Đề tài Khảo sát khả năng giải độc của Glutamat trên cây cải bị bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani

LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam là nước có nền nông nghiệp phát triển tương đối mạnh nhờ điều kiện tự nhiên khá thuận lợi (Đường Hồng Dật, 2004). Nước ta là một nước nông nghiệp với hơn 80% dân số sống bằng nghề nông. Vì vậy sự ổng định của nền nông nghiệp ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của đất nước. Việc phòng trừ sâu bệnh bảo vệ mùa màng là một trong những biện pháp quan trọng tạo ra sự ổn định này ( Nguyễn Xuân Thành, 1996). Rau màu là lọai cây trồng ngắn ngày, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm thiết yếu cho cuộc sống con người. Rau màu có chứa nhiều chất dinh dưỡng, nhưng thân lá lại non mềm, chứa nhiều nước, là môi trường thuận lợi cho các loài sâu bệnh phá hại. Vì vậy, rau màu đang là đối tượng sử dụng nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật. Cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp, ngành trồng rau nước ta đang không ngừng phát triển cả về diện tích, năng suất và chất lượng, từ đó hình thành nên nhiều vùng trồng rau chuyên canh, từ sự chuyên canh đó đã hình thành nên nhiều chủng bệnh nguy hiểm. Trong số các loại bệnh hại trên rau thì bệnh chết cây con, bệnh lỡ cổ rễ,… đang là những bệnh quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và năng suất. Việc sử dụng các loại thuốc hóa học ngày càng gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng về sức khỏe cho con người. Do đó, việc thay thế các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học bằng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học đang ngày càng được quang tâm nhiều hơn. Để phát huy hiệu quả của việc phòng trừ và kích thích tính kháng, đề tài này được thực hiện với mục tiêu như sau: “Khảo sát khả năng giải độc của Glutamat trên cây cải bị bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani”. Phần 1: TỔNG QUAN. 1.1 VÀI NÉT VỀ BỆNH CÂY. 1.1.1 Lịch sử khoa học bệnh cây. Thời thượng cổ, với đời sống hái lượm sau đó tiến bộ hơn là du canh, du cư, con người không phát hiện được sự phá hoại của bệnh cây mà cho rằng cây bị héo, bị chết, sản xuất nông nghiệp bị tàn phá là do trời,... Thế kỷ thứ 3 trước công nguyên vào thời Hy Lạp cổ đại, Theophraste đã mô tả bệnh gỉ sắt hại cây và hiện tượng nấm kí sinh ở gốc cây. Thế kỷ 16, chế độ phong kiến tập quyền phát triển mạnh, các vùng sản xuất chuyên canh lớn xuất hiện. Bệnh cây ngày càng gây nhiều tác hại lớn cho sản xuất và nhận thức về bệnh ngày càng rõ rệt hơn. Thế kỷ 18, kinh tế thế giới đã chuyển từ thủ công sang nửa cơ khí và cơ khí hóa. Các quốc gia tư bản hình thành, khoa học kỹ thuật phát triển mạnh, bước đầu đã có những biện pháp đơn giản phòng trừ bệnh cây. M. Tillet (1775) và B. Prevost (1807) là những người đầu tiên nghiên cứu về bệnh than đen lúa mì. Tài liệu nghiên cứu về bệnh cây của Anton de Bary (1853) đã tạo nền móng cho sự phát triển của khoa học bệnh cây sau này. Hallier (1875) phát hiện vi khuẩn gây thối củ khoai tây. A. Mayer (1886), D. Ivanopski (1892), M. Bayerinck (1898) tìm ra virus khảm thuốc lá. Nocar và Roux (1898) phát hiện Mycoplasma ở động vật. Schulrt và Folsom (1917 - 1921) tìm thấy bệnh củ khoai tây có hình thoi nhưng không xác định rõ nguyên nhân. Đến những năm 80 của thế kỷ 20, tin học, điện tử, tự động hoá đã phát triển mạnh, các công trình nghiên cứu bệnh cây đã chuyển sang một bước phát triển vượt bậc. E.F. Smith (1895 – 1980) đã nghiên cứu một các hệ thống về vi khuẩn gây bệnh cây. Rất nhiều nhà vi khuẩn học đã có các công trình nghiên cứu: Branes J.A Wdrey L.V.A, Bosh S.E, Boucher C.A., Chang M.L, Cook D., N.W.Schaad, J.B. Jones và W. Chun. Những năm đầu thế kỷ 20, các nhà khoa học Hà Lan, Pháp, Anh, Nhật Bản,… đã có nhiều công trình nghiên cứu. Cuốn "Bệnh virus hại thực vật" (Plant virology) của R.E.F Mathew là tài liệu cơ bản được xuất bản nhiều lần; cuốn "Phân loại virus" (Virus Taxonomy) của nhiều tác giả là một tài liệu rất chi tiết và hiện đại về virus học bệnh cây và virus nói chung. Dienier và W. Raymer (1966) đã xác định được viroide là nguyên nhân gây ra bệnh khoai tây có củ hình thoi ở Mỹ. J. Doi và các cộng sự (1967) lần đầu tiên đã xác định bệnh Phytoplasma hại thực vật ở Nhật Bản. Tài liệu "Bệnh cây nhiệt đới" của H. David và Thurston; "Bệnh cây" (Plant pathology) của George N. Agrios được xuất bản nhiều lần là những tài liệu có giá trị cho việc phát triển và nghiên cứu bệnh cây. Đặc biệt, môn sinh học phân tử phát triển đã mang lại sự phát triển vượt bậc của khoa học bệnh cây cuối thế kỷ 20 - đầu thế kỷ 21. Các hội bệnh lý thực vật của các nước thành lập từ rất lâu trên thế giới như: ở Hà Lan (1891), Mỹ (1908), Nhật Bản (1916), Canada (1930), Ấn Độ (1947). Hội nghị nghiên cứu bệnh cây lần thứ nhất đã tập hợp rất nhiều nhà nghiên cứu về bệnh cây tại London (Anh) vào 8/1968, mở đầu cho các hoạt động rất đa dạng và phong phú sau này của Hiệp hội các nhà nghiên cứu bệnh cây thế giới. Ở Việt Nam từ thời Lê Quý Đôn, trong cuốn “Vân Đài loại ngũ” ông đã mô tả nhiều phương pháp chăm sóc cây khỏe: dùng vôi tro bón ruộng - hun khói bếp để bảo quản hành tỏi, ngô - đặc biệt đã biết chọn lựa giống lúa tốt, ít bị sâu bệnh. Tình hình bệnh cây Việt Nam đầu thể kỷ 20 được ghi nhận bằng các công trình nghiên cứu của các tác giả người Pháp F. Vincens (1921) về phát hiện bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia hại lúa tại các tỉnh Bạc Liêu, Cần Thơ, Sóc Trăng. Bougnicourt (1943) phát hiện bệnh lúa von ở Việt Nam. Roger (1951) phát hiện bệnh đạo ôn ở miền Bắc Việt Nam. Trong cuốn "Bệnh cây nhiệt đới" (Phytopathologie des pays chaud) của tác giả Roger (1954) xuất bản tại Paris rất nhiều bệnh hại cây ở vùng nhiệt đới đặc biệt là ở Việt Nam đã được đề cập, mô tả tỉ mỉ. 1.1.2 Những thiệt hại do bệnh cây gây ra. Từ cuối thế kỷ 20 đến nay, nông nghiệp thế giới đã đạt được những thành tựu to lớn, sản lượng và năng suất cây trồng không ngừng ổn định và ngày một nâng cao. Tuy vậy, do những tác động của sự thay đổi khí hậu sự biến động của dịch hại đã dẫn đến những thiệt hại đáng kể về năng suất và phẩm chất cây trồng ở nhiều vùng trên thế giới. Theo tài liệu của Tổ chức Lương - Nông Liên hợp quốc (FAO), thiệt hại về bệnh cây trong những năm 90 thế kỷ 20 ước tính 11,6%. Trong đó, bệnh hại do nấm có tới hàng chục ngàn loài, hơn 1000 loài virus, 600 loài vi khuẩn,… tuyến trùng và rất nhiều bệnh hại khác do viroide và phytoplasma, protozoa gây ra. - Trận dịch bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans gây ra ở Aixơlen năm 1845 - 1847 làm 1 triệu người chết và hơn 2 triệu người phải di cư đi nơi khác. - Trận dịch bệnh rỉ sắt cà phê ở Sri Lanca đã gây thiệt hại hơn 150 triệu Franc Pháp gây mất mùa đói kém. - Những trận dịch do bệnh Greening và Tristeza gây ra hiện tượng tàn lụi cây cam ở nhiều vùng thuộc Bắc Phi, Trung Mỹ và Đông Nam Á. Ở Việt Nam (1955 – 1956) bệnh đạo ôn gây hại trên 2000 ngàn mẫu Bắc bộ tại Hà Đông (cũ). Bệnh lúa von đã phá hại đến hàng trăm mẫu Bắc bộ ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng. Bệnh lúa vàng lụi xuất hiện từ 1910 ở Yên Châu, Tây Bắc tới những năm 40 - 50; bệnh xuất hiện cả ở đồng bằng Bắc bộ nhưng tập trung phá hoại nặng nhất từ 1963 - 1965 trên diện tích rộng hàng trăm ngàn ha ở đồng bằng Bắc bộ. Chỉ tính riêng các tỉnh Thanh Hoá, Thái Bình, Nam Định, Hà Đông và Hà Nam trong năm 1964 đã có 57.500 ha lúa bị bệnh vàng lụi tàn phá hoàn toàn và hàng trăm ngàn ha bị nhiễm bệnh. Bệnh đạo ôn phá hại thường xuyên ở vùng đồng bằng Bắc bộ, Bắc và Nam trung bộ, miền Nam. Từ năm 1981 đến năm 1986 đã thường xuyên phá hại trên 10.000 ha, có lúc tới 160.000 ha bị nhiễm đạo ôn (1985) với mức thiệt hại nặng, nhẹ khác nhau. Cây khoai tây, cà chua, ớt, cây cam, chanh bị virus, cây hồ tiêu, cà phê, thuốc lá bị tuyến trùng. Các cây họ cà bị héo xanh vi khuẩn và vô số bệnh hại rau, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây làm thuốc, hoa cây cảnh gây thiệt hại to lớn. Bệnh cây làm giảm năng suất cây trồng: do cây bị chết, do một bộ phận thân, cành lá, củ, quả bị huỷ hoại. Cây bị bệnh sinh trưởng kém, còi cọc... Bệnh làm giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và cất trữ: giảm giá trị dinh dưỡng, mất hương vị khi chế biến, giảm độ bền... Bệnh làm giảm giá trị thẩm mỹ của hàng hoá. Bệnh làm giảm sức sống hoặc gây chết hom giống, mắt ghép, gốc ghép, cành ghép, các sản phẩm nuôi cấy mô tế bào...., trong nhân giống vô tính và giảm sức nảy mầm gây chết cây con khi bệnh nhiễm trên hạt giống. Vi sinh vật trong khi gây bệnh cây còn tiết ra những chất độc ảnh hưởng trực tiếp đến cây bị bệnh, gây độc cho người và gia súc. Nấm mốc vàng (Aspergillus flavus) hại lạc, đậu tương, hạt sen… tiết ra Aflatoxin gây ung thư gan ở người và động vật. Nấm gây bệnh than đen ở lúa mì tiết ra độc tố gây độc cho người và gia súc. Nấm gây bệnh mốc hồng ngô Fusarium cũng tiết ra độc tố ở liều cao có thể gây tử vong cho người. Nấm gây bệnh đốm vòng trên xu hào, bắp cải Alternaria brassicae tiết ra độc tố Alternarin. Bệnh cây còn gây ô nhiễm đất trồng trọt, vi sinh vật gây bệnh nằm trong tàn dư rơi xuống đất và tuyến trùng trong đất đã làm đất trở thành một nơi nhiễm bệnh rất nguy hiểm cho vụ trồng trọt sau. Hóa chất phòng trừ bệnh tích tụ lại trong đất ức chế vi sinh vật có ích, làm ô nhiễm môi trường... 1.1.3 Đối tượng nghiên cứu của khoa học bệnh cây. Khoa học bệnh cây là môn khoa học nghiên cứu về các cây bị bệnh. Trong đó, ký sinh gây bệnh và môi trường luôn là những điều kiện sinh thái quan trọng để vi sinh vật gây bệnh có thể phát triển thuận lợi hoặc bị ức chế không phát triển và gây hại. Đồng thời, tính độc cao hay thấp của vi sinh vật gây bệnh đã ảnh hưởng rõ đến mức độ nhiễm bệnh của cây. Chính vì vậy, đối tượng nghiên cứu cụ thể của môn bệnh cây là bản chất nguyên nhân gây ra bệnh cây, các ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của bệnh, các biện pháp phòng trừ có hiệu quả kinh tế nhất và bảo vệ môi trường. Chi tiết của các nội dung trên bao gồm: - Các đặc điểm triệu chứng và quá trình bệnh lý. - Đặc điểm, nguyên nhân gây bệnh và phương pháp chẩn đoán xác định bệnh. - Tác hại, tính phổ biến, tính quy luật phát sinh theo các vùng sinh thái. - Nghiên cứu tính miễn dịch, kháng bệnh, chịu bệnh và bản chất các hiện tượng này để ứng dụng trong nghiên cứu tạo giống kháng bệnh. - Đưa ra các biện pháp phòng trừ hiệu quả, kinh tế nhất và bảo vệ môi trường. 1.1.4. Những biến đổi của cây sau khi bị bệnh. Những biến đổi về cường độ quang hợp. - Cây bị bệnh nói chung cường độ quang hợp đều giảm. Quá trình quang hợp giảm là do diện tích lá của cây giảm sút rõ rệt hoặc do lá bị biến vàng, hàm lượng diệp lục. Nhiều cây bị bệnh lá rụng hoặc cây thấp lùn, lá nhỏ, lá biến dạng xoăn cuốn, cây còi cọc ít lá... Những biến đổi về cường độ hô hấp. - Sự thay đổi cường độ hô hấp của cây bệnh chủ yếu phụ thuộc vào đặc tính của ký sinh vật gây bệnh. - Đa số các trường hợp cường độ hô hấp tăng cao ở giai đoạn đầu nhiễm bệnh rồi sau đó giảm sút dần hoặc giảm đi nhanh chóng. - Khi cường độ hô hấp tăng chính là lúc các men oxy hóa tăng hoạt tính đột ngột (men catalase, peroxydase, polyphenoloxydase...). Quá trình này đã tạo các sản phẩm oxy hoá như quinon. Quinon tăng nồng độ đột ngột có thể gây chết mô cây do các sản phẩm này ức chế hoạt động của các men khử (dehydrase) nhất là ở các giống có tính kháng cao. Hiện tượng biến đổi này là do sự hoạt động của cây khi có các ký sinh gây bệnh tấn công và được coi như phản ứng tự vệ tích cực của cây chống bệnh. Phá hủy quá trình trao đổi chất. - Khi bị bệnh quá trình trao đổi chất có những thay đổi khác nhau. - Tuy nhiên, quy luật chung là đạm tổng số và gluxit tổng số giảm đi do quá trình phân hủy mạnh hơn. Tỷ số các dạng protein/phi protein giảm xuống. Protein của cây bị men protease của ký sinh phân hủy tạo ra một lượng lớn axit amin tự do, nhiều axit amin tự do lại phân giải và cuối cùng tạo thành NH3, cây bị mất một lượng đạm lớn. - Đường đa cũng thay đổi, các dạng đường đa phân giải thành dạng đường đơn. Các dạng gluxit dự trữ phân giải làm thay đổi số lượng và chất lượng của gluxit trong mô cây bệnh (như trường hợp bệnh mốc sương khoai tây, bệnh virus thực vật). - Ở các cây bị bệnh hiện tượng vận chuyển, phân bố, điều hòa các chất đạm, gluxit bị phá vỡ. Sự biến đổi chế độ nước. - Nước là môi trường quan trọng để thực hiện các cơ chế của sự sống trong cơ thể. Nước quyết định sự hoạt động của men và các phản ứng của sự sống nhưng cây bị bệnh luôn luôn xảy ra tình trạng mất nước. - Cường độ thoát hơi nước tăng mạnh làm cây mất nước. Sở dĩ xảy ra hiện tượng này là do ký sinh đã phá hủy hệ rễ và mạch dẫn nước ở cây. Một số ký sinh phá vỡ thân cây làm chảy nhựa và nước từ các bó mạch ra ngoài (hiện tượng xì mủ cao su). Ký sinh có thể tác động tới độ thẩm thấu của màng tế bào, phá vỡ mô bảo vệ bề mặt lá, cành,... làm tê liệt khả năng đóng mở của khí khổng và thủy khổng. - Ký sinh gây hại ở bó mạch thường tạo các khối u làm tắc bó mạch (bệnh sùi cành chè). Bệnh có thể gây héo vàng (các loại nấm Fusarium) hay gây héo xanh (vi khuẩn Ralstonia solanacearum). Biến đổi cấu tạo của tế bào. - Khi nhiễm bệnh, độ thẩm thấu của màng nguyên sinh thay đổi, phá vỡ tính bán thẩm thấu của màng tế bào, phá hủy áp lực thẩm thấu và tính trương của tế bào. - Độ keo nhớt của chất nguyên sinh giảm. Thay đổi về số lượng và độ lớn của lạp thể, ty thể, nhân tế bào... và nhiều thành phần khác của tế bào. Những biến đổi trên đây dẫn đến sự thay đổi hình thái tế bào và mô thực vật: Đó là sự sưng tế bào, tăng kích thước tế bào bất bình thường (như bệnh phồng lá chè) tạo khối u so tế bào sinh sản quá độ (như bệnh sưng rễ bắp cải, sùi cành chè) gây chết mô và đám chết trên như các bệnh hại lá, thân, cành, củ quả. - Những tác hại về sự hao hụt một lượng lớn các chất dinh dưỡng của cây bị bệnh, phá vỡ hoạt động sinh lý bình thường. 1.1.5 Các triệu chứng do bệnh cây gây nên. Triệu chứng bệnh là sự biến đổi mô bệnh biểu hiện ra bên ngoài mà ta có thể quan sát, nhận biết được. Số lượng bệnh cây rất nhiều, tùy theo tính chất khác nhau của các loại bệnh (bệnh toàn bộ hoặc bệnh cục bộ) mà triệu chứng thể hiện ra rất khác nhau, nhưng có thể phân chia thành các nhóm loại hình triệu chứng cơ bản thường gặp như sau: • Vết đốm: Hiện tượng chết từng đám mô thực vật, tạo ra các vết bệnh cục bộ, hình dạng to, nhỏ, tròn, bầu dục, hoặc bất định hình, màu sắc vết bệnh khác nhau (đen, trắng, nâu, đỏ,...) gọi chung là bệnh đốm lá, quả. • Thối hỏng: Hiện tượng mô tế bào (củ, rễ, quả, thân chứa nhiều nước và chất dự trữ), mảnh gian bào bị phân huỷ, cấu trúc mô bị phá vỡ trở thành một khối mềm nhão, khô teo, có màu sắc khác nhau (đen, nâu sẫm, xám trắng...), có mùi. • Chảy gôm (nhựa): Hiện tượng chảy nhựa ở gốc, thân, cành cây, các tế bào hoá gỗ do bệnh phá hoại (bệnh chảy gôm cam, chanh). • Héo rũ: Hiện tượng cây héo chết, cành lá héo xanh, vàng, rũ xuống. Các bó mạch dẫn có thể bị phá huỷ, thâm đen hoặc rễ bị thối chết dẫn đến tình trạng thiếu hụt nước, tế bào mất sức trương. • Biến màu: Bộ phận cây bị bệnh mất màu xanh do sự phá huỷ cấu tạo và chức năng của diệp lục, hàm lượng diệp lục giảm, gây ra hiện tượng biến màu lá với nhiều hình thức: loang lổ (bệnh khảm lá), vàng lá, bạch tạng (trắng lợt)… • Biến dạng: Bộ phận cây bệnh dị hình: Lá xoăn, nhăn dúm, cuốn lá, cong queo, lùn thấp, cao vống, búi cành (chổi thần), chun ngọn... • U sưng: Khối lượng tế bào tăng lên quá độ, sinh sản tế bào rối loạn tạo ra các u sưng trên các bộ phận bị bệnh (rễ, cành, củ) như bệnh tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne sp.), bệnh sưng rễ cải bắp (Plasmodiophora brassicae), bệnh u sưng cây lâu năm (như Agrobacterium tumefaciens). • Lở loét: Bộ phận bị bệnh (quả, thân, cành, gốc) nứt vỡ, loét, lõm như các bệnh loét cam, ghẻ sao khoai tây. • Lớp phấn, mốc: Trên bề mặt bộ phận bị bệnh (lá, quả...) bao phủ kín toàn bộ hoặc từng chòm một lớp sợi nấm và cơ quan sinh sản bào tử rất mỏng, xốp, mịn như lớp bột phấn màu trắng hoặc đen (bệnh phấn trắng, bệnh muội đen). • Ổ nấm: Vết bệnh là một ổ bào tử nấm nổi lên, lộ ra trên bề mặt lá do lớp biểu bì nứt vỡ. Loại triệu chứng này chỉ đặc trưng cho một số bệnh như các bệnh gỉ sắt hại cây, bệnh đốm vòng do nấm. • Mumi: quả, hạt, bông, cờ bị phá hủy toàn bộ, bên trong chứa đầy khối sợi nấm và bào tử như bột đen gọi là bệnh than đen (bệnh hoa cúc lúa, phấn đen ngô). Nấm thường gây ra các hiện tượng: vết đốm, thối hỏng, chảy gôm, héo rũ dạng héo vàng, u sưng, lở loét, lớp phấn mốc, ổ nấm, mumi. Vi khuẩn phổ biến gây ra các dạng: vết đốm, thổi hỏng, héo rũ dạng héo xanh u sưng, lở loét. Virus thường gây ra các dạng: biến màu, biến dạng, thỉnh thoảng có vết đốm. Phytoplasma, viroide, tuyến trùng thường gây ra biến màu, biến dạng, u sưng. Vì vậy, triệu chứng bệnh cây có thể dễ bị nhầm lẫn, vì vậy, khi chẩn đoán phải dùng nhiều phương pháp phối hợp với nhau mới xác định được nguyên nhân gây bệnh chính xác, đặc biệt là dùng phương pháp lây bệnh nhân tạo. 1.1.6 Tính kí sinh của vi sinh vật gây bệnh. Nhóm vi sinh vật ký sinh chuyên tính. - Ký sinh chuyên tính (ký sinh bắt buộc) là nhóm ký sinh chỉ có khả năng sử dụng chất hữu cơ sẵn có trong mô cây sống và đang phát triển. Chúng không sử dụng hay không phát triển trên các mô cây đã chết (tàn dư cây trồng). Nhóm vi sinh vật bán ký sinh (hoại sinh tự do có điều kiện). - Là các ký sinh vật chủ yếu sống trên các mô cây đang sống (thường ở bộ phận lá bánh tẻ, lá già), sinh trưởng và sinh sản vô tính (nấm), nhưng trong điều kiện nhất định nào đó có thể sinh sản hữu tính hoặc khi không có cây ký chủ trên đồng ruộng thì vẫn có khả năng sống và tồn tại trên tàn dư cây trồng, trên các mô cắt rời hoặc một số bộ phận cây đã chết hẳn. Nhóm vi sinh vật bán hoại sinh (ký sinh tự do có điều kiện). - Nhóm này gồm các vi sinh vật gây bệnh trên các phần của cây đã già, suy yếu như trên lá già, gốc thân, củ hay cây con suy yếu, chúng có thể tồn tại trên các mô đã chết, trên tàn dư cây trồng trong đất, trên hạt, quả, củ... Các nấm này còn có khả năng gây hại cả trong bảo quản nông sản ở các kho thô sơ trong nhiệt độ bình thường. Nhóm vi sinh vật hoại sinh. - Nhóm này gồm các vi sinh vật chỉ sống trên các vật chất hữu cơ ở mô cây đã chết, trên các tàn dư cây trồng, trong đất và nước,... Nhóm vi sinh vật này không có khả năng sống ký sinh trên các cây đang sống, kể cả các mô cây đã suy yếu. - Nhóm sinh vật hoại sinh này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phân huỷ chất hữu cơ giải phóng CO2. Chúng giúp phân huỷ chất hữu cơ và tạo mùn cho đất, trong số đó có rất nhiều loài vi sinh vật đối kháng sống ở đất đã được sử dụng để thực hiện biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Trước đây, nhóm này được coi như hoàn toàn không gây hại cho cây trồng, nhưng ngày nay một số vi khuẩn và nấm hoại sinh cũng có thể phá hại trong kho như nấm mốc Mucor, Penicillium và một số loài vi khuẩn. - Sự phân chia bốn mức độ của 4 nhóm vi sinh vật ký sinh chỉ mang tính tương đối, khi điều kiện sinh thái môi trường thay đổi có thể một vi sinh vật ở nhóm này sẽ mang đặc tính của một nhóm khác và sự phân chia 4 nhóm trên chỉ là 4 nhóm chủ yếu mà thôi. 1.1.7 Chẩn đoán bệnh cây. Tùy từng điều kiện và tính chất của bệnh người ta thường sử dụng các phương pháp sau: Phương pháp chẩn đoán dựa theo triệu chứng bên ngoài. - Triệu chứng bệnh biểu hiện ra bên ngoài phản ánh những đặc điểm riêng biệt của một loại bênh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Phương pháp này chủ yếu dựa vào các dấu hiệu đặc của bệnh đã biểu hiện ra bên ngoài. Phương pháp kiểm tra vi sinh vật trên cây bệnh. - Các phương pháp cần thiết phải đảm bảo điều kiện vệ sinh, điều kiện phát triển trong môi trường nhân tạo… Nếu nấm bệnh đã hình thành bào tử, thì chỉ cần quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi, hoặc sử dụng phương pháp “phòng ẩm” trong dĩa Petri sau đó nhuộm màu và quan sát. - Đối với virus, không thể dùng các phương pháp nêu trên mà phải làm tiêu bản, và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn. Phương pháp sinh học. - Phân ly cô lập mô bệnh trong môi trường thích hợp, sau đó kiểm tra bằng kính hiển vi. Nếu có nhiều loại vi sinh vật cùng xuất hiện, ta cần thực hiện lây bệnh nhân tạo để xác định vi sinh vật gây bệnh thực sự. Phương pháp huyết thanh. Kháng huyết thanh để chẩn đoán bệnh hại đã được thử nghiệm dựa trên hiện tượng khi có một chất lạ (kháng nguyên) vào cơ thể, cơ thể sẽ có khả năng kháng lại bằng cách tạo đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể. Lúc đầu, phương pháp này sử dụng cho bệnh do virus nhưng nay phổ biến cả trong chẩn đoán vi khuẩn và một số bệnh khác. Các phương pháp khác. - Phương pháp huỳnh quang. - Phương pháp đo độ nhớt của dịch cây. - Phương pháp sinh học phân tử hiện đại. 1.1.8 Nhóm các biện pháp phòng trừ bệnh cây. Toàn bộ các biện pháp phòng trừ bệnh cây có thể được phân chia thành các nhóm sau đây: - Sử dụng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh. - Biện pháp canh tác. - Biện pháp sinh học. - Biện pháp lý học, cơ học. - Biện pháp kiểm dịch thực vật. - Biện pháp hóa học. 1.2 Cải xanh (Brassica juncea). Đây là lọai cải không cuộn, dùng ăn lá. Các loại rau cải thường được sử dụng bằng cách: xào, nấu canh, ăn sống… Về mặt y học, các loại rau cải có tác dụng rõ rệt nhất là lợi tiểu, tiêu phù. Hạt cải có vị hơi cay, dùng làm thuốc trị đờm tích tụ, chữa đau nhứt do trúng gió, trừ mụn nhọt, xưng tấy,… Ở nước ta rau cải được trồng ở tất cả các miền và gần như quanh năm. 1.2.1 Đặc điểm thực vật. Các loài rau cải thuộc loại hoa thập tự, loại cây thân thảo, sống từ 1 – 2 năm, cao trung bình từ 30 – 70cm tùy theo từng loại giống. Lá đơn, phiến lá rộng, bóng loáng, có cuốn ngắn, tròn hoặc dẹt. Mép lá hơi nhăn. Hoa vàng tươi, có 4 cánh xếp hình chữ thập (thuộc loại hoa thập tự). Quả nhỏ, dài, có mỏ ngắn, bênh trong chứ nhiều hạt nhỏ, tròn, màu đen. Cải xanh cao vừa phải, cuốn lá ngắn và có dạng bẹ nhỏ, lá xanh mềm, vị đắng nhẹ. Thường ăn luộc, xào, nấu canh, ăn sống, ít làm dưa muối. Cải xanh có nhiều giống địa phương như: cải xanh Thanh Hóa, Vĩnh Tuy… và một số giống nhập nội khác. 1.2.2 Điều kiện sống. Thời vụ gieo trồng. Các loài rau cải có các điều kiện sống tương tự nhau. Thích hợp khí hậu ôn hòa, mát mẻ. Phạm vi nhiệt độ thích hợp từ 12 – 250C. Rể ăn nông, có bộ lá lớn nên chịu hạn kém. Rất mẫn cảm với các loại phân hóa học, cây thường lưu giữ các hóa chất và vi sinh vật tương đối lâu và nhiều. Hàm lượng nitrat ở các loại cải thường cao vượt ngưỡng nếu không tuân thủ quy trình bón thúc. Thời gian sinh trưởng ngắn. Cải xanh thường thu hoạch sau khi gieo 30- 40 ngày, nếu là rau ăn sống thì thu hoạch sau 15 - 20 ngày. Cải xanh có thể trồng quanh năm, nhưng cây phát triển tốt nhất và cho năng suất cao nhất và phẩm chất cao nhất là vào vụ đông-xuân. Có thể gieo vụ xuân-hè (từ tháng 2 – 6) gọi là vụ cải chiêm. Vào thời điểm này, do nhiệt độ cao, cây mau già nên thường gieo thẳng và thu hoạch sau 30 – 40 ngày. 1.2.3 Gieo trồng và chăm sóc. Hạt trước khi gieo nên ngâm trong nước ấm 450C trong 30 phút để loại bỏ hạt lép, hạt hư, như thế hạt sẽ nảy mầm nhanh và đều. Để phòng trừ sâu bệnh có thể trộn thêm các loại thuốc hóa học với nồng độ và liều lượng tùy theo từng loại thuốc. Cải xanh có thể trồng bằng cây con hoặc gieo vãi. Nếu trồng bằng cây con thì khoảng cách gieo trồng là 15x20cm. Gieo vãi với lượng hạt khoảng 40 -50g/100m2. Chăm sóc, tưới nước và phòng trừ sâu bệnh thường xuyên. Khi cây con được 2 – 3 lá (18 – 20 ngày) thì nhổ ra trồng. Trước khi nhổ cần tưới ướt đất bằng DAP pha loãng 3g/l nước. Nên trồng cây con vào buổi chiều, trồng xong cần tưới nước ngay, có thể dùng rơm rạ phủ lên. Cần tưới nước và giữ cho đất luôn ẩm trong 5 – 7 ngày đầu, sau đó chỉ nên tưới nước khi đất đã khô. Khi tưới tránh làm giập nát lá và cây con. Với cải xanh, mỗi ha cần bón: phân chuồng hoai mục 15-18 tấn; đạm urê 60-80kg; kali 25kg; lân supe 85-90kg. Phân chuồng, lân và 1/3 số đạm, kali dùng để bón lót, phần còn lại bón thúc 2 lần, lần cuối cùng trước lúc thu hoạch 10 ngày. Ngưng tưới phân thúc trước khi thu hoạch cây cải ít nhất 7 ngày. Trước khi bón phân cần kết hợp xới đất, vun gốc, làm cỏ. 1.2.4 Tình hình sản xuất rau trong nước và thế giới. Trong đề án phát triển về rau, quả và hoa, cây cảnh giai đoạn 1999 – 2010 của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đuợc thủ tướng chính phủ phê duyệt ngày 3/9/1999 có xác định mục tiêu cho ngành trồng rau nước ta: “Phải đáp ứng nhu cầu rau có chất lượng cao cho tiêu dùng trong nước nhất là khu vực tập trung dân cư (đô thị, khu công nghiệp,…) và xuất khẩu, phấn đấu đến năm 2010 phải đạt mức tiêu thụ đầu người là 85kg/năm, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 690 triệu USD. Tại 21 tỉnh miền Đông và Tây Nam bộ, diện tích trồng rau ngày càng tăng. Riêng ở Tp.HCM có 526 nhà luới, với diện tích là 85.8 ha, tập trung chủ yếu ở các xã Tân Phú Trung huyện Củ Chi, xã Xuân Thới Thượng, Tân Thới Nhì huyện Hóc Môn… đã cho hiệu quả sản xuất cao, sản phẩm an toàn (Dương Văn Chín 2007). Trên thế giới, theo thống kê của FAO dự báo từ năm 2001 – 2010 nhu cầu tiêu thụ các loại rau tiếp tục tăng đều, dự báo tăng 3.6% trong khi mức tăng sản lượng rau chỉ đạt 2.8%. 1.2.5 Giá trị dinh dưỡng của rau cải. Rau là loại thực phẩm rất cần thiết trong đời sống hằng ngày và không thể thay thế, vì có vị trí quan trọng với sức khỏe của con người. Rau cung cấp cho cơ thể những chất quan trọng như: protein, vitamin, khoáng chất, chất xơ,… Các vitamin trong rau cải có tác dụng quan trọng với quá trình phát triển của cơ thể. Các chất khoáng cũng rất cần cho xương, răng, máu,… có tác dụng điều hòa, cân bằng, tăng khả năng đồng hóa protein. Trong rau có nhiều Cellulose tuy không có giá trị về dinh dưỡng nhưng lại có tác dụng làm tăng khả năng tiêu hóa của cơ thể. 1.2.6 Một số bệnh do nấm trên cây cải. Nhiệt độ, độ ẩm, và pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng, phát triển và bảo tồn của nấm. Nhiệt độ thích hợp nhất là 25 – 280C, pH thích hợp là 6 – 6.5, nhiết độ thấp nhất là 5 – 100C, cao nhất là 350C,. Điều kiện lạnh khô thích hợp cho nấm hơn là điều kiện nóng ẩm. Nấm gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài kể cả trong điều kiện không có cây ký chủ. Chúng bảo tồn bằng các sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử trứng và những bào tử có vách dày ở trong giá thể và trên tàn dư cây trồng. Nấm đất xâm nhiễm, gây hại cây trồng, làm cho rễ và các tế bào mạch dẫn của cây không còn khả năng hút nước và chất dinh dưỡng từ giá thể. Vì vậy, các triệu chứng của bệnh do nấm gây ra thường rất giống nhau, đều gây héo vàng, còi cọc và chết cây. - Thối rễ: do nấm: Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Cylindrocladium, Armillaria và nhiều loại khác. Bệnh gây thối toàn bộ hệ thống rễ hoặc có loài gây hại các rễ chính… Triệu chứng biểu hiện trên mặt đất là các hiện tượng héo, lá chết và rụng xuống, gây chết các nhánh và cành cây, khi bị bệnh nặng gây chết toàn cây. - Thối thân, lỡ cổ rễ, thối nhũn: do nấm: Phytophthora, Sclerotium, Rhizoctonia, Scleortinia, Fusarium, Aspegillus niger. Triệu chứng điển hình là gây thối phần gốc thân sát mặt đất. Khi gốc thối dẫn đến hiện tượng héo vàng, rụng lá và chết toàn cây. Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nóng ẩm. - Lỡ cổ rễ và chết rạp cây con: do nấm: Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp. Những nấm này có thể xâm nhiễm vào hạt và cây con trong suốt thời gian nảy mầm của cây. Điều kiện thích hợp cho hạt nảy mầm cũng là điều kiện thích hợp cho nấm phát triển và gây bệnh như nơi râm mát, khô hay giá thể ẩm, bề mặt đất mặt chặt là những điều kiện cho nấm gây hại nặng. - Thối nhũn: Do vi khuẩn: Erwinia carotovora, mô bệnh có mùi hôi khó chịu, phần lá ngoài của cây bị héo rũ, cụp xuống để lộ rõ bắp ra và dễ dàng bị gẫy và thối nhanh chóng. Trên mô bệnh và thân cây dính dịch vi khuẩn màu vàng xám. Bộ phận mô cứng như rễ và thân già cũng có thể bị phá hoại. 1.3 AXIT GLUTAMIC. 1.3.1 Axit glutamic. Axit glutamic là một amino axit dùng để tổng hợp Protein. Glutamate là chất truyền thần kinh có tác dụng kích thích trong hệ thần kinh trung ương. - Công thức hóa học C5H9NO4. - Khối lượng phân tử: 147. - Công thức hóa học. Hình 1.1: Công thức hóa học của Axit glutamic. - Không màu, tinh thể màu trắng. - Tan hoàn toàn trong nước, không tan trong Ethanol hay Ether. Axit glutamic và α-ketoglutarate – chất trung gian trong chu trình Krebs - có thể đổi lẫn nhau được bởi sự chuyển hóa amin. Do đó, axit glutamic có thể tham gia quá trình trao đổi năng lượng của chu trình Krebs và được chuyển đổi thành glutamin bởi enzyme glutamin synthetase. Axit glutamic cũng dễ dàng được chuyển đổi thành Prolin (1 loại stress maker xuất hiện khi có tác nhân bên ngoài xâm nhập vào, nó thể hiện tình trạng trầm trọng). Hình 1.2 : Sự chuyển hóa Axit glutamic thành Prolin. 1.3.2 Natri Glutamat. Natri Glutamate là chất bột màu trắng, tan trong nước và rượu. - Công thức hóa học: COOH(CH2)2CH(NH2)COONa; C5H8NNaO4 - Khối lượng phân tử: 169.11109 g/mol. - Công thức cấu tạo: Hình 1.3 : Công thức cấu tạo của Natri Glutamat. 1.3.3 Kali Glutamat. Kali Glutamat là chất bột màu trắng, phân tử có ngậm nước, tan trong nước. - Công thức hóa học: KOOC(CH2)2CH(NH2)COOH.H2O; C5H8KNO4. - Khối lượng phân tử: 185.21962 g/mol. Hinh 1.4 : Công thức cấu tạo của Kali Glutamat. 1.3.4 Mg Glutamat. - Công thức hóa học: C5H7MgNO4. - Khối lượng phân tử: 169.41838 g/mol. - Công thức cấu tạo: Hình 1.5: Công thức cấu tạo của Mg Glutamat. 1.4 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NẤM GÂY BỆNH Ở CÂY. 1.4.1 Đặc điểm chung. Nấm có nhiều chức năng sinh học hiện nay còn chưa biết hết. Nấm có hơn 20 vạn loài đã được ghi nhận, sống ở khắp mọi nơi trên trái đất; trong đó có trên 10 vạn loài nấm hoại sinh, hàng trăm loài nấm sống ký sinh trên động vật và cơ thể con người. Hơn 1 vạn loài nấm gây bệnh hại thực vật và trên 80% số bệnh hại cây trồng là do nấm gây ra với thành phần loài rất phong phú, đa dạng. Đặc điểm chung của nấm gây bệnh cây là tế bào có nhân thực, cơ quan sinh sản có cấu tạo dạng sợi, sinh sản bằng bào tử, sống dị dưỡng, không chứa diệp lục. 1.4.2 Hình thái và cấu tạo sợi nấm. Sợi nấm là cơ quan sinh trưởng dinh dưỡng, cơ quan bán giữ, bảo tồn từ đó sinh ra các cơ quan sinh sản riêng biệt. Sợi nấm có thể đơn bào (không màng ngăn), hoặc đa bào (nhiều màng ngăn), có thể phân nhiều nhánh. Chiều rộng của sợi nấm khoảng 0,5 – 100 μm (nấm gây bệnh cây thường có kích thước chiều rộng từ 5 – 20 μm). Chiều dài sợi nấm thay đổi tuỳ thuộc từng loại nấm và điều kiện dinh dưỡng. Cấu tạo tế bào sợi nấm gồm 3 phần chính: vách tế bào, tế bào chất và nhân. - Vách tế bào cấu tạo chủ yếu là các Polysaccharid, Kitin và Cellulose. Thành phần hoá học của vách tế bào biến đổi tuỳ thuộc vào loại nấm, nhiệt độ, pH môi trường và tuổi của tế bào… - Tế bào chất bao gồm: màng, tế bào chất, Riboxom, hệ thống ti thể và các chất dự trữ. Màng tế bào chất có tính thẩm thấu chọn lọc (tính bán thấm) cho các chất cần thiết đi qua. Riboxom là trung tâm tổng hợp Protein của tế bào. Các chất dự trữ đơn giản trong tế bào chủ yếu ở dạng Ipitglucogen và Valutin. Ngoài ra ở tế bào non còn có nhiều không bào trong tế bào chất. Tế bào nấm có hệ thống men rất phong phú và sắc tố ở các nhóm khác nhau. Trong tế bào sợi nấm có khoảng 90% là nước, 10% chất khô bao gồm các hợp chất Cacbon, Nitơ, chất khoáng, và nguyên tố vi lượng… Sợi nấm sinh trưởng theo kiểu tia xạ, vươn dài ra từ đỉnh sinh trưởng của sợi. 1.4.3 Những dạng biến thái của sợi nấm. Bình thường sợi nấm làm nhiệm vụ dinh dưỡng sinh trưởng, nhưng trong những trường hợp đặc biệt, gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi (nhiệt độ quá cao, quá thấp, khô hạn, thiếu dinh dưỡng…), sợi nấm có thể thay đổi hình thái cấu tạo biến thành cấu trúc đặc biệt làm tăng khả năng chống chịu, bảo tồn sợi nấm lâu dài hơn. Nấm thường có các dạng biến thái chính như sau: - Bó sợi (Rhizomorph): là hình thức biến thái đơn giản, bó sợi gồm nhiều sợi nấm xếp sít song song tạo ra những bó sợi to nhỏ khác nhau, bên ngoài gồm những tế bào có màu tương đối thẫm vỏ dày. Ví dụ: Nấm mạng nhện hại cà phê. - Hạch nấm: là hình thức biến thái phức tạp, nhiều sợi nấm đan kết chặt chẽ, chằng chịt với nhau tạo thành những khối rắn chắc có kích thước, hình dạng khác nhau, có khi nhỏ li ti như hạt cải, có loại hình bầu dục, hình cựa gà. - Biến thành dạng rễ giả: sợi nấm biến đổi thành dạng hình rễ cây chỉ làm chức năng bám giữ trên bề mặt vật chủ. - Vòi hút: ở một số loài nấm ký sinh chuyên tính, hệ sợi nằm trên bề mặt tế bào hoặc phát triển trong gian bào có thể hình thành vòi hút xuyên qua màng tế bào ký chủ đi vào nguyên sinh chất để hút các chất dinh dưỡng trong tế bào. Vòi hút của nấm thường có nhiều hình dạng khác nhau: hình dùi trống, hình trụ ngắn đâm nhánh giống chùm rễ, hình chiếc xẻng, hình bàn tay… (nấm phấn trắng - Erysiphe), (nấm sương mai - Peronospora), (nấm gỉ sắt - Puccinia). 1.4.4 Dinh dưỡng và trao đổi chất ở nấm. Trao đổi chất là cơ sở của sự sống và sự phát triển của nấm. Sợi nấm là cơ quan sinh trưởng, dinh dưỡng, chúng tiết ra các enzyme, để phân giải nguồn hợp chất hữu cơ phức tạp ở bên ngoài thành hợp chất đơn giản dễ hoà tan, nhờ tính bán thấm chọn lọc của màng tế bào chất chúng hấp thụ các chất dinh dưỡng có sẵn vào cơ thể. Ngoại enzyme được nấm tiết ra môi trường để phân giải các hợp chất phức tạp thành các chất đơn giản dễ hấp thụ. Đó là các men thủy phân (Cutinase, Cellulase, Pectinase, Amylase,…). Nội enzyme dùng để tổng hợp các chất đã hấp thụ được thành những hợp chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và sinh sản của nấm, chủ yếu là các enzyme oxy hoá khử (oxydase, dehydrase…). Trong quá trình sinh trưởng, tế bào nấm cần hấp thụ nhiều nguyên tố khoáng (17 nguyên tố) như: C, N, O, S, H, P. Mg, Cu, Fe, Zn, Mn, Ca… các nguyên tố vi lượng như Bo, Mo,… và một số Vitamin (B1, B6…). trong đó các nguồn dinh dưỡng chủ yếu là Cacbon (Gluxit), nguồn đạm (axit amin) và những axit hữu cơ khác. - Nguồn cacbon: nấm cần nhiều hơn nguồn đạm và các chất khoáng, chủ yếu là các loại đường C6, C5, tinh bột, axit hữu cơ và axit béo. Đa số các loại nấm sử dụng tốt nhất đường glucose (C6). - Nguồn đạm: rất quan trọng song số lượng cần cho nấm ít hơn nguồn Cacbon. Một số loài nấm như: Helminthosporium, Colletotrichum và Rhizoctonia có khả năng khử đạm Nitrat thành NH3 à NO3 à NO2 à NH4OH à NH3 Một số nấm có thể tự tổng hợp Vitamin cần thiết cho cơ thể nếu không có trong môi trường. Ví dụ: nấm Pythium, nấm Aspergillus… Ngoài hệ thống enzyme, nhiều loại nấm còn sản sinh ra các độc tố, là những sản phẩm trao đổi chất của nấm có tác động làm tổn thương hoạt động sống của tế bào thực vật ở một nồng độ rất thấp. Căn cứ vào phổ tác động của độc tố nấm người ta thường phân thành 2 nhóm Pathotoxin và Vivotoxin. Độc tố của nấm có tác động kìm hãm hoạt động của hệ thống men tế bào ký chủ, kìm hãm hoạt động hô hấp của cây, phá vỡ tính thẩm thấu chọn lọc của màng tế bào chất, phá huỷ diệp lục và quá trình trao đổi chất của tế bào làm giảm khả năng đề kháng của cây. Về thành phần hoá học có thể phân chia độc tố của nấm hại cây thành các nhóm axit hữu cơ (axit oxalic, axit fusarinic, axit alternaric, axit pycolinic), nhóm polysaccarit (Licomarasmin, Colletotin, Piricularin), nhóm Protein và các sản phẩm phân giải của protein (NH3, Victorin) và nhóm các chất bay hơi (axit xianic). Một loài nấm có thể sản sinh nhiều độc tố ở các nhóm khác nhau. Ví dụ: nấm đạo ôn (Pyricularia oryzae) có hai loại độc tố là axit pycolinic và Pyricularin ở hai nhóm khác nhau. Nấm Fusarium sp. có các loại độc tố như axit fusarinic, fumonisin B1 và fumonisin B2, Licomarasmin. Ngoài độc tố, nấm còn sản sinh ra những hoạt chất sinh học khác như kháng sinh có khả năng đối kháng, ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật khác loài (ví dụ Penicillin là chất kháng sinh từ nấm Penicillium). Một số kháng sinh có hoạt tính đối kháng với các loài nấm gây bệnh cây. Ví dụ: Gliotoxin của nấm Trichoderma có thể tiêu diệt một số nấm gây bệnh cây như Fusarium, Sclerotium, Rhizoctonia… Dựa vào đặc tính đối kháng, và chất kháng sinh của nấm người ta tạo ra nhiều chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh hại cây trồng. Trong tế bào chất của cây còn có các loại sắc tố cũng là các sản phẩm trao đổi chất của nấm. Sắc tố nấm thường ở các nhóm: Anthraquinon, Naphtaquinon (Nấm túi, nấm bất toàn), Carotinoide (Nấm mốc, nấm rỉ sắt), Melanin (nấm đạm). Nhờ có sắc tố làm tản nấm có màu sắc khác nhau và biến đổi môi trường sống. Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm phụ thuộc vào đặc tính ký sinh của từng loài nấm và các yếu tố ngoại cảnh, chủ yếu là nhiệt độ, ẩm độ, pH môi trường… Nhiệt độ thích hợp cho hầu hết các loài nấm sinh trưởng khoảng 20 - 280C, pH thích hợp từ 6 – 6.5. 1.4.5 Sinh sản của nấm. Nấm sinh sản bằng nhiều phương pháp khác nhau và với tốc độ nhanh, số lượng nhiều. Sản phẩm hình thành trong quá trình sinh sản gọi là bào tử. Do có các hình thức sinh sản khác nhau nên bào tử cũng khác nhau về hình thức, màu sắc, kích thước và chất lượng. 1.4.5.1. Sinh sản từ cơ quan sinh trưởng. Ở hình thức sinh sản này, nấm không hình thành cơ quan sinh sản riêng biệt mà sợi nấm trực tiếp làm nhiệm vụ sinh sản. Hình thức sinh sản này thường cho các dạng bào tử sau: - Bào tử hậu (Chlamydospore): Khi bước vào giai đoạn sinh sản, một số tế bào trên sợi nấm được các tế bào bên cạnh dồn tế bào chất, sang trở thành tế bào có sức sống mạnh, chất dự trữ nhiều, màng dày lên, thay đổi hình dạng chút ít và trở thành bào tử hậu (nấm Fusarium spp.). Bào tử hậu có sức chịu đựng ở điều kiện khí hậu bất lợi trong thời gian dài, do vậy, một số loại nấm, bào tử hậu có thể là giai đoạn bắt buộc trong chu kỳ phát triển của nấm (hình 1.6). Hình 1.6 : Sinh sản từ cơ quan sinh trưởng. 1. Bào tử chồi; 2. Bào tử phấn; 3. Bào tử hậu - Bào tử phấn (Oidium): là những bào tử hình trứng hoặc hình bầu dục hình thành từ những tế bào sợi nấm tích lũy chất dự trữ, có màng ngăn riêng và đứt ra trở thành các bào tử phấn. - Bào tử chồi (Blastospore): bào tử này thường có ở các loại nấm men bia, rượu. Khi sinh sản, trên tế bào cũ mọc ra một hoặc nhiều chồi nhỏ, chồi lớn dần và tách thành bào từ chồi. - Bào tử khí (Arthrospore): Các bào tử khí hình thành từng chuỗi trên đầu các sợi nấm, mọc vươn cao lên và tung vào trong không khí khi chín. Dạng bào tử này thường gặp ở nấm phấn trắng. 1.4.5.2 Sinh sản vô tính. Đặc điểm của hình thức sinh sản này là các bào tử được sinh ra trên cơ quan sinh sản riêng biệt do sợi nấm sinh trưởng đến giai đoạn thuần thục hình thành nên. Tuỳ theo đặc điểm hình thành bào tử vô tính bên ngoài hoặc bên trong cơ quan sinh sản, mà phân biệt hai hình thức sinh sản vô tính nội sinh và ngoại sinh. - Sinh sản vô tính nội sinh: Khi nấm đã thuần thục bước vào sinh sản, tế bào trên đầu sợi nấm phình to hình thành cơ quan sinh sản có dạng cái bọc (sporang), khi thuần thục nhân của tế bào bọc và chất nguyên sinh phân chia nhiều lần để tạo thành các bào tử vô tính nội sinh gọi là bào tử bọc (không lông roi) hoặc bào tử động (có lông roi) Zoospore (hình 1.7). Khi chín bọc vỡ ra và bào tử được giải phóng ra ngoài. Hình 1.7 : Bọc và bọc bào tử động. 1 - 2: Bọc và bào tử bọc. 3 - 4: Bọc bào tử động và bào tử động - Sinh sản vô tính ngoại sinh: Ở các nấm bậc cao và một số nấm bậc thấp, sinh sản vô tính bằng hình thức ngoại sinh. Cơ quan sinh sản được hình thành trên sợi nấm thuần thục là cành bào tử phân sinh (Conidiophore) và tạo ra các bào tử phân sinh (Conidium) ở bên ngoài. Tùy loại nấm mà bào tử phân sinh có thể là đơn bào hay đa bào, có dạng hình trứng, hình lưỡi liềm, hình bầu dục, hình quả lê,… và màu sắc cũng khác nhau (màu nâu, vàng…) hoặc không có màu. Bào tử phân sinh có thể hình thành đơn độc từng chiếc hoặc từng chuỗi trên đầu cành bào tử phân sinh. Các loại nấm khác nhau các cành bào tử phân sinh cũng có cấu tạo và hình thái rất khác nhau, nó cũng có thể đơn bào, đa bào, phân nhánh hoặc không phân nhánh, có thể mọc riêng rẽ từng chiếc hoặc mọc thành từng cụm có cấu trúc đặc biệt khác nhau gồm 3 loại bó cành, đĩa cành và quả cành (hình 1.8). Các đặc điểm trên của bào tử phân sinh và cành bào tử phân sinh là một trong những chỉ tiêu để phân loại nấm. Hình 1.8 : Dạng cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh. 1. Cành bào tử phân sinh đâm nhánh và bào tử phân sinh (Phytophthora). 2. Cành bào tử phân sinh không đâm nhánh và bào tử phân sinh (Erysiphe). 3. Cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh (Macrosporium sp.). 4. Đĩa cành. 5. Quả cành. 1.4.5.3 Sinh sản hữu tính của nấm. Sinh sản hữu tính của nấm rất phức tạp, nó không giống các hình thức sinh sản hữu tính ở các sinh vật khác. Sinh sản hữu tính ở nấm là hiện tượng phối giao giữa các tế bào giao tử hoặc các bộ phận đặc biệt của nấm với nhau theo nhiều hình thức khác nhau, gồm đẳng giao và bất đẳng giao. - Sinh sản hữu tính đẳng giao: - Đẳng giao di động: Là hình thức sinh sản hữu tính đơn giản nhất (nấm cổ sinh), là quá trình giao phối giữa 2 giao tử (gamete) có hình dạng kích thước hoàn toàn giống nhau, là các bào tử động có lông roi di động được. Sau phối giao tạo thành hợp tử (zygote). - Đẳng giao bất động: Là hình thức sinh sản hữu tính phức tạp hơn, là quá trình tiếp hợp giữa tế bào 2 sợi nấm hoàn toàn giống nhau về hình dạng và kích thước. Ở giai đoạn thuần thục do sự tiếp xúc của 2 sợi nấm màng bào ở chỗ tiếp giáp dần dần tan ra tạo một tế bào chung hòa hợp tế bào chất và hai nhân với nhau, tế bào đó sẽ phình to, có dạng hình cầu, vỏ dày gọi là bào tử tiếp hợp (zygospore). Bào tử tiếp hợp có khả năng tồn tại lâu dài, gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm tạo thành bọc và bào tử bọc. - Sinh sản hữu tính bất đẳng giao: Là hình thức sinh sản hữu tính phức tạp hơn cả ở các nấm bậc cao và các nấm bậc thấp đã phát triển. Nấm sinh sản bằng các cơ quan sinh sản nhất định khác nhau cả về hình thái bên ngoài lẫn tính chất bên trong, các lớp nấm khác nhau có dạng bào tử hình thành có đặc điểm khác nhau. - Bào tử trứng (Oospore): Trên sợi nấm sinh ra các cơ quan sinh sản riêng biệt là bao cái (Oogonium) và bao đực (Antheridium). Sau khi phối giao toàn bộ nhân và chất tế bào của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinh và hình thành một bào tử trứng. - Bào tử túi (Ascospore): Đối với các nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes) cơ quan sinh sản là túi (Ascus) được hình thành trong quá trình phối hợp chất tế bào và nhân giữa bao đực và bao cái (ascogone). Sau giai đoạn chất phối và giai đoạn song hạch từ bao cái mọc ra sợi sinh túi phình to tạo thành túi (Ascus). Hình 1.9 : Sinh sản hữu tính của nấm và các loại quả thể của nấm túi. A. Nấm trứng: 1. Bao trứng (Oogonium); 2. Bao đực (Antheridium). 3. Phối giao (giao tử đực, giao tử cái); 4. Bào tử trứng. 5. Hình thành “Bào tử tiếp hợp”. B. Nấm túi: 6. Bao cái (Carpogonium) và bao đực (Antheridium). 7. Phối giao (giao tử đực, giao tử cái). 8. Sợi sinh túi và hình thành túi với tám bào tử túi. C. Quả thể: 9. Quả thể kín. 10. Quả thể bầu (quả thể mở). 11. Quả thể đĩa (a), (b). Trong khi nhân nhị bội tiến hành giảm phân (thường 3 lần) tạo thành bào tử hữu tính ở trong túi (bệnh phấn trắng bầu bí, bệnh lúa von) gọi là bào tử túi. Hình 1.10 : Quá trình hình thành đảm và bào tử đảm (Basidiospore). Các nấm thuộc lớp nấm Đảm khi sinh sản hữu tính hầu như không có cơ quan sinh sản riêng biệt mà cơ quan sinh sản là đảm (Basidium) được hình thành trên sợi nấm hai nhân. Đảm là một tế bào hai nhân, sau giai đoạn phối hạch thành nhân nhị bội thể rồi phân bào giảm nhiễm 1 đến 2 lần tạo ra 2 hoặc 4 nhân đơn bội thể hình thành 2 hoặc 4 bào tử hữu tính gọi là bào tử đảm (hình 1.10). Ngoài ra với một số nấm, đảm được hình thành trực tiếp từ trên bào tử hậu, bào tử đông (Teleutospore) (nấm than đen và nấm gỉ sắt). Ở nước ta mới chỉ thấy một số nấm sinh sản hữu tính, còn nói chung đa số sinh sản vô tính chiếm ưu thế tuyệt đối trong năm. Ở một số loại nấm, từ sợi nấm một nhân hoặc sợi nấm hai nhân có khả năng trực tiếp hình thành các loại bào tử hậu, bào tử xuân, bào tử hạ, bào tử đông. (vd: nấm gỉ sắt). Sinh sản vô tính sinh ra các cơ quan sinh sản vô tính và các bào tử vô tính với số lượng rất nhiều có thể lộ thiên, có thể được bảo vệ bao bọc trong các cấu trúc rất đặc biệt khác nhau tuỳ loại nấm gọi là “bó cành bào tử” (Coremium), “đĩa cành bào tử” (Acervulus) và “quả cành bào tử” (Pycnidium). Đây cũng là một trong những cơ sở để phân loại nấm. Sinh sản hữu tính của nấm túi hoặc nấm đảm cũng sinh ra các cấu trúc đặc biệt gọi là “quả thể” khác nhau như quả thể hình cầu (cleistocarp), quả thể hình bầu nậm là loại quả thể mở (có lỗ) (perithecium), quả thể đĩa (apotét) (Apothecium) đối với nấm túi hoặc quả nấm (nấm mũ) đối với nấm đảm. Căn cứ vào đặc tính chung về hình thái, sinh trưởng, sinh sản nói trên người ta phân loại toàn bộ các loại nấm thành những lớp nấm khác nhau để giám định chẩn đoán nấm bệnh. 1.4.6 Chu kỳ phát triển của nấm. Nấm không có diệp lục, sử dụng các chất hữu cơ sẵn có chủ yếu là các hợp chất nguồn cácbon, nguồn đạm, chất khoáng và vitamin của cây thông qua tác động của một hệ thống nội enzyme, ngoại enzyme và độc tố để hoàn thành chu kỳ phát triển của chúng trên cây trồng. Chu kỳ phát triển của nấm là một vòng đời bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát dục, sinh sản, tiến hành tuần tự kế tiếp nhau theo một trình tự nhất định để lắp lại giai đoạn ban đầu. Giai đoạn ban đầu của chu kỳ phát triển thường là bào tử (mầm bệnh). Sau khi nảy mầm xâm nhập tiến tới giai đoạn sinh trưởng thể dinh dưỡng (thể sợi) ký sinh phát ra triệu chứng bệnh rồi tới giai đoạn phát dục hình thành các cơ quan sinh sản và tạo ra các bào tử thế hệ mới vô tính để tái xâm nhiễm và hữu tính (bảo tồn). Tuy nhiên, do đặc điểm phát triển khác nhau và ảnh hưởng của các điều kiện địa lý sinh thái mà trong chu kỳ phát triển nhiều loại nấm không thấy xuất hiện giai đoạn hữu tính hoặc bỏ qua một giai đoạn phát triển nào đó gọi là chu kỳ phát triển không hoàn toàn. Chu kỳ phát triển của nấm có thể hoàn thành trên một loài cây ký chủ trong một vụ, một năm (nấm Sương mai) song có loại phải tiến hành trên cây ký chủ chính và trên ký chủ trung gian (bệnh nấm gỉ sắt lúa mì). 1.4.7 Xâm nhiễm và truyền lan của nấm. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của nấm vào cây trồng bao gồm các giai đoạn kế tiếp nhau như sau: - Giai đoạn tiếp xúc và xâm nhập của mầm bệnh (Bào tử nấm) - Giai đoạn tiềm dục của bệnh (giai đoạn ủ bệnh) - Giai đoạn phát triển bệnh Giai đoạn tiếp xúc - xâm nhập: Đây là giai đoạn đầu tiên kể từ khi mầm bệnh (bào tử nấm) tiếp xúc được trên bề mặt cây trồng. Trước tiên bào tử nấm tiến hành nẩy mầm khi có nhiệt độ và ẩm độ thích hợp. Khác với vi khuẩn, nấm có thể xâm nhập được vào các bộ phận của cây để thiết lập quan hệ ký sinh với cây ký chủ ngoài cách thụ động như qua các lỗ hở tự nhiên (thủy khổng, khí khổng hoặc các vết thương cơ giới,…) nấm còn có thể chủ động xâm nhập trực tiếp qua lớp chitin, và biểu bì của lá nhờ các men thủy phân. Trong nhiều trường hợp, để thực hiện xâm nhập dễ dàng nấm cần phải có số lượng mầm bệnh nhất định gọi là "lượng xâm nhiễm tối thiểu". Ở giai đoạn này, điều kiện ngoại cảnh có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nảy mầm của bào tử và sự xâm nhập của chúng vào cây trồng, độ ẩm có tác dụng quyết định. Ví dụ: nhiều loại bào tử nấm chỉ có thể nảy mầm trong điều kiện có giọt nước hoặc độ ẩm rất cao (nấm đạo ôn, nấm mốc sương cà chua, khoai tây… ), cá biệt có loài nấm chỉ cần độ ẩm thấp (nấm phấn trắng). Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ nảy mầm, tốc độ nảy mầm, và kiểu nảy mầm của bào tử nấm. Ví dụ: nấm Phytophthora infestans có tỷ lệ nảy mầm cao nhất ở 14 - 180C với kiểu nảy mầm gián tiếp hình thành bào tử động (Zoospore), còn ở nhiệt độ 20 - 220C bào tử nảy mầm trực tiếp thành ống mầm. Nhiều loài nấm ngoài ẩm, nhiệt độ còn cần điều kiện pH môi trường, oxi và ánh sáng thích hợp. Một số nấm ký sinh: rỉ sắt (Phakopsora, Puccinia), phấn trắng (Erysiphe) và nấm sương mai (Phytophthora) có thể nảy mầm xâm nhập trực tiếp qua lớp biểu bì còn nguyên vẹn của cây nhờ vũ khí cơ học (giác bám) và vũ khí hoá học (các enzyme thuỷ phân). Giai đoạn ủ bệnh (tiềm dục). Là thời gian từ sau giai đoạn nấm xâm nhập đến khi xuất hiện triệu chứng ban đầu của bệnh. Trong giai đoạn này nấm gây bệnh sinh trưởng phát triển tiềm tàng ở bên trong mô cây, gây ra những biến đổi sâu sắc và phá huỷ tế bào cây bệnh. Ngược lại cây trồng cũng có những phản ứng chống đối lại nhất là ở những giống cây có gen kháng bệnh. Các phản ứng tự vệ của cây có thể là thụ động, hoặc chủ động nhờ các đặc điểm cấu tạo hình thái, thành phần hoá học hoặc có những phản ứng siêu nhạy, phản ứng phản độc tố, phản men (enzyme) hoặc phản ứng phytoalexin dẫn đến thời kỳ tiềm dục của bệnh có thể ngắn hay dài, nhanh hay chậm cùng với sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh khác. Mối quan hệ ký sinh - ký chủ xảy ra rất phức tạp. Để ngăn chặn hoặc làm giảm khả năng xâm nhập của nấm các yếu tố cấu tạo hình thái như độ dày lớp biểu bì, lớp sáp trên bề mặt biểu bì, số lượng và kích thước khí khổng, độ mở khí khổng, lớp lông trên bề mặt, góc độ lá với thân cây... đều ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập qua bề mặt tế bào ký chủ của tất cả các loại nấm gây bệnh trên cây. Cơ chế bảo vệ của cây gồm nhiều phản ứng và những biến đổi của tế bào cây chủ như: thay đổi độ pH tế bào, sản sinh Phytoalexin và các chất hóa học độc có tác dụng kháng nấm như: Glycoankaloid, Tanin, Phenol, Hydroquinol, Anthocyanin… Các cơ chế bảo vệ chủ động của cây như phản ứng siêu nhạy, hiện tượng tự chết của mô tế bào nhằm bao vây, cô lập các loại nấm ký sinh chuyên tính, như hiện tượng tạo lớp bần, lớp vỏ bao, tầng rời… để cách biệt với nấm gây bệnh. Giai đoạn phát triển bệnh. Tiếp theo sau giai đoạn tiềm dục, kể từ khi xuất hiện rõ triệu chứng bên ngoài, bệnh tiếp tục phát triển cho đến khi kết thúc. Đây là thời gian kéo dài để nấm sinh sản hình thành các đợt bào tử mới, phát tán lây lan tạo tiền đề cho các đợt tái xâm nhiễm tiếp theo làm bệnh gia tăng, phát triển thành dịch trên đồng ruộng. Lây truyền của nấm. Trong tự nhiên, nấm lây truyền bằng nhiều hình thức khác nhau. Sự lây truyền của bào tử nấm có thể chủ động hay thụ động tùy thuộc vào đặc điểm sinh học của mỗi loại nấm và chịu ảnh hưởng lớn của các yếu tố môi trường. Lây truyền chủ động: (bào tử hữu tính từ quả thể đĩa, quả thể bầu tự phóng vào không khí). Lây truyền thụ động: Bào tử nấm lan truyền theo: - Mưa và nước tưới làm bắn bào tử tung tóe (bào tử nấm Colletotrichum) - Gió, bão thổi bào tử nấm đi xa (bào tử nấm phấn trắng, rỉ sắt) - Côn trùng mang truyền bào tử (ví dụ: Bọ cánh cứng Carpophilus spp) - Các yếu tố lan truyền khác (tàn dư, đất, hạt giống, cây giống, vật liệu làm giống, động vật và con người). 1.5 Rhizoctonia solani. 1.5.1 Vị trí phân loại. Vào 1858, Julius Kuhn đã phân lập được nấm Rhizoctonia solani trên rễ cây khoai tây và đã mô tả nó. Hệ thống phân loại: - Giới: Nấm thật.(fungi). - Ngành: Deuteromycotina (nấm bất toàn). - Lớp: Mycelia Sterilia (Agonomycetes): Nấm trơ. - Bộ: Myceliales (Agonomycetales). - Họ: Myceliaceae (Agonomycetaceae). - Chi: Rhizoctonia. - Loài: Rhizoctonia solani. Rhizoctonia solani là loài lớn nhất của giống Rhizoctonia. Bệnh phát sinh trên cổ rễ và rễ. Vết bệnh đầu tiên là những vết màu nâu sáng, sau phát triển và làm thắt cổ rễ. Đối với Rhizoctonia solani cũng như các loài khác của Rhizoctonia, chúng không tạo bào tử phân sinh và rất hiếm tạo bào tử đảm. Rhizoctonia solani sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ từ 280C – 320C, là loại chuyên kí sinh, có phổ kí chủ rộng trên 180 loài khác nhau: lúa, đại mạch, ngô, mía, đậu, rau, dâu, rau cải họ thập tự,… Theo (Khangua, R.K, Barbetti, M.J và Sweetngham 1999), nấm Rhizoctonia solani được phân lập gồm 6 nhóm: 54%ZG5 (AG2-1), 8%ZG6 (AG2-1), 1%ZG9 (AG10), 12%CZG1 (CAG1), 4%CZG4, 6%CZG5 (AGK). Trong đó, nhóm ZG1 và ZG5 gây nhiễm cao, làm giảm khả năng mọc của cây con và là nguyên nhân gây lỡ cổ rễ rất nghiêm trọng. Nhóm ZG5 có khả năng gây nhiễm cao ở hầu hết các loài cây trồng đặc biệt là các loài cây họ thập tự. 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nấm Rhizoctonia trên cây trồng. Ở nước ta bệnh do nấm Rhizocotnia solani Kuhn được nghiên cứu khác chi tiết trên cây lúa từ những năm 30 của thế kỉ 20 (Vicens (1921), Bougnicourt (1935), Đường Hồng Dật (1958)). Theo Phạm Văn Lợi (1991) các nguồn nấm Rhizoctonia solani được thu thập từ cá nguồn ở những nơi khác nhau có sự khác biệt về khả năng sinh trường trên các môi trường nhân tạo, nhiệt độ và khả năng gây bệnh,… Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), Rhizoctonia solani Kuhn là nấm gây bệnh hại phổ biến ở các vùng trồng trọt trên thế giới. Bệnh làm chết cây con hàng loạt, là nguyên nhân gây nên các bệnh như: thối gốc, lở cổ rễ, thối nhũn, thâm đen,… gây hại nặng trong giai đoạn vườn ươm và sản xuất. 1.5.3 Đặc điểm. Các sợi nấm sinh dưỡng dễ dàng quan sát trên môi trường nhân tạo khi còn non không có màu, nhưng khi khuẩn lạc phát triển và trưởng thành có màu nâu. Sợi nấm trưởng thành có thành dầy màu nâu, các tế bào sợi nấm có dạng hình ống kết hợp lại thành những cấu trúc rắn chắc khô, cứng, gọi là hạch nấm, nhìn dược bằng mắt thường, hạch nấm và sợi nấm tồn tại trong đất và trong các tàn dư trong vườn là nguồn lan truyền bệnh. Nấm Rhizoctonia solani Kuhn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ từ 280 – 320C, nhiệt độ thấp hơn 100C và cao hơn 380C thì nấm ngừng sinh trưởng, hạch nấm hình thành ở nhiệt độ từ 300C – 320C, khi nhiệt độ thấp hơn 100C và cao hơn 400C thì nấm không hình thành hạch nấm. Theo Nguyễn Văn Tường và các cộng sự (1996) thì nấm Rhizoctoni solani Kuhn có khả năng tấn công gây hại trên tất cả các bộ phận của cây. 1.5.4 Phân lập. Nấm bệnh có thể được phân lập dễ dàng từ mẫu bệnh khô vằn lúa, khô vằn ngô và thối bắp cải bằng cách khử trùng bề mặt mô bệnh, cấy lên môi trường thạch nước cất và cấy truyền lên môi trường thạch đường khoai tây có bổ sung kháng sinh. Việc phân lập từ rễ hoặc rễ con bị thối khó khăn hơn: 1. Rửa rễ cho sạch đất. 2. Khử trùng bề mặt trong cồn êtylic 70% trong 5 giây. 3. Rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm đã khử trùng. 4. Cấy các mẩu rễ nhỏ (1 - 2 mm chiều dài) cắt từ ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe lên môi trường thạch nước cất. 5. Cấy truyền lên môi trường thạch đường khoai tây. Rhizoctonia có thể phân biệt được với Pythium và Phytophthora trên môi trường thạch nước cất bằng đặc điểm hình thái sợi nấm phân nhánh vuông góc và sự có mặt của các sợi nấm sợi lớn có vách ngăn. Hạch nấm có thể hình thành trong môi trường nhân tạo, đặc biệt trên môi trường thạch thân lúa. 1.5.5 Các bệnh do Rhizoctonina gây ra trên cây trồng. Ở Việt Nam có nhiều bệnh do Rhizoctonia gây ra (Hình 1.11). Một số loài phát triển, xâm nhiễm, gây bệnh trên thân cây và bề mặt lá trong điều kiện thời tiết ấm, mưa hoặc ẩm độ cao. Ví dụ, một loài Rhizoctonia xâm nhiễm vào lá ngô và gây ra triệu chứng bệnh khô vằn điển hình trên lá (Hình 1.11d). Người ta cho rằng cũng loài đó, hoặc một loài tương tự, gây thối bắp cải bắp. Những nấm này có thể sinh ra các hạch nấm màu nâu với hình dạng bất định trên bề mặt cây bị bệnh. Rhizoctonia oryzae gây bệnh khô vằn trên lúa, một bệnh rất phổ biến. Các loài Rhizoctonia cũng gây hiện tượng lở cổ rễ cây con như đậu cô ve, cải bắp, lạc và bông. Triệu chứng lở cổ rễ do nấm xâm nhiễm ở phần cổ rễ sát mặt đất có thể làm chết cây con. Bệnh thối rễ Rhizoctonia hình thành do nấm xâm nhập vào cây ở đỉnh sinh trưởng của các rễ phụ nhỏ. Nấm sau đó phát triển từ đầu rễ và lan vào rễ chính làm thối rễ. Rhizoctonia xâm nhiễm ở đỉnh sinh trưởng của rễ con thường đưa đến triệu chứng “đầu mác” ở rễ (Hình1.11a). Hình 1.11. Các ví dụ về bệnh do Rhizoctonia: (a) triệu chứng nhọn như “đầu mác” ở rễ bệnh. (b) bệnh khô vằn trên lúa do Rhizoctonia. (c) hạch nấm của Rhizoctonia trên cải bắp bị bệnh. (d) bệnh do Rhizoctonia trên vỏ ngô. - Triệu chứng chính: Các triệu chứng phụ thuộc vào loài, chủng nấm và cây ký chủ, bao gồm lở cổ rễ cây con, héo, chết cây con, thối rễ con và thối rễ. Thối bắp cải do Rhizoctonia gây ra những vết thối đen trên lá. Bệnh khô vằn lúa và khô vằn ngô gây ra các vết bệnh màu vàng và các vết mất màu bất thường xen kẽ. - Dấu hiệu chẩn đoán: phụ thuộc vào quá trình phân lập và giám định nấm thuần trên môi trường nhân tạo. Các hạch nấm điển hình màu nâu, hình dạng bất định được hình thành ở một số loài trên các mô ký chủ bị bệnh. - Phổ ký chủ: đa dạng, tùy thuộc loài và chủng nấm. - Thời tiết: các bệnh ở cây con và thối rễ lại gây hại nặng hơn trên cây trồng ảnh hưởng bởi những điều kiện thời tiết không thuận lợi. Ví dụ, cây con đậu cô ve dễ mẫn cảm với bệnh lở cổ rễ khi trời lạnh vì nhiệt độ thấp làm chậm việc nảy mầm và nhú chồi. - Bảo tồn: các loài Rhizoctonia tồn tại trong đất dưới dạng hạch nấm hoặc sợi nấm trong tàn dư cây ký chủ. - Xâm nhiễm: sợi nấm Rhizoctonia trong tàn dư cây bệnh xâm nhiễm trực tiếp vào mô cây và một số tạo các cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt. Hạch nấm nảy mầm tạo ra sợi nấm xâm nhiễm vào cây. - Phòng trừ: bệnh chết rạp cây con (lở cổ rễ) có thể được giảm thiểu bằng cách xử lý hạt với thuốc trừ nấm như Quintozene (pentachloronitrobenzene) và thay đổi thời vụ (ngày) trồng sao cho nhiệt độ và độ ẩm đất có lợi cho nảy mầm và nhú chồi nhanh. Hiệu quả của việc luân canh tùy thuộc vào phổ ký chủ của các loài Rhizoctonia là đối tượng phòng trừ. 1.5.6 Bệnh chết rạp (bệnh lở cổ rễ) do Rhizoctonia solani. 1.5.6.1 Bệnh chết rạp (chết ẻo hay bệnh lở cổ rễ). Bệnh phân bố rộng rãi, bệnh gây hại phổ biến ở nhiều nước trên thế giới và cả ở nước ta. Bệnh phá hoại suốt thời kì sinh trường của cây nhưng chủ yếu là vào giai đoạn cây con. Bệnh làm cây con chết hàng loạt, có khi phải gieo trồng lại toàn bộ, làm mất nhiều thời gian và công chăm sóc. 1.5.6.2 Triệu chứng. Biểu hiện đặc trưng nhất của bệnh là: rễ, cổ rễ và gốc thân sát mặt đất bị thâm đen, thối mục, cây bị héo, đổ gục xuống. Lúc đầu vết bệnh chỉ là một chấm nhỏ màu đen ở gốc thân, cổ rễ, sau đó lan ra rất nhanh bao bọc quanh cổ rễ. Bộ phận bị bệnh thối mục có màu nâu đen, ủng nước hoặc hơi khô, cổ rễ teo tóp, lá thân bị héo rũ nhưng vẫn còn màu xanh. Sau 5 – 6 ngày, cây héo rũ đổ gục và chết hàng loạt. Trên vết bệnh ở cổ rễ thối nhũng hình thành một lớp nấm màu trắng xám, có hạch nấm màu nâu đỏ, hình tròn dẹt, nằm rãi rác hoặc thành từng đám. Nhổ cây lên thường bị đứt ở gốc thân hoặc cổ rễ. 1.5.6.3 Đặc điểm phát sinh bệnh. Bệnh lở cổ rễ (chết rạp) ngoài nấm Rhizoctonia, một số loài nấm khác như: Thielaviopsis hoặc Fusarium… cũng có thể gây bệnh. Bệnh phát sinh trong điều kiện độ ẩm cao (mưa phùn), mưa nhiều, đất bị ẩm, và nhiệt độ thấp 18 – 250C, hoặc thời tiết nóng lạnh thất thường. Khi nhiệt độ trên 250C, khả năng gây bệnh giảm nhiều, khi nhiệt độ trên 300C thì cây ít khi bị bệnh. Bệnh thường gây hại nặng nề trên những vùng đất trũng, ứ đọng nước. Đất thịch dẽ chặt, dễ đóng váng sau khi mưa. Mặt khác, trên những loại đất này, thì cây trồng cũng sinh trưởng yếu nên sức chống chịu bị giảm đi. Sự phát triển của bệnh ngoài việc liên quan nhiều về nước còn có liên quan đền chế độ bón phân. Trong canh tác, nếu chúng ta bón phân không cân đối, bón phân quá nhiều đạm cũng góp phần làm gia tăng nguy cơ nhiễm bệnh, do đó, nên bón phân cân đối, đặc biệt bón thêm Kali có tác dụng làm cây cứng cáp làm giảm mức độ nhiễm bệnh. Ngoài ra, bệnh còn phát triển mạnh do làm không tốt các khâu trong kĩ thuật trồng cây: làm đất không tốt, hạt gieo quá sâu, sử dụng hạt giống có chất lượng kém, sức nảy mầm thấp hoặc độc canh một loại cây trồng trong nhiều năm liên tiếp. 1.5.6.4 Các biện pháp phòng trừ hiện nay. Bệnh lở cỗ rễ do các loại nấm trong đất đặc biệt là Rhizoctonia solani gây ra, bệnh chủ yếu tấn công vào cây con nên để phòng trừ bệnh này ta cần áp dụng một số biện pháp phòng trừ như sau: - Làm đất kĩ, lên luống cao, san phẳng mặt luống không để ứ đọng nước. - Sử dụng hạt giống tốt, có sức nảy mầm cao, không nên gieo hạt giống quá sâu. Nên xử lý hạt giống bằng thuốc trước khi gieo và phun thuốc khi bệnh mới vừa xuất hiện. - Luân canh nhiều loại cây trồng, không nên độc canh một loại cây nào đó. - Gieo trồng đúng thời vụ với từng loại cây trồng. - Bón phân thích hợp, cân đối. Chú ý, phải làm đất, bón lót bằng phân hữu cơ và vôi trước khi gieo trồng. Tránh bón phân quá nhiều đạm. - Có thể dùng thêm các loại thuốc sau để phòng trừ: Ridomil MZ72 WB, Topsin M, Rovral,… theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. - Đặc biệt, nên sử dụng các chế phẩm sinh học (Trichoderma). Phần 2: PHẦN THỰC NGHIỆM. 2.1 Các dụng cụ - phương tiện thí nghiệm. 2.1.1 Dụng cụ - thiết bị. + Bình xịt thuốc lọai 0.5l và 2.5l. + Khay xốp. + Ống nghiệm các loại. + Erlen các loại. + Dĩa Petri. + Bếp đun. + Đèn cồn. + Máy đo quang phổ tử ngoại. + Máy đo OD. 2.1.2 Hóa chất. + Acetone 80%. + Cloroform. + Nước cất. + Cồn 700 và 900. 2.1.3 Vật liệu thí nghiệm. + Cải xanh. 2.1.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo. Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh. Việc lây bệnh nhân tạo có thể cung cấp thông tin để: • Khẳng định một sinh vật nào đó được phân lập là tác nhân gây bệnh (theo quy tắc Koch). • Xác định phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh. • Đo độc tính các mẫu cấy khác nhau của tác nhân gây bệnh. Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập. Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên - các giống cây trồng có thể có độ mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh. Các yếu tố cần được cân nhắc trong quá trình lây bệnh nhân tạo bao gồm: • Nhiệt độ. • Độ ẩm. • Dinh dưỡng. • Nguồn bệnh (quá ít hoặc quá nhiều) • Các điều kiện trồng nói chung. Nếu tất cả thí nghiệm và công thức lây bệnh đều được bố trí các công thức đối chứng (không lây bệnh) để so sánh với các công thức được lây bệnh, ảnh hưởng của những yếu tố này có thể được đo và giải thích. Công thức đối chứng cũng là một phương tiện để so sánh và có thể làm nổi bật các thiếu sót trong thí nghiệm nếu có. Một phần quan trọng của việc chẩn đoán bệnh là việc tái tạo bệnh trong quá trình lây bệnh nhân tạo nhằm hoàn tất các quy tắc Koch. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa mầm bệnh trực tiếp vào cây. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí nghiệm (Bảng 2.1). Bảng 2.1: Phương pháp lây nhiễm thích hợp. 2.1.4.1 Lây bệnh vào đất. Có thể lây bệnh trực tiếp vào đất bằng dung dịch bào tử lấy từ môi trường thuần hoặc từ sinh khối vi sinh vật gây bệnh được nhân trong bình tam giác (Hình 2.1). Dịch bào tử nấm hoặc dịch khuẩn có thể được tưới vào đất sau khi nảy mầm sao cho chúng được tiếp xúc trực tiếp với hệ thống rễ. Phương pháp này được thực hiện để lây bệnh nhanh ban đầu. Hỗn hợp Lớp mỏng Dịch bào tử Hình 2.1 Các phương pháp lây bệnh nhân tạo bằng cách đưa vi sinh vật vào đất. Một quá trình lây nhiễm tự nhiên hơn được thực hiện bằng phương pháp hỗn hợp hoặc phương pháp lớp mỏng. Cả hai phương pháp này đều yêu cầu nhân sinh khối nguồn bệnh trên một giá thể tự nhiên, như hạt kê hoặc vỏ trấu. Việc nhân sinh khối mẫu cấy trên các giá thể này trong bình tam giác cần thời gian khoảng 2-3 tuần. Một lượng sinh khối nguồn bệnh tiêu chuẩn được dùng cho cả hai phương pháp. Tuy nhiên do tác nhân gây bệnh được đưa vào đất cùng thời điểm trồng cây nên cây có thể nhiễm bệnh khi còn ở giai đoạn cây con - việc này có thể gây ra các kết quả sai lệch nếu mục đích của lây bệnh nhân tạo là để tái tạo bệnh trên cây trưởng thành. 2.1.4.2 Chuẩn bị nguồn bệnh cho quá trình lây bệnh nhân tạo. Dịch bào tử. Chuẩn bị nguồn nấm bệnh cho việc tạo dịch bào tử bằng cách nuôi nấm trên môi trường thạch nước cất chứa hạt, mẩu thân hoặc lá đã khử trùng, trên môi trường thạch lá cẩm chướng, hoặc trên môi trường thạch đường khoai tây. Một cách đơn giản là cạo các bào tử và sợi nấm ra khỏi đĩa cấy và cho vào nước vô trùng. Dịch bào tử này có thể được đổ lên trên đất. Môi trường lúa/cám (thể tích 50:50). 1. Ngâm hạt lúa trong nước vài giờ để hạt ngấm nước. 2. Chắt bỏ phần nước, trộn cám vào, cho thêm nước. 3. Cho khoảng 150ml giá thể vào một bình tam giác thể tích 250 ml. 4. Cuộn thật chặt một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn để nút chặt miệng bình tam giác. Hình 2.2 Bình lúa/cám. 5. Dùng giấy nhôm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng 6. Để bình nguội. 7. Cấy các miếng thạch có sợi nấm hoặc dịch bào tử vào giá thể trong bình tam giác, chú ý để nút bình vẫn trong điều kiện vô trùng, thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. 8. Đặt các bình tam giác ở nhiệt độ khoảng 250C trong 2 tuần trong điều kiện sáng và tối xen kẽ để hoàn thành quá trình nhân sinh khối nấm trên giá thể. 9. Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong giá thể. 2.2 Quá trình thí nghiệm – kết quả. Hình 2.3 Bịch hạt giống. Cải dùng làm thí nghiệm được trồng từ hạt giống mua ở công ty Gino. Được trồng trong các khay xốp, giá thể để trồng là xơ dừa trộn với đất và phân trùng quế. Hình 2.4 Khay xốp trồng cải. Tiến hành trồng cải trong 4 khay xốp khác nhau (K1, K2, K3, K4) với mật độ vừa phải và theo hướng dẫn của nhà cung cấp và một số tài liệu tham khảo được. Hình 2.5 Cải dùng làm thí nghiệm. Trong 5 ngày đầu (từ khi hạt được gieo cho đến khi nảy mầm) cây được tưới nước mỗi ngày. Sau đó cây cải được tưới nước cách nhật (1 ngày tưới – 1 ngày ngưng). Các cây cải sau khi trồng được 15 ngày, cây có chiều cao khoảng 5cm, tiến hành phun riêng các hóa chất Na-Glutamat, K-Glutamat và Mg-Glutamat (với nồng độ 0.5 g/l) trên 3 khay khác nhau (K1, K2, K3) và 1 đối chứng (K4) không phun hóa chất gì cả. Sau 3 ngày phun thuốc, tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng nấm Rhizoctonia Solani (được nhân giống từ trước) vào 3 khay đã phun hóa chất (K1, K2, K3) và 1 khay đối chứng (K4). Sau vài ngày, các cây cải đã có dấu hiệu xuất hiện bệnh. Ta tiến hành chọn ngẫu nhiên một số cây mang đi phân tích môt số chỉ tiêu sau: 2.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hàm lượng Chlorophyll. - Bố trí thí nghiệm: Các mẫu lá (5 lá) được lấy một cách ngẫu nhiên, sau đó cắt mỗi lá một phần nhỏ và cân đủ 25 mg. Các mẩu lá được lấy theo sơ đồ như sau: Khay trồng cải. Các vị trí lấy mẫu. 50 cm. 27 cm. Hình 2.6. Sơ đồ các vị trí lấy mẫu. - Mô tả thí nghiệm: Phương pháp đo Chlorophyll (Arnon D. I, 1949). - Mỗi nghiệm thức lấy 10 mẫu. Mỗi mẫu cân 25 mg lá (lá xanh tốt) và cắt nhuyễn. Cho từng mẫu vào ống nghiệm, sau đó dùng pipet 10 ml hút và cho vào mỗi ống nghiệm 10 ml aceton 80%. Đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc và nilon và để các mẫu không tiếp xúc ánh sáng trong 72 giờ. - Đồng thời cân mỗi nghiệm thức 10 mẫu lá có trọng lượng mỗi mẫu là 25 mg. Gói giấy và đem sấy khô ở nhiệt độ 800C trong 72 giờ. Suy ra trọng lượng khô trung bình A của mỗi mẫu đo Chlorophyll. - Sau 72 giờ, mang đi đo mật độ quang của từng ống nghiệm ở 2 bước sóng 645 nm và 663 nm bằng máy đo quang phổ. - Hàm lượng chlorophyll a và b được tính theo công thức sau: + Chl a (mg/g TLK lá) = + Chl b (mg/g TLK lá) = + Chl a+b (mg/g TLK lá) = + Tỷ lệ Chlorophyll a/b = Chl a / Chl b. - Trong đó: mA: Trọng lượng khô của lá. Chl a: Chlorophyll a. Chl b: Chlorophyll b. - Chỉ tiêu ghi nhận: các số liệu đo được dùng để đánh giá mối tương quan về hàm lượng Chlorophyll a và Chlorophyll b trong các nghiệm thức. 2.2.2 Thí nghiệm 2: Đo quang phổ tử ngoại. - Bố trí thí nghiệm: Các lá đuợc lấy một cách ngẫu nhiên như sơ đồ lấy mẫu ở (hình 2.6). - Mô tả thí nghiệm: Cân 1g lá, giã nhuyễn cho thêm 10ml nước cất, lọc và cho vào ống nghiệm, sau đó mang đi đo. Về thí nghiệm này, các kết quả được đo bằng máy chuyên dụng, và được xử lí bằng một phần mềm chuyên dụng riêng. Quá trình đo quang bằng máy chuyên dụng, sinh viên thực tập không được sử dụng máy, chỉ được đứng quan sát. Quá trình xử lí số liệu của kết quả đo này thì vô cùng phức tạp và phải dùng phần mềm chuyên biệt, sinh viên thực tập không có được. Sau khi có kết quả đo, số liệu sau đó được KS. HỨA QUYẾT CHIẾN (cán bộ hướng dẫn thực tập chính của chúng tôi) xử lí riêng sau đó đưa kết quả (ở phần 3) cho chúng tôi. Sau đó, ông (KS. HỨA QUYẾT CHIẾN) đã hướng dẫn chúng tôi đọc các kết quả và rút ra kết luận từ các số liệu này. + Protein = 1552*A280 – 757.3*A260 (µg/ml). + Axit Nucleic = -36*A280 + 62.9*A260 (µg/ml). Trong đó: A280 và A260 là cường độ thu được ở bước sóng 280 nm và 260 nm. - Chỉ tiêu ghi nhận: Ghi nhận sự thay đổi về hàm lượng Protein và Axit nucleic có trong các nghiệm thức. Phần 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ. 3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hàm lượng Chlorophyll. Thực vật là những sinh vật có khả năng tạo cho mình những chất dinh dưỡng từ những hợp chất vô cơ đơn giản và tổng hợp thành những phần tử phức tạp nhờ quá trình quang hợp. Quá trình quang hợp sử dụng năng lượng của ánh sáng mặt trời được hấp thụ bởi chất diệp lục (Chlorophyll), phân tách nước thành hydro và oxy sau đó tổng hợp thành các chất hữu cơ - chất dinh dưỡng phục vụ cho bản thân chúng và hầu hết các sinh vật trên trái đất, đồng thời tạo ra oxy và thiết lập sự cân bằng Oxy-Nitơ-Cacbonic cho bầu khí quyển. Cấu trúc hóa học của Chlorophyll gần giống Hemoglobin ở máu người, cũng gồm 4 nhóm heme gắn với một nguyên tố kim loại, ở người là nguyên tố sắt, còn ở thực vật và tảo, nguyên tố Magnesium thay thế cho nguyên tố Sắt. Người ta còn gọi chất diệp lục (Chlorophyll) là máu của thực vật. Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của Chl a và Chl b. Tác dụng chính yếu của Chlorophyll là phân tách nước, một số hợp chất vô cơ đơn giản mà thực vật hút từ đất, tạo ra Hydro, Oxy, hình thành ATP là nguồn năng lượng hoạt động quan trọng của sinh vật và NADPH - các nguyên liệu để tạo ra các chất đạm, dinh dưỡng cho thực vật. Do có tác dụng tạo ra nguyên tử Oxy bề mặt mà Chlorophyll có tác dụng diệt khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn kỵ khí. Về cơ bản công thức hóa học của 2 loại Chlorophyll chỉ khác nhau ở gốc -CH3 (của Chl a) và gốc –CH=O (của Chl b). Diệp lục có khả năng hấp thu rất mạnh các tia sáng có bước sóng xác định. Chl a có đỉnh hấp thu ở bước sóng λ= 410 nm, 429 nm ở ánh sáng xanh và 660 nm ở ánh sáng đỏ. Chl b có đỉnh hấp thu ở bước sóng λ= 430 nm, 453nm ở ánh sáng xanh và 642 ở ánh sáng đỏ. - Kết quả thí nghiệm: hàm lượng Chlorophyll được ghi nhận ở bảng 3.1: Bảng 3.1 Kết quả đo OD ở 2 bước sóng 645 nm và 663 nm. Bước sóng Hóa chất 645 nm 663 nm BT 0.245 0.562 K 0.181 0.429 Na 0.202 0.559 Mg 0.191 0.426 . + BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat. + Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat. Hàm lượng Chlorophyll a và Chlorophyll b sau khi tính bằng các công thức trên, ta có bản sau đây: Ta chỉ tính hàm lượng Chlorophyll mẫu làm thí nghiệm. Bảng 3.2. Hàm lượng Chlorophyll trong các cây cải thí nghiệm. Chl a (mg) Chl b (mg) Chl a + Chl b Chl a / Chl b BT 6.47835 2.98034 9.47829 2.17 Na 6.55592 2.00968 8.58176 3.26 K 4.96141 2.13718 7.11307 2.32 Mg 4.89641 2.38022 7.29191 2.06 + BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat. + Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat. Biểu đồ 3.1 Hàm lượng Chl a và Chl b trong từng mẫu thí nghiệm. Ở đây, ta chỉ tính hàm lượng của Chlorophyll a và Chlorophyll b trong lá, vì trong các kết quả của thí nghiệm này ta chỉ quan tâm đến hàm lượng của các loại Chlorophyll mà thôi, không quan tâm đến kết quả Chlorophyll /TLK của lá. Trong kết quả của thí nghiệm này, ta thấy: + Hàm lượng Chl a trong cả thí nghiệm và đối chứng đều cao hơn nhiều so với Chl b. + Hàm lượng Chl a trong mẫu có phun Natri Glutamat gần bằng với hàm lượng Chl a trong mẫu đối chứng (BT). + Hàm lượng Chl a trong mẫu có phun Kali Glutamat và Mg Glutamat thì gần như nhau và thấp hơn nhiều so với mẫu đối chứng (BT). + Trong khi đó, hàm lượng Chl b trong các mẫu có phun thuốc thì thấp hơn nhiều so với mẫu BT, trong đó, mẫu có phun Natri Glutamat có hàm lượng thấp nhất và mẫu có phun Mg Glutamat thì lại có hàm lượng cao nhất. Nhưng nếu chúng ta xét về tổng thể, có thể thấy rằng hàm lượng Chlorophyll tổng cộng (Chl a + Chl b) trong mẫu (BT) là cao nhất (9.47829 mg) và trong mẫu (K) là thấp nhất (7.11307 mg). 3.2 Thí nghiệm 2: Đo quang phổ tử ngoại. - Kết quả thí nghiệm: khi tiến hành đo quang phổ tử ngoại ở vùng bước sóng của ánh sáng tử ngoại ta thu được các cường độ ở các bước sóng như (bảng 3.3) Bảng 3.3 Cường độ thu được ở các bước sóng. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A260 nm 0.28913 0.18475 0.58852 0.16855 A280 nm 0.39337 0.3166 0.79952 0.4479 A320 nm 3.2191 1.6377 3.5421 2.4438 A340 nm 2.8624 1.3591 3.1894 2.0676 A360 nm 1.8604 0.8311 2.3912 1.3212 A380nm 1.0282 0.45263 1.7192 0.75532 Trong đó: + BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat. + Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat. + A: bước sóng. (nm). Áp dụng công thức xác định nồng độ (µg/ml) Protein và Axit nucleic: + Protein = 1552*A280 – 757.3*A260 (µg/ml). + Axit Nucleic = -36*A280 + 62.9*A260 (µg/ml). ta được kết quả như bảng 3.4 Bảng 3.4 Nồng độ Protein và axit nucleic. Nồng độ Hóa chất Protein (µg/ml). Axit nucleic (µg/ml). BT 392.064251 4.013077 K 795.168844 8.235188 Na 351.452025 0.223175 Mg 567.497885 Không xác định. Trong kết quả thí nghiệm này, ta thấy các mẫu cây cải lấy từ nghiệm thức có phun Kali Glutamat lại có sự khác biệt lớn với các nghiệm thức còn lại. Nồng độ (µg/ml) Protein và Axit Nucleic cao gần như gấp đôi so với mẫu đối chứng (BT). (dựa vào bảng 3.4 , hình 3.4 , hình 3.5 ) Biểu đồ 3.2 Nồng độ (µg/ml) Protein. Biểu đồ 3.3 Nồng độ (µg/ml) Axit nucleic. Với nghiệm thức được phun Mg Glutamat, nồng độ Protein tuy có cao nhưng nồng độ Axit nucleic lại không xác định được. Do đó, ta không thể có kết luận về tác dụng tích cực của hóa chất Mg Glutamat này. Với nghiệm thức được phun Na Glutamat, so với các nghiệm thức còn lại, kể cả so với nghiệm thức đối chứng (BT), nồng độ (µg/ml) Protein thì bằng so với đối chứng (BT), nhưng nồng độ (µg/ml) Axit Nucleic thì lại quá thấp và thấp hơn nhiều so với đối chứng (BT). Do đó, có thể thấy tác dụng của Na Glutamat là không đáng kệ trong thí nghiệm này. Lúc này ta xét riêng cường độ thu được ở các bước sóng khác nhau: Ứng với các bước sóng khác nhau, sẽ là các chất khác nhau. + Ở bước sóng 260 nm. Bảng 3.5 Cường độ thu được ở bước sóng 260 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A260 nm 0.28913 0.18475 0.58852 0.16855 Biểu đồ 3.4 Cường độ thu được ở bước sóng 260 nm. Ở bước sóng này: + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat là cao nhất cao gấp đôi so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat gần như nhau. + Ở bước sóng 280 nm. Bảng 3.6 Cường độ thu được ở bước sóng 280 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A280 nm 0.39337 0.3166 0.79952 0.4479 Biểu đồ 3.5 Cường độ thu được ở bước sóng 280 nm. Ở bước sóng này: + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat là cao nhất cao gấp đôi so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat cao hơn Natri Glutamat một ít. + Ở bước sóng 320 nm. Bảng 3.7 Cường độ thu được ở bước sóng 320 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A320 nm 3.2191 1.6377 3.5421 2.4438 Biểu đồ 3.6 Cường độ thu được ở bước sóng 320 nm. Ở bước sóng này: có sự thai đổi so với các bước sóng ở trên: + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, nhưng không còn cao hơn nhiều so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat đã thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat nhưng đã có sự chênh lệch lớn. + Ở bước sóng 340 nm. Bảng 3.8 Cường độ thu được ở bước sóng 340 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A340 nm 2.8624 1.3591 3.1894 2.0676 Biểu đồ 3.7 Cường độ thu được ở bước sóng 340 nm. Ở bước sóng này: kết quả cũng tương tự như ở bước sóng 320 nm. + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, nhưng không còn cao hơn nhiều so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat đã thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat nhưng đã có sự chênh lệch lớn. + Ở bước sóng 360 nm. Bảng 3.9 Cường độ thu được ở bước sóng 360 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A360 nm 1.8604 0.8311 2.3912 1.3212 Biểu đồ 3.8 Cường độ thu được ở bước sóng 360 nm. Ở bước sóng này: kết quả cũng tương tự như ở bước sóng 340 nm. + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, nhưng không còn cao hơn nhiều so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat đã thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat nhưng sự chênh lệch đã giảm đi. + Ở bước sóng 380 nm. Bảng 3.10 Cường độ thu được ở bước sóng 380 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A380nm 1.0282 0.45263 1.7192 0.75532 Biểu đồ 3.9 Cường độ thu được ở bước sóng 380 nm. Ở bước sóng này: kết quả lại có sự thai đổi, kết quả này lại tượng tự so với kết quả đo được ở các bước sóng ngắn (260 nm và 280 nm). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, cao gần gấp đôi so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn rất nhiều so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat vẫn thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat, sự chênh lệch này đã tăng lên.. Phần 4: KẾT LUẬN. Sau 3 tháng làm đồ án tốt nghiệp, các kết quả thí nghiệm được lặp lại 3 lần với cùng một thí nghiệm, chúng tôi nhận được các kết quả tương tự nhau. Do đó, có thể các kết quả thí nghiệm này sẽ chứng tỏ cùng một kết quả. Hình 4.1 Quá trình biến đổi Glutamat thành Glutamin. Qua 3 lần làm thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng: các cây cải thường bị bệnh nhất vào giai đoạn cây được 10 – 15 ngày tuổi. Các cây được chọn làm thí nghiệm cũng được lấy trong giai đoạn này. Trong giai đoạn cây bị bệnh, các cây cải bị chết rất nhiều, nhưng nếu cây sống được qua 20 – 25 ngày tuổi thì cây vẫn phát triển bình thường. Cây vẫn lớn. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng khay (K4) (khay làm thí nghiệm được cho lây nhiễm nhân tạo, nhưng không phun thuốc mà chỉ tưới nước) có tỉ lê cây chết nhiều hơn, những cây còn sống sót qua 25 ngày tuổi còn ít hơn những khay làm thí nghiệm còn lại. Do đó, có thể các loại glutamat đã có tác dụng ở một mức độ nào đó kiềm hãm việc gây chết do bệnh lở cổ rễ gây ra. 4.1. Kết luận về hàm lượng Chlorophyll. Trong các thí nghiệm trên, chúng ta nhận thấy rằng hàm lượng Chl a, Chl b, và Chl tổng số trong nghiệm thức có sử dụng các loại Glutamat thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (BT). Trong đó, nghiệm thức sử dụng Kali Glutamat là cho các kết quả thấp nhất. Điều này, chúng ta không thể kết luận được hiện tượng gì, do đó, chúng ta có quyền “nghi ngờ” rằng Kali Glutamat có một tác dụng gì đó. Do chưa có kết luận cụ thể trong thí nghiệm này, chúng ta chỉ đang “nghi ngờ” một tác dụng nào đó của Kali Glutamat nên ta tiến hành tiếp thí nghiệm 2. 4.2 Kết luận về kết quả đo quang phổ tử ngoại. Dựa vào số liệu sau khi được KS. HỨA QUYẾT CHIẾN (cán bộ hướng dẫn thực tập chính của chúng tôi) xử lí riêng sau đó đưa kết quả (ở phần 3) cho chúng tôi. Sau đó, ông (KS. HỨA QUYẾT CHIẾN) đã hướng dẫn chúng tôi đọc các kết quả và rút ra kết luận từ các số liệu này. Trong quá trình cây bị bệnh, các quá trình xảy ra trong cây có thể bị biến đổi, các chất có thể bị phá hủy nhanh hơn, trong đó protein sẽ bị phân hủy nhanh hơn do các quá trình khác tăng lên (GS. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề). Khi protein bị phân hủy nhanh sẽ tạo ra NH4+ (hay NH3 tự do) là chất gây độc cho cây. Dựa vào kết quả xử lí và ghi nhận được ở bảng 3.4: ta thấy rằng nồng độ Protein trong nghiệm thức sử dụng Kali Glutamat là cao nhất. Do đó, có thể Kali Glutamat đã góp phần vào việc hạn chế sự phân hủy nhanh protein trong các cây bị bệnh. Vì vậy, nếu các loại Glutamat có tác dụng “giải độc” thì Kali Glutamat cho kết quả tốt nhất. 4.3 Kết quả chung – kết luận. Dựa vào kết luận của 2 thí nghiệm trên, có thể thấy rằng Kali Glutamat là chất có khả năng nhất, có tác dụng lớn nhất trong việc hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra. Phần 5: KIẾN NGHỊ - HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Trong khoảng thời gian 3 tháng để thực hiện đề tài, khoảng thời gian ấy có thể không ngắn, nhưng cũng không dài cho một quá trình khảo sát, nghiên cứu khoa học. Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi đã gặp không ít khó khăn, nhưng nhờ sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của KS. HỨA QUYẾT CHIẾN (cán bộ hướng dẫn chính), CN. LÊ NGỌC THẠCH, CN. ĐỖ THỊ TUYẾN…, chúng tôi đã hoàn thành được các mục tiêu do thầy KS. HỨA QUYẾT CHIẾN đặt ra. Trong thời gian tới, chúng ta cần tiến hành điều tra, khảo sát để làm rõ hơn qui luật phát sinh và phát triển của bệnh này trên cây cải, từ đó có thể tìm ra cách phòng trừ tốt nhất. Tiếp tục thử nghiệm, khảo sát hiệu quả của các loại Glutamat khác, nhằm tìm ra loại Glutamat nào có khả năng, hiệu quả giải độc cao hơn Kali Glutamat trong quá trình khảo sát này. Tiếp tục một số thử nghiệm phức tạp hơn nhằm tìm ra được nguyên nhân của khả năng giải độc của Glutamat. Khả năng ứng dụng các hoạt chất sinh học đang có một tìm năng lớn, do đó, cần khảo sát khả năng này trên một số loài thực vật khác xem hiệu quả thu được như thế nào?? Có thể chúng ta phải tiến hành nhiều khảo sát hơn nữa, nhiều thí nghiệm hơn nữa để tìm ra những chất phụ gia bổ sung thêm vào có khả năng làm tăng lên hoạt tính giải độc của Glutamat.