Đề tài Kỹ thuật nhân giống hoa lan

ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP K13S2 @&? Đề tài: GVHD: Thạc sĩ Võ Thị Xuyến SVTH : Trần Thị Liên Phan Mỹ Linh Phan Thu Hà Ngô Quang Hùng Trương Thị Thu An Nguyễn Thị Anh Thư Trần Thị Thùy Trang Tô Thị Hồng Phượng Châu Huỳnh Kim Phụng Đoàn Thị Bích Nhung Tháng 11/2009 A.Giới thiệu về hoa lan: Phân loại khoa học: Giới : plantae. Ngành : Angiospermatophyta. Lớp: Liliopsida. Lớp phụ : Liliidea Bộ : orchidales. Họ : Orchidaceae. Giống: Dendrobium sp - Họ Lan, hay họ Phong lan, (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm. - Các họ lan được xem là một trong những loài hoa cao cấp của thảo mộc,gồm hơn 25.000 loài, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng năm. I.Phân loại: - Lan đất (phát triển mọc trong đất kháng nước). - Thực vật biểu sinh hoặc thực vật phụ sinh( phát triển phía trên mặt đất hoặc sống bám trên các loại thảo mộc khác, thu hút chất dinh dưỡng và nước từ môi trường xung quanh). -nThực vật phát triển trên mặt đá hoặc ngay cả dưới mặt đất( phát triển dưới bề mặt của môi trường cấy trồng). II.Đặc điểm hình thái: a.Cơ quan sinh dưỡng: - Giả hành:(thân giả) chỉ xuất hiện trên các loài lan đa thân. Giả hành là bộ phận rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của lan. Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp luc, đây là bộ phận dự trữ nhiều chất dinh dưỡng rất cần thiết cho sự phát triển của hành giả mới. Ngoài ra nó cũng là cơ quan dự trữ nước. - Thân: Thân vẩy giả có nhiều hình dáng khác nhau tùy theo giống lan. Trên thân có đốt, trên mổi đốt mọc một nhánh lá hoặc lá bao. Thân là cơ quan dự trữ nước và chất dinh dưỡng, mầm hoa và mầm lá đều mọc từ phần gốc của bộ phận thân rể. Chỉ có các loài đơn thân và các loài của giống Dendrobium và Epidendrum vừa có giả hành, vừa có thân. Các loài lan có thân thường không có cơ quan dự trữ nước và chất dinh dưỡng. - Lá : là cơ quan sinh dưỡng của hoa lan ,là xưởng chế tạo chất dinh dưỡng bằng quang. - Căn hành (thân rễ): chỉ gặp ở lan đa thân. Là nơi cấu tạo cơ quan dinh dưỡng mới.Trên căn hành có nhiều mắt sống ,chết hoặc hưu niên.Mắt lá nơi hình thành mang cũng rất nhiều rễ để nuôi sống cây lan. - Rễ: thường hình thành từ căn hành.Là cơ quann hút chất dinh dưỡng chính dể nuôi cây. b.Cơ quan sinh sản: - Hoa : tập hợp thành cụm hay chùm bông , hoa lưỡng tính. - Quả: khi khô nở thành 3-6 mảnh.Hạt rất nhỉ và nhiều , thường không có nội nhũ.Do nhẹ nên hạt dễ phát tán nhờ gió.Ở nhiều loài , trong quả có những long hút nước dung để bắn hạt đi.Phôi trong hạt phát triển yếu,không phân hóa thành cơ quan.Hạt muốn nảy mầm cấn có nấm cộng sinh. B.Giá trị kinh tế: - Hoa lan là sản phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao, ngày càng có nhiều cơ sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại . - Ngày nay việc trồng hoa lan đem lại một nguồn lợi đáng kể cho người trồng.Hoa lan được xuất khẩu đi khắp thế giới. C. Phương pháp nuôi cấy: I.Phương pháp cổ điển 1. Nhân giống vô tính: 1.1 Tách bụi: - Là sử dụng các giống lan đa thân Cattleya, Bendrobium, Cymbidium… và những gốc tương tự : ở mỗi gốc giả hành có ít nhất một chồi ngủ è mỗi giả hành thành một đơn vị để trồng. 1.2Kĩ thuật giâm cành: - Là kỹ thuật nuôi cấy mắt cây hay còn gọi là kỹ thuật giâm cành, mà ở VN gọi là cấy mô phân sinh. - Từ các chồi mắt (buds) "ngủ" bạn có thể sản xuất ra một hoặc nhiều cây (sinh sản vô tính). Phalaenopsis Mắt câyPhalaenopsis Mắt cây (node) :- Cây thường tạo ra các chồi "ngủ" để chắc chắn rằng cây có thể sống còn, nếu chồi ngọn chết đi hoặc bị sâu bọ ăn. Trong một thời dài, khi ngọn lớn lên và sản xuất chất điều hoà sinh trưởng (hormone – kích thích tố) để ngăn cản sự phát triển của các chồi khác trên thân cây. Nếu ngọn chết đi, chất điều hoà sinh trưởng bị thiếu hụt và các chồi "ngủ" bắt đầu phát triển. Phương pháp tiến hành: Chọn mẫu: Mẫu lan được cắt Mắt cây phù hợp là bạn cắt 3 cm ở phía trên và dưới mắt của cành hoa. Điều rất quan trọng là phải dùng dao bén, bởi vì dao cùn làm các mô bị tổn thương rất nhiều. Kế đó bạn hãy cẩn thận gỡ bỏ các màng bao. Giâm cành trên đất: Đặt mắt cây đã sửa soạn nằm ngang trong đất trồng, mắt cây phải ở phía trên. Tưới ẩm và đậy khay với lớp plastic giống như trong hình dưới đây. Chăm sóc: Đặt cái khay với những mắt cây vào nơi sáng và ấm và tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu vào. Kiểm soát mỗi 3-4 ngày để có độ ẩm đầy đủ.Mắt cây tươi Sau 2 tuần nữa 4 tuần kế tiếp Sau 4 tuần Ưu và nhược điểm: +Ưu điểm: + Ưu điềm: Cách thực hiện đơn giản Dễ chăm sóc…. + Nhược điểm: Thời gian trồng rất lâu Sản phẩm tạo ra ít…. 2. Nhân giống hữu tính: - Sự thụ phấn: trong thiên nhiên lan thụ phấn được là nhờ cô trùng. - Có 2 pp thụ phấn: +Sự tự thụ phấn: khi phấn hoa của bông này rơi vào nuốm hoa của chính hoa ấy.Điều này hiếm xảy ra trong tự nhiên vài cấu trúc cảu bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan. +Sự thụ phấn chéo: khi phấn hoa của hoa này được để vào nuốm của hoa khác của cùng cây hay cùng loài,hoặc khác loài. -Tạo hạt: sau tự thụ phấn, bầu noãn từ từ trương phù to tạo thành quả. Mỗi trái chứa hàng nghìn đến hàng triệu hạt. -Gieo hạt: trong thiên nhiên hạt muốn nảy mầm phải được nhiễm một nấm loại kí sinh.Người ta đã khám phá ra một số loài nấm giúp nảy mầm ở hạt lan:Rhizoctonia repens giúp nảy mầm ở Cattleya hay Lealia , Angraecum , Cypripedium. II. Phương pháp hiện đại: 1. Cải tiến phương pháp giâm cành a.Môi trường nuôi cấy: - Để khởi đầu phát triển của "mắt ngủ" chúng ta hãy dùng: +Chất dung môi gồm có cytokinins (chất kích thích sinh trưởng - phytohormon). + Cytokynins, trước đây gọi là kinins, đóng vai trò chính trong môi trường nuôi cấy mô để phân cắt tế bào, shoot multiplication và sự tăng trưởng của chồi nhánh. Chúng giúp làm chậm sự lão hóa, và chúng tác động chuyển hoá auxin. Nếu việc nuôi cây quá ốm yếu, tăng lượng Cytokynin sẽ giúp việc nuôi trồng ngắn hơn, thân mần khoẻ chắc. Tên Chữ viết tắt Benzyladenin BA 6-Benzylaminopurine BAP Pentyladenin Dimethylallyladenin Kinetin Zeatin Z Zeatinriboside ZR Isopentenyladenine iP Isopentenyladenosine iPA Thidiazuron TDZ -Dùng Sigma's P6793 (Phytotechlab P793) b.Cách thực hiện: Chuẩn bị dụng cụ và thiết bị: Thiết bị cần thiết: Bếp lò Nồi nấu nước đường kính miệng 30cm Đèn cồn (dùng sát trùng dụng cụ) Bao tay cao su Nhíp, kẹp (inox) Dao mổ (inox) Cái móc lấy hạt lan (dụng cụ cấy chuyền) Đồ dùng cần thiết: Ống nghiệm chứa môi trường cấy Bình cấy (lọ, ống nghiệm...) Giấy lau nhà bếp (kitchen paper) Cồn 70% Thuốc tẩy (như là Clorox) dùng tẩy trùng. Lọ (hũ) có nắp vặn (như là hũ thức ăn trẻ em - babyfood jar) Chọn mẫu: Mắt cây phù hợp là bạn cắt chéo với 1 cm ở trên và dưới mắt của nhánh (cây) hoa. Điều rất quan trọng là dùng dao bén bởi vì dao cùn làm các mô bị tổn thương rất nhiều. Nhánh hoa Phalaenopsis không có vỏ bao Nhánh hoa Phalaenopsis với vỏ bao Xử lý mẫu và dụng cụ: - Ngâm mắt cây đã cắt vào cồn 70% vài giây. - Sau đó đặt các mắt cây vào trong nước Oxi già 0,5% (hydrogen peroxide H2O2) trong 30 phút. - Kế đó đặt chúng vào trong nước Oxi già (H2O2) 3% trong 15 phút. - Sau 15 phút, đặt các mắt cây đã khử trùng (trong ống nghiệm) nằm trên vỉ trong vùng hơi nước sôi (vùng khử trùng). - Lấy ống nghiệm và mở ra trên hơi nước sôi. Nắp đậy phải đặt trong miếng giấy nhà bếp (kitchen paper) tẩm cồn. - Lấy cái nhíp và khử trùng bằng đèn cồn. Đưa cái nhíp vào vùng khử trùng (vùng hơi nước).Gợi ý: Để tạo dung dịch khử trùng có hiệu quả hơn, hãy nhỏ vài giọt nước rửa chén (dish washing solution) vào trong nước Oxi già. Đặt mẫu vào môi trường nuôi cấy: - Dùng nhíp vô trùng lấy một cái mắt cây đã cắt ngâm trong dung dịch Oxi già và đặt nó với phần đuôi vào đáy lọ trong dung môi nuôi. - Kế tiếp, nhúng cái nhíp vào trong nước sôi để rửa sạch các chất dung môi bám vào nhíp và ngâm nhíp vào trong lọ cồn 70%. - Đậy ống nghiệm lại (trên hơi nước sôi) và đặt nó trên bàn để dán nhãn. Với ống nghiệm kế tiếp cũng làm giống như vậy.Nếu bạn muốn sản sinh nhiều hơn mộy mầm bạn nên cắt 1/3 trên mắt cây. Bởi vì điều này mắt cây phát triển hàng chục chồi thay vì một chồi. Nuôi cấy mắt câyPhaius tankervilleae Cây con từ một mắt câyPhalaenopsis equestris Chăm sóc: - Đặt các ống nghiệm bạn đã làm các mắt cây vào nơi ấm và sáng (khoảng 20°C). Tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp bởi vì ánh sáng mặt trời sẽ làm ống nghiệm trở nên nóng bên trong. -Vì kích thước và cấu trúc của các mắt cây làm tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn dùng cách nẩy mầm không cộng sinh (asymbiotic seed germination). Như vậy, điều rất quan trọng là chúng ta phải kiểm soát mỗi ngày trong tuần đầu tiên, nếu có triệu chứng nhiễm trùng. Nếu bạn tìm thấy nấm hay vi khuẩn, bạn có thể khử trùng thêm một lần nữa.- Có nhiều mắt cây tiết ra các hợp chất (exudate phenolic compounds) vào trong dung môi nuôi cấy làm đen dung môi nuôi cấy. Các hợp chất tiết ra sẽ giết chết các mắt cây nếu bạn không thay dung môi nuôi mới. Nhiều mắt cây sẽ ngừng tiết ra các hợp chất sau 3 hay 4 lần thay. phenolic exudations - Khi mắt cây có 2 hay 3 lá bạn nên thay dung môi không có chất kích thích tố (như Sigma P6668) để rễ bắt đầu phát triển. Chuyển ra vườn ươm: Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật. c.Ưu và nhược điểm: Ưu điểm: - Cây mới sinh sản sau này hoa sẽ trông giống cha mẹ chúng. - Từ một chồi ngủ có thể tạo được nhiều cây con - Thời gian tạo cây nhanh… Nhược điểm: - Do kích thước và cấu trúc của các mắt cây đã làm tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn dùng cách nẩy mầm không cộng sinh. è Phải kiểm soát mỗi ngày trong tuần đầu tiên… 2.Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: - Kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền và đáp ứng nhu cầu của con người. 2.1.Tạo cây sạch virus Một trong những điều kiện cần thiết cho việc nhân giống là cây con phải sạch virus. Nhiều nghiên cứu cho rằng cứ cấy đỉnh sinh trưởng là thu được cây con sạch bệnh như thực tế thì không hoàn toàn như vậy. Các nghiên cứu của Morel (1960) trên Cymbidium cho thấy chỉ khi nuôi cấy một đỉnh sinh trưởng 1mm với 2 tiền phát khởi lá mới thu được cây con sạch virus. Một số nguyên nhân giúp mô phân sinh ngọn không bị nhiễm virus là: +Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống mô dẫn mà hệ thống này không có ở mô phân sinh ngọn +Trong sự phân chia các tế bào mô phân sinh ngọn không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus +Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng  mô phân sinh ngọn mạnh hơn các vùng khác trong cây. +Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép của virus. Bệnh virus trên lan Virus thường thấy nhất trên hoa lan là một chủng đặc biệt của virus khảm thuốc lá, được biết trước hết là virus đốm vòng Odontoglossum. Virus này có trong nhựa cây và sự lây nhiễm xảy do bàn tay con người hoặc do một con dao gây ra. Ít phổ biến hơn là virus khảm trên Cymbidium, chúng cũng lan truyền trong nhựa cây là nguyên nhân gây ra những đốm hoặc sọc vàng trên lá Cymbidium, Phalaenopsis và Vanda và còn gây ra bệnh thối trên hoa của Cattleya. Hakkaart và Balen (1980) gọi tên một loại virus là Rhabdovirus, chúng tấn công trên nhiều loại lan. Khác với 2 loại virus trên,   Rhabdovirus rất khó phát hiện, phải cần đến kính hiển vi điện tử và chỉ có thể thấy được triệu chứng trên những mãnh lá đã già. Nhiều cây bị xâm nhiễm bởi virus có triệu chứng kém phát triển, bị thối, xoăn lá, có sọc trên lá hoặc hoa, năng suất giảm và sau đó là cây chết (Quack 1997). Ngoài ra bệnh virus còn là nguy cơ truyền bệnh cho cây khỏe những năm sau. Mặt khác, virus không thể tiêu diệt, phòng trừ như những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng, tích lũy dần dần trong cây và làm thoái hoá giống. Do đó cách duy nhất là loại bỏ virus ra khỏi cây bị bệnh. Các bước thực hiện tách đỉnh sinh trưởng lan Dendrobium 2.2.Quy trình trên được tiến hành qua các giai đoạn sau: Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy: -Theo Champagnat (1997) và Fast (1980), các chồi lan đang tăng trưởng dài 10-15 cm vừa mới nhú lá thường được dùng làm nguyên liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. - Khi cấy đỉnh sinh trưởng cymbidium chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi lá u lên và cuối cùng tạo thành protocorm. Còn đối với Cattleya khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường bị hóa nâu. Vì lý do đó mà đỉnh sinh trưởng thường được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vô trùng và được nuôi trong môi trường không có agar, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào môi trường. Sự thành lập protocorm ở cattleya mất nhiều thời gian và luôn tạo ra ở phần gốc mẫu cấy. Các protocorm tạo thành được tách ra và cấy chuyền vào môi trường mới để thành lập các protocorm bất định từ các protocorm ban đầu, nếu không được cấy chuyền chúng sẽ phát triển thành chồi và ra rễ. - Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng. Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong 30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần. - Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non. Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng. Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng. Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường nhân giống ban đầu. Nhân giống: Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi. Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyền sau đó. Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây... nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyền và thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường. Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài. Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi. Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi. Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường mới MT bổ sung NAA Sau 8 tuần Sự phát sinh Protocomv và sinh chồi trong MT BAP sau 4 tuần Tái sinh cây hoàn chỉnh: Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ). Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con. Chuyển cây ra vườn ươm: Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật. Như vậy, từ một mô hoa Lan được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng. Ưu và nhược điểm: Ưu điểm: Với phương pháp nhân giống vô tính như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm bệnh. Tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Với ưu điểm ít chiếm diện tích, không quá khó trồng, cho hoa đẹp lại lâu tàn nên việc chọn, trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều người. Sản phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao. Nhược điểm: Phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng quy trình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt. Cần chú ý thêm, đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá tại vùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy, có như vậy mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm 3. Kỹ thuật gieo hạt trong ống ngiệm( cách gieo hạt lan nẩy mầm trong điều kiện (in-vitro) - Hạt lan rất khó nẩy mầm trong tự nhiên( chỉ nẩy mầm từ 1-2%) do hạt lan không có chứa anbumin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước rất nhỏ nên không chứa chất dự trữ. - Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm  nuôi cấy mô đã tạo môi trường gieo hạt lan trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo có khoáng, đường và hạt lan nảy mầm với tỷ lệ rất cao. Hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất có thể nhân giống lan trên qui mô công nghiệp. 3.1Đặc điểm của hạt lan: - Hạt lan rất nhỏ, như hạt bụi và không chứa nguồn dự trữ thức ăn. Trong tự nhiên, hạt có thể nẩy mầm nhưng sẽ không phát triển nếu không có sự tác động của nấm mycorrhizal. - Khi hạt lan đã nẩy mầm, nó sẽ tạo ra một lượng lớn các tế bào không phân hóa được gọi là protocorm. Sau đó, protocorm sẽ tiếp tục trong vài tuần, vài tháng, thậm chí cả năm tùy loài, đến khi đủ lớn để tạo thân và rễ. - Ở các loài lan đất,duy trì mối quan hệ cộng sinh này rất quan trọng trong suốt giai đoạn đầu tiên của cây, vì protocom nằm dưới đất nên không thể tự tổng hợp thức ăn.- - Ở các loài lan phụ sinh, protocorm thường xanh và vì thế nó có thể tự tổng hợp được một ít thức ăn. 3.2Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi: 24-280o C. Cường độ chiếu sang: 2000-3000 lux. Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày. Ẩm độ trung bình: 60- 70% 3.3Phương pháp: a.Khử trùng trái lan: Sử dụng Hypochlorite de calcium 10%: Ca(OCl)2. Việc khử trùng trái lan có thể thực hiện như sau: Quả lan sau khi mổ ra, hạt thu được trước khi đem gieo cần tuyển chọn các hạt chắc, các hạt lép không thụ tinh loại bỏ bằng cách đem ly tâm trong nước cất; các hạt lan tốt sẽ lắng phía dưới ống nghiệm, hạt lép nổi lên trên, được gạn bỏ đi. Các hạt tốt được tiếp tục khử trùng bằng Hypochlorite de calcium 10%: Ca(OCl)2. Cho hạt lan và nước khử trùng vào ống nghiệm, vừa đủ phủ kín hạt lan, lắc mạnh, đều và để yên trong vòng 10 phút, sau đó đổ nước khử trùng và tiếp tục rửa hạt lan 3 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng hạt lan đã khử trùng sẽ được gieo vào các bình chứa môi trường. b.Kĩ thuật gieo hạt trong ống nghiệm: Sử dụng chai thủy tinh 100ml và 500ml để nuôi cấy.Tất cả môi trường được hấp khử trùng ở 1atm,1210C trong thời gian 20 phút. Hạt sẽ nảy mầm trong ống nghiệm bằng thủy tinh hay bằng nhựa trên môi trường rắn có chứa đường và các loại khoáng chất cần thiết để hạt nảy mầm và phát triển. Sau 2 tuần , hạt gieo bắt đầu biến đổi tạo thành một đám tế bào có màu xanh. Số lượng protocorm ngày càng tăng nhanh sau 3-4 tuần , phình to lên và có lá mầm.(Sự tạo protocorm trong môi trường Knudson’C có bổ sung kích tố BA là tốt nhất). Đối với lan có 2 kiểu nảy mầm cơ bản: Nảy mầm cần mấm cộng sinh : + Gieo hạt với một lượng nhỏ mấm mycorrhizal thích hợp .Nấm này sẽ phát triển trên môi trường,bao phủ các hạt nảy mầm và mối quan hệ cộng sinh xuất hiện sẽ duy trì sức sống của protocorm cho đến khi nó tạo ra lá và có khả năng tự dưỡng→thường được áp dụng cho lan đất. + Ưu điểm: môi trường đơn giản (gồm bột yến mạch và một ít dịch chiết nấm men), cây sinh ra khỏe hơn,có khả năng kháng tác động của nấm tốt hơn cây đối chứng không cần nảy mầm. + Nhược : cần chủng nấm men mycorrhizal thuần khiết , hoặc quan hệ cộng sinh không phát triển, hoặc trở thành kí sinh và gieo hạt sẽ chết. Nảy mầm không cần nấm cộng sinh : sử dụng để nhân giống loài lan nhiệt đới.Môi trường sử dụng phức tạp hơn:muối khoáng,chất hữu cơ và đường với lượng thích hợp để hạt lan nẩy mầm mà không cần nấm. 3.3Ứng dụng của việc gieo hạt: Gia tăng lượng hoa lan trên thị trường. Nhân giống các loài lan hiếm nhằn nhân nhanh số lượng cả trong tự nhiên và trong các chương trình bảo tồn. Cung cấp cây con để bán . giúp hạn chế sự khai thác cây hoang dại,kích thích sự quan tâm của công chúng và tạo nguồn thu ngân sách. Kết hợp với kĩ thuật lai tạo giống tạo ra những cây lan khỏe mạnh có màu sắc đặc biệt. 4.Cấy mô: - Là kỹ thuật nhân giống nhanh chóng và hữu hiệu nhất. Người ta có thể cấy một loạt ra hàng ngàn hay hàng trăm ngàn cây lan nhỏ với đặc tính y hệt như cây lan mẹ.4.1Điều kiện nuôi cấy: - Môi trường: + Có nhiều môi trường khác nhau được dùng trên thế giới để nuôi cấy mô nhưng môi trường Knudson 's C được xem là tốt nhất để cấy cho hầu hết các loài lan. + Môi trường cấy và nước cất phải được tiệt trùng ở nồi hấp ở áp suất 15 PSI trong 10 -30 phút. - Nhiệt độ lý tưởng cho việc nuôi cấy là 22 0C+ 1 cho đa số các loài đa thân và 260C +3 cho đa số các loài đơn thân. - Ánh sáng: nhân tạo được cung cấp bởi 2 loại đèn huỳnh quang và đèn nóng sáng. ánh sáng phải được sử dụng liên tục 16 giờ,18 giờ hoặc 24 giờ tùy loài. Các đèn phải đặt cách môi trường cấy 0,4 - 0,5m. - Độ pH của môi trường thích hợp cho mô phát triển:khoảng 4,8 - 5,5, thông thường trong khoảng 5 - 5,2 là tốt nhất. - Máy lắc : các kết quả về cấy mô cho biết rằng, môi trường lỏng được xáo trộn trên máy lắc có hiệu quả hơn môi trường đặc. Tốc độ quay của máy lắc thay đổi tùy theo loài lan và giai đoạn cấy. + Trong giai đoạn đầu, điều chỉnh máy lắc với tốc độ 1/4 - 1/5 vòng/phút (làm cho môi trường dinh dưỡng hòa đều) + Sau đó, tốc độ tăng dần 100 vòng/phút phổ biến cho các loài. Thời gian của mô quay trên máy lắc có thể thay đổi tùy loài lan, thưường từ 3 - 4 tuần 4.2Vật liệu cấy: Người ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm . Vd: lấy từ đáy lá, đỉnh lá, rễ, lõi của các mầm non mới mọc… 4.3Phương pháp khởi tạo protocorm từ mô lá : - Các mẫu lá thu được từ các chồi sinh dưỡng được cắt theo kích thước 5 x 5 mm. - Các mẫu lá được đặt nuôi trên môi trường MS 1/2 bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thực vật NAA 1mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l   - Cho vào máy lắc chậm xoay vòng . - Sau 10 tuần nuôi cấy: các protocorm được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. - Khi đã có Plbs, người ta cắt thành 3 - 6 phần, mỗi phần sẽ sự đâm chồi và chưa đầy 1 tháng sẽ sản xuất đến 12 plbs mới (tiến trình này có thể tiếp tục mãi, vì thế mỗi tháng có thể nhận được 4 lần con số cây đó và sau một năm sẽ có đến 4 triệu cây con từ một chồi duy nhất.) - Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá tiếp tục phát triển trong khi phần mô lá ban đầu bị hoại đi. - Sự tái sinh chồi từ protocorm: khi tái sinh thành cây con từ protocorm chỉ cần sử dụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. - Sự ra rễ : các chồi tái sinh từ PLB sẽ ra rễ và phát triển mạnh trên môi trường có bổ sung nước dừa, chuối, khoai tây… và cũng không cần bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. Tuy nhiên, việc này còn tùy thuộc vào giống. - Chồi sẽ ra rễ dài, lá to. Sau 3-4 tháng nuôi cấy có thể đem cây con ra trồng ngoài vườn ươm.Ưu điểm: -Giá thành thấp- Từ một cây mẹ ban đầu có thể nhân ra hàng ngàn cây có kích thước và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn. - So với tách chiết thông thường tốc độ phát triển 1 cây/năm thì cấy mô sẽ sản xuất một số lượng cây con khoảng 4 triệu cây/năm. - Cây con không bị nhiễm bệnh. - Mầm để cấy lúc nào cũng có sẵn không mất thời gian chờ đợi trái chín như cây gieo hạt. Nhược điểm : - Từ khi cấy mô đến khi ra hoa thời gian kéo dài tối thiểu là 3 – 4 năm nếu chăm sóc tốt.. 5.Biến đổi gene: -Người ta đã phát hiện ra 1gene đặc biệt và biến đổi gene đó làm cho cây lan mau ra hoa hơn và có thể thay đổi hình dạng của cánh hoa. Cách tiến hành: - Để cho hoa nở sớm hơn, người ta đã biến đổi gene AGL24 được tìm thấy trong cây Aarabidopsis. -Người ta đã hoạt hóa gene này để nó hoạt động mạnh hơn bình thường trong giai đoạn đầu thảo mộc tăng trưởng, lúc các tế bào của thảo mộc đang thay đổi thành những lọa mô khác nhau. Điều này làm cây ra hoa sớm hơn. -Ngay khi hoa bắt đầu phát triển, gene này phải được ngưng hoạt động, dẫn đến kết quả cánh hoa cũng bị biến dạng. 6.Nhân giống bằng cách tạo hạt lan nhân tạo:  Hạt giống vốn thường được lấy từ vườn cây, cánh đồng sau khi thu hoạch. Đấy là hạt giống hữu tính, được tạo ra từ quá trình thụ phấn ở cây trồng. Vì vậy, nhân giống vô tính hiện được xem là một phương pháp hiệu quả để tạo ra một số lượng lớn cây giống đạt chất lượng. Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt, Phân Viện Phó Phân Viện Sinh học Đà Lạt đã tiến hành nhiều thí nghiệm tạo hạt nhân tạo trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau bằng công nghệ sinh học và thành công trong việc nghiên cứu hạt nhân tạo trên đối tượng cây địa lan. Và công trình này đã được chấp nhận đăng trên Tạp chí Khoa học quốc tế ở Bungari và cũng là một trong những công trình được bầu chọn là có ý nghĩa trong việc chuyển hạt vô tính ra bên ngoài sinh trưởng và phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Ý nghĩa khoa học của hạt vô tính là nó tạo nên những cá thể đồng nhất về mặt di truyền, tính ổn định cũng như chất lượng cây giống. Hạt nhân tạo là một dạng mô phỏng hạt tự nhiên. Hạt nhân tạo chứa phôi vô tính được bọc trong lớp alginate có chứa chất dinh dưỡng. Sau đó, các phôi vô tính có thể nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh. Việc sử dụng sodium alginate làm vỏ bọc đã đạt được một số kết quả khả quan trên các đối tượng như : cần tây, hoa cẩm chướng, rau mùi, cây hông. Hạt nhân tạo của cây địa lan Cymbidium spp. cũng được bọc bằng dung dịch sodium alginate  với nhiều nồng độ khác nhau. Tỷ lệ hạt sống sót của các hạt nhân tạo trong điều kiện invitro là 100% và khả năng tái sinh cũng khá cao. Hạt nhân tạo không bị giảm khả năng sống sót sau khi được bảo quản một năm trong môi trường lỏng không chứa đường. Cây con được tạo ra từ những hạt nhân tạo này đều sống tốt sau 6 tháng ngoài nhà kính. Kết quả cho thấy: Việc khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ alginate trong vỏ hạt, môi trường nuôi cấy và giá thể khác nhau nên sự tái sinh cây invitro của hạt nhân tạo từ nhiều nguồn nguyên liệu của cây địa lan cho thấy: Phôi là nguồn nguyên liệu tốt nhất đểå tạo hạt nhân tạo. Nồng độ alginate 30g/l trong dung dịch tạo vỏ hạt là nồng độ tối ưu giúp hạt có tỷ lệ nảy mầm cao. Đồng thời, việc nuôi cấy hạt trên giá thể giúp môi trường lỏng khuếch tán dinh dưỡng tốt (bông gòn) tạo điều kiện thuận lợi cho sự tái sinh cây invitro của hạt hơn là các giá thể rắn khác và môi trường nuôi cấy có nồng độ carbohydrate thấp phù hợp hơn cho sự tái sinh này. Ngoài ra, môi trường lỏng bảo quản hạt cũng không cần lượng  carbohydrate cao và nồng độ dinh dưỡng cũng có thể được giảm còn khoảng ½ - 1/5 so với môi trường nuôi cấy. Quả thật, đây là một thành công không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học, mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế, vì địa lan- một loài hoa chỉ phát triển được ở Đà Lạt và đang có tiềm năng rất lớn về xuất khẩu. Trước đây, các nhà vườn trồng điạ lan tự nhân giống bằng tách chồi. Sau này, khi kỹ thuật nhân cấy mô phát triển, người ta chuộng cây lan cấy mô hơn, vì tạo ra được số lượng lớn, độ sạch bệnh cao, nhưng vẫn chưa đủ để đáp ứng nhu cầu thị trường.