Đề tài Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải này. Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm. Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả nhất mà giá thành lại rẻ. Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành tôi đã thực hiện khóa luận này: “Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei. Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei. Xác định tỷ lệ tủa tối ưu của các tác nhân tủa: Muối ammonium, cồn, aceton. Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cellulase. Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate. Tinh sạch enzyme cellulase. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase, nhưng chỉ có một số ít vi sinh vật là có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase với số lượng lớn. Sau đây là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase. Bảng 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào STT Tên chủng Tên phân loại Hoạt tính celulase (unit/ml) Thuộc nhóm 1 B26 Bacillus subtilis 5,20 Vi khuẩn 2 B505 Bacillus subtilis 9,95 3 CFd - 7,71 4 CFh - 1,45 5 MSM 04 - 0,90 6 MSM 11 - 0,92 7 Li Bacillus lichenformis 9,76 8 A-62 Streptomyces sp 0,90 Xạ khuẩn 9 Y-519 Sarcharomyces fibuligera 1,35 Nấm men 10 Y-529 Sarcharomyces fibuligera   2,67 11 Y-32 Sarcharomyces capsularis 1,81 12 F273 Aspergillus niger 1,08 Nấm mốc 13 708 Tricoderma konigii 0,89 Nấm sợi 14 1’ - 1,32 - 15 V2 - 0,93 16 V3 - 1,10 17 V4 - 1,07 (-): chưa phân loại 2.2. Giới thiệu Trichoderma reesei 2.2.1. Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichodermaviride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong thế chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma"viride" mã số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản hơn là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm Tricoderma reesei. Trong hình, các protein trong các tế bào nấm được đánh dấu màu đỏ trong khi chất chitin – một thành phần của các thành tế bào – được đáng dấu màu xanh dương. (Ảnh: Mari Valkonen, VTT Finland) 2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ chất bã mía kết hợp với cám mì. Tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma. reesei VTT-D-80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn. 2.2.3. Hình thái của nấm Trichoderma reesei Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Hình 2.2 Hình thái Trichoderma Reesei 2.2.4. Đặc điểm Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác, chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Nấm Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Nấm Trichoderma khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và còn hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, tuy nhiên không nhiều giống có khả năng này. Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cây. Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng. Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau. Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian, sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ, làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh. Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế sinh sản vô tính. Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhận nhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soát sinh học. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái chủ yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng. Hiện nay nấm Trichoderma có ít nhất là 33 loài. Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei 2.2.5. Ứng dụng 2.2.5.1. Lương thực và ngành dệt Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả cao. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích tương tự. 2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật. Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây. 2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như: bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán. Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ. 2.2.5.4. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoá các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển. 2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ Hiện nay, việc bón phân hữu cơ cho cây cao su hầu như chưa được bà con nông dân chú trọng dẫn đến mất cân bằng sinh thái môi trường đất. Hệ vi sinh vật suy giảm đã làm cho nấm bệnh, đặc biệt là nấm Corynespora cassiicola có điều kiện phát triển và phát tán rất nhanh trong mùa mưa. Vì vậy, việc bón phân hữu cơ là một trong những giải pháp quan trọng cần được quan tâm thúc đẩy. Trong khi bệnh vàng lá, rụng lá đang có chiều hướng lây lan nhanh việc bón phân hữu cơ có chứa nấm đối kháng Trichoderma là một giải pháp rất hữu hiệu. Ngoài việc giúp cho bộ rễ cây phát triển, đất giữ ẩm tốt, đồng thời nấm đối kháng Trichoderma sẽ tấn công các mầm bệnh corynespora và các loai nấm bệnh khác có trong đất. Việc phun các chế phẩm sinh học có chứa Trichoderma lên tán cây cũng là một giải pháp rất tốt nhằm đưa các bào tử nấm đối kháng phát tán rộng rãi trong môi trường của vườn cao su tạo nên một hệ thống phòng thủ hữu hiệu lâu dài. Qua nhiều kết quả thực tiễn cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium, do vậy nấm Trichoderma đã được khuyến cáo sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở tỉnh Lâm Đồng những năm qua. Hình 2.4 Ủ phân hữu cơ có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma 2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…). Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất. Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật. Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau. Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: Động vật (hạn chế). Thực vật (hạn chế). Vi sinh vật (phổ biến). Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế. Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau: Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn. Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú. Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rất cao. Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh. Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể điều khiển dễ dàng các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu xuất cao trong sản xuất. Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp. Hình 2.5 Enzyme cắt mối liên kết peptit (-CO-NH-) 2.4. Giới thiệu sơ lược về protease Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase): Xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng la acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin. Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm 6 nhóm chính: Serine proteases. Threonine proteases. Cysteine proteases. Aspartic acid proteases. Metalloproteases. Glutamic acid proteases. Hiện nay, chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và vi rut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt, protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất, do đó protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm có tính thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 2.6 Cấu trúc không gian của protease 2.4.1. Ứng dụng của protease Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus... được dùng trong sản xuất pho mát.  Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy…. Protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định - phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất). Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. Trong công ngiệp thuộc da: Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh…. Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm. 2.5. Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, 4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 2.5.1. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4-glucanase, β-glucosidase. Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose. β -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose. Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase Cơ Chế Hoạt Động Của Enzyme Cellulase Hình 2.9 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase 2.5.2. Tính chất lý hóa của enzyme cellulase Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 550C. Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0. Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. 2.5.3. Ứng dụng của enzyme cellulase Enzym cellulase được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất cồn, trong xử lý môi trường. Enzym cellulase được ứng dụng rất ít trong thực phẩm (khoảng 1%) nhưng hầu như quá trình chế biến nào liên quan đến nguồn nguyên liệu là thực vật nếu có enzym cellulase đều cho hiệu suất cao hơn. Hơn nữa cellulase được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dệt, bột giặt, ngành công nghiệp giấy, cellulase còn được sử dụng cho các ứng dụng dược phẩm. 2.5.4. Các nguồn thu nhận enzyme Hiện nay trên thế giới có 3 nguồn để thu nhận enzyme là từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn. Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài như thu enzym từ nguồn thực vật và động vật.  Có 2 phương pháp để nuôi cấy vi sinh vật tạo enzyme là nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên ngày nay phương pháp nuôi cấy bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi do khả năng cơ giới hóa và tự động hóa. 2.6. Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa protein về dạng dịch. Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng phương pháp siêu âm. Các phương pháp kể trên thích hợp để xử lý các mô mềm, mô động vật, thực vật. Đối với vi khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lý với lysozine (enzyme phá vách tế bào). Đối với những tế bào có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một số trường hợp phải sử dụng máy ép tạo áp suất cao để phá vở tế bào. Một số trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phá mẫu. Sau khi nhận được sinh khối tế bào bị nghiền, công việc tiếp theo là phải tách vách và các mảnh vỡ tế bào ra khỏi dịch chứa protein được giải phóng trong quá trình nghiền. Thường người ta sử dụng phương pháp: ly tâm, lọc, tách dịch 2 lớp, tách nucleic acid và lipid. Tốt nhất là dịch thô được bảo quản ở nhiệt độ thấp. 2.7. Cố định enzyme 2.7.1. Định nghĩa về enzyme cố định Enzyme cố định là enzyme được giới hạn hay khác biệt về mặt vật lý ở một vùng không gian nhất định, nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thể tái sử dụng nhiều lần sau một quá trình xúc tác. 2.7.2. Ưu nhược điểm của quá trình cố định enzyme Ưu điểm: Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần 1 lượng enzyme xác định trong 1 thời gian dài, do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền, thuận lợi trong các quá trình tự động hóa và liên tục. - Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ do đó dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm. Tránh được ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm. Điều này đặc biệt là có ý nghĩa khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất thực phẩm, trong công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích. - Có thể dừng quá trình phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất. - Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như với các tác nhân gây biến tính so với enzyme hòa tan. - Hoạt tính ổn định so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi trường như: pH, nhiệt độ…. Nhờ vào các liên kết của enzyme với chất mang như liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro, liên kết ion và các liên kết khác. Nhược điểm: Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme tự do. - Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộng hóa trị là do chất hoạt hóa và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme. 2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme không hoà tan là: Bản chất và tính chất hóa học của chất mang. Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ trương điện tích, tính háo nước và kị nước,… đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hóa học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng. Dẫn xuất enzyme không hòa tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Sự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác. Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ khác. 2.7.4. Phương pháp cố định enzyme Cố định enzyme thông qua liên kết hóa trị Tạo liên kết hóa trị với vật liệu mang được hoạt hóa thông qua các gốc tự do – NH2, OH và SH ở mạch bên của các amino acid. Theo nguyên tắc, liên kết hình thành trong quá trình tương tác giữa nhóm ưa nhân (nucleophilic) của enzyme với các nhóm chất được hoạt hóa trước đó trên bề mặt chất mang. Cố định enzyme bằng cách nhốt trong gel Tiến hành nhốt enzyme vào nền chất tạo gel tự nhiên, hay tổng hợp, có bản chất là polymer, là khá đơn giản. Các polymer như Na-alginate, carrageenan, carboxymethyl-cellulose (CMC) hoặc polymer cationic như chitosan, thường được sử dụng để tạo liên kết với các ion trái dấu như Ca+2 hoặc polyphosphate. Tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế. Ion Ca+2 đóng vai trò làm chất kết nối gel thường dễ bị hòa tan khi bổ sung thêm muối. Gel dạng hình cầu lại mềm và xốp, độ bền cơ học thấp, khó có thể nhồi vào cột phản ứng, nên ít được sử dụng. Tuy nhiên hướng công nghệ này vẫn được tiếp tục nghiên cứu, theo hướng làm cứng nền gel bằng cách tạo phức gel với hạt epoxide. 2.7.5. Ứng dụng của enzyme cố định 2.7.5.1. Trong công nghiệp Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất… Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn. Chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa. Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định. - Năm 1971 đã dùng Chimotrypsin liên kết cộng hóa trị với carboximethyl cellulose làm đông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền. 2.7.5.2 Trong y học Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu. Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Do đó cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ. Enzyme được cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh. Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng: glucose, urea, cholesterol…Enzyme Horseradish peroxidase cố định trên polystyren cùng với kháng thể , giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kĩ thuật ELISA). Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn. 2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học Năm 1967, điện cực enzyme đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide. Nhúng điện cực vào dung dịch glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose. Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độ cholesterol. Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn. Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trong phương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng tế bào cố định để xử lí nước thải đạt hiệu quả cao. 2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ. Do đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài. 2.7.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế. Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde. Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ. Lê Quang Luân (1997) đã cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử lí chất hữu cơ nước. Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis… 2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này cho tất cả các loại enzyme. Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 công nghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả. Hiện tại enzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực tiễn (chủ yếu là ở Nhật). Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất Enzyme cố định Sản lượng (tấn/năm) Phương pháp cố định Hãng sản xuất Aminoacid acylase 1000 t DEAE sepharose Reactor màng Eupergit Tanabe Degussa Rohm Aminoglucosidase 5000 t sirô glucose Than hoạt tính Tate % Lyle Aspartate 1000 t Nhốt tế bào trong carrageeman Tanabe Furmarase Malic acid Nhốt tế bào trong carrageeman Tanabe Glucose Isomerase 6-7 triệu tấn Lactase < 1000 t sirô lactose Hạt ceramic, trao đổi ion, sợi nylon Corning Sumomoto Lipatse Chuyển ester, thủy phân Trao đổi ion celite Novo Unillever Nitrilase 6000 t acrylamide Nhốt tế bào trong polyacrylamide Nitto RNAase >500 t RNA Thủy tinh, cellulose hoạt hóa, Eugergit VR China, Japan Rohm Penicillin G amidase 4500 t 6-amino-penicillanic Eupergit Rohm Beecham Penicillin V amidase 500 t Polyacrylamide, sợi nylon Toyo Jozo Boehringer Novo Tế bào nấm men Sản xuất cồn Na-alginate KyowaHakko CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1. Thiết bị Bể ổn nhiệt Cân phân tích Máy ly tâm Máy quang phổ UV Máy lắc nuôi cấy Nồi khử trùng Máy đo pH Tủ sấy Ống nghiệm Bình tam giác Phễu lọc, giấy lọc Đũa khuấy Pipet man các loại Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml Gía đựng ống nghiệm Ống đong 100ml, 250ml Xi lanh Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ Các dụng cụ chạy điện di Tủ lạnh Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích Hình 3.3 Máy đo quang UV Hình 3.4 Máy ly tâm Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 3.1.2. Hóa chất Triton X-100 Tween-20 Tweeen-80 Sodium carboxymethyl cellulose Coomassie Brilliant Blue Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4 Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd CaCl2 0,02M Acid acetic 1% Chế phẩm 3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp) Dịch ↓ (Trộn tỷ lệ nước) ↓ Khuấy ↓ Lọc ↓ Thu Dịch ↓ Ly tâm (8000 vòng/p) ↓ Dịch ↓ Tủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat) Ly tâm ↓ Enzyme thô ↓ Tinh sạch ↓ 3.2.1. Thuyết minh quy trình Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường. Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất. Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trong khoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất). Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml. Đem dịch lọc được đi ly tâm. Thu dịch ly tâm. Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hoặc muối amoni sulphate), trong trường hợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 960. Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm. Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô. Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương). Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm. Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm 3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Bradford Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. Hóa chất, thiết bị: Dung dịch mẫu enzyme cellulase cần xác định. Dung dịch albumine 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumin pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200 C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumine có nồng độ 0.01mg/ml. Dung dịch thuốc thử Bradford: Coomassie Brilliant Blue: 0.001g. Ethanl tuyệt đối: 4,7g Acid phosphoric 85%: 8.5g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Thiết bị: Máy quang phổ Lập đồ thị chuẩn Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau: Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn Ống số 1 2 3 4 5 6 Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50 Dung dich albuine(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6 các ống cách nhau 1 phút. Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Đo ở bước sóng 595nm. Tính kết quả Trị số mật độ quang (OD) của những ống chứng (ống 2 đến ống 6) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức: mg protein = b x 10-3 x m x M Với: b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) m: hệ số pha loãng M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g) 3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulose bằng phương pháp đường chuẩn glucose Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5,0 và 400 C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm. Dụng cụ, thiết bị Máy ly tâm. Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. Bếp điện. Chậu nước lạnh. Que khuấy thủy tinh. Hóa chất Cồn 960 . Sodium acetate. NaOH 1N. Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 Ml dd DNS-Lactose 2 2 2 2 2 2 2 Ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0. Hút 1ml dung dịch đệm Na-acetac 50Mm, pH 5.0 cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chưa enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm bằng 0. Ống nghiệm 2: Phản ứng enzyme Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 400 C/5 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400 C/5 phút. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản ứng ở 400 C chính xác 10 phút. Thêm 2ml dung dịch DND-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Ống nghiệm 3: Không có phản ứng enzyme Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ 5 đến 10 phút để bất hoạt enzyme. Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% chứa dung dịch enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Định lượng đơn vị hoạt tính Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng. 3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ pH tối ưu 3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường Chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm với các thành phần môi trường tương ứng như sau.Cố định thành phần cám 75% và thành phần (NH4)2SO4 1%, thay đổi thành phần trấu. Trấu là tác nhân kích thích sinh tổng hợp cellulase. Ta có bảng thành phần môi trường thí nghiệm được bố trí như sau. Bảng 3.3 Thành phần môi trường thí nghiệm theo phần trăm Đơn Vị Tính Phần Trăm (%) Môi Trường Số 1 2 3 4 5 6 Cám 75 75 75 75 75 75 Trấu 22 20 18 16 14 12 (NH4)2SO4 1 1 1 1 1 1 Thêm nước điều chỉnh độ ẩm 60%. Cấy giống vào và nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng 28-300C. Thời gian khảo sát đối với Trichoderma.viride là 72 giờ. Sau đó xác định hoạt tính enzyme cellulase (đối với Trichoderma.viride) bằng cách đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 540 nm cho cellulase. Trong thành phần môi trường nhân giống, chúng tôi cố định hàm lượng cám và muối sunphat amôn ((NH4)2SO4), thay đổi thành phần trấu . Trấu là tác nhân làm cho môi trường thoáng xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Ban đầu nấm mốc sẽ tận dụng những chất dễ tiêu trong môi trường như các loại đường nhưng khi môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì nấm mốc phải tiết ra những enzyme để phân hủy cơ chất khác thành đường để tiếp tục tồn tại và phát triển. Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà nấm mốc sẽ tiết ra lượng enzyme khác nhau. Sự tổng hợp của enzyme còn phụ thuộc vào khả năng tiết tối đa của từng loại vi sinh vật có nghĩa là nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm. 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian Kết quả của thí nghiệm trên được áp dụng để tiếp tục cho thí nghiệm này. Sau khi chọn được môi trường tốt nhất cho sinh tổng hợp enzyme cellulase (đối với Trichoderma. viride), ta tiến hành bố trí thí nghiệm nuôi cấy nấm mốc và lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau. Thời gian khảo sát từ 28 – 32 – 36 – 40 – 44 – 48 – 52 giờ, giữ nguyên độ ẩm 60%. Khi cấy nấm mốc vào môi trường, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme mà sẽ tiết kiệm năng lượng đến mức tối đa và sử dụng ngay những chất dễ sử dụng nhất là các đường đơn, khoáng chất có sẵn. Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vào thành phần các chất có trong môi trường. Nấm mốc phát triển được chia ra thành 4 giai đoạn như sau: thích nghi, phát triển, cân bằng và tử vong. Ở giai đoạn thích nghi và phát triển, nấm mốc sẽ tìm cách thích nghi và tiết ra loại enzyme nào và số lượng bao nhiêu để có thể tồn tại và phát triển. Theo thời gian thì lượng enzyme tiết ra sẽ tăng dần và đến một mức độ ổn định, sau đó sẽ giảm đi khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt dần. Quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase cũng tăng tương ứng theo thời gian. Ở Trichoderma. viride, thời gian tăng trưởng chậm hơn nhưng tạo ra hệ enzyme cellulase rất tốt. Sản phẩm của hệ enzyme cellulase là cellobiose, một chất kìm hãm hoạt tính của exo - β -glucanase. Do đó mà quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ở Trichoderma. viride tăng trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ 4 ngày. 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm Cũng giống như thí nghiệm trên, những kết quả khảo sát được áp dụng như thành phần môi trường và thời gian cho thí nghiệm này. Thay đổi độ ẩm theo các giá trị như sau: 50% - 54% -68% - 62% - 66% - 70%. Các quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc đều có liên quan đến độ ẩm. Độ ẩm là yếu tố quan trọng trong môi trường. Nếu độ ẩm quá thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc và làm cho tế bào bị chết. Điều này sẽ làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển. Ở một độ ẩm nhất định, khi đó hoạt động trao đổi chất diễn ra tốt nhất thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc sẽ diễn ra tốt nhất. Ở môi trường thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy ở độ ẩm 58% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất ở Trichoderma. viride. Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy để nấm mốc sinh trưởng và phát triển tốt và sản sinh ra từng loại enzyme cực đại thì tùy thuộc vào từng loại giống mà chúng ta bố trí độ ẩm thích hợp. 3.4.4 Xác định độ pH tối ưu Để xác định pH phản ứng tối ưu cho phản ứng xúc tác của enzyme nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0.002 mg protein) được ủ với cơ chất CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3.5-5.5 và 100 mM potassium phosphate, pH từ 6.0-8.0, hỗn hợp phản ứng được ủ ở 500C trong 20 phút. Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trước hết cellulase (0.002 mg protein) được ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3.5-8.0, trong 2 giờ ủ ở 370 C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợp để tiếp tục xác định độ bền pH theo thời gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Tốt nhất ở pH 5.0. 3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, chủng nấm nghiên cứu được nuôi trong môi trường: urea: 0.3, (NH4)2SO4: 1.4, KH2PO4: 2.0, CaCl2: 0.3, MgSO4.7H2O: 0.3, peptone: 1, cao nấm men: 10, tween 80: 1, CMC: 10, các yếu tố vi lượng: 0.1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4: 18 mM, MnSO4: 6.6 mM, ZnSO4: 4.8 mM, CoCl2: 15 mM, pH: 7.0 cơ bản cho sinh tổng hợp cellulase, lắc 200 vòng/phút ở 250C, 280C; 300C, 320C và 370C, pH 7.0. Dịch canh trường được thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính cellulase, tốt nhất ở 300 C. 3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa 3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hoặc polymer Thường được sử dụng như là bước tinh sạch đầu tiên, bởi chúng có độ chọn lọc không cao, dễ thay đổi. Ở nồng độ muối thấp, độ hòa tan của protein tăng với nồng độ muối gia tăng, gọi là staling in. Khi nồng độ muối tăng cao hơn, thì độ hòa tan của protein giảm và tạo tủa, gọi là staling out. Chủ yếu các cation và anion của muối tương tác với nước bao quanh phân tử protein, làm tăng tính kỵ nước của protein, dẫn đến tạo tủa. Trong đó, các muối trung tính như muối sulphate và phosphate, đặc biệt là muối (NH4)2SO4 là thông dụng hơn cả. 3.5.2 .Tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau Chế phẩm enzyme cellulase thô dạng bột của nấm Trichoderma reesei được chiết bằng nước cất, thu được dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này được tủa với muối (NH4)2SO4 so ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme: cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 cặn tủa thu được hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính cellulase nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa cellulase. Từ đó khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của cellulase từ dịch tủa enzyme thu được từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lượng phân tử cellulase bằng điện di. Kết quả thu được như sau: Ở nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1:4 là tối ưu để tủa cellulase. Cellulase hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470 C. Tủa protein-enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ Thường được sử dụng ở giai đoạn đầu tinh sạch enzyme. Có trở ngại là phải thực hiện ở nhiệt độ thấp (khoảng 200 C), vì dung môi hữu cơ gây biến tính protein ở nhiệt độ phòng. Ethanol và acetone là 2 dung môi thường được sử dụng nhiều nhất. Kết tủa bằng dung môi hữu cơ ưu điểm hơn kết tủa bằng muối, vì có độ chọn lọc cao hơn, ít tạo tủa vô định hình, dễ dàng thu nhận bằng ly tâm. Tủa tạo thành nhờ tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein với nhau, kể cả sự có mặt tương tác hấp dẫn Van de Waals, làm giảm hằng số điện môi giữa chúng. Tủa protein-enzyme bằng các polymer trung tính Các polymer trung tính tạo tương tác giữa các protein với nhau, nhờ ưu thế loại bỏ bọc nước, dẫn đến tạo tủa protein và tách phase. Khác với dung môi hữu cơ, các polymer trung tính như polyethylene glycol (PEG), không gây biến tính protein, nên có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng. Ngoài 3 phương pháp tạo tủa phân đoạn protein kể trên, một số phương pháp tạo tủa khác cũng được sử dụng. Đó là tạo tủa phân đoạn protein bằng cách gây biến tính bởi nhiệt độ, độ pH, dung môi hữu cơ, tạo tủa loại protein gây nhiễm. Để tăng tủa đặc hiệu, người ta bổ sung các tay nối (ligand) đặc hiệu vào các polymer tạo “tủa ái lực protein” cho phép làm sạch đáng kể protein-enzyme dịch. 3.5.5. Tủa enzyme bằng điểm đẳng điện Dựa trên tính chất protein có độ hoà tan thấp ở điểm đẳng điện. Ở điểm đẳng điện độ hydrate-hoá của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein, dẫn đến tạo tủa. Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có khoảng giá trị pH đẳng điện giới hạn. Phương pháp này cho hiệu quả không cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ. 3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel Tạo dung dịch Natrialginate 3%: Cân 0.75g Natrialginate hòa tan trong 25 ml dung dịch đệm acetate pH 5. Khuấy đến khi tất cả Natrialginate hòa tan hoàn toàn là được. Tiến hành cố định: Cân 0.5g ezyme cellulase hòa tan trong dung dịch Natrialginate 3%. Dùng ống xilanh có đầu kim tiêm, hút dung dịch enzyme hòa tan này nhỏ từ độ cao 20cm vào trong 100ml dung dịch 0.2m CaCl2 để tạo gel. Qúa trình tạo gel xảy ra trong 2 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau cố định, dùng giấy lọc, lọc enzyme đã được cố định. Kết quả thu được hạt gel enzyme cellulase đã được nhốt trong khuôn gel. Dịch lọc thu được đem đi xác định hàm lượng theo phương pháp Bradford và xác định hoạt tíh theo phương pháp của công ty Shin Nihon Chemical Co, Ltd. Cách tính: HL Protein cố định (mg) = HL Protein trước cố định – HL Protein còn lại Hiệu suất gắn Protein được tính theo công thức sau: HS cố định Protein = HL Protein cố định/HL Protein trước cố định x 100 Hiệu suất hoạt tính enzyme cellulase cố định so với hoạt tính enzyme cellulase ban đầu: ∑ ĐVHT E cellulase cố định HS hoạt tính enzyme cố định (%) = X 100 ∑ ĐVHT E cellulase trước cố định Trong đó: ∑ ĐVHT E cellulase cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase cố định (UI/g). ∑ ĐVHT E cellulase trước cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase trước cố định (UI/g). Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase cố định trên Natrialginate Sau khi hạt gel đã được cố định ta bọc bằng giấy lọc, thu dịch nước tiến hành khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 1 và rửa lại bằng CaCl2, tiếp tục khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 2 cứ như thế ta khảo sát được lần 3, lần 4,…. Vẽ đồ thị số lần tái sử dụng giảm 50% so với enzyme ban đầu. . Tinh sạch enzyme 3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ 3.7.1.1. Dụng cụ và thiết bị Phễu đổ gel Bình hút chân không Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm, thể tích 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3,14 . Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm: 20 cái Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch. 3.7.1.2. Hóa chất Gel “Sephadex G-100”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm, khả năng ngậm nước: 12ml/1 g gel khô, phạm vi phân tách: 5.000-100.000 Daltons. Đệm Acetate 50 Nm, pH 5.0: khử bọt khí trước khi dùng 3.7.1.3. Tinh sạch enzyme Dịch enzyme sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7.5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn. Dịch enzyme thô Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endo- β -1,4-glucanase cao được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là 3320 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể được tóm tắt như sơ đồ: Ly tâm 10000 vòng/10 phút ↓ Dịch trong ↓ Cột Sephadex G100 ↓ Cột DEAE ↓ Enzyme tinh sạch ↓ . Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel Polyacrylamide 3.8.1. Giới thiệu về gel Polycrylamide Gel polycrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N, N’-methylene-bis-acrylamide. Qúa trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS), N, N ,N’ ,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước của ỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide: nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptooethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng. Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein có xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000-200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2.5%. Ngoài kĩ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo lien kết (cross-linkes) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kĩ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focusing gel electrophoresis). Vật liệu . Dụng cụ và thiết bị Bộ điện di chứng Bộ nguồn chạy điện di (electrophoresis power supply) Biorad Pipetteman 1000 µl. Pipetteman 200 µl. Pipetteman 10µl. Típ xanh: 1 hộp. Típ vàng: 1 hộp. Típ trắng: 1 hộp. Giấy lọc. Giấy thấm. Găng tay: 1 đôi. Phao. Eppendorf. pH kế . Hóa chất N, N, N’, N’-tetramethylenediamide [C6H16N2-TEMED] Dung dịch Acryamide/Bisacryamide 40% (29:1) (3,3 % C) β-Mercaptoethanol [HSCH2CH2OH] Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad), gồm các protein chuẩn có kích thước xác định sau: Phosphorylase b 97.400 Daltons Bovine serum albumin 66.200 Daltons Ovalbumin 45.000 Daltons Carbonic anhydrase 31.000 Daltons Soybean trypsin inhibitor 21.500 Daltons Lysozyme 14.400 Daltons Sodium Dodecyl Sulfate [SDS] Ammonium persulfate [(NH4)2S2O8][APS] Coomassie Brillilant Blue G 250 dạng viên (Bio-Rad) Cồn tuyệt đối [99,5 độ] Methanol [CH3OH] Tris (hydroxymethyl) aminomethane Axit acetic Bromophenol blue Glycerol [C3H8O3] Glycine [C2H5O2N] Axít Clohydric [HCl] Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%: cân 10g SDS cho 100ml nước cất vào khuấy cho tới khi tan hết. Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1.5 M, pH 8.8-0,4% SDS: cân 36,3 g Tris pha thêm 100 ml nước cất thêm dần HCl 6 N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8.8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40 C. Dung dịch gel gom (stacking gel buffer) Tris-Cl 0,5M, pH 6.8-0,4% SDS: cân 6.05g Tris pha trong 100ml nước cất thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chi 6.8. Hút 4ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 100ml, lắc đều giữ ở 40 C. Ammoniumperslfate 10% (chỉ pha trước khi dùng): cân 0.1g cho vào một eppendorf 1000µl thêm 1ml nước cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng. Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8.3: pha dung dịch me 10X chứa 30g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000ml nước cất. Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần như sau: 2.5ml dung dịch đệm Tris-Cl 0.5M, pH 6.8, 4ml 10% SDS, 2ml Glycerol, 2mg Bromophenol Blue, 0.2 ml mercaptoethanol, thêm nước đủ 10ml. Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm gel chứa 0.625g Coomassie Blue G 250, 112.5ml ethanol tuyệt đối, 112.5ml nước cất và 25ml axit acetic, lắc đều, giữ trong chai màu tối. Dung dịch giải nhuộm: 30ml methanol: 10ml acid acetic: 60ml nước cất. Phương pháp Đổ gel Chuẩn bị đổ một gel có kích thước 100 x 100 x 0.75mm có nồng độ acrylamide là 10%. Gel phân tách (separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50ml sạch: 40% Acrylamide/Bis (29:1) 2.5ml Tris-HCl 1.5M pH 8.8-0.4% SDS 2.5ml Nước cất 4.445ml TEMED 5µl Ammonium persulfate 10% 50µl Tổng thể tích 10ml Sau khi cho Ammonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20-30 phút). Gel gom (Stacking gel) Cho các thành phần sau vào một Becher 50ml khác: 40% Acrylamide/0.85 bisacrylamide 0.5ml Tris-HCl 0.5M pH 6.8-0.4% SDS 1ml Nước cất 2.476ml TEMED 4µl Ammonium persulfate 10% 20µl Tổng thể tích 4ml Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sauk hi gel trùng ngưng à tháo lược à lắp đĩa gel vào bộ phận điện di à cho dung dịch điện di vào buồn điện di. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di Xử lý mẫu Hút 30µl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30µl dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5-10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1-5 giây. Đối với những thang chuẩn protein (Biorad0 hút 2µl vào eppendorf 1ml chứa 8 µl nước cất và 10µl dung dịch nạp mẫu. Tiến hành chạy điện di Dùng pipetteman 10µl nạp mẫu vào các giếng (20µl/giếng). Tiến hành chạy điện di ổn định dòng: 100V Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước (2-4 giờ) 1 giờ. Sau đó, tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đén khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sauk hi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. Xác định trọng lượng phân tử của protein Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách đến các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. Tính giá trị Rf: Khoảng cách di chuyển của protein Rf = Khoảng cách di chuyển của vạch màu Brommophenol Blue Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng. Trọng lượng phân tử của các vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể xác định thông số giá trị Rf của chúng thông qua phương pháp ngoại suy tử đồ thị. Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase trên Natrialginate Cân 1 g enzyme cố định đem xác định số lần tái sử dụng của enzyme cellulase trên Natrialginate theo phương pháp mục 3.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp mục 3.2.2. Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt ính enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng Số lần lặp lại Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 1 136.15 100 2 104.97 77.09 3 73.76 54.18 4 51.08 37.52 5 39.75 29.20 6 31.25 22.96 7 14.21 10.44 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hoạt tính của enzyme cellulase qua các lần tái sử dụng Nhận xét: Việc tái sử dụng enzyme là đặc tính quan trọng của enzyme cố định. Tuy nhiên qua các lần tái sử dụng hoạt tính của enzyme bị giảm so với hoạt tính ban đầu của enzyme cố định. Sự giảm hoạt tính của enzyme cố định phụ thuộc nhiều yếu tố.Theo đồ thị thì hoạt tính cellulase cố định trên Natrialginate giảm đi rất nhiều so với ban đầu. Ở lần tái sử dụng thứ 4 hoạt tính cellulase chỉ còn 37.52%. Hiệu suất tái sử dụng của cellulase cố định trên Natrialginate không cao có thể là do cơ chất Natrialginate kém bền với nhiệt độ và các điều kiện phản ứng. Sau mỗi lần tái sử dụng, enzyme bị thất thoát nhiều, do đó hoạt tính cellulase cố định giảm rất nhanh. Tuy nhiên sau 4 lần tái sử dụng hoạt tính cellulase cố định giảm đi ít hơn so với những lần đầu tiên. Có thể là do đường kính hạt gel Natrialginate khá lớn nên với những điều kiện phản ứng chỉ tác động đến một phần hạt gel làm cho những lần tái sử dụng sau lượng enzyme trong hạt gel ít thất thoát hơn nên hoạt tính cellulase cố định những lần sau giảm ít hơn và ổn định hơn. Tuy vậy hoạt tính của những lần tái sử dụng sau vẫn thấp (hoạt tính còn giữ lại 10.44% sau 7 lần tái sử dụng). CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ những nghiên cứu về quy trình tách chiết enzyme cellulase từ Trichoderma reesei xác định được các yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm cơ chất ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cũng như tách chiết enzyme cellulase. Xác định đươc tác nhân của enzyme hiệu quả nhất cho quy trình phân hủy cơ chất và củng như giúp cho quy trình thu hồi enzyme tốt nhất. Xây dựng quy trình tách chiết enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ký lọc gel đồng thời xác định trọng lượng của phân tử enzyme tạo thành. 4.2. Đề nghị Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các dòng nấm Trichoderma Reesei bị đột biến xem dòng nào mang lại hiệu quả sản xuất enzyme cellulase là cao nhất, mà giá thành sản xuất lại ít tốn kém . Ngoài chủng nấm Trichoderma Reesei ra, thì chúng ta nên tiến hành khảo sát thêm khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc khác như : Bacillus subtilis, Apergilus, vi khuẩn, xạ khuẩn…xem khả năng tổng hợp enzyme cellulase của chủng nào là mạnh nhất, mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất . Tận dụng và xử lý có hiệu quả nguồn phế thải hữu cơ từ các nhà máy : mạt cưa, bã mía, cám mì, bã đậu nành... Nó không chỉ góp phần vào bảo vệ môi trường mà còn tạo ra một lượng lớn enzyme cellulase ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất bột giặc, trong dược phẩm… Bên cạnh ứng dụng của các chủng nấm để sản xuất enzyme cellulase thì ta cũng nên nghiên cứu thêm nhũng ứng dụng khác của chủng nấm để phục vụ cho khoa học, cũng như trong đời sống hàng ngày. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,113 - 114, 2003. [2] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1- Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 128 - 129, 2003. [3] Lê Hồng Phú, Nghiên cứu sinh tổng hợp Enzyme Pectinase và Cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ, Luận văn thạc sĩ ngành sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, 2003. [4] Nguyễn Văn Tuân, tuyển chọn nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất của Endo-β-1,4-glucanase, luận văn Thạc sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Thái Nguyên . [5] Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Thu nhận enzyme cellulase của Trichoderma Reesei trên môi trường bán rắn, Viện Sinh Học Nhiệt Đới-Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam. [6] PGS TS Nguyễn Tiến Thắng, Giaó trình công nghệ Enzyme, TP HCM 2010 Tài liệu tiếng anh Okada G., The growth of Trichoderma viride on media containing cotton fibres, J. Biochem, trang 591 – 607, 1963. Ruy D.D.Y. And Mandels M. – Cellulase, Biosynthesis and applications - Enzyme Microbiology Technology, 1980. Gary J. Samuels, Trichoderma a guide to identification and biology. Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA, 2004. Science & Technology Development, Vol 12, No.13 – 2009. PHỤ LỤC Phụ lục A. Bảng 1.1: Đại diện vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase Vi Sinh Vật Vi Khuẩn Nấm Acremonium cellulolyticus Actinomycetes Thermoactinomyces sp. Chrysosporium Aspergillus acculeatus Actinomycetes Thermomonospora curvata Schizophyllum xã Aspergillus fumigates Sclerotium rolfsii Aspergillus niger Sporotrichum cellulophilum Fusarium solani Talaromyces emersonii Irpex lacteus Thielavia terrestris Penicillium funmiculosum Trichoderma koningii Phanerochaete Trichoderma reesei Clostridium thermocellum Trichoderma viride Ruminococcus albus Streptomyces sp. Phụ lục B. Môi trường nuôi cấy các chủng Vi Sinh Vật Môi trường nuôi cấy: Môi trường (MT) nuôi cấy vi khuẩn: CMC 1%, peptone 0,05%, cao thịt 0,1%, NaCl 0,1%). MT nuôi cấy xạ khuẩn: CMC 1%, tinh bột 0,1%, cao nấm men 0,02%. MT nuôi cấy nấm sợi: CMC 1%, cao malt 0.02%. MT nuôi cấy nấm men: CMC 1%, glucose 0,1%, peptone 0,05%, cao nấm men 0,03%, cao malt 0,03%. MT nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh cellulase được sưu tập từ phòng thí nghiệm của trường Đại học khoa học Tự nhiên: CMC 1%, tinh bột 0,1%, MgSO4 0,02 %, NaHCO3 0.02%, K2HPO4 0,5%, CaCl2 0.02%, NaCl 0,02%, peptone 0,02%. Môi trường AN: KH2PO4 0,1g, NaNO3 0,3g, MgSO4 .H2O 0,05g, KCl 0,05g, FeSO4 7H2O 0,01g, Cao bắp 0,5g, giấy lọc 2g, nước cất 1l. MT Zapek, Cell. Phụ lục C. Gel “Biogel-P-“Hãng Bio-Rad C.1.Giới thiệu Các loại gel “Bio-Gel P” là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, được điều chế bằng quá trình đồng hóa polymer hóa acrylamide và N, N’ –methylene-bis-acrylamide. Các gel này rất ưa nước và không mang điện tính, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Độ phân giải cao được xác định bằng 2 yếu tố (1) sự phân bố hẹp và consistent của đường kính hạt, (2) sự phân tách tốt theo trọng lượng phân tử. Gel “Bio-Gel P” thích hợp với các acid hữu cơ yếu, urê 8M, guanidine 6M, các tác nhân chatropic, các tác nhân khử như dithiothreitol và mercaptoethanol, các tác nhân tẩy như SDS, CHAPS, và Triton X-100, Bio-Gel P có thể được dùng với nước cất, tuy nhiên các dung dịch đệm có cường độ ion > 50Mm sẽ mang lại hiệu quả phân tách protein tốt nhất. Có thể cho dung môi hữu cơ miscible vào chất giải hấp được dùng với gel “Bio-Gel P”. Cồn (có thể đến 20%) không làm thay đổi đặc tính phân tách của gel, và trong một vài trường hợp nó còn làm tăng quá trình phân tách các hỗn hợp phức tạp của các phân tử hòa tan kém trong nước như các nucleotide, peptide, tamin. Có thể dùng dung môi formamide ở cường độ mạnh vì gel “Bio-Gel P” swell hoàn toàn bởi dung môi này. Gel “Bio-Gel P” có thể khử trùng ở pH 5.5-6.0 trong các dung dịch đệm như HEPES 50Mm, MES, hoặc citrate ở 1200 C trong 15-30 phút. Ở nhiệt độ phòng, phạm vi pH nên điều chỉnh từ 2 đến 10. Gel “Bio-Gel P” nhạy cảm với sự thủy phân các nhóm amide ở pH cao hoặc thấp. Tốc độ dòng và độ phân giải gia tăng khi nhiệt độ trong phạm vi 4-800 C. C.2. Các thông số kĩ thuật Bảng 3.1 Các thông số của sản phẩm gel “Bio-Gel-P” Thông Số Đặc Tính Chất nền (Matrix) Gel-Bio-Gel polyacrylamide Kích thước hạt Trung bình 90-180 µm Mịn 45-90 µm Rất mịn < 45 µm Shipping medium Shipped dry Phạm vi hoạt động tốt pH 2-10 Áp suất 15 psi Các dung môi hữu cơ < 200 C Phạm vi nhiệt độ vận hành 4-800 C Phạm vi nhiệt độ cho phép Khử trùng bằng autoclave, pH 5.5-6.5 ở nhiệt độ 1200 C trong 30 phút. Bảo quản Khô, ở nhiệt độ phòng, trong nước cất hoặc dung dịch đệm ở 40 C với sodium azide 0.02%. Bảng 3.2 Các dặc tính của gel “Bio-Gel P” Gel Phạm vi kích thước hạt, các hạt đã bị ngậm nước(µM) Thể tích nền đã hydrated điển hình, ml/g gel khô Tốc độ dòng điển hình (cm/hr) Phạm vi phân tách tiêu biểu/giới hạn phân tách thong thường (Daltons) Bio-Gel P-2 Gel, mịn Bio-Gel P-2, rất mịn 45-90 < 45 3 5.0-10 < 10 100-1.800 100-1.800 Bio-Gel P-4 Gel, trung bình Bio-Gel P-4 Gel, mịn Bio-Gel P-4 Gel, rất mịn 90-180 45-90 < 45 4 15-20 10-15 < 10 800-4.000 800-4.000 800-4.000 Bio-Gel p-6 Gel, trung bình Bio-Gel P-6 Gel, mịn Bio-Gel P-6 Gel, rất mịn 90-180 45-90 < 45 6.5 15-20 10-15 < 10 1.000-6.000 1.000-6.000 1.000-6.000 Bio-Gel P-6DG Gel 90-180 6.5 15-20 1.000-6.000 Bio-Gel P-10 Gel, trung bình 90-180 7.5 15-20 1.500-20.000 Bio-Gel P-10 Gel, rất mịn 45-90 10-15 1.500-20.000 Bio-Gel P-30 Gel, trung bình Bio-Gel P-30 Gel, mịn 90-180 45-90 9 15-20 10-15 2.500-40.000 2.500-40.000 Bio-Gel P-60 Gel, trung bình Bio-Gel P-60 Gel, mịn 90-180 45-90 11 15-20 10-15 3.000-60.000 3.000-60.000 Bio-Gel P-100 Gel, trung bình Bio-Gel P-100 Gel, mịn 90-180 45-90 12 15-20 10-15 5.000-100.000 5.000-100.000 Lưu ý: Tốc độ dòng xác định ở cột 1.5 x 70 cm. Phạm vi phân tách trên 40.000 daltons đối với các phân tử hình cầu. Đối với mục đích kiểm soát chất lượng, giới hạn phân tách được xác định bằng cách tính giá trị Kd, hoặc hệ số phân bố. Hệ số phân bố là giá trị thời gian lưu của phân tử trong các lỗ gel, được biểu diễn như sau: (Ve – Vo)/ (Vt – Vo) Trong đó: Ve là thể tích giải hấp (thể tích thôi = elution volumn). Vo là thể tích trống (void volumn). Vt là thể tích tổng xác định bằng một phân tử nhỏ như vitamin B12 C.3. Hướng dẫn sử dụng Bio-Gel P C.3.1. Chọn cột Kích thước cột lý tưởng là những kích thước cho phép phân giải vạch ranh giới các chất phân tích mà không cần pha loãng mẫu nhiều. Điển hình, chiều dài cột so với tỷ lệ đường kính ở khoảng pH 5-10, và thể tích lớp nền (bed volumn) gấp 4-20 lần thể tích của mẫu. Hệ số pha loãng tối thiểu có thể thu được đối với một chất đã được tách (excluded substance) khoảng 1,25. Nhìn chung, đối với quá trình phân tách khó thì cần chiều dài lớp nền so với tỷ lệ đường kính là 25-100 hoặc lớn hơn, và thể tích lớp nền gấp 25-100 lần thể tích mẫu. Chọn chất tách Chất tách (chất giải hấp) là chất lỏng dùng để chiết một chất khỏi chất khác trong sắc ký. Chất tách chọn cần tạo tính ổn định tối đa cho các chất tan không ổn định trong mẫu. Nồng độ ion ít nhất là 20mM để loại trừ ảnh hưởng của số lượng nhỏ các nhóm mang điện âm trên gel. Việc sử dụng các dung dịch muối ở nồng độ cao có thể gây ra những thay đổi nhỏ trong thể tích lớp nền gel và giới hạn phân tách (exclusion limits). Bio-Gel P tương thích với các trạng thái hòa tan và làm biến tính (solubilizing and denaturing condition) được sử dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử như guanidine-HCl 6M, các tác nhân chaotropic, các tác nhân khử như dithiothreitol và mercaptoethanol, và các thuốc tẩy như SDS, CHAPS, và Triton X-100. Có thể sử dụng các muối đệm dễ bay hơi như pyridine, acetic acid, ammonium formate hoặc ammonium bicarbonate nếu sản phẩm cuối cùng cần phải ở trạng thái không có muối đệm. Có thể loại các chất này ra khỏi phân đoạn dòng chảy (effluent fractions) dễ dàng bằng đông khô. Nên loại các khí hòa tan như CO2 để ngăn chặn sự tạo bọt trong hệ thống. Thực hiện điều này bằng cách hút dung dịch đệm trong một lọ chân không bằng một vòi nước tạo chân không hoặc bằng máy tạo chân không. Nên tránh sử dụng các chất tách có pH trên 10 hoặc nhỏ hơn 2 để ngăn sự thủy phân gel. Tránh dùng các tác nhân 0xy hóa mạnh vì các chất này sẽ phản ứng với gel và làm gia tăng hàm lượng các nhóm tích điện trên chất lớp. Chuẩn bị gel Cho từ từ môi trường Bio-Gel P vào dung dịch đệm đã được đựng trong cốc mỏ (beaker). Có thể ước tính lượng gel Bio-Gel P cần cho vào cột có thể tích đã biết bằng cách sử dụng bảng 2, bảng này cho biết thể tích lớp neenfkhi được hydrat hóa. Lưu ý sự mất gel trong suốt quá trình tiến hành công việc. Dùng dung dịch đệm nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền cần cho trong cột. Đối với các gel từ Bio-Gel P-2 đến Bio-Gel P-10 cần hydrat hóa trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng (1 giờ nếu dung dịch đệm đã được làm nóng đến 1000 C và rồi làm lạnh sau khi đã cho gel vào dung dịch đệm). Đối với các gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ ở 200 C để hydrat hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 1000 C . Sauk hi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong suốt quá trình hydrat hóa. Sau khi quá trình hydrat xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình lọc và gắn với nguồn chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư hại gel. Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ bình. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Gạn hoăc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại > 99% hạt mịn. Cho một cái phễu trên đỉnh cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều chất pha trộn loãng (slurry) vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn (tung tóe) chất pha trộn loãng để đảm bảo việc nhồi cột đều và để tránh việc bẫy các bọt khí. Khi 2-5 cm lớp nền đã hình thàh, cho cột chảy cho đến khi cột được nạp đầy (packed). Khi cột đã được nạp đầy, đóng đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích trên lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị. Nếu không dùng flow adaptor thì lấy lớp gel thừa cho đến khi đạt chiều cao lớp nền mong muốn khi mà cột đã được nạp xong và gắn cột vào một reservoir. Cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ dòng chảy. Rút dung dịch đệm xuống bằng lớp nền gel và mẫu nằm trên lớp nền gel, sau đó cho thêm dung dịch đệm để lấy mẫu vào lớp nền. Thay lớp dung dịch đệm nổi trên bề mặt và gắn cột vào reservoir. Thu các phân đoạn để phân tích hoặc theo dõi bằng một thiết bị dòng liên tục (continuous flow equipment) như UV/Vis, các máy đo độ dẫn (conductivity) và chỉ số khúc xạ (refractive index). Mẫu Lọc gel phần lớn độc lập với nồng độ mẫu nhưng thể tích mẫu tương ứng với thể tích lớp nền lại khá quan trọng. Với mục đích phân tích, mẫu không nên lớn hơn 1-5% thể tích lớp nền. Với mục đích khử muối, mẫu có thể là 30-35% so với thể tích lớp nền. Độ nhớt của mẫu có thể giới hạn nồng độ mẫu mà có thể sử dụng. Mẫu có độ nhớt cao có thể pha loãng để là giảm độ nhớt. Có thể đạt được kết quả tốt hơn bằng cách áp dụng mẫu có độ nhớt cao ở tốc độ chảy thấp. Mẫu cần sạch và hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm chạy mà không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn. Lọc mẫu sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột. Nếu vì tính chất của mẫu mà không thể đem lọc được thì nên ly tâm mẫu cho đến khi nó sạch. Trình bày ảnh hưởng theo giả thuyết về các điều kiện sắc kí khác nhau. Xác định thể tích trống (void volumn) và hiệu chuẩn (calibration) Thể tích trống (Void volumn) = Vo của lớp nền bằng với thể tích phân tách (elution volumn = Ve) của các nguyên liệu đã phân tách. Nên xác đinh thể tích chân không của lớp nền và nên kiểm tra tính đồng nhất của chất phân tách của lớp nền trước khi áp dụng mẫu thí nghiệm. Các protein có màu như hemoglobin, ferritin phù hợp với phương pháp xác định thể tích chân không này. Dextran xanh không được đề nghị xác đinh thể tích chân không vì nó không đồng nhất (heterogeneous) và có thể cho ra những kết quả khác nhau. Nó cũng có thể liên kết không dặc hiệu với gel. Sử dụng các protein chuẩn cho phép kiểm tra viecj nạp cột (colum packing) và sự phân tách protein (protein elution). Nó cũng cho phép so sánh các loại cột với nhau và các nguyên liệu để nạp cột khác nhau mà không làm lãng phí mẫu. Chuẩn lọc gel của hãng Bio-Rad là một hỗn hợp 5 protein có trọng lượng phân tử đã biết: thyroglobulin (Mr 670.000), gamma globulin bò (Mr 158.000), ovalbumin của gà (Mr 44.000), myoglobin của ngựa (Mr 17.000), và vitamin B12 (Mr 1350). Vitamin B12 và myoglobin có thể nhìn thấy được khi chúng di chuyển qua cột Vệ sinh và khử trùng Gel Bio-Gel P có thể được khử trùng bên trong cột bằng cách sử dụng 3% hydrogen peroxide trong nước, dung dịch ethanol, diethyl pyrocarbonat hoặc thimerosal 1: 10.000. Gel Bio-Gel P đã hydrat hóa có thể được khử trùng bằng autoclave ở pH 5.5-6.5 ở 1200 C trong 30 phút. Khi khử trung bằng autoclave, gel có thể bị phồng lên từ 4-20 lần thể tích ban đầu. Sự phồng lên càng nhiều thì làm cho kích thước lỗ càng lớn. Bảo quản Các cột đã được nạp gel Bio-Gel P có thể bảo quản không giới hạn nếu được duy trì ở pH trung tính khi có mặt chất kháng khuẩn như 0.02% sodium azide. Nên bảo quản các cột đó ở 40 C. Xác định tốc độ dòng Lọc gel là một quá trình có kiểm soát chất khyếch tán : hiệu quả phân tách tùy thuộc vào tốc độ và độ đồng nhất của kích thước hạt gel. Độ phân tách cao nhất nhạn đươc khi tốc độ dòng được duy trì trong phạm vi 2-10 cm/hr. Đối với tốc độ dòng tuyến tính 5cm/hr (nghĩa là tốc đọ dòng theo chiều dài của cột), để xác định tốc độ dòng của cột ta lấy tốc độ dòng tuyến tính nhân với diện tích thiết diện (cross sectional area) của cột. Bảng 3.3 Xác định tốc độ dòng Tốc độ dòng tuyến tính (cm/hr) Đường kính cột (cm) Diện tích thiết diện (cm2) Tốc độ dòng qua cột ml/hr 5 0.7 0.385 1.9 5 1.0 0.785 3.9 5 1.5 1.77 8.9 5 2.5 4.91 25 5 5.0 19.6 98 Đối với cột có kích thước 1.5 x 70 cm. Tốc độ dòng sẽ giảm nếu chiều dài cột tăng. ml/hr/cm2 (diện tích thiết diện) = cm3/hr/cm2 = cm/hr.