Đề tài Kỹ thuật DNA Marker

DNA MARKER °¨¨°º°¨¨° Nhĩm thực hiện: Trần Như Khoa Nguyễn Duy Lan Nguyễn Thị Bích Liễu Lê Hồng Lâm Nguyễn Thị Kim Ngân Đặng Thị Ái Trinh Nội dung Khái niệm DNA marker. Các kỹ thuật: Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism). Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism). Kỹ thuật RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA). Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat). DNA MARKER Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai dịng hoặc hai giống khác nhau đều cĩ thể được xem như một DNA marker. Các DNA marker cĩ thể chia thành hai nhĩm:-Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP, minisatellite. -Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD. Dựa trên kiểu hình cĩ thể phân loại DNA marker thành 2 loại: -Marker đồng trội: là những marker cĩ thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, đĩ là các marker allozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP. Trong trường hợp này tần số alen cĩ thể được tính trực tiếp từ dữ liệu kiểu gen. -Marker trội: RAPD marker khơng thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Marker Tên đầy đủ RFLP Restriction fragment length polymorphism ALP Amplicon length polymorphism AFLP Amplified freagment lenth polymorphism RAPD Random Amplification Polymorphic DNA DAF DNA amplification fingerprinting SSR Single sequence repeat (microsatellite) AP-PCR Arbitrary primer-PCR SSCP Single strand conformation polymorphism MRDHV-DNA Moderately repeated, dispersed and highly variable DNA (minisatellite) Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Định nghĩa: Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism) RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi cĩ sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. Nguyên tắc Dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dị DNA (được đánh dấu phĩng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. T-RFLP method Ưu và nhược điểm Ưu điểm : Là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Hạn chế: Do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phĩng xạ đánh dấu). DNA yêu cầu cĩ chất lượng cao. Ứng dụng 1.Xác định thơng tin di truyền: Schematic for RFLP by cleavage site loss. 2.Phân tích cấu trúc di truyền DNA ứng dụng trong Y pháp nhận dạng : Từ những năm 30s dấu vân tay được đưa vào ứng dụng trong Y Pháp (Forensics) và trở thành một cơng cụ cần thiết trong phịng thí nghiệm của cảnh sát hình sự và thám tử để nhận dạng. Tuy nhiên dấu vân tay bộc lộ nhiều khiếm khuyết một khi áp dụng trong thực tế. Chẳng hạn, dấu vân tay thơng thường chỉ cĩ thể lấy mẫu được từ các đầu ngĩn tay mà thơi. Đã thế ngày nay nĩ khơng cịn đặc hiệu cho từng cá thể nữa từ khi phẫu thuật chỉnh hình phát triển mạnh, người ta cĩ thể chủ định thay đổi dấu vân tay qua phẫu thuật. Chỉ trong vịng trên dưới 50 năm từ khi cấu trúc chuỗi di truyền DNA được Watson và Crick cơng bố [1], ngành sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi. Một trong những ứng dụng quan trọng của sinh học phân tử là sử dụng đặc tính của cấu trúc chuỗi di truyền DNA của từng cá thể vào trong Y pháp để nhận dạng đối tượng coi như là một cuộc cách mạng trong Y học hình sự của nhân loại. Tương tự như dấu vân tay, mỗi một con người đều cĩ một đặc trưng riêng về cấu trúc di truyền của mình, được xác định bằng chuỗi di truyền DNA. Cấu trúc của DNA [1], và"điểm chỉ" DNA: Đặc tính của tất cả các sinh vật, kể cả con người, đều được cấu tạo từ đơn vị căn bản nhất là tế bào, từ nguyên thuỷ là hợp tử được thụ tinh bởi trứng và tinh trùng. Về phương diện sinh học phân tử, mỗi tế bào của cơ thể (trừ hồng cầu) đều cĩ nhân, trong nhân chứa các chất liệu di truyền, nhiễm sắc thể (chromosome) quyết định cấu trúc đặc tính cho mỗi cá thể. Con  người cĩ 23 bộ nhiễm sắc thể (22 đơi thường và một đơi xác định giới tính). Các nhiễm sắc thể này được tạo bởi các chuỗi chất liệu chứa đựng thơng tin di truyền DNA (viết tắt của từ DeoxyriboNucleic Acid) thừa kế từ cha và mẹ. Mỗi cá thể sống nhận chất liệu DNA 50% từ cha và 50% từ mẹ.  Cĩ thể hình tượng cấu trúc phân tử của một DNA như là một cái phéc-mơ-tuya (zip), mỗi răng kéo là một trong bốn khối chất liệu căn bản, viết tắt bằng các ký tự A (adenine), C (cytosine), G (guanine), và T (thymine), mà mỗi một ký tự đĩ gọi là một nucleotide, chúng cũng đứng song đơi như các răng kéo của phéc-mơ-tuya theo cặp cố định A-T hoặc G-C. Thơng tin chứa đựng trong DNA được xác định cơ bản bằng chuỗi tiếp nối các ký tự này dọc theo cái "phéc-mơ-tuya" di truyền đĩ. Các 'ký tự' này đứng theo một thứ tự và một số lượng nhất định để tạo thành đơn vị lớn hơn gọi là gien. Nhiều gien nối lại với nhau tạo thành nhiễm sắc thể. Theo ước tính mới nhất, con người cĩ khoảng 35000 bộ gien. Trong đĩ chỉ cĩ 1% số lượng gien đĩng vai trị chức năng (thí dụ như gien quy định màu da, tĩc v.v..), 99% cịn lại là những gien khơng cĩ chức năng,  các gien này rất đa dạng, khác nhau ở từng cá thể. Cho nên chẳng thể cĩ người nào giống người nào về cấu trúc di truyền DNA cả, trừ đĩ là người sinh đơi cùng trứng. 'Hồ sơ' DNA (tạm dịch từ DNA profiling) là một phần nhỏ trích từ cấu trúc tồn bộ của chuỗi DNA (của một cá thể), tức là các bộ gien và thuộc phần gien khơng cĩ chức năng, đủ để phản ánh đặc thù riêng nhất của mỗi cá thể khơng lẫn lộn với người khác. Và cũng từ đĩ mà thuật ngữ "Điểm chỉ" DNA (tạm dịch từ DNA fingerprint)- cũng chính là 'hồ sơ DNA', do một nhà Di truyền học người Anh, Alec Jeffreys đề xuất, để nĩi lên một đặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể giống như là dấu vân tay (hay điểm chỉ). 'Điểm chỉ' DNA là hồn tồn giống nhau ở tất cả các tế bào, tổ chức mơ, tạng phủ trong một cơ thể; và điểm chỉ DNA khơng cĩ thể thay đổi được bằng bất cứ hình thức nào với tri thức của nhân loại hiện nay. Về nguyên lý nhận dạng cá thể sống bằng DNA rất đơn giản, đĩ là nguyên lý so sánh và ghép cặp. Đối với nhận dạng vết tích thì người ta đem mẫu DNA của vết tích so sánh với mẫu DNA dự trữ hoặc với các mẫu nghi ngờ. Đối với việc nhận dạng quan hệ huyết thống (cha mẹ chẳng hạn), người ta đem so sánh DNA của cha, mẹ với cá thể đĩ để xem cĩ quan hệ di truyền hay khơng. Nĩi nơm na là như biển số đăng ký xe. Mỗi một chiếc xe cĩ một biển số riêng, người ta cĩ thể dựa vào hồ sơ đăng ký cĩ thể xác định chính xác chủ nhân hiện thời của chiếc xe đĩ, tương tự mỗi chủ nhân cĩ một thẻ đăng ký xe, khi mất xe họ cĩ thể dùng số đăng ký đĩ đi truy tìm chiếc xe ở đâu. Kỹ thuật nhận dạng bằng DNA cũng y như vậy nhưng điều đặc biệt là DNA khơng thể thay đổi được, và nĩ 'ẩn' bên trong cơ thể, phải dùng các phương pháp kỹ thuật nhất định để cĩ thể đọc được nĩ mà thơi. Tuy nhiên như đã trình bày vì cấu trúc di truyền DNA đầy đủ của mỗi một cá thể rất phức tạp, người ta khơng thể và khơng cần thiết phải sử dụng tồn bộ 35 nghìn bộ gien để đi phân tích, so sánh. Do đĩ chỉ sử dụng những bộ gien (khoảng chừng 12 gien hoặc ít hơn) hoặc các marker (đoạn đặc trưng) của các gien (khơng cĩ chức năng) sao cho đủ để đặc trưng cho mỗi cá thể để phân tích mà thơi. Ứng dụng thực tế của cơng nghệ điểm chỉ DNA: Điểm chỉ DNA được ứng dụng trong cuộc sống hàng ngày với mục đích: (a) Trong Y pháp, hình sự : để xác định quan hệ phụ hoặc mẫu hệ; để nhận dạng tội phạm cũng như loại trừ nghi can thơng qua dấu vết của cơ thể để lại hiện trường; nhận dạng cá nhân, nạn nhân vơ thừa nhận. (b) Trong Y học điều trị: để chẩn đốn các bệnh về di truyền; phát triển các phương pháp để chữa các rối loạn về di truyền. (c) Trong các ngành khoa học khác: Như trong khảo cổ học; hoặc trong nơng-lâm-ngư nghiệp dùng để vẽ bản đồ gien (mapping), tạp giao, lai giống, chuyển gien, để nhận dạng dấu vết các lồi thú quý hiếm. Một trong ứng dụng mới nhất của cơng nghệ phân tích điểm chỉ DNA trong nơng nghiệp là để bảo vệ tác quyền thương mại các sản phẩm, hay giống lai tạo mới. Tuỳ theo các mục đích khác nhau mà người ta tiến hành cách thức thu thập mẫu để cĩ được chuỗi DNA cơ bản đầu tiên để phân tích khác nhau. Trong ứng dụng nhận dạng con người các mẫu thu thập cũng tuỳ theo yêu cầu mà cĩ thể lấy mẫu máu, tĩc, lơng, da v..v đặc biệt trong nhận dạng tội phạm hình sự, mẫu thu thập rất đa dạng tuỳ theo tính chất sự kiện các dấu vết được để lại hiện trường. Các kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA hiện hành [2]:Cĩ nhiều kỹ thuật  phân tích nhưng hai kỹ thuật thơng dụng nhất hiện nay là: Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism) (tạm dịch là các đoạn gien cĩ độ dài giới hạn đa hình thái). Xuất phát từ thực tế là các đoạn DNA chức năng và các đoạn DNA khơng chức năng cĩ thể tồn tại dưới nhiều hình thái khác nhau. Bằng cách sử dụng các enzyme đặc hiệu, chẳng hạn Restriction enzyme, cĩ thể cắt ra các đoạn gien RFLP. Người ta đã cĩ thể nhận dạng được đến vài nghìn loại RFLP, rất đặc hiệu cho cơ thể. Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase chain reaction/Short Tandem Repeat) Tức là kỹ thuật dùng phản ứng chuỗi enzyme đa phân để 'khuếch đại' các đoạn gien ngắn cĩ độ lặp ngắn theo thứ tự (Short Tandem Repeat, STR). Ở đây polymesase tức là một loại enzyme cĩ thể cho phản ứng tạo ra nhiều bản copy của một đoạn DNA nào đĩ; phản ứng chuỗi tức là một phản ứng diễn ra liên tục. Như vậy bằng kỹ thuật PCR cĩ thể trong một thời gian ngắn tạo ra hàng triệu triệu đến hàng tỷ bản copy của một STR. Kỹ thuật này cịn được gọi là kỹ thuật "khuếch đại DNA" hay "Photocopy phân tử" trong một lối nĩi rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật hiện đại nhất hiện nay được dùng trong Y pháp DNA. Về mặt cơ bản kỹ thuật này cũng tiến hành tương tự như kỹ thuật RFLPs. Lợi điểm của kỹ thuật này so với RFLP là: - Mẫu thu thập khơng nhất thiết phải đạt tiêu chuẩn cao, những mẫu lấy từ các mơ bị huỷ hoại hoặc cháy bỏng nặng, xác thối rữa do chơn lâu đều cĩ thể dùng được, hoặc chỉ lấy các 'vi vết' như tàn thuốc lá, vết dính nước bọt, những mẫu bệnh phẩm bị trộn lẫn như máu của nạn nhân lẫn với máu hay dịch của phạm nhân. Các đặc điểm khác nhau về kỹ thuật cơ bản giữa PCR/STR vơi RFLP là: (a) Trong nhận dạng quan hệ huyết thống, nếu phân tích một gien bằng kỹ thuật RFLP chỉ cĩ thể cho ra tối đa hai dị hợp tử (allele)  và ba kiểu gien (genotype), trong khi đĩ dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại số lượng gien này lên, thì cĩ thể cho ra đến 20 dị hợp tử và đến (20x21)/2 kiểu gien, và vì thế kỹ thuật này cho phép đánh giá chính xác hơn, (b) kỹ thuật PCR/STR gắn huỳnh quang rất tốt, nên rất dễ phát hiện tự động, thuận lợi cho phân tích pháp y, bảo quản và dễ phục hồi số liệu. Sau khi cĩ các đoạn gien cần thiết được cắt đoạn, xếp theo kích thước, phân loại, thơng qua hai kỹ thuật trên, các đoạn DNA này được chuyển dạng, nhuộm màu hoặc gắn huỳnh quang và tạo thành các thanh (như các thanh mã (bar codes) trong các gĩi hàng bán trong siêu thị), và dùng để so sánh đối chiếu.  Tuy nhiên cơng nghệ DNA cũng như moị cơng nghệ khoa học khác, ưu điểm và nhược điểm vẫn luơn song đơi với nhau. Một số vấn đề đối với điểm chỉ DNA Kết quả sai lầm của điểm chỉ DNA khơng phải do sự trùng hợp giữa cấu trúc di truyền của nhiều người mà do sai sĩt trong khâu kỹ thuật cũng như điều kiện tối ưu để cho ra kết quả chính xác. Ngồi ra kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA cịn liên hệ đến mặt đạo đức. Thứ nhất phải kể đến tình trạng nhiễm DNA ngoại lai, cĩ khi bị nhiễm ngay trên kính hiển vi khi soi tiêu bản. Do đĩ cần phải đặt vấn đề tiêu chuẩn chất lượng của phịng thí nghiệm phải đạt yêu cầu. Ngay ở Mỹ cũng chỉ cĩ 20 trên tổng số 60 phịng thí nghiệm làm DNA tiêu bản được Ban giám đốc kiểm nhận phịng thí nghiệm của Hiệp Hội Tội phạm của Mỹ cơng nhận đạt tiêu chuẩn mà thơi. Ở Úc, cho đến 1991 vẫn chưa cĩ một cơ quan kiểm nhận chất lượng các phịng thí nghiệm DNA nào [3], cũng như khơng cĩ các chương trình kiểm tra chất lượng của nội bộ phịng thí nghiệm đĩ. Thứ hai, liên quan đến kỹ thuật chọn mẫu, nhiều khi mẫu khơng đại diện, khơng điển hình, hoặc mẫu bị thối hố. Tuy nhiên với kỹ thuật mới PCR/STR nêu trên cĩ thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng kỹ thuật này lại khơng cho độ chính xác cao. Cũng trong vấn đề phân tích kết quả, cần phải đề cập đến độ tin cậy của dữ kiện trong quần thể (population data). Ví dụ như FBI đã xây dựng được một hệ dữ liệu thống kê quần thể tham khảo cho các sắc dân da trắng, đen, da màu và dân Á châu. Vấn đề là ngay trong mỗi nhĩm sắc dân đĩ cũng cĩ sự biến đổi (chẳng hạn Á châu thì gồm Đơng Á, Tây Á, Đơng Nam Á v.v..). Xác suất để cĩ thể khớp được một mẫu DNA với một mẫu trong quần thể tham khảo là rất thấp (1 phần 6 triệu!), do đĩ xác suất này cĩ thể cao hơn nếu dùng phụ nhĩm của quần thể tham khảo (cĩ thể tăng lên 1/800000). Một trở ngại khác liên quan đến bằng chứng. Kết quả báo cáo của chuyên viên DNA được tồ ghi nhận, thế nhưng lại khơng cĩ bằng chứng cụ thể nào để xác nhận mẫu DNA đĩ là sản phẩm lấy từ mẫu bệnh phẩm nguyên thuỷ cả. Điểm sau cùng trong tính phức tạp của kỹ thuật điểm chỉ DNA là liên quan đến vấn đề đạo đức và pháp lý. Đây là vấn đề tranh cãi rất nhiều và chưa hồn tồn thống nhất trong hệ thống pháp luật của nhiều quốc gia. Thứ nhất là về ngân hàng dữ liệu DNA tội phạm. Luật lệ nhiều nước gần như thống nhất là tội phạm hoặc như nghi phạm bắt buộc phải làm DNA. Cịn những người bình thường thì khơng cĩ cơ sở luật pháp bắt họ phải làm, như vậy về mặt dữ liệu sẽ bị thiếu hụt. Trong một số trường hợp những bệnh nhân bình thường, vì lý do gì đĩ phải xét nghiệm DNA thì đây là một trong những trường hợp nguy cơ kết quả DNA bị lạm dụng. Hoặc giả sử một trường hợp khác vừa liên quan đến đạo đức, vừa luật pháp. Ví dụ một đơi vợ chồng cĩ một đứa con bị bệnh Cystis Fibrosis (hay CF, dịch là bệnh xơ nang tổn thương chủ yếu là tuỵ tạng và phối) là một bệnh di truyền lặn, do đĩ về di truyền thì bố mẹ phải cĩ gien ẩn của bịnh này mới 'truyền' được cho đưá con. Nhưng khốn thay, khi xét nghiệm ra thì chỉ cĩ người mẹ mang gien lặn mà thơi. Vấn đề đặt ra là, liệu cĩ nên thơng báo cho người chồng của bà mẹ biết rằng ơng khơng phải là bố của đứa trẻ hay khơng? Và cĩ nên thơng báo cho cha chính thức của đứa trẻ rằng chính ơng cĩ mang gien lặn của bệnh CF, về mặt di truyền ơng khơng nên cưới vợ cĩ cùng mang gien lặn bệnh như ơng nữa, hay khơng? Điểm chỉ DNA và vụ thảm hoạ hoả hoạn ở ITC thành phố HCM tháng 10/2002: Áp dụng của điểm chỉ DNA trong nhận dạng tử thi của thảm hoạ hoả hoạn  vừa mới xảy ra trong hạ tuần tháng 10 vừa qua tại ITC, thành phố HCM [4], theo báo cáo của nhà chức trách thì cĩ 60 người tử vong, do sự huỷ hoại của lửa, 7 tử thi khơng cĩ khả năng nhận dạng. Giới chuyên mơn cĩ thẩm quyền cĩ hứa hẹn sẽ thu mẫu làm điểm chỉ DNA cho các trường hợp đĩ. Vậy ta cĩ quyền hy vọng khơng? Câu trả lời là hồn tồn cĩ thể nếu dưạ trên bài tổng quan trên đây. Thực sự nhận dạng cá thể trong trường hợp này khơng hồn tồn phức tạp như truy tìm dấu vết tội phạm. Các bước cần phải làm là chỉ cần thu mẫu mơ bệnh phẩm, rồi lấy mẫu của thân nhân cĩ người mất tích nghi ngờ trong vụ hoả hoạn. Chế khắc nhược điểm của mơ bị cháy, nhiễm bẩn thì kỹ thuật phân tích PCR/STR hồn tồn cĩ khả năng. Vấn đề chỉ cịn là kinh phí và khả năng thực hiện kỹ thuật. Về mặt thực tế, giới chuyên mơn Phillipines đã thành cơng trong việc ứng dụng cơng nghệ điểm chỉ DNA để nhận dạng các nạn nhân trong một vụ thảm hoạ hoả hoạn [5] tại một trại mồ cơi ở Paco, Manila năm 1998. Vụ hoả hoạn này đã cướp đi ít nhất là 28 sinh mạng, trong đĩ hầu hết là trẻ em. Điều phức tạp là tất cả những thi thể đã gần như cháy thành than ngồi khả năng nhận dạng cơ học, và các thi thể này vì lý do vệ sinh lúc đĩ đã được chơn cất đến 3 tháng mới được khai quật để lấy mẫu. Vấn đề đạo đức đặt ra trong trường hợp này là sau vụ thảm nạn, nhiều bố mẹ trước đĩ đã từng gửi con vào trại mồ cơi ở đây, bây giờ khơng biết nạn nhân cĩ phải là con của mình khơng, nếu nhận dạng được thì họ cĩ thể làm được điều duy nhất họ cĩ thể là nhang khĩi cho đứa con xấu số của mình trong quá khứ họ khơng cĩ khả năng nuơi dưỡng. Mặc dù cĩ một số nhược điểm, nhưng cho đến nay điểm chỉ DNA  vẫn được coi là cơng nghệ tối tân nhất trong khoa học nhận dạng cá thể đặc hiệu và chính xác,  do tính đặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể. Điểm chỉ DNA đã khơng những đưa hình sự Y pháp lên một bước tiến mới mà nĩ cịn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành khoa học khác, kể cả ứng dụng trong nghiên cứu tế bào mầm và tạo sinh vơ tính. 3.Xét nghiệm phát hiện quan hệ huyết thống, truy tầm tơng tích, phát hiện thủ phạm. Một người da đen (gọi là "X") sinh tại Anh đã bỏ qua sống với cha của mình tại Ghana. Sau đĩ anh ta xin qua trở lại Anh để sống với mẹ (gọi là "M") và ba người anh chị em ruột của mình thì bị từ chối cho nhập cảnh vì người ta nghi ngờ đã bị thay thế bởi một người cháu hay một người khơng thân thuộc gì với bà mẹ. Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh này xảy ra vào năm 1985, lúc này xét nghiệm dấu ấn protein (protein markers) đã được thực hiện và xác định được bà mẹ cĩ liên hệ với "X?", tuy nhiên khơng thể loại trừ được M là cơ hay dì của "X?". Thắc mắc trên tưởng chừng bế tắc, khơng cĩ cách giải quyết, nhưng may mắn Jeffereys và các cộng sự đã được nhờ đến và lần đầu tiên xét nghiệm dấu ấn DNA được áp dụng trong trường hợp này. Kết quả xét nghiệm đã xác định được đúng "X?" chính là "X" vì "X?" cĩ mang các dấu ấn DNA từ M, đồng thời cĩ chung các dấu ấn DNA với những đứa con của "M" thừa hưởng từ người cha. Vậy dấu ấn DNA là gì? Nguyên tắc hoạt động của các xét nghiệm dấu ấn DNA như thế nào? Những tiến bộ và các phạm vi ứng dụng hiện nay của xét nghiệm dấu ấn DNA ra sao? DNA bộ gen người của chúng ta cĩ đến 30% chứa các trình tự base lặp lại và hầu như khơng mang những mã cĩ ý nghĩa chức năng. Cũng như các trình tự base cĩ ý nghĩa chức năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từ cha mẹ sang con cái theo định luật phân ly độc lập của Mendel. Tuy nhiên khác với gen, rất khĩ tìm thấy sự khác biệt về trình tự base của gen giữa các cá nhân, cĩ nhiều trình tự base lặp lại cĩ thể giúp phân biệt được cá nhân này với các nhân khác, khơng những thế, cĩ thể giúp tìm xem họ cĩ quan hệ huyết thống với nhau hay khơng? Các trình tự base lặp lại này được gọi là các dấu ấn DNA. Cĩ hai loại dấu ấn DNA hiện đang được dùng trong xét nghiệm dấu ấn DNA là:Các tiểu vệ tinh (minisatellite)Ðĩ là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats = Số lượng thay đổi các trình tự base lặp lại), cĩ các kích thước thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB). Các VNTRs này hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đa vị trí (multilocus minisatellite); Hay chỉ cĩ tại một vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đơn vị trí (single-locus minisatelite). Xét nghiệm dấu ấn DNA mà Jeffereys thực hiện năm 1985 là xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí bằng kỹ thuật phát hiện sự đa hình về chiều dài các đoạn DNA của bộ gen bị cắt bởi men cắt hạn chế (Restriction Fragments Lenght Polymorphism = RFLP). Kỹ thuật này được tĩm tắt như sau (hình 1): (1) Trước hết mẫu máu được lấy từ những người cần thử nghiệm để tách được bạch cầu, sau đĩ ly trích tồn bộ bộ gen nguyên vẹn của bạch cầu trong các mẫu thử nghiệm; (2) Cắt đoạn các bộ gen đã ly trích này bằng men cắt hạn chế, là một loại men cắt nhận diện được 4 trình tự base đặc hiệu, nhờ đĩ cắt đoạn được bộ gen thành những mảnh DNA dài ngắn khác nhau, trong đĩ cĩ những mảnh chứa các trình tự base lặp lại; (3) Ðiện di mẫu thử nghiệm để phân tách các đoạn DNA này trên thạch agarose, sau đĩ chuyển các đoạn DNA trên thạch này qua một màng nylon bằng kỹ thuật thấm Southern (Southern blotting); (4) phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nylon bằng cách lai với một trong những dị DNA đánh dấu đồng vị phĩng xạ và đặc hiệu cho các trình tự base lặp lại này. Trong thử nghiệm, Jeffereys đã thiết kế 2 dị DNA cĩ mã số là 33.6 và 33.15. Kết quả xét nghiệm ở trường hợp trên đã cho thấy "X?" cĩ 61 vị trí của trình tự lặp lại đặc hiệu với hai loại dị 33.6 và 33.15, và tất cả 61 vị trí này đều thấy hiện diện được trên M (do "X?" đã di truyền được từ "M") hoặc trên 3 người con của "M" (do "X?" và họ đã di truyền được từ cha mình, tức là chồng của "M" dù khơng cĩ mẫu thử nghiệm lấy từ ơng này).Xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí, vì dùng kỹ thuật RFLP, nên được gọi ngắn gọn là xét nghiệm RFLP. Xét nghiệm này được dùng khá nhiều trong xác định quan hệ huyết thống. Xin dẫn thêm một trường hợp bị chứng minh loạn luân tại Anh (ảnh 1). Kết quả xét nghiệm RFLP cho thấy mẹ đứa bé là "D" và cha của nĩ là "F" cĩ đến 62% các vạch vị trí của tiểu vệ tinh đa vị trí trùng nhau; đồng thời "F" và "B" lại cĩ đến 78% các vạch trùng nhau. Chính nhờ vậy mà đã xác định được chẳng những "F" là cha của "D" đồng thời cũng là cha của "B", cĩ nghĩa là "F" vừa là ơng ngoại, vừa là cha của "D". Tuy nhiên xét nghiệm RFLP cĩ một hạn chế là phải cĩ mẫu thử nhiều tế bào để cĩ thể trích được bộ gen nguyên vẹn (phải lấy khơng dưới 10ml máu để tách đủ bạch cầu dùng trong ly trích bộ gen). 4.Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trrên cây cao su (Hevea brasiliensis) bằng phương pháp RFLP – PCR. (VŨ THỊ QUỲNH CHI. Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN, ThS. PHAN THÀNH DŨNG.) Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng cĩ tác hại rất lớn đến nền kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá khác. Do đĩ tìm hiểu phương pháp chẩn đốn, phát hiện nhanh bệnh Corynespora cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola cĩ sự phân hĩa trong cùng lồi, C. cassiicola trên các dịng vơ tính cao su khác nhau cĩ sự khác biệt về di truyền, nhờ đĩ cĩ thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dịng vơ tính cao su khác nhau. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự đa dạng di truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dịng vơ tính cao su đang được trồng ở Việt Nam. Kết quả đạt được : Nhận diện được triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Thu thập  mẫu bệnh trên 32 dịng vơ tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn đốn và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp RFLP – PCR trên 7 dịng vơ tính. Qua phân tích đi đến kết luận: Quy trình phản ứng PCR đối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự (1998) cĩ thể sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Chẩn đốn bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng ITS sử dụng cặp primer ITS A và ITS B là khơng hiệu quả, sản phẩm thu nhận được khơng đặc trưng cho nấm C. cassiicola Khơng tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI. Các mẫu nấm được dùng trong phân tích cĩ thể thuộc cùng một chủng nấm C. cassiicola và đây cĩ thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay Amplified Fragment Length Polimorphism (AFLP) Khái niệm AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) là sự đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. 1975 Vos và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật này. 1993 Vos và Zabeau cho ra protocol đầu tiên cho kỹ thuật AFLP nhấn mạnh sự quan trọng của việc làm thuần khiết hai enzyme sử dụng (EcoRI và MseI), sau đĩ là chuẩn bị adapter và thiết kế primer một cách thận trọng. Ngày nay nĩ được cải tiến khán nhiều với những cơng dụng như sau: Cơng cụ cĩ hiệu quả phát hiện tính chất đa hình. Xây dựng bản đồ di truyền cĩ mật độ cao của genome. Xây dựng bản đồ DNA marker cĩ hiệu quả nhất so với những marker khác (Vos và cộng tác viên. 1995). Khám phá ra những clone genome, vd YAC. Fingerprinting các đoạn DNA đã được cloned như cosmid, P1, BAC, YAC (Vos và cộng tác viên. 1995) AFLP marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR. AFLP là một marker trội. -Marker trội: marker khơng thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Kỹ thuật AFLP Nguyên tắc của kỹ thuật AFLP giống như RFLP, điểm khác biệt cơ bản là AFLP khơng cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot), do vậy thực hành nhanh. NƠI DUNG CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP Cắt DNA bằng RE cĩ bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên các đoạn cĩ đầu mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác nhau. QUI TRÌNH THỰC HIỆN AFLP: 4 bước Tách chiết và tinh sạch DNA. Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng cặp RE chọn lọc cĩ bổ sung các adaptor (trình tự nối mạch đơi- Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. ) phù hợp. Tiến hành PCR ngắt quãng với hai loại mồi đặc hiệu primer 1+1 nucleotid và primer 2+ 2 nucleotid. Phân tích kết quả bằng các phần mềm thơng dụng, lập dendrogram để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học các mẫu nghiên cứu. Ứng dụng So sánh đa hình AFLP giữa hai nhĩm cá thể cá tra (pangasius hypophthalmus) cĩ trọng lượng phân biệt. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNguyên liệu:Mẫu cá tra được thu từ trung tâm Cái Bè – Tiền Giang, được bảo quản trong cồn 700, ở 40C cho đến khi sử dụng (Mẫu do Viện Nghiên cứu nuơi trồng thuỷ sản I cung cấp). Từ 282 mẫu cá, chọn 10 mẫu cĩ trọng lượng lớn nhất (trung bình là 3,9 gam) và 10 mẫu cĩ trọng lượng nhỏ nhất (trung bình là 2,2 gam). Tách chiết DNA:DNA cá tra được tách chiết chủ yếu theo Fetzner [3]. Cụ thể: khoảng 50 mg mẫu được rửa sạch cồn bằng 0,9 ml đệm TLE (10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8.0). Thêm vào 0,9 ml đệm phá tế bào (10 mM Tris; 100 mM EDTA; 2% SDS, pH 8.0). Bổ sung 5µl enzyme protease K (20 mg/ml), ủ 550C trong 14-16 giờ. Để mẫu ở nhiệt độ phịng và bổ sung 4µl RNAase A (10mg/ml), ủ 370C trong 30 phút. Thêm vào 0,3 ml dung dịch kết tủa protein (7,5 mM Ammonium Acetate), trộn đều và ủ trong đá 30 phút. Ly tâm 2 lần để loại tủa protein và thu dịch DNA. Kết tủa DNA bằng 0,9 ml isopropanol, để -200C trong 3 giờ, ly tâm thu tủa DNA. Rửa DNA bằng 0,75 ml cồn 700 . Hịa tan DNA trong 100µl đệm TLE. Bảo quản ở 40C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.Kỹ thuật AFLP:AFLP cơ bản được tiến hành theo Liu và cs [6]. Các bước chính của phương pháp được tĩm tắt như sau: DNA được cắt bằng 2 enzyme EcoRI và MseI: 300 ng DNA, 3U enzyme EcoRI và MseI ở 370C trong 2 giờ. Sau đĩ, các đoạn DNA cắt ra được gắn vào các adapter của EcoRI và MseI nhờ enzyme T4 DNA ligase trong 3 giờ ở 200C. Các đoạn DNA tạo ra trước hết được khuếch đại bằng PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc (preselective primer) sau đĩ là mồi chọn lọc (selective primer) Bảng 1: Trình tự các adapter và mồi được sử dụng trong phân tích AFLP Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tích formamide dye được thêm vào phản ứng. Mẫu được biến tính bằng nhiệt ở 950C trong 3 phút, và đặt ngay vào đá. Sản phẩm AFLP được điện di trên gel polyacrylamide biến tính (19:1 acrylamide:bisacylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE buffer ). Bản gel được cố định trong axit axêtic 10%, nhuộm trong bạc nitơrat 1%, hiện trong natricacbơnat 2,5% và cố định lại trong axit axêtic 10% [1].KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNDNA hệ gen từ hai nhĩm cá tra cĩ trọng lượng lớn và nhỏ được tách chiết. Kết quả đánh giá trên điện di agarose cho thấy chất lượng DNA đạt tiêu chuẩn cho các phân tích tiếp theo.Để chuẩn bị khuơn DNA cho AFLP, DNA hệ gen được cắt đồng thời bởi 2 enzyme giới hạn EcoRI cĩ trình tự nhận biết 6 base pair (G(AATTC) và MseI cĩ trình tự nhận biết 4 base pair (T(TAA). Thành cơng của kỹ thuật AFLP phụ thuộc vào sự cắt hồn tồn của phản ứng cắt và chất lượng DNA. Các đoạn DNA tạo ra được gắn với các adapter EcoRI và MseI để tạo thành khuơn cho phản ứng khuyếch đại sau này, đồng thời ngăn cản sự tái kết hợp giữa các đoạn DNA vừa được tạo ra. Trước hết, một số đoạn DNA tạo ra được nhân lên nhờ phản ứng PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc (PSP - preselective primers). PSP chứa các trình tự: i) bổ trợ với adapter; ii) bổ trợ với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn; iii) một nucleotid. Các đoạn DNA mà nucleotid liền kề với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với nucleotid của PSP sẽ được nhân lên (theo xác suất một phần tư số đoạn DNA sẽ được nhân lên). Tương tự, các đoạn DNA mà 3 nucleotid tiếp theo liền kề với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với 3 nucleotid của mồi chọn lọc (SP - selective primers) sẽ được nhân lên. Theo xác suất qua 2 lần PCR, 1/256 số đoạn DNA sẽ được nhân lên. Đối với các cá thể mang đột biến tại các nucleotid bổ trợ với PSP và SP (so với mẫu chuẩn), các đoạn AND sẽ khơng được nhân lên. Do đĩ, trên bản điện di tại các vị trí trên khơng xuất hiện băng.54 tổ hợp mồi được sử dụng để phân tích đa hình AFLP của hai nhĩm cá tra cĩ trọng lượng lớn và nhỏ. Mỗi tổ hợp mồi tạo ra từ 27 đến 94 băng, trung bình là 55 băng trên một tổ hợp mồi. Trong đĩ, cao nhất là tổ hợp mồi E-ACC/M-CAG: 94 băng/mẫu, và thấp nhất là tổ hợp mồi E-ACG/M-CTG: 27 băng/mẫu. Trong 54 tổ hợp mồi nghiên cứu, 11 tổ hợp mồi khơng tạo băng AFLP và 43 tổ hợp mồi tạo 204 băng AFLP. Tỷ lệ băng đa hình giữa các mẫu cá tra là 1,35% cho thấy sự đa hình AFLP giữa các mẫu trong cùng lồi thấp. Kết quả này cũng phù hợp với phân tích của Liu và cs [6] tiến hành trên cá tra Mỹ (Ictalurus punctatus và Ictalurus. furcatus). Tỷ lệ băng đa hình trong cùng lồi I. punctatus là 3,4 %, ở I. furcatus dao động từ 1,7% -3,3% [6]. Đa hình AFLP của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG giữa 2 nhĩm cá lớn và nhỏ được thể hiện ở hình 1. Hình 1. Đa hình AFLP giữa nhĩm cá lớn và nhĩm cá nhỏ của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG1,2: Băng AFLP xuất hiện ở cả 2 nhĩm cá với tần số khác nhau Tổng cộng cĩ 204 băng AFLP được tạo ra từ 43 tổ hợp mồi, trung bình là 4,74 băng AFLP/mồi. Tần suất xuất hiện các băng AFLP ở hai nhĩm cá tra là khác nhau nên chúng tơi đã tính tần số khác biệt giữa hai nhĩm. Kết quả được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Tần số khác biệt của các băng AFLP giữa hai nhĩm cá tra Những băng AFLP cĩ tần số khác biệt trên 50% được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3: Các băng AFLP cĩ tần số khác biệt trên 50 %. Kết quả trên cho thấy, chỉ cĩ 8 băng AFLP cĩ tần số khác biệt trên 50%, chiếm 3,92% tổng số băng AFLP. Để kiểm tra mức độ ổn định và tin cậy của các băng AFLP, chúng tơi đã tiến hành phân tích các băng AFLP này với số lượng mẫu lớn hơn (18 mẫu). Kết quả cho thấy, băng AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT và băng AF 7-4 của tổ hợp mồi E- ACC/M-CAA đạt độ chênh lệch giữa 2 nhĩm cá thí nghiệm là 56% và 50%. Do cĩ tính ổn định tương đối, rõ nét và ưu thế cho nhĩm cá cĩ trọng lượng nhỏ, hai băng AFLP này được tách dịng và đọc trình tự nhằm mục đích xây dựng 2 chỉ thị AFLP liên quan tới tính trạng tăng trưởng của cá tra.KẾT LUẬNPhân tích đa hình AFLP cá tra bằng 54 tổ hợp mồi chọn lọc cho thấy tỷ lệ đa hình trong lồi tương đối thấp, trung bình 1,35%. Tuy nhiên, tỷ lệ này đủ tin cậy trong việc xác định các chỉ thị liên quan tính trạng cĩ ý nghĩa kinh tế.So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhĩm cá tra cĩ trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng AFLP cĩ tần số khác biệt trên 50%. Tuy nhiên chỉ cĩ 2 băng: AF 7-4 của tổ hợp mồi E-ACC/M- CAA và AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT cĩ tính ổn định, và vẫn giữ được tỷ lệ này khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn. Hai băng này sẽ được sử dụng để tuyển chọn lại trong quần đàn.Ưu và nhược điểm Ưu điểm. AFLP nhanh, đơn giản khơng phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được tồn bộ gen (kỹ thuật này kỹ thuật này địi hỏi ít lượng DNA ban đầu, khơng cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng khơng cần đặc hiệu lồi (các mồi thương mại cĩ thể dùng cho hầu hết các lồi). Nhược điểm AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. C và G trong primer càng nhiều, thì các DNA fragment được khuếch đại càng ít. Khích thước genome càng nhỏ, số fragment được khuếch đại càng ít Random Amplification Polymorphic DNA (RAPD) Khái niệm: RAPD (đọc là "rapid") là chữ viết tắt của Random Amplification of Polymorphic DNA nghĩa là đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên do William (1990), Welsh và cộng sự (1991) phát minh. Là phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên. Nguyên tắc Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thơng thường. Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp để tạo điều kiện bắt cặp khơng nghiêm ngặt. Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30oC-36oC. RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotide được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9-12 base nên dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen . Các đoạn mồi nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuơn DNA trong khoảng cách cĩ thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA cĩ kích thước khác nhau sau khi khuếch đại. Tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi cĩ sự thay đổi một base nitơ nào đĩ thì nĩ sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuơn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đĩ sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại. Tuỳ vào từng nhĩm lồi thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế đặc dụng. Sản phẩm của PCR gồm nhiều đoạn DNA cĩ kích thước từ 2-100 bp. Kết quả sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các đoạn DNA được nhân bản. Sự khác nhau này được gọi là tính đa hình. Tính đa hình của các đoạn DNA được phát hiện khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose hay polyacrilamid, sau đĩ nhuộm ethidium và soi dưới đèn tử ngoại. Tính đa hình của các mẫu RAPD-PCR là do sự thay đổi một hoặc cả hai vùng gắn primer (ví dụ đột biến điểm) hay là do những thay đổi (thêm đoạn, mất đoạn, đảo đoạn) trong đoạn DNA được nhân lên, gây ra sự thay đổi về kích thước hay cản trở quá trình nhân lên của DNA này. Tính đa hình sẽ thể hiện thơng qua sự cĩ hay vắng mặt của vạch điện di tương ứng. Tính đa hình được nhận ra do: khi phân tích đa hình di truyền bằng kỹ thuật RAPD, nếu 2 cá thể cĩ genome hồn tồn giống nhau thì khi làm phản ứng PCR-RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho các băng giống nhau. Đoạn mồi ngẫu nhiên cĩ thể bám vào bất cứ vị trí nào cĩ trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA genome. Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi cĩ được điểm gắn trên phân tử DNA khuơn là khá lớn. Theo tính tốn, một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xác suất bắt cặp của nĩ là 1x410 = 1.048.576. Ở lúa, bộ DNA nhân đơn bội cĩ khoảng 550.000kb =550.000.000 bp. Như vậy, với một mồi ngẫu nhiên cĩ thể cĩ 524 vị trí bắt cặp với mồi nghĩa là cĩ thể cĩ 262 đoạn DNA được nhân bội. Do kỹ thuật RAPD chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả 2 đầu đoạn DNA cần nhân bản, ngồi ra hai đoạn mồi này phải kết cặp trên 2 sợi đơn khác nhau của chuỗi DNA và phải “đi” theo chiều hướng vào nhau nên xác suất trên sẽ phải nhỏ đi nhiều. Xác suất này sẽ cịn nhỏ hơn nữa do trong điều kiện thơng thường kỹ thuật PCR chỉ tổng hợp được một đoạn DNA khơng dài quá 5000 nucleotide dẫn đến việc phản ứng PCR chỉ hiệu quả khi hai đoạn mồi kết cặp với DNA genome ở vị trí khơng xa quá 5000 bp. Trong thực tế, số lượng này nhỏ hơn nhiều vì cịn phụ thuộc vào độ dài của đoạn được nhân bội và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên DNA genome của lúa. Quy trình thực hiện Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo các bước cơ bản sau: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR. Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid. Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thơng dụng (NTSYS-PC, GELCOMPAR, …). Các số liệu cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Ưu và nhược điểm RAPD là phương pháp phân tích nhanh, rẻ tiền hơn RFLP và chỉ sử dụng một lượng mẫu DNA rất nhỏ (25ng). Phương pháp này khơng địi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, cho phép phát hiện nhiều locus cùng một lúc. RAPD marker tỏ ra rất hiệu quả trong việc thiết lập bản đồ gen của các cây họ tùng bách trong khi các RFLP marker khơng thể dùng cho mục đích này bởi vì hàm lượng DNA trong các mơ của các giao tử lớn rất thấp và sự địi hỏi thời gian dài để thu được quần thể F2. Mỗi primer cung cấp số liệu từ nhiều vị trí trong genom vì vậy những sai khác cĩ tần xuất xuất hiện rất thấp giữa các mẫu cĩ quan hệ gần gũi cĩ thể được phát hiện nhanh hơn so với việc phân tích locus đơn. Phương pháp này rất nhạy cảm với điều kiện phản ứng như chất lượng DNA, nồng độ muối ví dụ Mg2+ và tỷ lệ giữa mồi và đoạn mẫu (template) và vì thế các kết quả khơng phải luơn trước sau như một. Các RAPD marker rất ít khi được sử dụng trong việc lập các bản đồ gen so sánh và nhân dịng bởi tính đặc thù thấp và khơng ổn định của chúng. Việc so sánh genom của những lồi cĩ quan hệ gần gũi địi hỏi các mẫu dị (probe) cĩ thể nhận dạng các vùng đồng dạng trong mỗi nhĩm đã phân loại. Tuy nhiên sự thiếu tính đồng dạng giữa các genom lại cho phép các RAPD marker cĩ thể dùng cho việc lập bản đồ gen của các lồi đa bội, trong khi các các mẫu copy đơn của RFLP lại được lai với rất nhiều các trình tự và tạo ra các band khá phức tạp và do vậy rất khĩ xác định các allele thay thế. Việc sử dụng các marker rõ ràng để xác định các loci cĩ một copy là rất cần thiết trong việc nhân dịng. Rất nhiều các trình tự được nhân lên nhờ PCR cĩ chứa các đoạn lặp lại rải rác và khơng thể dùng làm các mẫu lai. Các đoạn mồi ngắn dùng để xác định các RAPD marker cũng nhân lên một vài trình tự từ các vùng khơng liên kết. Vì vậy các marker như vậy khơng thể sử dụng để đánh giá các dịng từ các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men hay một thư viện mẫu thậm chí khi cĩ sự liên kết gần gũi của chúng với gen đã biết. Hiện tượng phát sinh tính đa hình giả đơi khi cũng thấy khi phân tích RAPD do khơng chắc chắn các đạon cùng kích thước từ hai mẫu DNA khác nhau cĩ thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên DNA của genome hay khơng. Sự di truyền tính trội và số lượng allele thấp cũng là những hạn chế của RAPD marker. Các marker trội chỉ mang ½ thơng tin di truyền trong quần thể F2 cũng như các tính trạng đồng trội. Một marker chỉ cĩ ích cho chương chọn tạo giống khi chúng phân ly trong một số các tổ hợp lai. RFLP loci cĩ thể cĩ một vài allele dễ nhận biết. Số allele cao nhất (5-8) đã được quan sát ở rau diếp và cá lồi cĩ quan hệ gần. Ngược lại một locus của RAPD thường cĩ 2 allele thể hiện qua sự cĩ hay vắng mặt của các vạch tương ứng.Sự đồng trội của các RAPD marker thường ít khi gặp. Tính đa hình như vậy của độ dài các đoạn cắt được nhân lên bằng PCR cĩ thể là kết quả của việc mất đoạn hay chèn đoạn xảy ra giữa các vùng gắn mồi. Gần đây, phương pháp trộn các đoạn mẫu (template mixing) cho phép các RAPD marker đồng trội cĩ thể được xác định đã được giới thiệu. Phương pháp này dựa trên sự xuất hiện các band nhân đơi khác nhau khơng phải của bố mẹ trong các thể dị hợp tử, phân ly chậm hơn cả bố và mẹ vốn là đặc trưng của các RAPD marker đồng trội. Các band khơng phải của bố mẹ cĩ thể thu được bằng việc trộn các đoạn mẫu của DNA của bố mẹ trước khi chạy PCR. Việc này sẽ cho phép chọn lọc được các RAPD marker đồng trội trứoc khi phân tích sự phân ly. Khi cĩ sự nghi ngờ trong việc phân biệt các band phân ly chậm và nhanh, các đoạn mẫu của bố mẹ và con cái được trộn lẫn để xác định các band kép dị hình trong số các band của các thể dị hợp tử của F2 và để khẳng định kiểu hình của một marker. Mặc dầu cĩ các hạn chế, nhiều nghiên cứu đã khẳng định RAPD là phương pháp hữu hiệu để xác định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứư sự phát sinh lồi và lập bản đồ di truyền ở nhiều lồi khác nhau như lúa, đậu tương, lúa mạch đen, đại mạch, đậu hà lan, hoa hồng, v.v. Ứng dụng Sử dụng phương pháp này để nhận dạng ở mức độ phân tử, khảo sát đa dạng sinh học, phân lập gen đột biến, xác định các tính trạng liên kết hay di truyền, chẩn đốn bệnh. Ứng dụng cụ thể: nghiên cứu đa hình một số giống dâu tằm. NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH MỘT SỐ GIỐNG TẰM DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPDNguyễn Thị Thanh Bình, Hồng Thị Hằng, Nơng Văn HảiViện Cơng nghệ Sinh học I. MỞ ĐẦUNgày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử DNA về đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên-RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi đơn giản-SSR (Simple Sequence Repeats) hay cịn gọi là tiểu vệ tinh (Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu đa dạng sinh học của động vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam [4, 5, 7, 8]. So sánh với phương pháp truyền thống, phân loại và nghiên cứu đa hình bằng chỉ thị phân tử cho kết quả cĩ độ tin cậy cao [2].Kỹ thuật RAPD do William và cs, 1990 [8] phát triển trên cơ sở PCR sử dụng một số đoạn mồi ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã được ứng dụng kết hợp cùng với một số kỹ thuật khác để phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá thể tằm dâu [1, 2, 5, 10,11]. Ở Việt Nam chưa cĩ cơng trình nào đề cập tới vấn đề này, mặc dù nghề nuơi tằm là một trong những nghề truyền thống của đất nước, hiện đang được đẩy mạnh phát triển, việc phân loại đánh giá đa hình vẫn dựa vào các đặc điểm sinh học và hình thái, cho nên cịn cĩ những hạn chế nhất định.Trong bài báo này chúng tơi xin trình bày một số kết quả về sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu nuơi tại Việt Nam. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1.     Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu gồm tám giống tằm đang được dùng tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB, TML, VC, ĐS 1, ĐS 2, BM, THT, VYD, trong đĩ cĩ bốn giống được sử dụng nhiều trong vài năm gần đây, đĩ là hai giống địa phương thuộc tập đồn gốc đa hệ: vàng chấm [VC] và Đồ Sơn [ĐS] hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình [TTB] và trắng Mai Lĩnh [TML]. Tất cả các giống tằm trên do Trung Tâm Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ Trung Ương, Xí nghiệp Giống Tằm Cấp I Mai Lĩnh và Xí nghiệp Giống tằm Thái Bình cung cấp.Hố chất : EDTA, Tris-HCl, SDS, Proteaza K, RNaza, chloroform, phenol, NaCl, agaroza của các hãng Sigma, Merck, Amersham Phamacia Biotech, Fermentas...Các loại máy mĩc chuyên dụng thuộc phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Gen đặt tại Viện Cơng nghệ Sinh học.2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA theo Wiliam và cộng sự, tham khảo thêm tài liệu của một số tác giả khác [ 8, 9, 10] và cải tiến cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm.Xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ, kiểm tra DNA trên gel agaroza 0,8% và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, chụp ảnh ở máy Geldoc hoặc Polaroid.Nhân gen bằng kỹ thuật PCR với các đoạn mồi do hãng Genset Singapore Biotech tổng hợp. Tổng thể tích dùng cho một mẫu là 25 ml. Chu trình nhiệt theo tài liệu của Zhou Zheyang và cộng sự [6]. Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agaroza 0,8% và 1,3%.------------------------------------------------------------------------Cơng trình được hồn thành với sự hỗ trợ kinh phí của nhiệm vụ thường xuyên: đề tài cấp Viện Cơng nghệ Sinh họcPhân tích kết quả bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0. Hệ số đồng dạng di truyền được tính theo cơng thức của Nei và Li năm 1979 [3].III. KẾT QUẢ 1. Tách chiết và làm sạch DNA từ mẫu tằmMẫu nghiền mịn và hồ tan trong dung dịch đệm, thành tế bào và màng nhân được phá vỡ, giải phĩng DNA. Tiếp theo bổ sung proteinaza K để phân huỷ hồn tồn các protein liên kết . Sau đĩ, dùng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol loại bỏ các tạp chất và ly tâm thu DNA. Loại ARN bằng RNaza ở 37oC. Sản phẩm DNA được chạy điện di kiểm tra, đánh giá trên gel agaroza 0,8% và đo OD trên máy đo quang phổ, bảng 1 và hình 1 là kết quả thu được. Kết quả cho thấy, sản phẩm nhận được cho vạch gọn và cĩ trọng lượng phân tử lớn hơn 21,6 kb, tỉ lệ OD260 nm/OD280 nm dao động từ 1,781 đến 2,025 cho biết DNA thu được cĩ đủ độ sạch để làm nguyên liệu cho PCR hoặc các nghiên cứu tiếp theo. DNA được bảo quản lạnh trong dung dịch TE. Ảnh 1. Điện di DNA 1-5 : DNA của mẫu.M : DNA l/EcoRI+HindIII Bảng 1. Tỷ số OD260 nm/OD280 nm và nồng độ của DNA 2. PCR với DNA cuả tằm dâuChúng tơi đã tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng nhân gen đối với các mồi nghiên cứu [6 ], sàng lọc từ 20 đoạn mồi ngẫu nhiên để chọn ra 5 đoạn phù hợp cho tằm. Tiếp theo thực hiện PCR với các giống tằm, kết quả nhận được trình bày ở bảng 2. Bảng 2: Kết quả RAPD của các giống tằm nghiên cứu[ Cột chỉ thị RAPD: chữ cái và số là ký hiệu của đoạn mồi, tiếp theo là kích thước của băng. Số 1:phân đoạn DNA được nhân. Số 0: phân đoạn DNA khơng được nhân. Giống tằm 1: TTB, 2: TML, 3: VC, 4: ĐS1, 5:ĐS2, 6: BM, 7: THT, 8: VYD]Các băng nhân bản được sử dụng như là các chỉ thị RAPD bao gồm hai loại đơn hình và đa hình. Băng đơn hình cĩ mặt trong tất cả các giống nghiên cứu, cịn băng đa hình xuất hiện ở giống này nhưng lại vắng mặt ở giống khác. Trong tổng số 67 băng nhận được cĩ 26 băng đơn hình, chiếm 38,81% và 41 băng đa hình, chiếm 66,19%, kích cỡ của các băng từ 100bp đến 3500bp. Trong 8 giống tằm nghiên cứu cĩ 2 giống lưỡng hệ tương đối xa nhau về quan hệ di truyền, cịn 6 giống đa hệ địa phương cĩ họ hàng khá gần gũi với nhau, do đĩ tỷ lệ băng đơn hình ở mức trung bình thấp, tỷ lệ băng đa hình đạt mức trung bình cao hơn. Các băng đa hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với nhau, cĩ băng đa hình chỉ xuất hiện ở một giống mà khơng xuất hiện ở các giống khác như băng 0P019-1200bp và 0P019-1000bp chỉ thấy ở giống TML, băng 0P019-800bp ở giống TTB và trong nhĩm đa hệ chỉ xuất hiện ở giống BM. Với mồi 0P016, băng 300bp quan sát thấy ở giống TTB, cịn băng 400bp cĩ ở giống TML và duy nhất ở VC trong Hình 2: Sản phẩm PCR mồi OP 13 của các giống tằm nghiên cứuGiếng M: DNA l/EcoRI+HindIIICác giếng khác: mẫu của các giống tương ứng. 1-TTB 5-TML 6-VC 8-ĐS 19-ĐS 2 10-BM 11- THT 13- VYD Từ các số liệu thu được, chúng tơi phân tích mối tuơng quan di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0 và trình bày ở bảng 3. Bảng 3 cho thấy, giống TTB cĩ hệ số đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,547 đến 0,703, thấp nhất trong các giống nghiên cứu, cịn ở giống TML chỉ số này cao hơn, biến đổi từ 0,766 đến 0,906. Các giống trong nhĩm đa hệ cĩ hệ số đồng dạng di truyền thay đổi từ 0,766 đến 0,984. Giống ĐS1 và ĐS2 cĩ chỉ số cao nhất 0,984, cĩ khả năng đây chỉ là một giống nhưng nuơi ở hai địa phương khác nhau. Bảng 3. Hệ số đồng dạng di truyền giữa các giống tằm nghiên cứuTừ bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tơi xây dựng cây phân loại của các giống tằm và biểu diễn bằng hình 3. Dựa trên sơ đồ hình cây biểu thị đa hình DNA giữa 8 giống tằm nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy các giống tằm khảo sát được chia thành hai nhĩm lớn, cụm lại ở mức độ 0,54, nhĩm thứ nhất chỉ cĩ 1 giống TTB, cịn nhĩm thứ hai là các giống cịn lại, cụm ở mức độ 0,79 và chia thành hai phân nhĩm bậc I. Phân nhĩm bậc I thứ nhất gồm hai giống TML và VC, cụm lại ở mức 0,90. Phân nhĩm bậc I thứ hai là 5 giống thuộc đa hệ và lại chia thành phân nhĩm bậc hai.... Riêng ĐS1 và ĐS2 ở phân nhĩm bậc cao nhất. Hình 1. Cây phát sinh chủng loại của các giống tằm IV. KẾT LUẬN1.     Đã phân tích tính đa dạng di truyền của 8 giống tằm dâu nuơi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 đoạn mồi, kết quả nhận được 67 băng DNA nhân bản trong đĩ cĩ 26 (38,8%) băng đơn hình và 41 (61,2%) băng đa hình. Đoạn mồi 0P016 cho số băng đa hình phong phú nhất, mồi 101 cĩ tỷ lệ băng đa hình thấp nhất.2.     Kết quả phân tích NTSYS-SIMUAL cho thấy các giống tằm nghiên cứu cĩ mối tương đồng di truyền trong khoảng 0,547 đến 0,984. (Simple Sequence Repeat - SSR) Kỹ thuật SSR Các trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat) hay cịn được biết đến như các microsaterlite (vi vệ tinh) là những đoạn ngắn của DNA cĩ chứa từ 2 đến 6 cặp base cĩ trình tự lặp lại liên tiếp và số các trình tự lặp lại dao động từ 2 đến 40. Các trình tự lặp lại đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật cũng như thực vật. Chúng được phân bố trong hệ gen và cĩ tính đực trưng cho từng lồi. SSR rất phổ biến trong genom của lúa. SSR là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế primer. Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. SSR primer sau đĩ được sử dụng tương tự như các RAPD primer. Ưu điểm: Kỹ thuật SSR cĩ tiềm năng rất lớn do cĩ khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, cĩ thể phân biệt được sự sai khác mà khơng xác định được bằng các marker khác như RAPD và RFLP. SSR primer cĩ từ 1 đến 12 locus (tuỳ vào lồi) được tổ hợp trong một ống phản ứng PCR do vậy cho phép đồng thời ghi nhân các kiểu gen cĩ nhiều locus. Phản ứng khơng quá tốn kém, tiêt kiệm được thời gian và hố chất. Primer sử dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự đặc trưng và vì thế tỏ ra đáng tin cậy khi phát hiện cùng một locus và thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ gen. Marker SSR là các locus đặc trưng, đa allele nên cung cấp nhiều thơng tin rất cĩ ích so viẹc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm. SSR là loại marker đồng trội nên đã nhanh chĩng thay thế RFLP và RAPD và trở thành cơng cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền. Nhược điểm: Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dịng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN của genom cĩ chứa SSR. Hiện nay, số lượng primer thiết kế cho các loại cây trồng cịn hạn chế, làm giảm hiệu quả của SSR trong việc lập bản đồ gen. Một vấn đề khác cũng thường gặp phải trong sử dụng SSR là việc xác định quan hệ giữa các allele với các marker phân tử là rât khĩ. SSR cĩ thể được phân bố ngẫu nhiên trong genom nhưng cũng cĩ khi tập trung lại ở tâm động hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể. Điều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dị nhiều locus trong phân tích liên kết di truyền và nghiên cứu quần thể. Tài liệu tham khảo PGS.TS.Khuất Hữu Thanh-Đại học Bách Khoa Hà Nội – Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen – Trang 151 – NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang – Di truyền phân tử.Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng – Trang 93 – NXB Nơng nghiệp.