Đề tài Khái quát chung về các loại vector

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ˜™˜™˜™˜™˜™ VECTOR KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÁC LOẠI VECTOR Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện : TS. TRẦN THỊ DUNG PHẠM THÀNH THÁI Thành phố Hồ Chí Minh 2008 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ VECTOR : Vector : là phương tiện truyền thông tin di truyền vào tế bào. Gồm : Hệ thống vector có bản chất virus (dựa trên virus): retrovirus, adenovirus và virus kết hợp adeno (Adeno associated virus – AAV). Một số vector có bản chất virus nhưng ít được sử dụng hơn : Herpes simple virus I (HSV–1), virus đậu mùa hay Baculovirus,… Hệ thống vector không có bản chất virus bao gồm các phân tử DNA, RNA tại chỗ được khuyết đại trong tế bào vi khuẩn hay các tế bào eukaryote (plasmid, cosmid, bacteriophage,…) và các oligodeoxyribonucleic hay những phân tử tương tự được tổng hợp in vitro bằng phương pháp nhân tạo. Các vector cần thỏa mãn các yêu cầu sau : Có trình tự khởi đầu sao chép (ori – origin of replication) để có thể tự sao chép và tồn tại độc lập. Có các vị trí nhận biết đơn (single recognition sides – SRS), nơi các enzyme hạn chế nhận biết để cắt rời để ghép đoạn gene ngoại lai. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu sao chép để tránh cắt nhầm. Có trình tự khởi động (promoter) để tiến hành phiên mã gene ngoại lai. Chứa các gene chỉ thị (marker gene) (thường là các gene kháng chất kháng sinh) để có thể phát hiện ra thể tái tổ hợp. Ngoài ra còn có các đặc tính khác như : chứa gene vô hiệu hóa các gene không mong muốn được gắn vào. Có thêm các trình tự như RBS (ribosome blinding site – vùng liên kết với ribosome để dịch mã),… Việc chọn lựa các vector phụ thuộc vào : Tế bào mục tiêu và những đặc tính của nó. Vd: khả năng tải nạp ex vivo (chuyển gene vào tế bào bên ngoài cơ thể) và dung hợp vào bệnh nhân. Thời gian biểu hiện cần thiết. Kích thước của vật liệu di truyền cần chuyển. Ứng dụng chủ yếu của vector chuyển gene là: Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) một đoạn trình tự của DNA. Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA. Chuyển gene vào tế bào động – thực vật. Chuyển gene mã hóa một loại protein chức năng (hay một thực thể sinh học) vào tế bào nhằm thay đổi sự biểu hiện của gene nội sinh. Sản xuất protein, RNA,… CÁC VECTOR CÓ BẢN CHẤT VIRUS Sử dụng virus trong chuyển gene có lợi là chúng không làm thay đổi sự điều hòa hoạt động của gene chủ, tuy nhiên các vector virus này có khả năng tạo nên chủng virus mới, nó có thể mạnh và nguy hiểm hơn chủng đã dùng làm vector rất nhiều. Một số virus tạo vector và đặc tính của chúng Virus Genome Protein virus Lý tính Bệnh ở động vật Retrovirus 7 – 10kb, RNA đơn Gap, Pro, Pol, Env Ø ~ 100 nm, có vỏ bọc Cảm ứng khối u, suy giảm miễn dịch Adenovirus 36kb, DNA thẳng – kép Hơn 25 loại protein Ø ~ 70 – 100 nm, không vỏ bọc Cảm lạnh, viêm kết mạc, dạ dày, ruột AAV 4,7kb, DNA thẳng – đơn Rep, Cap Ø ~ 18 – 26 nm, không vỏ bọc Chưa biết HSV – 1 152kb, DNA thẳng – kép Hơn 18 loại protein Ø ~ 110 nm Loét miệng, mụn cóc, viêm bộ phận sinh dục, viêm não Virus đậu mùa 190kb, DNA thẳng – kép Hơn 198 khung đọc (ORF) Chữ nhật 350 – 270nm, có vỏ bọc Virus được làm nhược độc, điều chế vaccin đậu mùa Baculovirus 80 – 230kb, DNA vòng – kép Hơn 60 loại protein Chữ nhật 27 – 45nm, có vỏ bọc Không gây bệnh ở động vật có vú, gây bệnh ở côn trùng Vector retrovirus Retrovirus Các retrovirus có đường kính trung bình 100nm. Vỏ bao bọc chứa những phân tử glycoprotein, chúng quyết định tính chuyên biệt cho tế bào mục tiêu thông qua sự gắn kết tương đồng lên recepter của tế bào đích. Retrovirus chứa hai bản sao của mạch RNA đơn dài khoảng 5 – 10kb, chúng có thể nhận các gene chuyển (transgene) có kích thước khoảng 8kb. Bộ RNA đơn được sao chép thành phân tử DNA mạch đôi, sáp nhập vào bộ gene của vật chủ, tồn tại và duy trì lâu dài sự ổn định. Nguyên tắc hoạt động của Retrovirus là gắn các gene chuyển vào NST tế bào đích. Sau khi gắn lên receptor, RNA đi vào cytoplasm và sao chép thành DNA mạch đôi nhờ enzyme reserse transciptase (có thêm chúc năng RNase – phân hủy RNA trong phân tử lai DNA-RNA). Mạch đôi DNA này chuyển vào nhân và sáp nhập vào bộ gene tế bào vật chủ nhờ enzyme integrase được tạo bởi virus. Sự xâm nhập có sự khác nhau giữa các retrovirus. Vd : MLV (Murine Leukimia Virus) chỉ nhiễm vào tế bào đang phân chia, vì DNA chỉ chuyển vào nhân khi màng nhân bị phá vỡ trong quá trình nguyên phân ; HIV thì có thể xâm nhiễm vào tế bào không phân chia, nó có các protein nền (protein matrix) và các protein mã hóa bởi các gene vpr có những tín hiệu định vị nhân, do đó cho phép chúng đưa DNA vào nhân. Enzyme reserve transcriptase (phiên mã ngược) : tổng hợp mạch DNA thứ nhất từ mạch RNA khuôn, DNA polymerase của tế bào chủ sẽ tổng hợp mạch thứ hai. Enzyme integrase : chèn một bản sao DNA virus vào bộ gene tế bào chủ. Giúp retrovirus thoát khỏi sự tấn công của hệ thống miễn dịch hay chính là sự “bền vững” của retrovirus khi chúng đã nhiễm vào tế bào chủ. Chu trình sống của retrovirus, ở đây là Human Immunodeficiency Virus – HIV Chu trình sống của retrovirus gồm các giai đoạn : Nhiễm virus vào tế bào đích. Phiên mã ngược RNA thành DNA nhờ enzyme reverse transcriptase. Chuyển DNA virus vào nhân. DNA virus sát nhập vào bộ gene tế bào chủ. DNA virus phiên mã thành mRNA bởi promoter trong trình tự LTR. Dịch mã trong cytoplasm tạo các protein do các gene Gag, Pol, Env mã hóa. Hình thành và đóng gói hai mạch RNA virus và các enzyme reverse transcriptase. Các virion (hạt virus) làm “nổ” tế bào và thoát ra ngoài. Gene Gag mã hóa cho protein lõi, capside, nucleoprotein, gene Pol mã hóa cho enzyme reserse transciptase và enzyme integrase, gene Env mã hóa cho protein trong cấu trúc vỏ của virus. Trình tự LTR : là các đoạn lặp dài ở hai đầu genome virus chứa tất cả các tín hiệu cần thiết cho biểu hiện gene của virus. Trình tự ψ+ : là trình tự cần thiết cho quá trình đóng gói. Vector retrovirus Về nguyên tắc có thể thêm các trình tự cần chuyển vào virus, nhưng phương pháp phổ biến hơn cả là thay thế 1 trình tự trên virus bằng trình tự cần chuyển vào để tạo vector tái bản không hoàn toàn. Hệ thống vector retrovirus này gồm hai phần : Cấu trúc vector mang gene : chứa trình tự promoter, trình tự cần cho sự sát nhập vào bộ gene chủ và trình tự cần thiết cho đóng gói vỏ (kí hiệu ψ+(psi)). Nói cách khác là thay thế các gene của virus (gag, pol, env,…) bằng các gene chuyển mong muốn. Dòng tế bào cung cấp protein vỏ virus cần thiết cho sản xuất virus tái tổ hợp gọi là dòng tế bào đóng gói (packing cell line). Các tế bào đóng gói chứa các gene mã hóa cho protein vỏ cần cho sự đóng gói (Gag và Env), nhưng không chứa các trình tự cần thiết cho sự đóng gói ( ψ-) và trình tự LTR. Để sản xuất các vector retrovirus tái tổ hợp, cấu trúc vector mang gene liệu pháp (therapeutic gene) sẽ được biến nạp vào trong tế bào đóng gói bằng phương pháp vật lý như điện biến nạp,… các gene của dòng tế bào đóng gói sẽ sản xuất các protein và enzyme. Nhờ trình tự đóng gói nằm trên cấu trúc gene nên các tế bào sẽ bao bọc vỏ capside cho vector và hình thành virus tái tổ hợp. Những virus này sẽ thoát ra ngoài, khuyết tán vào môi trường nuôi cấy. Môi trường chứa virus tái tổ hợp sẽ được lọc để tinh sạch virus và sau đó cho virus nhiễm vào tế bào mục tiêu. Virus sẽ bám lên các receptor của tế bào mục tiêu, RNA phiên mã ngược thành DNA và sát nhập vào DNA tế bào chủ. Các gene sẽ phiên mã, tổng hợp protein, đây chính là protein liệu pháp mong muốn. Quá trình đóng gói retrovirus. Dòng tế bào chứa hai vùng gene, đều có trình tự mang nhân tố phiên mã nhưng không có tín hiệu đóng gói. Vector mang trình tự đóng gói và đoạn gene chuyển. Tín hiệu đóng gói sẽ giúp tế bào đóng gói các vector. Neor là gene marker chọn lọc. Các dòng tế bào đóng gói thường dùng là : ψ-2, ψ-Am, PA12, PA317, PE501, ψ-CRE, ψ-CRIP, GP + E-86, GP + envAM12,… Ứng dụng của vector retrovirus : Vector retrovirus thường được sử dụng trong liệu pháp gene. Đã được sử dụng có hiệu quả nhiều liệu pháp gene chữa bệnh cho người như suy giảm miễn dịch do thiếu hụt enzyme, thiếu máu, tiểu đường,… Tạo động vật chuyển gene như : gà chuyển gene đặc biệt, chuyển gene vào noãn của bò và khỉ,… Đối với trường hợp gà chuyển gene thì các vector phải mang trình tự Env nhận biết các tế bào phôi gà, chúng được tiêm vào trứng gà mới đẻ ; tuy nhiên hiệu quả không cao do phôi gà lúc này đã chứa khoảng 60000 tế bào nên chỉ có một số ít tế bào mang gene chuyển và ít có cơ hội truyền gene chuyển cho các thế hệ sau ; một phương pháp khác có hiệu quả hơn là tiêm virus ở giai đoạn phôi 16 tế bào. Ở trường hợp chuyển gene vào noãn bò, khỉ thì vector retrovirus phải thỏa hai điều kiện sau : vỏ là protein G của VSV (vesicular somatitis virus) có khả năng nhận biết màng phospholipid ; các hạt virus phải được tiêm vào giữa màng trong và màng noãn bào vào lúc màng nhân đã biến mất để RNA virut có cơ hội tốt nhất đến genome của tế bào chủ. Các hạn chế, rủi ro khi sử dụng vector retrovirus : Việc tải nạp các vector retrovirus gặp khó khăn khi các tế bào ở nhiều mô đã biệt hóa, không thể phân chia. Do vậy, các vector retrovirus cần phải cảm ứng để tế bào phân chia. Một hướng khác là tải nạp vào tế bào không phân chia. Hiện nay có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng virus HIV làm vector vì nó có khả năng tải nạp vào tế bào không phân chia. Rất hiệu quả trong việc cài gene chuyển vào tế bào nhận tuy nhiên các vector này chỉ chuyển được một đoạn nhỏ DNA đoạn gene chuyển có thể thiếu các trình tự quan trọng để điều hòa sự biểu hiện của mình. Xuất hiện đột biến chèn khi vector virus chèn vào bên trong hay kề gene nội bào. Đột biến này có thể làm bất hoạt các anti-oncogenes hay hoạt hóa các proto-oncogene gây ung thư. Nguy cơ ung thư khi dùng vector retrovirus đã xuất hiện ở động vật. Anti-oncogene : (các gene ức chế hình thành khối u – tumor suppressor genes) ức chế quá trình tăng sinh của tế bào khối u. Vd : gene p53 nằm trên tay ngắn của NST 17, khoảng 50% bệnh ung thư là do đột biến gene p53. Proto-oncogene (gene tiền ung thư) : đóng vai trò quan trọng trong sự điều hòa phát triển và tăng sinh của các tế bào bình thường. Sản phẩm của proto-oncogene bao gồm các nhân tố phát triển, các receptor của nhân tố phát triển hay các chất truyền tín hiệu của nhân tố phát triển. Khi bị đột biến chúng sẽ chuyển thành oncogene (gene gây ung thư). Sự tái tổ hợp các virus tạo nên các virus hoang dại có ba hình thức : sự tái tổ hợp trong dòng tế bào đóng gói và vector, tuy nhiên các virus này có thể bị loại bỏ khi tiến hành các thử nghiệm kiểm tra ; sự tái tổ hợp ở vector virus có khả năng sao chép ; sự tái tổ hợp giữa vector virus và các virus nội sinh. Sự tái hợp nếu thành công sẽ tạo thành những chủng virus có khả năng sao chép rất nguy hiểm. Do sử dụng virus làm vector nên trong cơ thể sinh vật cũng mang loại virus này. Các virus tuy được thiết kế là một vector tái bản thiếu Vì những lý do trên nên hiện nay phương pháp này chỉ có ý nghĩa trong phòng thí nghiệm, ít được dùng để tạo ra các sinh vật chuyển gene có ý nghĩa thương mại. Một số vector retrovirus : Murine Leukimia Virus (MLV) : Là retrovirus đơn giản với bốn gene Gag, Pro (mã hóa cho enzyme protease), Pol và Env. MLV là vector đầu tiên trong hệ thống retrovirus. Nó được sử dụng khá nhiều vì : Sinh học của MLV được biết rõ. Bộ gene của MLV là bộ gene retrovirus được tạo dòng sớm nhất. Cách xâm nhập vào vật chủ khá hiệu quả. Đa số MLV chỉ có khả năng xâm nhiễm vào tế bào của loài gặm nhấm, ít có khả năng xâm nhập vào tế bào người, trừ trường hợp được thiết kế để xâm nhiễm vào tế bào người. Lentivirus Là một họ của retrovirus, trong đó có HIV. Chúng có khả năng hợp nhất vào genome của tế bào chủ ở pha nghỉ khi tăng sinh và cả khi không tăng sinh. Khả năng này có được do sự có mặt của một trong số các protein virus, có khả năng nhắm tới genome ở vùng nhân. Lentivirus phức tạp hơn MLV, vector lentivirus đang được nghiên cứu rất nhiều do ứng dụng của nó trong liệu pháp gene. Vector dùng genome của lentivirus tạo ra các hạt virus tái tổ hợp có khả năng nhiễm vào tế bào đang phân chia hoặc không phân chia. Chúng chứa LTR đã biến đổi dẫn đến sự bất hoạt của genome virus hợp nhất, điều này làm giảm khả năng tái tổ hợp tạo ra virus mang gene ngoại lai nguy hiểm. Vector này có hiệu quả đặc biệt với việc chuyển gene vào chuột. (Lois, 2003) Ngoài hai loại kể trên, một số retrovirus khác cũng được sử dụng ở các mức độ khác nhau và tùy thuộc vào đặc điểm sinh học của chúng. Một số vector retrovirus khác Tên Đặc điểm nổi bật N2 Chứa 2 đầu 3’,5’ LRT, trình tự đóng gói dài với 418 nu gene gag và trình tự codon khởi đầu AUG của gene gag. Có thể tái tổ hợp tạo virus hoang dại. LNL 6 Chứa 2 đầu 3’,5’ LRT, trình tự đóng gói dài với 418 nu gene gag và đột biến ở codon bắt đầu dịch mã AUG thành codon bất hoạt UAG và phần đầu 3’ của gene env Nhóm LN Cấu trúc tương tự LNL 6 nhưng không có đầu 3’ của gene env. Gồm LNSX, LNCX, LXSN. Trình tự kí hiệu là trình tự của các phần trong vector với L là LRT, N là gene kháng neomycin, S là promoter SV40, C là promoter CMV và X là trình tự đa liên kết (polilinker) để giúp chèn các gene liệu pháp vào. Vector Adenovirus Adenovirus Từ “adeno” xuất phát từ tiếng Lating có nghĩa là “tuyến”, vì lần đầu tiên virus này được phân lập là từ amidam và tuyến vòm họng của người. Adenovirus gây các bệnh về đường hô hấp, chúng có thể nhiễm vào tế bào người không phân chia. Tuy gây bệnh nhưng đây là loại virus được dùng rộng rãi như một vaccin sống mà không có tác dụng phụ trong việc chống lại sự lây nhiễm qua đường hô hấp và viêm dạ dày, ruột. Chính vì thế nên adenovirus có khả năng là một vector chuyển gene hiệu quả và an toàn. Adenovirus có hình khối 20 mặt, DNA mạch kép thẳng dài khoảng 36kb, đầu 5’ chứa đoạn cuối lật ngược dài 100 – 1800 nu (trình tự IRT). Bộ gene gồm các thành phần sau : vùng gene cuối lật ngược (IRT), các gene sớm E (early gene), các gene muộn L (late gene), tín hiệu đóng gói P (packaging signal). Có năm gene sớm gồm : E1A, E1B, E2, E3 và E4. Chúng được phiên mã và dịch mã sau một thời gian ngắn khi các virus xâm nhâp vào tế bào, sau đó tạo thành các chuỗi polypeptid, có chức năng điều hòa. Các gene muộn L tạo thành 11 loại protein khác nhau với 7 protein ở vỏ và 4 protein ở lõi. Các edenovirus bám vào bề mặt tế bào thông qua các thụ thể là protein sợi. Khi vào cytoplasm, các tiểu phần virus sẽ được đưa vào nhân theo tín hiệu định vị nhân nằm trên vỏ capsid. Trong nhân, các gene của adenovirus và gene chuyển sẽ phiên mã và sau đó là dịch mã trong tế bào chất tạo protein virus và protein của gene chuyển. Giai đoạn đầu của quá trình phiên mã được thực hiện bởi enzyme RNA polymerase của tế bào chủ. Sự phiên mã của adenovirus xuất phát từ hai đầu của phân tử DNA thẳng. Tạo thành một phân tử mạch dơn và một phân tử mạch kép, phân tử mạch đơn sẽ cuộn tròn nhờ vào trình tự lật ngược ở hai đầu và mạch mới được tổng hợp từ đuôi 5’, hình thành một phân tử mạch kép mới. Vector Adenovirus Vector có kích thước chèn khoảng 7,5kb. Các promoter sử dụng vector adenovirus được tách từ cytomegalo virus. Hệ vector này chuyển gene tốt nhưng kông bền, do vậy tần số biểu hiện gene thấp. Vector adenovirus thế hệ thứ nhất : được tạo ra bằng cách thay thế trình tự 3kb của gene E1 bằng promoter và gene chuyển. Sự loại bỏ gene E1 làm virus không có khả năng tái bản trong tế bào chủ. Mặc dù vector này biểu hiện mức cao trong các cơ quan khác nhau nhưng chỉ trong thời gian ngắn do sự biểu hiện của gene chuyển gây độc tế bào hay cũng có thể là do bộ máy miễn dịch của tế bào vật chủ làm bất hoạt gene chuyển. Các thế hệ vector adenovirus sau : hủy bỏ các gene E2, E3 và E4 cùng với gene E1. Điều này làm giảm biểu hiện của gene muộn L, giảm đáp ứng miễn dịch tăng thời gian biểu hiện gene chuyển đồng thời làm tăng không gian cho gene chuyển vào. Các adenovirus tái tổ hợp mang gene chuyển sẽ xâm nhiễm vào trong tế bào mục tiêu. Tại đây, DNA tái tổ hợp lại không có khả năng tái tổ hợp vào genome của tế bào chủ nên không bền. Do đó khi dùng liệu pháp gene dựa trên adenovirus cần phải bổ sung adenovirus tái tổ hợp vào tế bào định kì. Vector adenovirus a)Genome Adenovirus b)Vector Adenovirus c)Tế bào đóng gói Ứng dụng của vector adenovirus : dùng chuyển gene in vivo vào phổi, gan, cơ, mạch máu, mắt, não và khối u ở động vật. Các hạn chế, nguy cơ tiềm ẩn khi sử dụng vector adenovirus : Giới hạn chính của vector adenovirus là thời gian biểu hiện của gene chuyển ngắn (khoảng 1 tháng), do sự đáp ứng miễn dịch với các thành phần protein còn lại của virus. Sự đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh chóng loại bỏ các tế bào nhận gene chuyển, có thể gây viêm hoặc rối loạn chức năng của cơ quan tại vị trí nhận gene đó. Cơ chế dung nạp vector adenovirus phát triển có thể gây bệnh bạo phát khi bị nhiễm virus hoang dại có cùng cơ chế, cách nhiễm bệnh. Sự phát triển những chủng virus in vivo, có khả năng sao chép và gây bệnh. Vector Adeno associated virus: Adeno associated virus (AAV) : Virus kết hợp với adeno có kích thước nhỏ, không gây bệnh cho người, có khả năng gắn vào vùng đơn của NST 19 ở người. Bộ gene DNA đơn, dài khoảng 4,7kb. Khả năng sao chép của AAV phụ thuộc vào một loại virus khác gọi là virus giúp đỡ (helper virus) như adenovirus. Do đó chúng có tên là virus kết hợp adeno, dù không gần gũi gì với adenovirus. Bộ gene gồm 2 vùng lật ngược lặp lại ở cuối bộ gene (ITR) và gene Rep và Cap. Trình tự IRT cần thiết cho việc sao chép, đóng gói và sát nhập của AAV Rep : mã hóa cho 4 chuỗi polypeptid có vai trò điều hòa sự sao chép. Cap : mã hóa cho 3 chuỗi polypeptid. Khi AAV xâm nhập vào nhân, polymerase của tế bào chủ chuyển bộ gene của AAV thành sợi đôi và sau đó phiên mã. Vetor AAV Tương tự như vector retrovirus, có thể hủy bỏ các trình tự rep, cap và thay thế bằng gene mong muốn cùng với promoter của nó. Việc loại bỏ hai gene rap, cap làm giảm sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể với vector. Phương pháp phổ biến dùng để đóng gói vector là tạo hai plasmid : plasmid thứ nhất mang gene chuyển và trình tự IRT ; plasmid thứ hai mang gene rep và cap, plasmid này không chứa trình tự IRT nên không thể sao chép và đóng gói thành hạt virus. Việc sản xuất số lượng lớn AAV vẫn còn nhiều khó khăn do sự chuẩn bị một lượng lớn plasmid chứa ITR là không dễ dàng ; và do độc tố của rep làm hạn chế khả năng tạo những dòng tế bào đóng gói ổn định, dùng để khuếch đại các vector ; việc sản xuất cần phải có sự hỗ trợ của một loại virus khác. Vector AAV chuyển gene khá hiệu quả trong lúc tế bào phân chia và cả lúc tế bào nghỉ. AAV biểu hiện chuyển gene 2 năm ở chuột, vài tháng ở chó, tinh tinh và người. Ở người, vector này có thể dùng để điều trị các bệnh mãn tính. Nguyên tắc tạo vector AAV Quy trình tạo vector tái tổ hợp Plasmid 1 mang gene trị liệu (TG) nằm giữa hai trình tự IRT. Plasmid 2 mang gene mã hóa giúp cho sự sao chép (rep), tạo vỏ (cap) nằm dưới sự kiểm soát của promoter (p) và trình tự polyadenin (p.a). sau khi làm tan tế bào chủ tạo thành các AAV và ADV (Adenovirus). Tách AAV ra khỏi hỗn hợp bằng cách ly tâm và bất hoạt ADV bằng nhiệt. Vector Herpes Simplex virus : Herpes Simplex virus (HSV) : HSV có nhiều dạng. Trong đó có dạng HSV-1 có thể nhiễm và tồn tại rất lâu trong trong tế bào thần kinh, đồng thời chúng có khả năng sinh sản trong nhân. Có cấu tạo từ bốn thành phần : vỏ bọc, teguenzymt, capsid và nhân. Có đường kính khoảng 150nm, trung tâm là nhân chứa DNA mạch đôi, một capsid bao bọc bên ngoài có cấu trúc 20 mặt, bao gồm 160 tiểu phần. Bên ngoài capsid là lớp vỏ định hình có cấu trúc sợi đặc trưng cho HSV có tên là teguenzymt. Ngoài cùng là lớp vỏ với bề mặt có nhiều tua nhỏ. DNA của HSV có kích thước 152kb mã hóa cho hơn 75 loại protein khác nhau. Quá trình nhiễm diễn ra khi virus bám vào tế bào chủ, capsid lọt vào bên trong và chuyển đến nhân của tế bào. Các thành phần của virus sẽ tương tác ức chế quá trình sinh tổng hợp của tế bào vật chủ. Chu trình sinh sản gồm quá trình li giải (sinh tan, gây tan) và pha tiềm tàng. Trong suốt quá trình li giải, chúng nhân đôi và vỏ virus được tạo ra. Trong pha tiềm tàng thì bộ gene củ virus dày lên và đặc lại. Genome của HSV chứa nhiều vùng dài và ngắn gọi là vùng UL (long unique region) và US (short unique region), mỗi bên được bao bởi các trỉnh tự lật ngược. Sự phiên mã các gene sớm nhờ nhân tố VP16 hiện diện trong virion (hạt virus). HSV chứa ba điểm khởi đầu sao chép (ori) : một ori nằm ở giữa vùng UL (OriL), ori thứ hai nằm trong vùng lật ngược US (OriS), ori thứ ba nằm trong mạch kép cuộn tròn cần cho sự sao chép. DNA virus được đóng gói thông qua trình tự đóng gói nằm trong vùng gene cuối của bộ gene. Ở người có nhiều khiếm khuyết gene khác nhau ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương và thần kinh ngoại biên, trong đó bao gồm các khối u, khả năng biến dưỡng, miễn dịch,…ví dụ như hội chứng suy giảm thần kinh mà điển hình là bệnh Alzheimer và Parkinson,… Các bệnh này liên quan đến các tế bào thần kinh nên HSV rất thích hợp để làm vector liệu pháp gene chữa trị những loại bệnh này. Vector HSV Hầu hết các vector dều dựa trên HSV-1 đều hủy bỏ 1 hay nhiều gene cần cho sự sao chép để lấy chỗ gắn gene chuyển và để tránh HSV-1 nhân lên hàng loạt trong tế bào chủ. Do đó các hạt virus HSV-1 sản xuất trong tế bào muốn sao chép thì phải “mượn” gene chủ để biểu hiện. Vector này có thể chứa một gene chuyển trình tự dài đến 25kb, tuy nhiên chúng có thể gây độc cho tế bào in vitro và gây viêm não khi được dùng với liều cao. Mặt khác, HSV có kích thước lớn nên việc thao tác gene trở nên khó khăn hơn. Để khắc phục các vấn đề trên, phiên bản vector HSV mới được phát triển. Vector này bao gồm các thành phần nguyên thủy của HSV như : trình tự khởi động sao chép và các tín hiệu đóng gói được kết hợp trong plasmid của E.coli. những vector có cấu trúc như vậy gọi là amplicon (amplicon plasmid). Phần lớn hệ thóng chuyển gene nhờ HSV đều dựa vào các helper virus để cung cấp các protein cần thiết cho sao mã và gắn kết các bộ phận virus. Bộ gene của helper virus cần phải biến đổi để không đóng gói được nên virus hoang dại không được tạo thành. Để sản xuất vector HSV, một amplicon plasmid được biến nạp vào tế bào vật chủ đã nhiễm helper virus HSV. DNA của HSV amplicon plasmid sao chép theo kiểu cuộn vòng, tạo thành phân tử DNA mạch đôi thẳng, phân tử này gồm khoảng 10 amplicon tương đương với kích thước bộ gene HSV. Sau cùng DNA được đóng gói trong vỏ capsid, những gene của helper virus không được đóng gói do đã bị loại bỏ trình tự đóng gói. Một hướng khác để tạo vector HSV tái tổ hợp là đồng nhiễm vào tế bào chủ chủng HSV hoang dại và plasmid mang gene chuyển. Trong quá trình sao chép của DNA plasmid và DNA của HSV thì xảy ra sự tái tổ hợp giữa bộ gene của HSV và trình tự tương đồng trên plasmid tạo nên bộ gene của HSV có cấu trúc đầy đủ và mang gene chuyển. Sự đóng gói diễn ra với cả hai hạt virus hoang dại và hạt virus tái tổ hợp. Chúng được giải phóng vào môi trường sau khi làm tan tế bào chủ. Các virus tái tổ hợp được chọn lọc qua phân tích PCR hoặc lai DNA, sau đó vector HSV tái tổ hợp được lưu giữ tránh xa HSV hoang dại. Vector HSV có thể chuyển gene vào não, tủy và cơ tuy nhiên hiện nay vẫn chưa sử dụng vector này trên đối tượng là người. Vector HSV Một trình tự khởi đầu sao chép của HSV (HSV ori), một tín hiệu đóng gói, gene trị liệu (TG) được đưa vào plasmid (HSV amplicon plasmid). Nó được đưa vào tế bào một tế bào chủ đã nhiễm HSV. DNA của HSV amplicon plasmid sao chép theo kiểu cuộn vòng sau đó được gói vào trong vỏ capsid. Bộ gene của HSV helper không được đóng gói. HSV mang nhiều phiên bản của gene trị liệu được giải phóng sau chu trình tan của tế bào và được dùng để nhiễm nạp vào tế bào thần kinh. Có hai rủi ro chính trong việc sử dụng vector HSV là : Độc tố của HSV tái tổ hợp vẫn còn. Vector HSV-1 hủy bỏ 4 gene sẽ ít độc hơn vector HSV-1 hủy bỏ 1 gene nhưng chúng vẫn có khả năng gây độc cho tế bào. HSV hoang dại có thể vẫn còn sau khi đã qua chọn lọc. Sự phát triển của HSV hoang dại gây nhiều bệnh nguy hiểm như viêm não,… Một số virus khác cũng được phát triển thành vector chuyển gene như : Baculovirus có DNA vòng mạch kép kích thước khoảng 80 – 230kb, sao chép trong tế bào côn trùng in vitro và in vivo, hiện đang sử dụng nhiều trong chuyển gene liệu pháp. Virus đậu mùa có DNA mạch kép dài 191kb. Tuy nhiên đây là các virus độc nên khi thao tác cần hết sức thận trọng. CÁC VECTOR KHÔNG PHẢI VIRUS Là những vector không có bản chất virus bao gồm tất cả phương tiện mang vật liệu di truyền không liên quan đến việc tạo ra các tiểu phần của virus. Được chia thành hai dạng cơ bản dựa vào thành phần phân tử : Các phân tử DNA, RNA tại chỗ được khuếch đại trong tế bào vi khuẩn hay tế bào eukaryote khác (plasmid, cosmid, bacteriophage,…). Các oligodeoxyribonucleic hay những phân tử tương tự được tổng hợp in vitro bằng phương pháp nhân tạo. DNA, RNA được khuếch đại trong vi khuẩn và tế bào Eukaryote : Nguyên tắc chung : Các phân tử DNA, RNA mục tiêu được đồng hóa trong các plasmid, hay NST nhân tạo. Tại đây chúng được khuếch đại trong tế bào vi khuẩn hay tế bào eukaryote. Sau đó một lượng lớn plasmid hay NST nhân tạo được thu nhận gọi chung là các DNA trần (naked DNA) mang gene chuyển. Các DNA trần này sẽ biến nạp vào tế bào mục tiêu (in vitro hoặc in vivo) bằng nhiều cách khác nhau. Một số điểm lưu ý đối với các vector : Tùy thuộc vào kích thước đoạn gene chèn vào mà ta có thể sử dụng các plasmid, bacteriophage, cosmid hay NST nhân tạo. Cách chuyển vật liệu di truyền vào. Duy trì vật liệu di truyền trong tế bào để có thể biểu hiện trong thời gian dài. Tạo vector mang DNA tái tổ hợp : Tạo nguồn gene : có ba phương thức khác nhau để thu nhận gene : Thu nhận DNA từ thư viện DNA : là phương pháp thường dùng ngay từ giai đoạn đầu phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp. Toàn bộ DNA của sinh vật được tách thành các đoạn nhỏ bằng cách lắc cơ học hoặc dùng enzyme giới hạn. Sau đó gắn các đoạn DNA này vào plasmid. Đây là phương pháp được sử dụng để lập ngân hàng DNA của hệ gene. Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học : muốn tổng hợp được một đoạn DNA thì cần phải biết trình tự của nó, sau đó dùng máy tổng hợp DNA tự động. Từ ngân hàng cDNA (DNA bổ trợ – complementary DNA) : là phương pháp tạo gene từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Đầu tiên là từ mRNA phiên mã ngược thành cDNA sợi đơn, rồi tổng hợp thành cDNA sợ kép nhờ enzyme DNA polymerase. Các cDNA mạch kép được gắn vào plasmid tạo plasmid tái tổ hợp. Tạo vector : Sau khi đã có đoạn DNA mong muốn, thì ta cần gắn chúng vào các vector chuyển gene theo các cách sau : Phương pháp dùng đầu dính : xử lý đoạn DNA và vector chuyển gene (như plasmid) bằng cùng một loại enzyme giới hạn. Trộn lẫn DNA và vector. Sau đó enzyme nối ligase để gắn các đoạn cần nối với nhau. Phương pháp dùng đoạn nối : các đoạn DNA được tổng hợp từ phương pháp hóa học thì không có trình tự nhận biết enzyme giới hạn thì ta cần gắn các đoạn cầu nối (linker, trình tự nhận biết enzyme giới hạn) vào hai đầu đoạn DNA cần chuyển. Bước tiếp theo tương tự như phương pháp dùng đầu dính. … Một số cách biến nạp vector vào tế bào : Việc biến nạp các phân tử DNA trần vào tế bào khó đạt hiệu quả cao, tuy nhiên vẫn có thể chuyển vào tế bào theo con đường in vitro và ex vivo. Đối với phương thức ex vivo, các gene được chuyển vào tế bào bằng cách sử dụng điện biến nạp, calcium phosphate,… Với hầu hết các tế bào hiệu quả chuyển gene chỉ đạt 5 – 10%. Các tế bào chuyển gene thành công sẽ sẽ được chọn lọc dựa trên marker chuyên biệt, các marker này thường nằm trên đoạn DNA chuyển. Các đoạn DNA lớn sẽ kém hiệu quả hơn trong chuyển gene. Việc chuyển gene in vitro thường kém hiệu quả hơn chuyển gene ex vivo. Có nhiều nghiên cứu đã sử dụng liposome, lipid tích điện để tăng hiệu quả chuyển gene. Một hướng nghiên cứu sử dụng phức hợp phân tử DNA và một tiểu phần virus đã bất hoạt, nhằm lợi dụng các protein dung nạp màng. Chẳng hạn như kết hợp giữa DNA với Hemagglutinating virus Janpan (virus Sendai) bị bất hoạt bởi nhiệt. Các adenovirus cũng có tiềm năng đưa DNA vào tế bào. Một tiến bộ quan trọng là kĩ thuật bọc DNA plasmid bên ngoài các hạt nhỏ bằng vàng, hạt Tungsten rồi bắn vào tế bào tế bào, gọi là bắn gene hay bắn DNA. Phương pháp này được phát triển đầu tiên để chuyển gene vào tế bào thực vật và hiện nay được mở rộng ở tế bào động vật. Lực bắn được tạo bởi dòng điện có hiệu điện thế cao sẽ đẩy các hạt mang DNA vào tế bào trong mô. Đã ứng dụng thành công trong chuyển gene vào tế bào da, mô cơ, gan và các cơ quan khác. Tuy nhiên sẽ có nhiều tế bào bị hư hại khi dùng phương pháp này nên nó ít được dùng trong liệu pháp gene. Kỹ thuật Calcium phosphate được phát triển đầu tiên vào năm 1973 nhằm xác định sự lây nhiễm của DNA virus và hiện nay được dùng trong biến nạp DNA vào tế bào nhận. Phương pháp này ủ tế bào nhận và hai chất đồng kết tủa là DNA và calcium phosphate. Kết tủa tạo thành bám vào tế bào và sẽ được chuyển vào tế bào qua quá trình ẩm bào. Tuy nhiên có rất ít DNA đi dến nhân và hợp nhất với genome tế bào nhận. Đây là phương pháp sử dụng phổ biến vì đơn giản, ít tốn kém, tế bào chết sau biến nạp thấp. Tuy nhiên tần số biến nạp và mức độ biểu hiện của gene chuyển thấp. Phương pháp vi tiêm với nguyên tắc là tiêm một lượng nhỏ DNA vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn dưới kính hiển vi. Phương pháp này cho phép đưa gene vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao, tuy nhiên thao tác cần phải rất tinh vi, tỉ mỉ và chính xác tránh làm tổn thương tế bào. Đối với động vật thì đây là phương pháp chuyển gene hiệu quả nhất hiện nay, mặc dù xác suất để gene chuyển xen vào genome tế bào chủ để biểu hiện vẫn còn thấp. Chuyển gene bằng kĩ thuật xung điện : đây là phương pháp dùng xung điện cao thế tác động trong khoảng khắc làm rối loạn tính chất của màng tế bào, tạo các lỗ thủng tạm thời giúp cho các phân tử DNA từ môi trường đi vào trong tế bào. Phương pháp này có thể áp dụng cho mọi loại tế bào. Tuy nhiên có hạn chế là nếu xung điện quá mạnh có thể làm tổn thương màng tế bào. Những hạn chế và rủi ro chính trong việc sử dụng các vector này : Có hai hạn chế chính là : tần số biến nạp thấp, thời gian gene chuyển thể hiện quá ngắn nên do đó hiệu quả chữa bệnh thấp. Lý do thời gian gene chuyển biểu hiện ngắn là các vector này không ổn định cấu trúc của mình trong tế bào đích. Có hai rủi ro khi dùng vector dạng này chữa bệnh là : có thể gây đột biến ung thư, các tác nhân giúp cho tế bào dung nạp DNA có thể gây độc cho tế bào nhận đó. Tuy nhiên việc sử dụng vector không virus này là tránh được việc tạo ra các chủng virus hoang dại nguy hiểm. Nên hiện tại liệu pháp gene dùng vector plasmid đang nghiên cứu thủ nghiệm, trước tiên là chữa các bệnh về suy thoái cơ và ung thư. Một số vector Plasmid vector : Plasmid là thông tin di truyền ngoài nhân có trong nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Chúng là những DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1 – hơn 200kb, có khả năng tự sao chép, tồn tại độc lập trong tế bào. Các plasmid có thể mang những gene có lợi cho vi khuẩn và chúng có thể biểu hiện ra kiểu hình như : kháng chất kháng sinh, thủy phân các chất hữu cơ phức tạp, ... Các plasmid có khả năng nhận một trình tự dài khoảng 15 kb. Một vi khuẩn có thể chứa hai hoặc nhiều loại plasmid, chúng được chia thành hai nhóm : tiếp hợp và không tiếp hợp. Trong tự nhiên, plasmid xâm nhập vào tế bào nhận nhờ sự tiếp hợp của vi khuẩn nhưng trong nghiên cứu thì các plasmid được chuyển vào tế bào bằng quy trình nhân tạo gọi là biến nạp gene. Đến nay, đã có ba thế hệ plasmid được sử dụng : Thế hệ đầu là các plasmid trong tự nhiên. Thế hệ thứ hai là các plasmid có cấu tạo phức tạp hơn. Một plasmid thường được sử dụng là pBR 322, kích thước là 4363bp nó có các gene kháng thuốc (Ampr – gene kháng ampicillin và Tetr – gene kháng tetracyclline), trình tự khởi đầu (ori) và các điểm nhận biết enzyme cắt hạn chế (EcoRI, HindIII, BamHI, SalI,…) Thế hệ thứ ba là các vector đa năng (polycloning plasmid), chúng có nhiều trình tự nhận biết các RE khác nhau được xếp thành đoạn dài gọi là polylinkers, vùng này cho phép chèn vào gần như bất cứ trình tự DNA lạ nào. Điển hình là : nhóm plasmid pUC: có kích thước khoảng 2600 bp, mang gene ampr và một phần gene lacZ’ (mã hóa β-galactosidase tạo khuẩn lạc màu xanh trên môi trường nuôi cấy có IPTG và X-gal). … Bacteriophage là virus chỉ lây nhiễm ở vi khuẩn có DNA thường là dạng mạch kép thẳng, có khả năng nhận một gene lạ dài 20 kb. Vì là một virus nên cách sử dụng phage làm vector tương tự như cac vector có dạng virus : phần trung tâm của phage λ chứa gene điều hòa quá trình tiềm tan bị cắt bỏ mà không làm suy yếu quá trình sinh tan ở phage, phage nói chung thì có nhiều điểm nhận biết enzyme giới hạn nên ta dùng kĩ thuật đột biến để sửa đổi các điểm không cần thiết ; như vậy ta có thể tạo được phage mang gene chuyển với những điểm nhận biết mong muốn. Cosmid vector : Là vector nhân tạo kết hợp các đặc tính của plasmid với phage. Cosmid chứa phần đầu cos của phage nên nó có thể gắn vào phần vỏ của phage. Mặt khác cosmid lại có phần gốc plasmid do đó nó có thể tự sao như plasmid của vi khuẩn. Hầu như toàn bộ DNA của vi khuẩn bị loại bỏ nên cosmid có khả năng mang 1 đoạn DNA lớn. DNA ngoại lai được ghép nối tạo cosmid tái tổ hợp và cosmid này được bọc trong vỏ của phage. Phage mang DNA tái tổ hợp không tự nhân đôi lên được do phần DNA phage đã bị loại bỏ nhưng chúng có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Sau khi vào vi khuẩn thì chúng lại có khả năng tự nhân đôi. Ngoài ra còn có các dạng vector khác như : Ti-plasmid – được sử dụng rất rộng rãi trong chuyển gene thực vật ; NST nhân tạo của vi khuẩn (BAC – Bacterial artifical chromosome), nấm men (YAC – Yeast artifical chromosome), động vật có vú (MAC – Mammalian artifical chromosome),… các NST nhân tạo này đều có các đặc tính của một NST như : vùng khởi đầu sao chép, tâm động, các trình tự điều hòa hoạt động của gene,… Một số vector thường gặp Vector Tế bào chủ Dung lượng chèn (kb) Plasmid E.coli 0,1 – 10 Phage λ λ/E.coli 10 – 20 Cosmid E.coli 35 – 45 BAC E.coli 50 – 300 YAC Nấm men 100 – 2000 MAC Tế bào động vật >2000 Oligonucleotide Nhóm thứ hai của các vector không dựa vào virus là các oligodeoxynucleotide và những polymer khác của nucleotide. Oligodeoxynucleotide là phân tử DNA dài khoảng 20 – 25 nu, chúng điều hòa biểu hiện gene trong tế bào theo những cách khác nhau. Có thể chia thành năm loại là : Antisense-oligonucleotide Ribozyme Liệu pháp triplex interference RNA (iRNA) SMaRT (Spliceosome Mediated RNA trans splicing : sự cắt nối chéo của các phân tử RNA thông qua Splicesome) Năm loại trên được chia hành ba nhóm chính dựa vào mục tiêu của liệu pháp là : Kĩ thuật antisense (Antisense-oligonucleotide, Ribozyme, iRNA) : nhằm ngăn cản sự biểu hiện của gene đột biến. SMaRT : sửa chữa các đột biến trên gene. Liệu pháp triplex. Các loại ON : Các ON bị phân hủy rất nhanh nên một lượng lớn các nucleotide được biến đổi để sử dụng trong kĩ thuật antisense. Nhìn chung có thể tiến hành ba phương pháp biến đổi chính trên ba vị trí chính của nucleotide : cấu trúc của base, phân tử đường biến đổi (đặc biệt là ở vị trí 2’), thay đổi sườn phosphate. Một số biến đổi khác cũng được thử nghiệm nhằm làm chắc chắn sự liên kết giữa các cặp base, tăng sự ổn định cấu hình xoắn kép giữa antisense và mRNA mục tiêu. ON thế hệ thứ nhất : Phosphorothioate (PS) oligonucleotide là thế hệ đầu tiên của DNA được sử dụng trong ON một cách rộng rãi. Ở thế hệ này, một trong các nguyên tử oxi không cầu nối trong liên kết phosphodiester được thay thế bằng phân tử lưu huỳnh. PS DNA ON đầu tiên được tổng hợp bởi Eckstein vào những năm 1960, sau đó được Matsukura sử dụng để ức chế sự nhân lên của virus HIV vào năm 1987. Các PS DNA hình thành những cặp base bắt cặp theo kiểu Watson-Crick, chúng hoạt hóa các RNase H và mang điện âm nên dễ dàng vận chuyển vào tế bào, đồng thời nó có những đặc tính dược học cần thiết cho tế bào. Tuy nhiên, các PS ON có khả năng gắn với các protein (nhất là tương tác với chuỗi polyanion) gây độc cho tế bào. Một nhược điểm khác nữa là sự giảm nhẹ lực liên kết với các phân tử RNA so với phân tử oligonucleotide bình thường. ON thế hệ thứ hai : Những vấn đề của ON thế hệ I được giải quyết ở thế hệ II. Các ON ở thế hệ II là những nucleotide được biến đổi ở ở vị trí 2’ ribose. Các 2’-O-methyl RNA và 2’-O-methoxy-ethyl RNA là thành viên quan trọng của nhóm này. AS-ON ít độc hơn PS ON, và kết hợp mạnh hơn với RNA bổ trợ (Kurreck và cs, 2002). Tuy nhiên 2’-O-alkyl RNA lại không thể cảm ứng cắt RNase H cắt RNA mục tiêu, nên hoạt động của antisense là ức chế sự dịch mã của ribosome. Một cách tiếp cận khác đối với các ON không hoạt hóa RNase H là thay đổi trình tự cắt nối (splicing). Khác với các AS-ON thông thường là ức chế sự biểu hiện của protein thì các AS-ON này được sử dụng để khóa các vị trí cắt nối. Kĩ thuật này đang được phát triển để chữa bệnh khiếm khuyết máu di truyền β-thalassemia. Trong hầu hết các kĩ thuật antisense, công việc hàng đầu là hoạt hóa RNase H để cắt các RNA mục tiêu. Do đó kĩ thuật Gapmer được phát triển để thực hiện mục đích này. Gapmer chứa 1 đoạn DNA trung tâm (hay các monomer DNA PS), hai đầu mang các nucleotide được biến đổi như 2’-O-methyl RNA. Như vậy sẽ ngăn cản quá trình phân hủy từ hai bên đầu cua phân tử antisense, do đó sẽ hoạt hóa hiệu quả RNase H của E.coli cũng như của người. Bên cạnh đó việc sử dụng phương pháp này sẽ giải quyết được nhiều vấn đề phát sinh từ ON như trường hợp “cắt không hợp lý” (irrelevant cleavage) và nhiều trường hợp khác. AS-ON thế hệ thứ ba : hiện nay có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau để biến đổi nucleotide được phát triển nhằm tăng lực liên kết mục tiêu, kháng nuclease và dược lực (pharmacokinetics). Peptide nucleic acid (PNA) là những phân tử DNA tương tự, dùng thay thế được nghiên cứu khá nhiều. Trong PNA, sườn deoxyribose phosphate được thay thế bởi các liên kết polyamide. PNA đầu tiên được phát triển bởi Nielsen và cs vào năm 1991, chúng có những đặc tính lai hữu dụng, sự ổn định sinh học cao nhưng lại không phát động được cơ chế cắt RNA của RNase H. Hơn nữa, chúng là những phân tử trung hòa về điện nên sự vận chuyển vào tế bào rất khó khăn. Theo các nghiên cứu in vivo, cho đến nay, PNA không độc vì chúng là phân tử không tích điện, khó kết hợp với protein, gắn được với nucleic acid. Đây có lẽ là ưu điểm đầu tiên của ON thế hệ III. N3’-P5’phosphoroamidate (NP) : là ví dụ về sườn phosphate bị biến đổi, trong đó nhóm 3’-hydroxyl của vòng 2’-deoxyribose được thay thế bằng nhóm 3’-amino. NP vừa kết hợp mạnh với mạch RNA bổ trợ lại kháng được nuclease. Do NP không cảm ứng được sự cắt của RNase H với RNA nên nó được dùng để can thiệp vào quá trình cắt nối mRNA. 2’-Deoxy-2’-fluoro-β-D-arabino nucleic acid (FANA) : là các ON đầu tiên được biến đổi đồng nhất đầu tiên, có khả năng cảm ứng RNase H cắt RNA bị gắn. Nucleic bị khóa (locked nucleic acid – LNA) : là một nucleotide được biến đổi mang nhiều hứa hẹn. Đây là một ribonucleotide chứa cầu methelene nối nguyên tử 2’-oxy của đường ribose với nguyên tử 4’-cacbor. Morpholino oligonucleotide (MF) : là những phân tử tương tự DNA, trong đó một nửa phân tử đường ribose bị thay thế bởi một nửa morpholino và những liên kết phosphoroamidate giữa các tiểu phần thay vì là phosphodiester. MF không hoạt hóa RNase H, nên để ức chế sự biểu hiện của gene nào đó chúng sẽ gắn vào vùng 5’ không dịch mã hay vào 25 base đầu tiên xuôi dòng của codon mở đầu để ngăn cản ribosome gắn vào, khóa sự dịch mã. Cyclohexene nucleic acid (CeNA) : thay thế vòng 5-furanose bởi vòng 6-, khiến cấu hình của các oligomer có độ cúng cao. CeNA hình thành nên xoắn kép ổn định với DNA hay RNA bổ trợ, bảo vệ các ON khỏi sự phân hủy bởi các nuclease. Hơn nữa có thể lai CeNA-RNA, có thể hoạt hóa RNase H, mặc dù hiệu quả thấp hơn 600 lần so với xoắn kép (Verbeure và cs,2001). Tricyclo-DNA (tcDNA) : là nucleotide khác, có khả năng gắn kết mạnh với trình tự bổ trợ, tcDNA không hoạt hóa RNase H cắt mRNA. Khái quát kĩ thuật antisense : Antisense là những đoạn oligonucleotide ngắn chừng 15 -20 nu được sử dụng để ức chế sự biểu hiện của gene mục tiêu, bằng cách gắn vào DNA, mRNA tại những vị trí gene chuyên biệt thông qua sự bắt cặp bổ sung. Sự bắt cặp này ngăn cản sự phiên mã hay dịch mã của gene, tức là ngăn cản sự hình thành các sản phẩm của gene. Do đó kỹ thuật này dùng để xác định hệ gene chức năng, đánh giá vai trò của một gene nào đó và liệu pháp gene. Khả năng của oligonucleotide hoạt động như một tác nhân antisense ức chế sự nhân lên của virus trong nuôi cấy tế bào được phát hiện bởi Zamecnik và Stephenson năm 1978. Và cho tới nay kĩ thuật antisense được phát triển như một công cụ mạnh cho mục đích chữa bệnh. Trên lý thuyết, kĩ thuật này có thể điều trị bất kì bệnh nào do biểu hiện của gene bệnh như nhiễm virus, ung thư,… 1998, thuốc antisense đầu tiên với thương hiệu Vitravene (Fomivirsen) ra đời, thông qua sự chấp nhận của Cơ quan Thực phẩm và Thuốc của Mĩ – FDA. Có ba chiến lược sử dụng anti-mRNA. Khác với các phương pháp cổ điển là thuốc gắn vào protein làm thay đổi chức năng của nó, các antisense làm biến đổi các mRNA, không cho chúng dịch mã thành protein. Chiến lược thứ nhất là dùng các antisense-oligonucleotide để bắt cặp với mRNA Chiến lược thứ hai là sử dụng ribozyme và các enzyme để phân hủy các RNA mục tiêu Chiến lược thứ ba là sử dụng các đoạn oligonucleotide nhỏ để “can thiệp” (interference), ức chế biểu hiện gene trong tế bào động vật có vú gọi là iRNA hay siRNA (small interference RNA) Vài cơ chế tác động của kĩ thuật antisense Sử dụng các AS-ON khóa sự dịch mã hay cảm ứng enzyme RNase H phân hủy các RNA mục tiêu, cách khác là dùng ribozyme. Sử dụng các siRNA để “can thiệp”, tạo thành phức hợp RISC và sau đó phân hủy RNA mục tiêu. Một số phương pháp làm ngưng quá trình dịch mã Antisense-oligonucleotide : Phương thức hoạt động của Antisense-oligonucleotide (AS-ON) : AS-ON sẽ hoạt hóa các RNase H, cắt mạch RNA của mạch kép RNA-DNA, dẫn đến sự phân hủy các mRNA mục tiêu Các AS-ON sẽ ức chế sự dịch mã do khóa cấu trúc không gian, ngăn cản sự di chuyển của ribosome, khi các AS-ON gắn lên đầu 5’, bộ máy dịch mã sẽ bị ngăn cản, các gene hư hỏng sẽ không biểu hiện Gây mất ổn định pre-mRNA (mRNA chưa trưởng thành) : các AS-ON sẽ gắn vào các vùng mã hóa, không mã hóa trên pre-mRNA, huy động sự phân hủy thông qua các RNase ; hay can thiệp vào quá trình gắn đuôi polyadenine hay quá trình hình thành mũ. Ức chế quá trình cắt nối của pre-mRNA Các AS-ON hoạt hóa các RNase H cắt mRNA Thiết kế các antisense-oligonucleotide : Đây là một bước quan trọng và cũng là thách thức chính trong việc ứng dụng thành công của kĩ thuật antisense-oligonucleotide. Các mRNA không tồn tại ở các dạng mạch xoắn ngẫu nhiên mà chúng có những cấu trúc nhất định, việc xác định cấu trúc của mRNA luôn giữ vai trò quan trọng trong hiệu quả hoạt động của AS-ON. Trên mạch mRNA chọn một đoạn vào khoảng 10 – 30 nu làm mục tiêu cho các AS-ON. Tuy nhiên các đoạn mRNA được chọn đó có thể hình thành cầu nối nội phân tử, tạo nên cấu trúc bậc ba và bậc bốn. Do đó phần lớn các đoạn mRNA không thể tương tác với AS-ON. Sự gấp cuộn mRNA có thể dự đoán bằng các chương trình máy tính mặc dù vẫn rất khó khăn. Hơn nữa những nhân tố trong tế bào cũng có ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc của mRNA. Ví dụ như sự kết hợp AUF1 – một nhân tố gắn vào vị trí giàu A+U – với mRNA sẽ hình thành nên cấu trúc của mRNA, điều này khiến cho phân tử xoắn chặt lại (condense) (Wahlestedt và cs, 2000). Có bốn hướng tiếp cận được phát triển gần đây trong việc thiết kế các AS-ON, mặc dù khi thực hiện vẫn còn rất nhiều sai sót. Kĩ thuật mRNA walking (đi bộ trên mRNA – giải trình tự bằng phương pháp đi bộ) : dựa trên việc tổng hợp nhiều trình tự khác nhau để bắt cặp với những vùng khác nhau trên trình tự mục tiêu. Thông thường có hàng trăm trình tự khác nhau sẽ được kiểm tra bằng phương pháp này và chỉ có vài trình tự cho kết quả tốt. Thuận lợi chính của phương pháp này là có thể thu nhận một lượng lớn các trình tự AS-ON thích hợp và hiệu quả. Tuy nhiên nó lại rất mất thời gian, công sức và khá tốn kém,… thích hợp với việc sàng lọc AS-ON với quy mô lớn. Cách thứ hai là dựa vào máy tính để dự đoán vùng gấp cuộn của mRNA, từ đó xác định những vị trí dễ bị ảnh hưởng của mRNA. Tuy việc dự đoán cấu trúc chưa chính xác nhưng phương pháp này rẻ, nhanh dễ tiến hành vì chỉ cần sàng lọc một vài trình tự. Phương pháp này có thể tìm được trình tự cần nhưng có thể trình tự đó không hiệu quả nhất. Scan trên oligonucleotide array, tất cả các AS-On bổ trợ với các vị trí trên mRNA được tổng hợp và lai với mRNA in vitro (Brassch và Corey, 2001). Cách này tạo tương quan tốt giữa các AS-ON với tế bào, nhất là tác dụng của AS-ON với mRNA. Thiết kế AS-ON dựa trên nguyên tắc cắt RNase H ra khỏi phân tử mRNA mục tiêu, sau đó tiến hành gắn ngẫu nhiên với thư viện oligonucleotide. Tiếp tục phân tích các vị trí gắn oligonucleotide bằng điện di trên gel (Renneberg và cs, 2002). Cách này có thuận lợi là thư viên oligonucleotide dễ tổng hợp và thích hợp với bất kì mRNA mục tiêu nào. Một số AS-ON được sản xuất Sản phẩm Công ti Mục tiêu Bệnh Hóa học Vitravene (Fomivirsen) ISIS Pharmaceuticals CMV IE2 CMV võng mạc lưới PS DNA Affintac (ISIS 3521) ISIS PKC-α Ung thư PS DNA Genasense Genta Bcl 2 Ung thư PS DNA Alicaforsen (ISIS 2302) ISIS ICAM-1 Vẩy nến, viêm đại tràng PS DNA ISIS 14803 ISIS Antiviral Siêu vi gan C PS DNA ISIS 2503 ISIS H-ras Ung thư PS DNA MG98 Methylgene DNA methyl transferase Khối u rắn PS DNA EPI-2010 EpiGenesis Pharmaceuticals Adenosin A1 receptor Hen suyễn PS DNA GTI 2040 Lorus Therapeutics Ribonucleotide Reductase (R2) Ung thư PS DNA ISIS 104838 ISIS TNFα Viêm khớp Thế hệ II Generation Avi4126 AVI BioPharma c-myc Ung thư, bệnh về thận,… Thế hệ III Generation Gem231 Hybridon PKA Riα Khối u rắn Thế hệ II Generation Gem92 Hybridon HIV gag AIDS Thế hệ II Generation GTI 2051 Lorus Therapeutics Ribonucleotide Reductase (R1) Ung thư PS DNA DNA Avi4557 AVI BioPharma CYP3A4 Thế hệ III Ribozyme 1981, Cech và cs phát hiện một số hoạt tính cắt của nhóm intron I thuộc Tetrahymena thermophilia và dùng thuật ngữ ribozyme để gọi những enzyme có bản chất RNA này. Sau này, Altman phát hiện vai trò và hoạt tính của thành phần RNA trong enzyme RNase P trong quá trình trưởng thành của mRNA. Các ribozyme có khả năng phân giải các RNA khi chúng gắn lên vị trí thích hợp. Phát hiện ribozyme và những nghiên cứu về cơ chế của quá trình cắt-nối cho thấy những chi tiết về cấu trúc của RNA. Lúc đầu các ribozyme được cho rằng để hoạt động được thì nó phải thông qua các ion kim loại hóa trị hai xúc tác. Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy “ribozyme kẹp tóc” vẫn có hoạt tính của ribozyme mà không cần các ion hóa trị hai (Murray và cs, 1998). Từ đó có thể thấy rằng trong tự nhiên, các ribozyme khác nhau sẽ thể hiện những cơ chế hoạt động khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc của nó. Trung tâm xúc tác của ribozyme kết hợp với RNA antisense thể hiện sự cắt chuyên biệt với từng mục tiêu RNA. Sự kết hợp hai kĩ thuật này tạo ra nhiều ứng dụng trong kĩ thuật y sinh vì RNA antisense chỉ bất hoạt các RNA mục tiêu mà không phân hủy nó, ngược với ribozyme. Sự kết hợp kĩ thuật của antisense và ribozyme tạo ra nhiều hi vọng cho những ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học (Khan và cs, 1998). Trong nuôi tế bào in vitro hay in vivo, ribozyme đều có thể được phiên mã từ các plasmid của tế bào mục tiêu hay có nguồn gốc ngoại sinh. Việc sử dụng các ribozyme tổng hợp hóa học ít phức tạp hơn ribozyme tự nhiên nên các nghiên cứu theo hướng ứng dụng ribozyme tổng hợp nhân tạo được tiến hành nhiều. Tuy nhiên các ribozyme dễ bị phân hủy trong môi trường nội bào nên những ribozyme tổng hợp phải kháng được các nuclease để có thể sử dụng nuôi cấy tế bào in vivo. Đảm bảo sự ổn định của ribozyme thì khó khăn hơn AS-ON vì khi đưa chúng vào tế bào thì thường dẫn đến sự thay đổi về cấu hình, làm mất hoạt tính. Sự phát triển của những thư viện dữ liệu đã mở ra con đường tạo các ribozyme mới với nhiều thuận lợi hơn. Một trong những công ti dẫn đầu trong lĩnh vực này là Ribozyme Pharmaceuticals (Boulder, CO, USA) đã tiến hành những thử nghiệm lâm sàng với những ribozyme hammerhead. interference RNA (iRNA) : Hiện tượng RNA tác động có thể làm “im lặng” gene sau phiên mã khi tiêm các RNA dài mạch đôi được phát hiện đầu tiên ở gium tròn Caenorhabditis elegans (Fire A và cs, 1998), gọi là sự can thiệp của RNA, RNA là RNA can thiệp (interference RNA – iRNA). Như vậy iRNA là một chiến lược mới để “tắt có chọn lọc” sự biểu hiện sau phiên mã của các mRNA, khả năng làm “im lặng” nhanh chóng, chọn lọc các sản phẩm gene đã mở ra những hướng mới trong nghiên cứu ung thư, các khiếm khuyết di truyền,… dsRNA – double strand RNA : RNA mạch đôi. siRNA – small interference RNA : iRNA nhỏ được hình thành khi cắt dsRNA thành các đoạn nhỏ dài khoảng 21 nu nhờ enzyme Dicer – giống RNase III. RISC – RNA interfering silencing complex : phức hợp làm im lặng can thiệp RNA được hình thành khi các siRNA bắt cặp với các protein trong tế bào, RISC sẽ gắn với các trình tự bổ sung trên mRNA và dẫn đến sự cắt các mRNA. Cơ chế hoạt động của iRNA : Các dsRNA dài được cắt thành các phân tử siRNA bởi enzyme Dicer Tạo phức hợp RISC mạch siRNA kép rồi tạo thành phức hợp RISC mạch siRNA đơn Các RISC với siRNA mạch đơn bổ sung trình tự với các mRNA mục tiêu và cắt nó. Kết quả là làm ‘‘im lặng’’ sự biểu hiện của gene và chức năng của nó. Tổng hợp siRNA : Chọn trình tự siRNA thích hợp : Scan trình tự mRNA mục tiêu từ codon mở đầu AUG để chọn lấy trình tự khoảng 21 nu. Xác định và loại bỏ những trình tự không chuyên biệt (những trình tự tương đồng với các mRNA khác) từ các cơ sở dữ liệu về bộ gene như BLAST. Tiếp theo, ta chọn vài trình tự dài chừng 21 nu từ những vùng khác nhau của mRNA. Hoạt động của iRNA Tổng hợp các siRNA : khi đã chọn được trình tự thích hợp thì ta có thể tiến hành tổng hợp siRNA từ những nu riêng rẻ ban đầu (hóa học) hay bằng những phương pháp khác. Một phương pháp là tạo vector biểu hiện siRNA dưới dạng shRNA (RNA kẹp tóc ngắn – short hairpin RNA) bằng một trình tự DNA dài khoảng 50 nu mã hóa cho shRNA được tạo dòng xuôi theo chiều promoter RNA polymerase III và kết thúc là một terminator. Trình tự 50 nu DNA chứa trình tự mục tiêu dài khoảng 21 nu và trình tự đối của nó cách 6, 7 nu để tạo cấu trúc kẹp tóc. Khi trình tự 50 nu phiên mã nó sẽ tự gấp lại tạo thành shRNA. Các shRNA này được cắt cấu trúc kẹp tóc ở đầu tạo thành siRNA Triplex DNA : Tuy ít phổ biến nhưng việc gắn trực tiếp các oligonucleotide lên DNA nhằm thay đổi sự biểu hiện của gene cũng là một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng. Có ít nhất ba cách khác nhau : Sử dụng các polyamide gắn vào các rãnh nhỏ của phân tử DNA mạch kép Dùng PNA (peptide nucleic acid) để thay thế một đoạn mạch của xoắn kép DNA Các oligonucleotide gắn vào các rãnh lớn của xoắn DNA hình thành các triplex. PNA sẽ thay thế một đoạn mạch của chuỗi xoắn kép DNA. Trong nhiều điều kiện cấu trúc PNA-DNA ổn định hơn xoắn kép DNA-DNA (Egholm và cs, 1993). Cấu trúc PNA cũng rất ổn định trong tế bào, tuy nhiên mức độ thành công còn tùy thuộc vào nhiều điều kiện : tế bào phôi hay tê bào đang biệt hóa,… Các nghiên cứu in vitro về sự tổng hợp DNA (dùng các DNA polymerase khác nhau) cho thấy rằng triplex có thể ức chế quá trình tổng hợp DNA (Hacia và cs, 1994). Các oligonucleotide hình thành triplex có khả năng ức chế phiên mã ở in vitro và cả in vivo (Bailey và Weeks, 2000). Tuy nhiên sự sao chép DNA in vivo có bị ức chế hay không thì chưa rõ (Maine, 1994), vì khi sử lý các tế bào nuôi tạo triplex thì chu trình tế bào không ngừng lại. Sự bắt cặp trong triplex DNA theo kiểu : Watson-Crick và Hoogteen SMaRT : sliceosome mediated RNA trans-splicing (cắt nối chéo RNA thông qua spiceosome). Ở eukaryote, gene sau khi được phiên mã tạo thành pre-RNA, chúng sẽ bị cắt bởi các phân tử spliceosome (một ribozyme) tạo các đoạn intron, exon và sau đó nối các đoạn exon lại với nhau. Quá trình này gọi là sự trưởng thành của phân tử mRNA, chúng được tiến hành theo hai cách : Cắt nối cis là quá trình cắt các intron và các exon của cùng một pre-RNA, các exon này được ghép lại để tạo thành mRNA trưởng thành xảy ra chủ yếu trong tế bào eukaryote. Cắt nối trans (cắt nối chéo) là quá trình xảy ra trên hai pre-mRNA khác nhau, exon của mRNA này có thể nối với exon của mRNA kia, rất hiếm xảy ra trong tế bào động vật. Liệu pháp SMaRT tiến hành dựa trên cơ sở của cắt nối trans. Cách này sẽ sửa chữa những đột biến gene nhờ thay thế các đoạn exon bị đột biến bằng các đoạn exon bình thường được tổng hợp đúng từ bên ngoài vào tế bào. TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005. Sinh học phân tử. Chương XIII – phần I : các vector, 173-181. Nxb Giáo Dục. Nguyễn Hoàng Lộc (chủ biên) – Lê Việt Dũng – Trần Quốc Dung, 2007. Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp. Chương 4 : các hệ thống vector, 72-101. Nxb ĐH Quốc Gia TP.HCM. Online : Phan Kim Ngọc – Phạm Văn Phúc, 2007. Công nghệ sinh học trên người và động vật. Chương 10 – phần II : vector dùng trong liệu pháp gene, 576-627.Nxb Giáo Dục. Trần Quốc Dung (chủ biên) – Nguyễn Hoàng Lộc – Trần Thị Lệ, 2006. Công nghệ chuyển gene (động vật, thực vật). Chương 1 : các vector sử dụng trong công nghệ chuyển gene ở động vật và thực vật, 1-47. Huế. Online : Các website như : …