẽ được cho vào 20ml môi trường trên (đã được tiệt trùng ở 121 0 C, 20 phút) trong một erlen 250ml, sau đó đem cho vào thiết bị lắc với vận tốc 180 rpm ở 30 0C trong 24 giờ. Đem cả canh trường đi ủ trong 48 giờ ở 300C, sau đó đem bảo quản ở 40C. b. Nhân giống: - Nhân giống là quá trình tăng dung tích, dịch chứa sinh khối qua nhiều cấp. Mỗi cấp nhân giống thường tăng dung khối từ 10-15 lần. Cứ làm như vậy cho đến khi toàn bộ dung tích đủ để tiến hành quá trình lên men. - Khi nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các dụng cụ thủy tinh như ống nghiệm, erlen với các dung tích 750 ml, 1l, 2l kết hợp với tủ ấm, tủ lắc điều nhiệt. Do thể tích môi trường nhỏ nên việc sử dụng máy lắc có thể đảm bảo được sự đồng nhất trong canh trường nuôi và cung cấp đầy đủ oxy cho sự sinh trưởng, phát triển của nhóm vi sinh vật hiếu khí. - Khi nhân giống ở giai đoạn phân xưởng, người ta sử dụng những thiết bị với dung tích khác nhau: 100l, 500l, 1m 3 , 3 m 3 , 5 m 3 , 10 m 3…hoặc lớn hơn tùy theo dung tích của thiết bị lên men đang sử dụng tại nhà máy. Phương pháp thực hiện: 10ml chứa môi trường glucose được tiệt trùng và canh trường vi sinh vật được ủ ở 30 oC trong 24h. Sau 24h, canh trường sẽ được chuyển vào 90ml môi trường đã tiệt trùng tương tự và tiếp tục ủ ở 30oC trong 24h. 100ml giống này sẽ được chuyển tiếp đến 900ml môi trường và được ủ tiếp. Các cấp nhân giống được thực hiện cho đến khi có đủ số lượng giống cần thiết cho quá trình lên men. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 19 Hình 7. Thiết bị nhân giống 1. Hệ thống điều nhiệt (nhân giống trong erlen). 2. Bình nhân giống trung gian. 3. Thiết bị nhân giống. 4. Hệ thống lọc tách bụi và vi sinh vật. 5. Valve. 6. Bộ phận lọc hơi. 7. Bộ phận đo pH. 2. Chuẩn bị môi trường: Mục đích: Bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật. Môi trường lên men: Thành phần môi trường lên men(g/l) Glucose 30 Chất chiết nấm men 0.5 K2HPO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.1 NH4NO3 0.9 Dung dịch muối, 1M Dung dịch muối chứa (g/100 ml) : MnCl2.4H2O: 0.18 FeSO4.7H2O: 0.248 H2BO3 :0.028 CuCl2. 2H2O 3.4 Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 20 ZnCl2 2.1 CoCl2. 2H20 7.4 Na2MoO4. 2H2O 0.003 Disodium tartarate 0.21 3. Tiệt trùng Mục đích: Tiêu diệt vi sinh vật chuẩn bị cho quá trình lên men Thiết bị sử dụng: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 Cấu tạo: gồm thùng chứa môi trường dinh dưỡng, bơm ly tâm, bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt, bộ thu hồi nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh tự động các thông số của quá trình. Nguyên tắc hoạt động: Trước khi bắt đầu hoạt động tất cả các thiết bị, đường ống dẫn và phụ tùng YHC được thanh trùng bằng hơi quá nhiệt. Hơi nước được đưa vào bộ đun nóng theo đường viền của van điều chỉnh tiêu hao hơi, sau đó vào bộ giữ nhiệt, thu hồi nhiệt và theo đường viền của van giảm áp suất vào thiết bị làm mát. Cùng lúc mở các van xả nước ngưng và khi đạt được nhiệt độ lớn hơn 1400C thì bắt đầu tiệt trùng. Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy đảo các cấu tử của môi trường dinh dưỡng, môi trường mới lại cho vào thùng chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nóng. Thông số công nghệ: - Nhiệt độ: 1210 C. - Thời gian tiệt trùng: 20 phút. - pH=7. - Tốc độ bơm môi trường: 3.5 m3/s. Hình 8. Thiết bị tiệt trùng YHC Chú thích: 1- Thùng chứa 2- Bơm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 21 3- Bộ đun nóng 4- Bộ giữ nhiệt 5- Bộ lấy mẫu 6- Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát 8- Thiết bị lên men 4. Lên men: Mục đích: Sinh tổng hợp gellan Quy trình thực hiện: - Nạp môi trường vô trùng vào trong thiết bị - Cho giống cấy vào thiết bị với tỉ lệ 10% so với thể tích thiết bị lên men. - Lên men bề sâu trong thiết bị lên men ở 300 C, pH 7.0 ( điều khiển bằng cách sử dụng KOH 2M / HCl 2M). Khuấy trộn trong 500rpm, lưu lượng khí 1vvm. Các biến đổi trong quá trình lên men:  Vật lý: Nhiệt độ của bình lên men tăng lên do có sự tỏa nhiệt.  Hóa lý: Độ nhớt tăng, tạo hợp chất keo.  Hóa học: Hàm lượng cơ chất và các thành phần dinh dưỡng giảm xuống.  Hóa sinh: Enzyme xúc tác cho các phản ứng trao đổi chất trong tế bào vi khuẩn diễn ra mạnh.  Sinh học: Sinh khối tế bào tăng lên. Thiết bị: Cấu tạo của bình lên men: cấu tạo tương tự như thiết bị nhân giống vi sinh vật. Chúng cũng cũng có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ. Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy và các đầu dò nhiệt độ, pH… để có thể theo dõi trực tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men. Motor cho cánh khuấy thường được đặt phía trên nắp thiết bị. Còn cửa nạp và tháo môi trường được bố trí phía đáy. Ngoài ra thiết bị còn có cửa quan sát, van lấy mẫu… Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 22 Hình 9: Thiết bị lên men Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men: Ảnh hưởng của điều kiện khuấy trộn và sục khí : a/ Đến sự phát triển sinh khối tế bào: Sự phát triển của S. paucimobilis có liên hệ chặt chẽ với tốc độ khuấy trộn. Hàm lượng sinh khối lớn nhất( 4.5g/l) khi tốc độ khuấy trộn 100rpm, trong khi nó không thể vượt quá 3.4 g/l khi được điều chỉnh ở 500 rpm và 1 vvm. Khi tốc độ khuấy trộn giảm xuống ( 250 rpm, 1vvm) thì lượng sinh khối cũng giảm.Khi tăng tốc độ sục khí từ 1 vvm đến 2vvm, dẫn đến tăng cường sự phát triển của tế bào, đặc biệt với tốc độ khuấy trộn 250 rpm lượng sinh khối tế bào tăng lên rõ rệt. Điều này có được là là do sự cải thiện việc cung cấp oxi cho tế bào ở 2vvm. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 23 Giản đồ 1: Biểu thị hàm lượng sinh khối trong môi trường lên men của S. paucimobilis ATCC 31461 ở các tốc độ khuấy trộn và sục khí khác nhau. b/ Ảnh hưởng đến nồng độ glucose tiêu thụ: Giản đồ 2: Biểu thị ảnh hưởng của sự khuấy trộn và sục khí đến sự tiêu thụ glucose trong quá trình lên men Từ giản đồ 1, ta nhận thấy rằng, khi tăng tốc độ khuấy trộn thì sự phát triển tế bào cũng tăng lên, bằng sự tăng lên về chuyển hóa khối lượng. Thật vậy, khi tốc độ khuấy trộn giảm (250 rpm) lượng glucose tiêu thụ giảm rất nhiều so với các chế độ khác và tương tự sự tiêu thụ ammonium cũng xảy ra nhưng chậm hơn so với các chế độ khác, chứng tỏ sự hấp thu cơ chất ít. Khi tăng tốc độ sục khí từ 1vvm đến 2vvm tại 250rpm, cải thiện sự đảo Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 24 trộn đều và lưu thông khí trong dịch lên men. Giản đồ 3: Ảnh hưởng của sự khuấy trộn và sục khí đến nồng độ Ammonium tiêu thụ trong quá trình lên men Có thể là do quá trình tự phân của tế bào gây ra bởi sự cạn kiệt muối ammonium và việc lưu thông khí của sinh khối bị giới hạn bởi sự tăng độ nhớt của dịch lên men trong quá trình lên men. Muối ammonium được tiêu thụ với tỉ lệ cao trong giai đoạn đầu của quá trình Trong hầu hết các quá trình, sinh khối giảm nhanh chóng sau khi đạt cực đại. Nguyên nhân là do quá trình tự phân của tế bào.Quá trình tự phân của tế bào gây ra bởi sự cạn kiệt muối ammonium và việc lưu thông khí của sinh khối bị giới hạn bởi sự tăng độ nhớt của dịch lên men trong quá trình lên men. Muối ammonium được tiêu thụ với tỉ lệ cao trong giai đoạn đầu của quá trình lên men (9-13 h) và sau đó gần như là cạn kiệt ( mức độ cạn kiệt tăng nhanh từ chế độ 250 rpm và 1vvm) . Nhưng ở cuối giai đoạn lên men thì nồng độ muối ammonium lại tăng lên có thể là do quá trình tự phân của tế bào. Sự tự phân trong canh trường của vi khuẩn là một quá trình tích cực. Đây là quá trình tiêu thụ năng lượng và tiếp tục giải phóng ra ion ammonium. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 25 Giản đồ 4: a: Ảnh hưởng của vận tốc trượt lên độ nhớt b: ảnh hưởng của thời gian lên độ nhớt ứng với các vận tốc khuấy trộn và tốc độ sục khí. Chú thích giản đồ: Giản đồ a: Ảnh hưởng của vận tốc trượt lên độ nhớt Apparent viscosity: độ nhớt động học (mPa.s) Shear rate: tốc độ trượt (1/s) là tỉ lệ giữa vận tốc trượt giữa hai lớp chất lỏng và khoảng cách giữa hai lớp chất lỏng đó. Công thức: . = d d : tốc độ trượt. Giản đồ b: ảnh hưởng của thời gian lên độ nhớt ứng với các vận tốc khuấy trộn và tốc độ sục khí. Giải thích giản đồ: Căn cứ vào giản đồ, độ nhớt càng tăng thì tốc độ trượt của dòng lưu chất càng giảm. Trong khi đó tốc độ sục khí không ảnh hưởng nhiều tới việc tổng hợp nên gellan. Độ nhớt của dung dịch lên men vào cuối thời điểm lên men là 2500 cp tại tốc độ trượt là 11.7S-1. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 26 Trong quá trình tổng hợp gellan độ nhớt của dịch lên men sẽ tăng gây nên vấn đề trong việc đảo trộn và lưu thông khí. Vì thế tốc độ của không khí và sự khuấy trộn được gia tăng tùy theo những khoảng thời gian khác nhau. Ở chế độ khuấy 500rpm, 1vvm sẽ cho lượng gellan lớn nhất. Tính chất lưu biến học của dung dịch gellan ở những nồng độ khác nhau cũng chỉ ra hoạt động “giả nhựa” của gellan. Pseudoplastic behaviour được quan sát thậm chí ở nồng độ nhỏ 0-1% và trở nên rõ ràng hơn khi nồng độ của gellan tăng lên. Sự thêm muối như KCl và MgCl2 sẽ làm giảm độ nhớt của dung dịch lỏng vì sự thêm dung dịch KCl 0-1% vào dung dịch lỏng, làm giảm độ nhớt thực xuống gần một nửa (490 xuống còn 260cp ở tốc độ trượt là 21.4 S-1) Bảng 4: Ảnh hưởng của tính chất lưu biến đến sự tạo thành gellan . Ảnh hưởng của thành phần môi trường ban đầu đến lượng gellan tạo thành: a. Nồng độ glucose: Qua giản đồ trên ta thấy được với glucose sẽ cho hàm lượng gellan lớn nhất. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 27 Hình 10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại đường đến nồng độ gellan tạo thành. b. Các thành phần khác trong môi trường: Hình 11: Đồ thị biểu diễn các yếu tố trong môi trường ảnh hưởng đến nồng độ gellan. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 28 Giống lên men: Thời gian của pha lag ảnh hưởng đến lượng gellan tạo thành, vì đây là giai đoạn thích nghi, nếu giống vi sinh vật thích nghi tốt thì việc tạo ra gellan sẽ nhiều. Căn cứ vào kết quả thí nghiệm lấy từ tài liệu của Madhavan Nampoothiri, Reeta Rani Singhania, C. Sabarinath, Ashok Pandey, biotechnology Division, Regional Research Laboratory (CSIR), Trivandrum 695 019, India, ta thấy ở 20giờ được lượng gellan lớn nhất. Kích thước của vi khuẩn cũng ảnh hưởng đến lượng gellan tạo thành, ở 10 giờ thu được lượng gellan lớn nhất 23.5 g/l. Nhiệt độ: Nhiệt độ cho thiết bị lên men khoảng 300C, cần điều chỉnh để vi khuẩn hoạt động tốt nhất. Bảng 5: Ảnh hưởng của vi khuẩn đến sự tạo thành gellan. Age of the inoculum (h) Gellan (g/l) 48 h Size of the inoculum (% v/v) Gellan (g/l) 48 h 8 15.7 1 20.2 12 16.8 2 20.5 16 18.9 4 22.0 20 22.2 6 21.6 24 20.4 8 21.8 30 19.4 10 23.5 ĐỘNG HỌC CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN: Nghiên cứu quá trình là một phần quan trọng của việc lên men gellan. Phương pháp phân tích các yếu tố động học của quá trình lên men polysaccharide bao gồm sự thay đổi cảu cơ chất theo thời gian (S), sinh khối (X), và sản phẩm polysaccharide. a. Sự phát triển của vi khuẩn: Đường cong sinh trưởng Trong các phương pháp lên men, đặc biệt là những quá trình lên men polysaccharide bởi nhiều loại vi sinh vật, sự phát triển của tế bào được miêu tả bằng đường cong sinh trưởng. Đường cong sinh trưởng có thể mô tả qua công thức sau: Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 29 Trong đó: μm là tốc độ tăng trưởng riêng lớn nhất (h -1 ) Xm: là nồng độ snh khối lớn nhất mà tế bào có thể đạt được( g/l). Lấy nguyên hàm từ phương trình (1) X = Xo ( t=0), cho ta một hàm số thể hiện đường cong biến thiên sinh khối theo t: b. Sự tạo thành sản phẩm: phương trìnhh Luedeking_Piret: Các yếu tố động học của sự tạo thành sản phẩm phụ thuộc vào phương trình Luedeking-Piret. Theo mô hình này tốc độ tạo thành sản phẩm (rP) phụ thuộc vào nồng độ sinh khối tức thời và tốc độ phát triển, biểu diễn qua đường thẳng: Trong đó: α và β là hằng số tạo thành sản phẩm và có thể khác nhau ở những điều kiện lên men khác nhau. Lấy tích phân phương trình (3) ( trong đó: P = P0 ở t = 0) với phương trình (2): c. Sự tiêu thụ glucose: Lượng glucose tiêu thụ được thể hiện qua phương trình: (modified Luedeking-Piret equation) Trong đó: YX/S: là hệ số chuyển hóa glucose cho sự phát triển tế bào YP/S: là hệ số chuyển hóa glucose cho sự tạo thành sản phẩm mS: là hệ số duy trì sự sống của vi sinh vật (g cơ chất · g tế bào h −1 ). Kết hợp công thức (3) và (5): Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 30 Phương trình rút gọn của phương trình (6): Trong đó: γ: là tổng của 1/YX/S and α/YP/S δ: là tổng của β/YP/S and mS. Tương tự, lấy tích phân của phương trình ( 7 ) với S = S0 ở t = 0 : d. Trong môi trường lên men, lượng chất dinh dưỡng tiêu thụ theo công thức sau: 5. Ly tâm lần 1 Mục đích: tách tế bào vi sinh vật trong dịch lên men và những tế bào bám vào polysaccharide. Các quá trình biến đổi:  Vật lý: Nhiệt độ tăng lên.  Hóa lý: Độ nhớt giảm. Thiết bị: Thiết bị ly tâm lọc, tốc độ quay 8000rpm, trong vòng 30 phút ở 40C. Trên thành thùng quay của máy ly tâm lọc có đục lỗ và được bọc bằng các lớp lưới hoặc vải có kích thước lỗ phù hợp với tính chất sản phẩm. Dưới tác dụng của lực ly tâm pha lỏng bắn ra qua các lỗ, pha rắn nằm lại trên thành máy. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 31 Hình 12: Máy ly tâm lọc 6. Kết tủa: Mục đích: Kết tủa polysaccharide bằng isopropanol , chuẩn bị cho quá trình sấy thu nhận sản phẩm. Các biến đổi trong quá trình: Hóa lý: Có sự chuyển pha từ pha lỏng sang pha rắn. Phương pháp thực hiện: Dịch sau khi được ly tâm, lọc để tách tạp chất sẽ được bổ sung isopropanol hoặc ethanol lạnh 40C. Và giữ dịch lên men ở 40C trong 12h. Kết tủa còn chứa tế bào vi khuẩn lại được li tâm 38Kg/h. Phần kết tủa còn lại sẽ được sấy khô tới khối lượng không đổi và thu được gellan.Tỉ lệ thất thoát gellan chịu ảnh hưởng bởi độ pha loãng của phần dịch lỏng. Cơ chế: Khi cho isopropanol hoặc ethanol vào trong dịch lên men sau khi ly tâm lọc, do lực hút tĩnh điện giữa isopropanol hoặc ethanol với nước mạnh hơn so với giữa polysaccharide với nước, nên tách nước ra khỏi liên kết giữa polysaccharide với nước và tạo ra kết tủa. Trong sản xuất, người ta thường dùng ethanol vì ethanol có giá thành rẻ. Vì gellan là polysaccharide ở dạng ion âm nên sự hiện diện của cation trong dung dịch sẽ hỗ trợ quá trình kết tủa khi có mặt của dung môi, thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của KCl trong dung môi propanol. Trong nghiên cứu này nồng độ của gellan là 1 g/l. Kết quả được đưa ra sau đây chỉ ra rằng, khi có mặt của dung dịch KCl 1% thì lượng propanol cần thiết giảm xuống còn ¼, lúc này, muốn kết tủa 1g gellan cần 1l propanol Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 32 Bảng 6: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng đến sự thất thoát của gellan Bảng 7: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến sự kết tủa gellan của isopropanol 7. Deacyl hóa Mục đích:Khử các nhóm acyl của high acyl gelan Các biến đổi trong quá trình Hóa học: làm mất nhóm acyl của gellan Phương pháp thực hiện: Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 33 Dịch lên men được nhúng ngập trong nước sôi trong vòng 15 phút, làm nguội và tăng pH lên 10 bằng cách sử dụng NaOH 1M. Dịch được giữ ở 80 0 C trong vòng 10 phút để thực hiện quá trình khử các nhóm acyl và sau đó hạ pH về 7. 8. Ly tâm lần 2: Mục đích: Thu nhận kết tủa gellan Các biến đổi của quá trình: Vật lý: nhiệt độ tăng Hóa lý: Độ nhớt giảm Phương pháp thực hiện và thiết bị: Giống như ly tâm lần 1. 9. Sấy: Mục đích: Thu nhận gellan Các biến đổi của quá trình  .  .  .  . Thiết bị: Thông số công nghệ: 80 0 C, 12 giờ 10. Nghiền: Mục đích: hoàn thiện, tạo sự đồng nhất cho sản phẩm. Các biến đổi: Vật lý: Giảm kích thước Thiết bị: Máy nghiền răng Nguyên lý tương tự máy nghiền búa, sử dụng động năng đang quay của các răng lắp trên dĩa để đập nguyên liệu. Về cấu tạo, bao xung quanh rotor là lưới, do đó diện tích lưới của máy nghiền răng lớn hơn rất nhiều so với máy nghiền búa. Rotor là một dĩa phẳng có gia công các răng sắp xếp theo đường tròn đồng tâm ở các vị trí khác nhau sao cho khi đóng nắp máy lại hàng răng cố định trên nắp máy nằm giữa 2 hàng răng quay trên rôto. Răng trên rôto sẽ quay theo khe giữa 2 hàng răng cố định. Răng gắn trên rôto bằng cách đúc liền hay bắt bằng các vít cấy phía sau. Ðầu răng và nắp máy càng gần (khe hở hẹp) nghiền càng mịn. Nguyên liệu được cho vào giữa tâm máy, bị răng quay đập nhiều lần. Nguyên liệu đập vào hàng răng quay thứ nhất, sau đó đập qua hàng răng cố định đi ra ngoài và đập vào hàng răng quay kế tiếp... Cứ tiếp tục cho đến khi nào kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ lưới (thường ra khỏi hàng răng cuối cùng) sẽ theo lỗ lưới ra ngoài. Nếu kích thước sau khi ra khỏi các hàng răng vẫn còn lớn hơn kích thước lỗ lưới, hạt sẽ tiếp tục bị đập nhỏ ở hàng răng cuối. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 34 Số vòng quay của roto rất lớn: 3000 - 6000 vòng/phút, do đó động năng va đập rất lớn, khả năng nghiền mịn tăng. Máy nghiền răng cũng có thổi khí nhưng ít hơn máy nghiền búa nên năng suất cao hơn (thổi khí ít, lắng bụi nhanh).Tuy nhiên, máy nghiền răng chỉ nghiền hạt có kích thước nhỏ, đồng đều trong khi máy nghiền búa có thể nghiền hạt có kích thước nhỏ, lớn đồng thời. Hình 13: Máy nghiền răng V. Sản phẩm: Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 35 1. Tính chất của gellan: - Nghiên cứu về khả năng tạo gel, cấu trúc gel: Nhờ sự tập trung của các polymer, nhiệt độ, và sự có mặt của những cation hóa trị một và hai đã làm cho gellan đông tụ. Ở nhiệt độ thấp, gellan gồm 2 sợi xoắn ốc vào nhau theo một trật tự, trong khi ở nhiệt độ cao chỉ xuất hiện dây đơn, đánh dấu sự giảm độ nhớt. Nhiệt độ chuyển tiếp khoảng 350C nhưng cũng có thể vào khoảng 300C- 500C. - Cơ chế: khi gia nhiệt rồi hạ nhiệt sẽ dẫn đến sự hình thành hai lần đọan gấp khúc theo hình xoắn, tạo nên cấu trúc không gian 3 chiều bởi các liên kết phức tạp với kim loại và liên kết hidro với nước. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng tạo gel của gellan:  Nhóm acyl: Đây là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới độ bền gel của gellan. Gellan có những gốc acyl khác nhau sẽ cho những chất gel có thuộc tính khác nhau. Gellan ban đầu là những gel mềm, có độ đàn hồi, và rất yếu vì những nhóm acetyl và glyeryl cồng kềnh ngăn không cho tạo liên kết giữa những đoạn dây polymer gellan, cản trở chuỗi xoắn kép liên kết chéo nhau.  Loại ion và sự tập trung của ion: Những ion có tác động lên độ bền gel và độ mỏng của gel. Gellan không hình thành gel khi ở trong nước đã lọai bỏ hết ion, nhưng chỉ cần thêm muối của Ca, Na, K, Mg thì sẽ tạo gel và tác động đến hai yếu tố trên. Tính chất vật lí của gellan dưới sự ảnh hưởng của các ion: K + Na + Li + E x 10 -4 (Pa) 31.5 11.9 0.44 Fm(N) 23.1 13.3 - Fm: lực phá vỡ, trường hợp này gel được hình thành ở độ tập trung của polymer là Cp= 13g/l khi có mặt 0.1 M XCl.  pH: Nghiên cứu của ISanderson và Clark cho thấy độ bền gel được tăng cường trong khoảng pH từ 3.5- 8, tương ứng với phạm vi pH của hầu hết các lọai thực phẩm. Trong giới hạn này, thay đổi pH không làm thay đổi điển tạo gel nhưng ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy trong một số trường hợp. Ví dụ: gel với nồng độ thấp của ion hóa trị một nóng chảy ở 700C ở pH trung tính, nhưng ở pH 3.5 thì nhiệt độ nóng chảy gia tăng. Khuynh hướng này không có ở ion hóa trị hai.  Sự có mặt của những nhóm ưa nước: Việc thêm vào các nhóm ưa nước (như đường tại khoảng 10% V/M) sẽ làm giảm sự tập trung của các ion cần cho sự bền gel tối ưu.  Độ ổn định và tính linh hoạt của điểm nóng chảy: Gellan ổn định ở nhiệt độ cao, khoảng 900C. Theo Sanderson và Clark, nhiệt độ nóng chảy của gellan có thể trên hoặc dưới 1000C, phụ thuộc vào điều kiện hình thành gel. Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới tính linh họat của nhiệt độ nóng chảy là sự tập trung của các cation trong gel vì những cation hóa trị một và hai sẽ làm tăng số lượng cầu nối trong gel và tạo nên sự kháng nhiệt. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 36  Ảnh hưởng của sự có mặt của các keo nước khác trên cấu trúc của gellan. Đã có nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm ra sự thay đổi cấu trúc của gellan khi trộn chung với những loại thực phẩm ưa nước như Na Alginate, gelatin… - Có khả năng tạo gel khi độ tập trung thấp (0.05- 0.4%) nên được ứng dụng là chất phụ gia thực phẩm. - Có khả năng giải phóng vị rất tốt. - Ở nhiệt độ thấp có độ nhớt cao. Chỉ tiêu chất lượng của gellan Theo tài liệu của Institute of Chemical Technology, University of Mumbai, Matunga, Mumbai 400019, Indian, 2007, chỉ tiêu chất lượng của gellan được thể hiện trong bảng sau: Tính chất: Tiêu chuẩn: Lượng ẩm Dưới 15% (w/w) Lượng Pb Dưới 2mg/kg Lượng Nitrogen Dưới 3% Kiểm tra khả năng tạo gel với ion Ca2+ gel. Kiểm tra khả năng tạo gel với ion Na+ Cho 1% dung dịch mẫu, thêm vào đó 0.5g sodium chloride, gia nhiệt lên 800C và khuấy trong một phút. Đặt dung dịch ở nhiệt độ phòng, gel bền sẽ được hình thành. Hàm lượng isopropyl còn lại sau khi trích ly Dưới 750mg/g Chỉ tiêu vi sinh vật: 1. Tổng vi sinh vật 2. E.Coli. 3. Salmonella. 4. Nấm men và nấm mốc Dưới 104 tế bào/g Không có Không có Dưới 400 tế bào/g Hàm lượng cho phép dùng trong thực phẩm Năm 1991, theo đánh giá của FAO và WHO, gellan không có đủ độc tố làm cho chuột chết. liều lượng khuyến cáo cho con người là 200mg/kg thể trọng. 2. Ứng dụng của gellan: - Gellan được ứng dụng như 1 tác nhân tạo đặc hay tạo cấu trúc trong thực phẩm. Tùy loại và lượng gellan sử dụng sẽ tọa ra gel có cấu trúc khác nhau theo mong muốn. - Gellan được ứng dụng thành công trong sản xuất mứt, có thể thay thế cho pectin. Hàm lượng gellan sử dụng khoảng 0.4% thấp hơn so với pectin (khoảng 0.6% đối với Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 37 methoxypectin cao và 0.8% đối với methoxypectin thấp). Ở những sản phẩm này, sự hợp nhất là giảm đến mức tối thiểu trong khi mứt có được tính chất cảm quan đặc trưng rất tốt. Có thể sử dụng 0.15% gellan tinh chế để chuẩn bị cho mứt cần độ cứng thấp, ít năng lượng với độ bóng tốt. - Trong công nghệ sản xuất bánh kẹo, gellan sẽ góp phần tạo cấu trúc và kế t cấu để giảm sự đông cứng của bột theo thời gian.. Ngoài ra, gellan có thể ngăn ngừa sự chảy nước của đường, sự đóng băng.. - Gellan có khả năng kết hợp với các chất keo khác như alginate khác nên sẽ làm tăng nồng độ và độ cứng của gel. Muối alginate natri hòa tan trong muối CaCl2 ở 90 0 C cho ra gel có tính chất yếu giống như xanthan. Nếu làm lạnh thì gel sẽ cứng hơn và bền lâu dài nếu bảo quản ở nhiệt độ thấp. gel đạt độ cứng cực đại khi 40% calcium conversion (trong alginate với 58% hàm lượng polyguluronate), và tính đàn hồi của gel được diều khiển sự điều chỉnh nồng độ Ca2+ quanh giá trị tối ưu này. Theo Papageorgiou et al thì sự kết hợp của nồng độ gellan trung bình (0.1-0.3% khối lượng/thể tích, với 2% khối lượng /thể tích alginate và trisodium citrate 5 mM. - Gellan được ứng dụng thành công trong sản xuất mứt, có thể thay thế cho pectin. Hàm lượng gellan sử dụng khoảng 0.4% thấp hơn so với pectin (khoảng 0.6% đối với methoxypectin cao và 0.8% đối với methoxypectin thấp). Ở những sản phẩm này, sự hợp nhất là giảm đến mức tối thiểu trong khi mứt có được tính chất cảm quan đặc trưng rất tốt. Có thể sử dụng 0.15% gellan tinh chế để chuẩn bị cho mứt cần độ cứng thấp, ít năng lượng với độ bóng tốt. - Cung cấp chất tạo gel cho nước giải khát với vị như của gelatin. Khi thêm gellan sẽ làm tăng nhiệt độ nóng chảy, giúp cho gel mềm, mọng nước nhưng lại không tan chảy, đồng thời tạo trực quan tốt, cần khoảng 0.3% gellan cho ứng dụng này. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 38 - Loại Gellan đã tinh sạch được sử dụng như là chất thay thế cho agar trong việc làm môi trường rắn để nuôi cấy vi sinh vật. Môi trường này có thể chịu được nhiều chu trình tiệt trùng và cũng có thể kháng cự với sự đa dạng của enzyme. Nó có cấu trúc giống với cấu trúc của agar. Trong môi trường, lượng gellan sử dụng chỉ là 6g/L so với agar là 15g/L. Nhiều bằng chứng chứng tỏ rằng gellan là môi trường lý tưởng để nuôi cấy mô thực vật. - Gellan được sử dụng trong cố định tế bào enzyme và tế bào. Theo Camelin et al gel của gellan cung cấp một giá thể bền cơ học trong việc cố định tế bào Bifidobacterium longum (gel ổn định trong hơn 150h của quá trình lên men trong môi trường whey). Hơn nữa hoạt tính xúc tác của sinh học trong sản xuất acid lactic rất cao. Wenrong và Griffits đánh giá khả năng của các hạt gel gellan – xanthan trong việc bảo vệ Bifidobacteria longum dưới những điều kiện khác nhau bao gồm dung dịch pepton, pH=4, yogurt tiệt trùng, và dịch vị được tái tạo. Và kết quả là việc cố định Bifidobacteria longum trong các hạt gel của hỗn hợp gellan-xanthan làm tăng tính chịu đựng của chúng trong môi trường acid cao. Từ đây người ta có thể sử dụng gellan trong việc cố định các vi sinh vật có lợi probiotic và sau dó chuyển nó vào cơ quan ruột của người. - Điện di gel trong nghiên cứu sinh học Bằng phương pháp điện di, gel của gellan có thể được sử dụng như giá thể rắn cho việc tách các mảnh DNA dựa vào kích thước khác nhau. Điện di gel được ứng dụng rộng rãi và là tiến trình then chốt trong sinh học phân tử. Gel điện di dựa trên gellan phải đi kèm với một polymer thứ hai là hydroxymethylcellulose hoặc là polyethylen oxide để giảm hiện tượng điện thẩm.Trong ứng dụng này, gellan có thể Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 39 thay thế cho agarose tinh chế. Agarose tinh chế rất đắt và hàm lượng sử dụng khá cao, 1%. Gellan rẻ hơn agarose và sử dụng chỉ khoảng 0.125%. Gellan được xem là có tiềm năng trong việc ứng dụng trong kĩ thuật y sinh, những phần tử trung tâm của gellan bezyl ester được dùng để kiểm soát cho việc cắt vỏ thuốc. VI. Thành tựu công nghệ  Phân lập Sphingomonas paucimobilis E2 (DSM 6314 từ S. paucimobilis ATCC 31461, có khả năng sản xuất gellan cao hơn so với S. paucimobilis ATCC 31461. Cách phân lập: Pha loãng canh trường của S. paucimobilis ATCC 31461 trong nước muối sinh lý, sau đó cho vào đĩa chứa môi trường YMG( yeast/malt-gellan. Khi đó nhựng phần sinh khối không chìm sẽ được thu nhận để sản xuất gellan. Đặc điểm của Sphingomonaspaucimobilis E2 thể hiện ở bảng sau Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 40 Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 41 - Môi trường nhân giống của Sphingomonaspaucimobilis E2(DSM 6314) để sản xuất gellan: Sphingomonaspaucimobilis E2(DSM 6314) được nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng YPG gồm glucose 2%, chất chiết nấm men 3%, peptone 5g/l và agar 2%, pH 7.0. Thạch nghiêng được ủ ở 30oC trong 48h, sau đó bảo quản ở 4oC. Môi trường nhân giống được tiệt trùng.  Gellan có độ nhớt rất cao nên gây hạn chế trong việc ứng dụng của nó. Ngày nay các nhà khoa học đã tách lập được enzym gellan lyase nhằm cắt ngắn mạch polymer của gellan, làm giảm độ nhớt và khối lượng phân tử của gellan, để ứng dụng trong các ngành công nghiệp dựa trên các polymer sinh học . Enzyme này có trong vi khuẩn chịu nhiệt được tách ra từ Bulgarian hot spring, nó được phân loại là Geobacillus stearothermalphilus. Nó phát triển trên môi trường có gellan như là nguồn carbon với tốc độ sinh trưởng là 0.69 h -1 và thời gian thế hệ là 60 phút. Giống này sẽ sản xuất ra enzyme gellan lyase chịu nhiệt trong suốt pha log của tế bào. Enzyme này hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 75 0 C trong khoảng pH rất rộng 4-8.5. Đặc biệt nó sẽ hoạt động mạnh trong quá trình deacyl hóa native gellan, do trong quá trình này ta xử lý ở nhiệt độ cao.  Có thể tận dụng được phụ phẩm trong công nghiệp như whey từ các quá trình sản xuất các sản phẩm từ sữa, như phô mai làm nguyên liệu chính để sản xuất gellan. Theo nghiên cứu người ta so sánh 3 quá trình sản xuất gellan từ glucose , lactose và whey(lactose 52g/l, acid lactic 0,5g/l) pha loãng với tỉ lệ thích hợp. Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 42 Sản xuất gellan từ S. paucimobilis ATCC 31461 trong canh trường tĩnh ở 300C với tốc độ khuấy 250 rpm trong môi trường basal S chau71 glucose (○) hoặc lactose (■) với nồng độ ban đầu từ 5-30 (g/l). OD640: mật độ quang của canh trường đo ở bước sóng 640nm. Broth viscosity (cp): độ nhớt dịch lên men. Residual sugar : nồng độ đường sót Sugar initial concentration: nồng độ đường ban đầu Ảnh hưởng của mức độ pha loãng dịch whey tới sự hình thành gellan Tỉ lệ pha loãng whey Gellan (g/l) BOD5 còn lại(mg/l) BOD5 đã khử (%) 1:4 7.9 26,000 52 1:5 7.2 18,750 66 1:6 6.4 18,000 67 Khi pha loãng dịch whey với tỉ lệ 1:5 thì nồng độ gellan thu được là 7 (g/l) Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 43 Giản đồ: Nồng độ gellan và độ nhớt trong môi trường Whey ở những tỉ lệ pha loãng khác nhau Phân tích hóa học và phương pháp NMR của gellan được sản xuất trên môi trường Basal S với glucose hoặc lactose hoặc whey pha loãng được thành phần các nhóm thế acetate và glycerate là khác bhau, từ đây ảnh hưởng tới tính chất lưu biến của gellan. Bảng: Thành phần của gellan ở các môi trường khác nhau Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 44  TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Ngọc Tú ( chủ biên) - Lê Văn Chứ - Đặng Thị Thư – Phạm Quốc Thăng- Nguyễn thị Kim Thịnh – Bùi Đức Hợi – Lưu Duẩn – Lê Doãn Diên. Hóa sinh công nghiệp. Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật Hà Nội – 2002. 2. Louisa E. Whittaker, Ibrahim M. Al-Ruqaie, Stefan Kasapis* and Robert K. Richardson, Development of composite structures in the gellanpolysaccharide/sugar system ( From Department of Food Research and Technology, CranJield University, Silsoe College, Silsoe, Bedford MK45 IDT, United Kingdom), Received 10 September 1996; revised version received 20 November 1996; accepted 20 December 1996. 3. Ishwar B. Bajaj, Shrikant A. Survase, Parag S. Saudagar and Rekha S. Singhal,Gellan Gum: Fermentative Production, Downstream Processing and Applications ( From Food Engineering and Technology Department, Institute of Chemical Technology, University of Mumbai, Matunga, Mumbai 400 019, India), Received: January 8, 2007 - Accepted: May 24, 2007 4. R.M. Banik, A. Santhiagu , S.N. Upadhyay, Optimization of nutrients for gellan gum production by Sphingomonas paucimobilis ATCC-31461 in molasses based medium using response surface methodology (From School of Biochemical Engineering, Institute of Technology, Banaras Hindu University, Varanasi 221 005, India - Department of Chemical Engineering, Institute of Technology, Banaras Hindu University, Varanasi 221 005, India), Received 21 November 2005; received in revised form 13 March 2006; accepted 23 March 2006 Available online 16 May 2006. 5. B. Manna, A. Gambhir and P. Ghosh, Production and rheological characteristics of the microbial polysaccharide gellan ( From Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology, Hauz Khas, New Delhi, India), JIP1135: received 28 December 1995 and accepted 28 January 1996. 6. Ioannis Giavasis, Linda M. Harvey, Brian McNeil , The effect of agitation and aeration on the synthesis and molecular weight of gellan in batch cultures of Sphingomonas paucimobilis (FromStrathclyde Fermentation Centre, University of Strathclyde, Department of Bioscience, 204 George street, Glasgow G1 1XW, UK), Received 20 April 2004; received in revised form 12 April 2005; accepted 5 May 2005. 7. K. Madhavan Nampoothiri, Reeta Rani Singhania, C. Sabarinath, Ashok Pandey, Fermentative production of gellan using Sphingomonas paucimobilis ( From Biotechnology Division, Regional Research Laboratory (CSIR), Trivandrum 695 019, India), Received 9 October 2002; accepted 9 November 2002. 8. A.I. Rodrı´guez-Herna´ndez, S. Durand, C. Garnier, A. Tecante, J.L. Doublie r, Rheology-structure properties of gellan systems: evidence of network formation at low gellan concentrations ( From Departamento de Alimentos y Biotecnolog ı´a, Facultad de Qu ı´mica “E”, UNAM, Cd. Universitaria, 04510 Me´ xico, DF, Mexico Laboratoire de Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn GELLAN Trang 45 Physico-Chimie des Macromole´ cules, INRA, BP 71627, 44316 Nantes Cedex 3, France), Received 12 June 2002; accepted 11 November 2002. 9. Yiqun Huanga, Juming Tanga, Barry G. Swansonb, Anna G. Cavinatoc,Mengshi Linb, Barbara A. Rascob, Near infrared spectroscopy: a new tool for studying physical and chemical properties of polysaccharide gels( From Department of Biological System Engineering, Washington State University, 213 L.J. Smith Hall, P.O. Box 646120, Pullman, WA 99164- 6376, USA Chemistry Program, Eastern Oregon University, One University Boulevard, La Grande, OR 97850, USA) Received 24 November 2002; revised 4 February 2003; accepted 7 February 2003 10. 11. 12.