Đề tài Góp phần khảo sát thành phần hóa học của trái mướp đắng

1 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG 2 1.1 Mô tả cây 2 1.2 Phân bố và sinh thái 4 1.3 Y học dân gian của cây mướp đắng 1.3.1 Rễ 5 1.3.2 Thân 5 1.3.3 Lá 5 1.3.4 Hoa 6 1.3.5 Trái 6 1.3.6 Hạt 6 2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MƯỚP ĐẮNG 7 2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 7 2.1.1 Thành phần hóa học 7 2.1.2 Tác dụng dược lý 7 2 2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 8 2.2.1 Thành phần hóa học 8 2.2.1.1. Triterpene 8 2.2.1.2. Steroid 9 2.2.1.3. Protein 9 2.2.1.4. Lipid 9 2.2.1.5. Carbohydrate 9 2.2.1.6. Caroteniod 10 2.2.2. Một số triterpene trong cây mướp đắng 10 2.2.2.1. Các triterpene glycoside được cô lập từ hạt mướp đắng 10 2.2.2.2 Các triterpene glycoside được cô lập từ trái mướp đắng 12 2.2.2.3 Các triterpene glycoside được cô lập từ lá và dây mướp đắng 16 2.2.3. Tác dụng dược lý 19 THỰC NGHIỆM 1. NGUYÊNLIỆU 23 2. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI MƯỚP ĐẮNG 23 2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid 24 2.1.1 Thuốc thử alkaloid 24 2.1.2 Định tính alkaloid 24 2..2. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid 25 2.2.1 Thuốc thử flavonoid 25 2.2.2 Định tính flavonoid 25 2.3. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất anthraglycoside 25 2.3.1 Thuốc thử anthraglycoside 25 2.3.2 Định tính anthraglycoside 25 2.4. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol 26 2.4.1 Thuốc thử sterol 26 2.4.2 Định tính sterol 26 3 2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin 26 2.5.1 Thuốc thử saponin 26 2.5.2 Định tính saponin 27 2.6. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử 28 2.7. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin 28 2.7.1 Thuốc thử tanin 28 2.7.2 Định tính tanin 28 2.8. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside 28 2.8.1 Thuốc thử glycoside 28 2.8.2 Định tính glycoside 29 3. TÁCH CHIẾT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT 30 3.1. Thiết bị và hóa chất 30 3.1.1. Thiết bị 30 3.1.2. Hóa chất 30 3.2. Chiết xuất các nhóm hợp chất 31 3.3. Phân lập và tinh chế các hợp chất 32 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 1. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI MƯỚP ĐẮNG 36 2. NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TINH KHIẾT 37 2.1. Chất MC1 37 2.1.1 Kết quả phân tích độ tinh khiết của MC1 bằng HPLC 37 2.1.2 Nhận danh cấu trúc hóa học của MC1A và MC1B 37 2.1.2.1. Mẫu chất MC1A 37 2.1.2.2 . Mẫu chất MC1B 41 2.2. Hợp chất MC6 47 2.3. Hợp chất MC5 51 KẾT LUẬN 4 1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƯỢC 52 2. KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO viii PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC xi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT brs : Broad singlet (NMR) COSY : Correlation Spectroscopy d : Doublet (NMR) đđ : Đậm đặc dd : Doublet of doublet (NMR) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO : Dimethyl sulfoxid PE : Petroleum ether EtOAc : Ethyl acetate EtOH : Ethanol HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC : High Performance Liquid Chromatography HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation IR : Infrared J : Coupling constant m : Multiplet (NMR) MeOH : Methanol mp : Melting point MS : Mass Spectroscopy 5 NMR : Nuclear Magnetic Resonance ppm : Parts per million Rf : Retention factor s : Singlet (NMR) t : Triplet (NMR) TLC : Thin Layer Chromatography UV : Ultra Violet α-Glc : α-glucosidase δ : Chemical shift DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Kết quả sắc ký cột thường 34 Bảng 3.1: Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong trái khổ qua 36 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR; DEPT và HMBC của MC1A 39 Bảng 3.3 : Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của MC1B 42 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT và HMBC của MC1B 45 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của MC6 49 Bảng 3.6: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT và HMBC của MC6 49 Bảng 3.7: So sánh dữ liệu phổ MC6 với tài liệu 50 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết xuất các nhóm hợp chất của trái mướp đắng 32 Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ trái mướp đắng 33 6 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây khổ qua 3 Hình 1.2: Dây và lá khổ qua 3 Hình 1.3: Trái khổ qua 3 Hình 1.4: Hạt khổ qua 3 Hình 1. 5: Giàn khổ qua (Phú Yên) 3 Hình 1.6: Var. charantia L. 5 Hình 1.7: Var. abbreviata Ser. 5 Hình 2.1: Quá trình sấy nguyên liệu 23 Hình 2.2: Sắc ký cột 30 Hình 2.3: Sắc ký lớp mỏng 30 Hình 3.1: Tinh thể MC1 37 Hình 3.2: TLC của MC1, MC1A và MC1B 37 Hình 3.3: TLC của MC1A ở các hệ giải ly khác nhau 38 Hình 3.4: Công thức cấu tạo của MC1A 39 Hình 3.5: TLC của MC1B ở các hệ giải ly khác nhau 42 Hình 3.6: Công thức cấu tạo của MC1B 45 Hình 3.7: Mẫu chất MC6 48 Hình 3.8: TLC của MC6 48 Hình 3.9: Công thức cấu tạo của MC6 51 Hình 3.10: Mẫu chất MC5 51 Hình 3.11: TLC của MC5 51 7 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh ThS. Phùng Văn Trung Người thầy đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em nghiên cứu tại phòng Hóa hợp chất thiên nhiên- Viện Công nghệ Hóa học. Khoa Công nghệ Hóa- Thực phẩm cùng Thầy, Cô và các bạn sinh viên trường Đại học Lạc Hồng đã quan tâm động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. ThS. Phan Nhật Minh, các anh chị trong phòng Hóa hợp chất thiên nhiên, cùng các anh chị nghiên cứu viên trường Đại học Cần Thơ, các bạn sinh viên đến làm đề tài nghiên cứu đã tận tình hướng dẫn, góp ý, cung cấp tài liệu, tạo điều kiện giúp em làm tốt công việc của mình. Con kính gửi đến Gia đình lòng biết ơn sâu sắc. Xin chân thành cảm ơn! LẠC HỒNG, tháng 11 năm 2009 Lê Thị Minh Nguyệt 8 LỜI MỞ ĐẦU Mướp đắng hay còn gọi là khổ qua (Momordica charantia L.), thuộc họ Bầu bí - Cucurbitaceae) được trồng ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là những vùng có khí hậu nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây được trồng ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung du và miền núi. Mướp đắng có vị đắng, tính hàn nên trong dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, trừ phiền, thanh tâm, sáng mắt, giảm đau… Khoa học ngày nay đã chứng minh dịch chiết trái mướp đắng có khả năng ức chế khối u, có tác dụng hỗ trợ men gan và điều trị bệnh đái tháo đường… Hiện nay bệnh đái tháo đường là một trong các bệnh mãn tính, gây tử vong cao, đứng hàng thứ ba trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thư. Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh ngày một gia tăng, đòi hỏi cấp thiết phải tìm ra các loại thuốc hiệu quả, đặc trị. Mướp đắng có tác dụng đăc biệt như vậy nhưng hiện nay vẫn còn rất ít công trình nghiên cứu về hợp chất trị bệnh đái tháo đường. Vì thế, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài : “Góp phần khảo sát thành phần hóa học của trái mướp đắng”. 9 TỔNG QUAN 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY MƯỚP ĐẮNG 1.1. Mô tả cây Tên khoa học: Momordica charantia L. Họ: Bầu bí (Cucurbitaceae) Tên nước ngoài: Bitter melon, bitter gourd (Anh), bitter apple, wild cucumber, bitter cucumber, ampalaya (Philipines), balsam pear (Mỹ), karela (Ấn Độ)… Tên Việt Nam: Mướp đắng, khổ qua, lương qua, cẩm lệ chi…[3] Ngoài ra nó còn có nhiều tên khác như: Mướp mủ, chua hao, dưa mát, hồng cô nương, hồng dương, bồ đạt, lại qua. [16] Mô tả cây mướp đắng: [3,21] Cây mướp đắng thuộc loại dây leo, có đời sống khoảng một năm. Đường kính dây khoảng 5-10mm, dây bò dài 5 – 7m, thân màu xanh nhạt có góc cạnh, leo được nhờ có nhiều tua cuốn, ở ngọn có lông tơ. Lá đơn, nhám, mọc so le, dài 5-10cm, rộng 4-8cm, phiến lá mỏng chia làm 5 – 7 thùy hình trứng, mép có răng cưa đều, mặt dưới lá màu xanh nhạt hơn mặt trên lá, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn. Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc, có cuống dài. Hoa đực có đài và ống rất ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhụy 5 rời nhau. Hoa cái có đài và tràng hoa giống hoa đực. Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2cm . Trái hình thoi, dài 8 – 15cm, gốc và đầu thuôn nhọn. Mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏ không đều. Trái khi chưa chín có màu xanh hoặc xanh vàng nhạt, khi chín có màu vàng hồng. Vì thế ở Trung Quốc, mướp đắng còn có tên là hồng dương, hồng cô nương. Khi chín, trái nứt dần ra từ đầu, tách ra làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong . 10 Hạt dẹt, dài 13 – 15mm, rộng 7 – 8mm, hình răng ngựa, thắt đột ngột ở hai đầu. Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ như màng hạt gấc. Hình 1.1: Cây mướp đắng Hình 1.2: Dây và lá mướp đắng Hình 1.3:Trái mướp đắng Hình 1.4: Hạt mướp đắng Hình 1.5: Giàn mướp đắng (Phú Yên) 11 1.2. Phân bố và sinh thái Mướp đắng được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các châu lục. Từ thời xa xưa, mướp đắng được trồng lần đầu tiên ở Đông Ấn và Nam Trung Quốc, được sử dụng như là loại rau ăn quả giàu chất sắt và vitamin C. Sau đó cây được du nhập sang châu Phi và châu Mỹ Latinh. Quần thể mướp đắng trồng đã trở nên rất phong phú với các giống cây đa dạng được tạo ra trong quá trình chọn giống và lai tạo.[29] Ở Việt Nam, mướp đắng được trồng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc Trung Nam, từ đồng bằng đến trung du và miền núi. Ở một số vùng núi cao và lạnh như Sa Pa (Lào Cai), Phó Bảng (Hà Giang)…không thấy có mướp đắng.[15] Trên thế giới, mướp đắng cũng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, châu Phi và vùng Caribbean.[29] Cây mướp đắng có biên độ sinh thái tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng từ 20 đến 35oC, lượng mưa hàng năm từ 1500mm đến 2500mm, độ cao đến 1000m. Cây chịu đựng được nhiều điều kiện đất khác nhau nhưng phát triển tốt nhất trên đất thoát thủy tốt, giàu chất hữu cơ. Mướp đắng có thể trồng quanh năm. Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa quả sau 7 – 8 tuần gieo trồng. Hoa thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng. Sau khi trái già, cây sẽ tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4 – 5 tháng tồn tại. Hiện nay, cây vẫn còn tồn tại ở hai quần thể: Mọc hoang và được trồng trọt. Loại trồng trọt rất phong phú về giống nhưng đều được xếp chung vào chi mướp đắng (Momordica charantia L.). Tuy nhiên, căn cứ vào kích thước, hình dạng, màu sắc của quả mà chia mướp đắng thành hai chủng loại: − Momordica charantia L. var. charantia L., trái to (đường kính > 5cm), màu xanh nhạt, gai tù, ít đắng. − Momordica charantia L. var. abbreviata Ser., trái nhỏ (đường kính < 5cm), màu xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng. 12 Hình 1.6: Var. charantia L. Hình 1.7: Var. abbreviata Ser. 1.3. Y học dân gian của cây mướp đắng Hầu hết các bộ phận của cây như rễ, thân, lá, hoa, trái, hạt đều có thể dùng làm thuốc chữa bệnh. [4] 1.3.1 Rễ Rễ tươi, sắc nước uống, mỗi ngày một thang, từ 1000ml nước với 60g rễ mướp đắng tươi, sắc còn 400ml, chia làm 2 – 3 lần uống, có thể áp dụng cho mọi dạng bệnh. Rễ mướp đắng dùng trị lỵ, nhất là amip. Tại Ấn Độ, dịch rễ (cũng như lá, trái) mướp đắng được dùng trị bệnh tiểu đường, do có tác dụng làm giảm đường huyết. Rễ mướp đắng còn có thể trị bệnh gan. [2] 1.3.2 Thân Dây mướp đắng được dùng làm thuốc chữa viêm xoang, chảy nước mũi có mùi hôi hoặc bệnh gan làm vàng da. [13] 1.3.3 Lá Lá có vị đắng, tính mát. Ăn lá non trị bệnh nóng bức trong mình. Giã lá vắt nước, thêm chút muối, uống trị bệnh nóng mê man hoặc trị mụn nhọt, rôm sẩy. Ngoài ra, lá còn có thể trị được rắn cắn, làm thuốc nhuận trường, hạ sốt. [2, 4] 13 1.3.4 Hoa Hoa mướp đắng được dùng để chữa đau dạ dày, lỵ cấp tính , đau mắt. [4,15] 1.3.5 Trái Trái còn xanh có vị đắng, khi chín thì ít đắng hơn. Trái mướp đắng có tính hàn (mát), không độc. Trái xanh có tính giải nhiệt, làm tiêu đờm, nhuận tràng, bổ thận, nuôi can huyết, bớt mệt mỏi, giảm stress, xoa dịu thần kinh, giải độc, lợi tiểu, làm bớt đau khớp. Khi chín mướp đắng có tính bổ thận, kiện tỳ, dưỡng huyết, diệt giun (sán, lãi), đồng thời có tác dụng làm sáng mắt, bổ tim, bổ máu, mát gan, rất thích hợp với những người đau gan, đau lá lách.[22] Ở Trung Quốc, trái mướp đắng còn dùng để trị đột quị tim, bệnh sốt, khô miệng, viêm họng. Ở Ấn Độ, dịch trái mướp đắng được dùng trị rắn cắn. Người ta còn dùng bột trái mướp đắng để hàn các vết thương (làm kéo da non), trị vết loét ác tính. Ở Thái Lan, dịch trái được dùng trị bệnh về gan, lá lách.[2] Với tính diệt khuẩn và chống oxi hóa, trái mướp đắng làm da mịn màng, trị mụn trứng cá hay bệnh vẩy nến, và ngay cả với vết thương do côn trùng cắn, nhiễm trùng da. Mặt khác, trái mướp đắng còn cung cấp nguồn năng lượng dồi dào và tăng khả năng chịu đựng cho cơ thể.[22] Ngoài các công dụng trên, trái mướp đắng còn được dùng để trị nhiều bệnh như: Trị ho, sốt, kiết lỵ, dạ dày, đau tức, đái dắt, phù thủng do gan, mắt đỏ đau nhức, giải nhiệt, hồi hộp, buồn phiền, tắm cho trẻ em trị rôm sảy, làm hạ đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insulin). [17] 1.3.6 Hạt Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độc, giải cảm, trị ho, lợi tiểu. Hạt còn chữa rắn cắn, chữa nhọt độc sưng tấy, vết thương nhiễm trùng, hạ sốt đau họng và chống thụ thai.[13] Tại nhiều nước khác, hạt mướp đắng được dùng để trị bệnh đái tháo đường.[18, 22] 14 Ngoài ra, theo một số nghiên cứu gần đây cho biết các hoạt chất trong hạt mướp đắng còn có tác dụng chống ung thư, làm hạ huyết áp, kháng virus HIV…[17] 2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MƯỚP ĐẮNG 2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 2.1.1 Thành phần hóa học Các tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng và Lê Minh Phượng của Viện Dược liệu đã thống kê và khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây mướp đắng. Tuy nhiên, các tác giả này chưa cô lập được các hoạt chất có hoạt tính dưới dạng chất tinh khiết cũng như chưa xác định cấu trúc của các hoạt chất này, mà chỉ định lượng theo chất G6, một aglycon của nhóm glycoside .[14] Các tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung ở Viện công nghệ Hóa học đã cô lập và nhận danh được hai hợp chất từ hạt: Momordicoside A và Momordicoside B và bốn hợp chất từ trái: Momordicoside K, Momordicoside L, 3-O- [β-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene và 23-O-β-D-allopyranosyl 5β,19- epoxycucurbita-6,24-dien-3β,22,23ξ-triol 3-O-β-D-allopyranoside. [10] 2.1.2 Tác dụng dược lý Y học cổ truyền và dân gian Việt Nam đã có nhiều kinh nghiệm chữa bệnh từ mướp đắng, nhưng chỉ ở dạng nguyên liệu thô ban đầu hoặc ở các dạng nước ép, nước sắc mà thôi. Ngày nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm trái mướp đắng nhưng đa số ở dạng thực phẩm chức năng như trà hòa tan, trà túi lọc. Điển hình là sản phẩm trà mướp đắng của Viện Dược liệu hay trà túi lọc mướp đắng của Công ty Traphaco. Nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu và cộng sự đã sản xuất chế phẩm Morantin từ thành phần glycoside của trái mướp đắng dạng to, màu trắng và chứng minh tác dụng hạ đường huyết của nhóm glycoside trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan. [14] 15 Các tác giả Nguyễn Thị Như, Nguyễn Thị Bay đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của một bài thuốc nam trên thực nghiệm lâm sàng, đó là sản phẩm trà túi lọc mà thành phần mướp đắng qua chiếm 60%. Các tác giả Mai Phương Mai, Võ Phùng Nguyên cũng đã thăm dò tác dụng hạ đường huyết của một số bài thuốc dân gian ở mô hình đái tháo đường bằng streptozotocin trên chuột nhắt, mà thành phần của bài thuốc cũng có chứa trái mướp đắng. 2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 2.2.1 Thành phần hóa học [14, 32] Người ta đã tìm thấy khoảng hơn 200 hợp chất có trong cây mướp đắng và được thống kê sơ bộ thành các nhóm chính như sau: 2. 2.1. 1. Triterpene − Triterpene glycoside: • Momordicosides A, B, C, D, E, F1, F2, G, I, K, L. • Cucurbitane triterpenoid 1. • Momordicine II, momordicine III. • Goyaglycosides -a, -b, -c, -d, -e, -f, -g, -h. • Momordicin I, momordicin II. − Triterpene saponin: Goyasaponins I, II, III. − Các triterpene khác: • Momordicin, momordicinin, momordicilin. • Cucurbitane triterpenoid 3, cucurbitane triterpenoid 6. • β-amyrin, cycloartenol, erythrodiol, gypsogenin, karounidiol, multiflorenol, oleanolic acid, squalene, taraxerol… 16 2.2.1.2. Steroid − Steroid glycoside: • β-sitosterol-3-O-β-glucoside; 3-O-[β-D-glucosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene. • 3-O-[6’-O-palmitoyl-β-D-glucosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene; • 3-O-[6’-O-stearoyl-β-D-glucosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene. − Sterol: Elasterol; lanosterol; momordenol; β-sitosterol; α-spinasterol; stigmasterol; stigmasta-5-ene-3β,25-diol. 2.2.1.3. Protein − p-insulin, v-insulin. − Map-30. − Momorcharin I, momorcharin II, α-momorcharin, β-momorcharin, ∆- momorcharin, ε-momorcharin, γ-momorcharin. − Momordin, momordin A, momordin B. − Ribosome-inactivating proteins 1, 2, 3, 4. − Trypsin inhibitor mcti-I, trypsin inhibitor mcti-II, trypsin inhibitor mci-3. − Các protein khác: Alanine, β-alanine, phenylanaline, arginine, asparagine, aspartic acid… 2.2.1.4. Lipid Arachidic acid, capric acid, cholesterol, α-elaeostearic acid, lauric acid, linoleic acid, linolenic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid. 2.2.1. 5. Carbohydrate D-galacturonic acid, α-glucose, β-glucose, inulin, mycose, pectin, trehalose, α- trehalose. 17 2.2.1. 6. Carotenoid β-carotene, cryptoxanthin, lutein, lycopene, mutatochrome, phytofluene, rubixanthin, zeaxantin, zeinoxanthin… Ngoài ra còn có các thành phần khác: Alkaloid: Charine, zeatin, zeatin riboside…; monoterpene: p-cymene, menthol ; sesquiterpene: Nerolidol; sapogenin: Diosgenin; các chất khoáng: Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, P, N, I, F… Trong nhiều nghiên cứu, người ta đã chứng minh được rằng có ít nhất ba nhóm hợp chất có tác dụng làm giảm lượng đường huyết hoặc có hoạt tính kháng đái tháo đường. Đó là hỗn hợp của hai steroid glycoside gọi là charantin, các peptide giống insulin (p- insulin) và alkaloid. Các hợp chất này chủ yếu tập trung ở trái mướp đắng. 2.2.2. Một số Triterpene Glycosede có trong cây mướp đắng 2.2.2.1. Các triterpene glycoside được cô lập từ hạt mướp đắng [25, 26, 27,28,31,33] ™ Momordicoside A − Là 3-O-β-gentiobioside của cucurbit-5-en-3β,22(S),23(R),24(R),25-pentaol. − Công thức chung: C42H72O15; M = 816 đvC; mp = 181 – 187oC; [α]20D = +1.05o. − Công thức cấu tạo: O O O O H OH H OH OH OH OH OH OH OH OH HOHO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' 1" 2"3" 4" 5" 6" 18 ™ Momordicoside B -3-O-β-D-xylopyranosyl(1→4)-[β-D-glucopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside của cucurbit -5-en-3 β,22(S),23(R),24(R), 25pentaol. − Công thức chung: C47H80O19; M = 948 đvC; mp = 238 – 242oC; [α]20D= +6.15o. − Công thức cấu tạo: H OH H OH OH OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 O O O O OH OH OH OH OH HO 1' 2'3' 4' 5' 6' 1" 2"3" 4" 5" 6" O OH OHHO O 1''' 2'''3''' 4''' 5''' ™ Momordicoside C − Là 3-O-β-gentiobioside của cucurbit-5-en-3 β,23,24,25-tetraol. − Công thức chung: C42H72O14; M = 800 đvC; mp = 224 – 227oC; [α]20D = +13.9o. − Công thức cấu tạo: 19 O O O O H OH OH OH OH OH OH OH OH HOHO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' 1" 2"3" 4" 5" 6" ™ Momordicoside D − Là 3-O-β-gentiobioside của cucurbita-5,24-dien-3 β,22,23-triol. − Công thức chung: C42H70O13; M = 782 đvC; mp = 199 – 203oC; [α]20D = -126o. − Công thức cấu tạo: O O O O H OH OH OH OH OH OH HOHO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' 1" 2"3" 4" 5" 6" OH 2.2.2.2. Các triterpene glycoside được cô lập từ trái mướp đắng [25, 26, 27,28,31,33] ™ Momordicoside F1 − Là 3-O-β-D-glucopyranoside của 5,19–epoxy-25-methoxy-5β-cucurbita-6,23- dien-3β-ol. − Công thức chung: C37H60O8; M = 632 đvC; kết tinh trong MeOH–H2O (1:1) cho tinh thể hình kim, không màu; mp = 198 – 203oC; [α]20D = -11o. 20 − Công thức cấu tạo: O O HO OMe OH OH HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O ™ Momordicoside F2 − Là 3-O-β-D-allopyranoside của 5,19-epoxy-5β-cucurbita-6,23-dien-3β,25-diol. − Công thức chung: C35H58O8; M = 618 đvC; kết tinh trong acetone-nước cho tinh thể hình vảy, không màu; mp = 155 – 158oC. − Công thức cấu tạo: O O HO OH OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O OH HO ™ Momordicoside G − Là 3-O-β-D-allopyranoside của 5,19 –epoxy-25-methoxy-5β-cucurbita-6,23- dien-3β-ol. − Công thức chung: C37H60O8; M = 632 đvC; kết tinh trong CH3CN-H2O cho tinh thể hình kim, không màu; mp = 183 – 187oC; [α]20D = -107.3o. 21 − Công thức cấu tạo: O O HO OMe OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O OH HO ™ Momordicoside I − Là 3-O-β-D-glucopyranoside của 5,19 –epoxy-25-methoxy-5β-cucurbita-6,23- dien-3β,25-diol. − Công thức chung: C36H58O8; M = 618 đvC; kết tinh trong MeOH 50% cho chất bột màu trắng; mp = 210 – 216oC; [α]20D = -110o (C=1.00; MeOH). − Công thức cấu tạo: O O HO OH OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 1' 2'3' 4' 5' 6' O OH HO ™ Momordicoside K − Là 3-O-β-D-glucopyranoside của 3β, 7β-dihydroxy -25-methoxy cucurbita-5,23- dien-19-al. − Công thức chung: C37H60O9; M = 648 đvC; kết tinh trong MeOH cho tinh thể hình kim, không màu, vị đắng; mp = 236 – 237oC; [α]20D = 63.3o. 22 − Công thức cấu tạo: HO OMe 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 O 1' 2'3' 4' 5' 6' OHC O HO OH OH HO ™ Momordicoside L − Còn có tên là 7-O-β-D-glucopyranoside của 3β,7β,25-trihydroxy-cucurbita-5,23- dien-19-al. − Công thức chung: C36H58O9; M = 634 đvC; kết tinh trong CHCl3-MeOH cho tinh thể hình kim, không màu, vị đắng; mp = 227 – 232oC; [α]20D = +57.3o. − Công thức cấu tạo: HO OH 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 O 1' 2'3' 4' 5' 6' OHC O HO OH OH HO 2.2.2.3. Các triterpene glycoside được cô lập từ lá và dây mướp đắng ™ Cucurbitan triterpenoid I 23 − Là 3β,7 β,23-trihydroxycucurbita-5,24-dien-7-O- β-D-glucoside. − Công thức chung: C36H60O8; M = 620 đvC; dạng bột vô định hình, [α]20D = +89o (C=0.43; MeOH). − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 O O OH OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' HO OH OH ™ Cucurbitan triterpenoid II − Là 3β,7 β,23-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien–19-al. − Công thức chung:C30H48O4; M = 472 đvC; dạng bột vô định hình, [α]26D = +58.0o (C=0.48; MeOH). − Công thức cấu tạo sau: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH CHO OH ™ Cucurbitan triterpenoid III 24 − Là 3β,7 β-dihydroxy-25-methoxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al. − Công thức chung: C31H50O4; M = 486 đvC; dạng bột vô định hình; [α]26D = +48.9o (C=0.45; MeOH). − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH CHO OMe ™ Momordicine I − Là 3β,7 β,23ξ-trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al. − Công thức chung: C30H48O4; M = 472 đvC; mp = 125 – 128oC ; [α]20D = +81.3o. − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH OHC OH ™ Momordicine II − Là 23-O-β-glucopyranoside của 3β,7β,23ξ-trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al. − Công thức chung: C36H58O9; M = 634 đvC; kết tinh trong CHCl3 cho tinh thể dạng bột không màu. 25 − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH OHC O O OH OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' HO OH ™ Momordicine III − Là 23-O- β-glucopyranoside của 3β,7β,23ξ-trihydroxy-24-oxo-cucurbita-5,25- dien-19-al. − Công thức chung: C36H56O10; M = 648 đvC. − Công thức cấu tạo: HO 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 31 323 OH OHC O O OH OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' HO OH O 2.2.3. Tác dụng dược lý Theo y học hiện đại, mướp đắng có tác dụng: − Diệt vi khuẩn và virus, chống lại các tế bào ung thư, hỗ trợ đắc lực cho bệnh nhân ung thư đang chữa bằng tia xạ. 26 − Chống các gốc tự do – là nguyên nhân gây lão hóa và phát sinh các bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tổn thương thần kinh, viêm đường tiết niệu, đái tháo đường. − Tăng oxy hóa glucose, ngăn chặn sự hấp thu glucose vào tế bào. Ức chế hoạt tính các men tổng hợp glucose. − Có tác dụng sinh học giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin. − Có tác dụng tốt với người mắc bệnh đái tháo đường type 2. Hỗ trợ tăng tác dụng, giảm liều và giảm tác dụng phụ của các loại sulfamid trị đái tháo đường type 2. Dịch chiết trái mướp đắng có khả năng ức chế khối u hỗ trợ men gan, chữa được nhiều bệnh như đái tháo đường, lách, gan, khớp, gout ….[14, 30] Theo tài liệu , cao MeOH 50% từ trái mướp đắng cho tác dụng hạ đường huyết 25% (liều dùng 30mg/kg), cao butanol cho kết quả là 34% với liều dùng như trên. Các tác giả này cho rằng các hợp chất phân cực, tan nhiều trong butanol có khả năng làm giảm đường huyết. Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết insulin từ tuyến tụy. Nghiên cứu in vivo trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan cho thấy, khi dùng nước ép trái mướp đắng với liều dùng 6ml/kg B.W cho kết quả tối ưu, làm giảm lượng đường máu ở thỏ bình thường sau 2 giờ và tăng trở lại sau 3 giờ. Tuy nhiên ở thỏ mắc bệnh, lượng đường máu tiếp tục giảm tới 4 giờ sau khi cho uống rồi mới bắt đầu tăng trở lại .[33] Theo báo cáo của Đại học Y khoa Calcuta (Ấn Độ), đã thử nghiệm cho 6 bệnh nhân đái tháo đường type 2 uống mỗi ngày một lần 100ml nước sắc mướp đắng tươi. Sau 3 tuần lễ uống thuốc liên tục, đo lượng đường trong máu (khi đói) đã giảm được 54% so với ban đầu. Sau 7 tuần dùng thuốc, cả 6 bệnh nhân đều không thấy đường trong nước tiểu, lượng đường trong máu như người bình thường. ™ Tác dụng dược lý của charantin Giới thiệu[32] 27 Charantin là một hỗn hợp 2 steroid glycoside được công bố là một trong những hoạt chất có hoạt tính kháng đái tháo đường type 2, được chiết tách và cô lập từ trái mướp đắng. Năm 1962, Lotlikar và Rao lần đầu tiên cô lập được charantin với hàm lượng khoảng 0.01%. Đến năm 1965, Sucrow đã xác định được đây là một hỗn hợp 2 steroid glycosides (tỉ lệ 1:1) gồm 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene và β- sitosterol-3-O-β-glucoside , với công thức lần lượt như sau: O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O CTPT: C35H58O6 (M = 574) O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O CTPT: C35H60O6 (M = 576) Năm 1966, Lotlikar và Rao đã đưa ra qui trình chiết xuất charantin với hàm lượng cao hơn, đồng thời công bố về hoạt tính kháng đái tháo đường của hoạt chất này, được phân lập từ dịch chiết EtOH của trái mướp đắng khô . 28 Sau đó đến năm 1979, Pugazhenthi và Suryanarayana Murthy đã khẳng định một lần nữa charantin là hỗn hợp 2 chất và hoạt tính sinh học của nó vẫn có thể mất đi trong quá trình chiết xuất kéo dài [32]. Hoạt tính kháng đái tháo đường của charantin Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của charantin trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan: − Chọn thỏ ở cả con đực và con cái với trọng lượng cơ thể vào khoảng 1.5 – 3kg, được gây đái tháo đường bằng cách tiêm Alloxan qua tĩnh mạch với liều lượng 200mg/kg. Chỉ có 4 trong 20 con còn sống sau 5 ngày được tiếp tục đem đi khảo sát. − Charantin hòa tan trong Tween 80 với nồng độ 0.3%. Xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch 5ml dung dịch này. Mức đường huyết giảm dần từ giờ thứ nhất đến giờ thứ tư sau khi xử lý, nhưng sau đó sẽ từ từ lấy lại mức ban đầu. − Hoạt tính của charantin có hiệu lực hơn 5 giờ, cao nhất ở giờ thứ tư, được ghi nhận là có tác động như nhau ngay cả khi xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch. Với liều 50mg/kg cho uống làm giảm 42% lượng đường huyết ở giờ thứ tư và giảm còn 28% ở giờ thứ năm sau xử lý. Tuy nhiên khi sử dụng với liều lượng 25mg/kg cho uống sẽ cho kết quả giảm đường huyết tương tự chỉ với liều dùng 15mg/kg tiêm qua tĩnh mạch. [32] Charantin cho hoạt tính giảm đường huyết cao hơn Tolbutamide, một loại thuốc thông thường để chữa đái tháo đường, với cùng liều dùng. Mặc dù cách thức thay đổi glucose huyết khi xử lý ở cả 2 trường hợp đều giống nhau. Tuy nhiên việc charantin có phải là chất duy nhất trong trái có hoạt tính giảm đường huyết hay không vẫn còn là vấn đề đang được đặt ra. Vì giả sử để có được 50mg charantin cần tới hơn 1.5kg trái tươi. Trong khi theo các nghiên cứu, chỉ với liều dùng 50 – 60ml nướp ép trái hàng ngày đã cho kết quả lâm sàng tốt, chứng tỏ không phụ thuộc hoàn toàn vào rất ít khối lượng của charantin có trong đó. MAP, một protein kháng siêu vi khuẩn, có ức chế nhiễm virus HIV-1 ở tế bào lympho T và bạch cầu đơn nhân to, nó không độc với tế bào bình thường không bị nhiễm. Hạt và vỏ trái chứa một chất nhựa, một saponin glycoside, và những alkaloid gây nôn và tiêu chảy. Nhiều protein có hoạt tính dược lý được phân lập từ hạt , như các protein α–momorcharin và β–momorcharin có tác dụng độc hại gan trên tế bào gan chuột cô lập. Ở Trung Quốc, người ta đã phân tách được hai hoạt chất hạn chế sinh sản là α– protein và β–protein từ hạt. Các thí nghiệm nuôi cấy, ghép phôi in vitro cho thấy 2 hoạt 29 chất này có tác dụng ức chế quá trình làm dày đặc nguyên bào phôi trước khi làm tổ và hình thành phôi ở thai kỳ đầu, từ đó phôi ngừng phát triển, thoái hóa phân hủy dẫn đến sẩy thai [13]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy α–protein và β–protein cũng có ảnh hưởng đến sự sinh sản của phôi chuột nhắt trắng và ảnh hưởng đến việc tổng hợp phân tử lớn tế bào nội mô tử cung; chúng cũng có khả năng ức chế tổng hợp ADN, ARN và protein, làm cho sự phát triển của nội mạc tử cung bị ức chế [13]. 30 THỰC NGHIỆM 1. NGUYÊN LIỆU Mướp đắng do Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Dược liệu miền Trung cung cấp, là loại mướp đắng còn non, hạt chưa phát triển. Trái được cắt thành lát mỏng, sấy ở nhiệt độ dưới 60oC trên hệ thống sấy nguyên liệu đến khối lượng không đổi. Tiếp đó, nguyên liệu được xay nhuyễn để quá trình tách chiết được triệt để hơn. Hình 2.1: Quá trình sấy nguyên liệu 2. NHẬN DANH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI MƯỚP ĐẮNG Để giúp cho việc nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất hoạt chất từ cây thuốc, trước hết cần phải tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học để chúng ta có khái niệm sơ bộ về mặt định tính, từ đó có thể định hướng cho việc chiết xuất cũng như việc xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trong cây thuốc. Từ mẫu cây, sử dụng kỹ thuật chiết tách khác nhau để có được cao chiết ethanol toàn phần hoặc các loại cao có tính phân cực khác nhau. Áp dụng các phương pháp phân tích sơ bộ về hóa- thực vật để biết trong cao chiết có thể chứa các loại hợp chất tự nhiên nào. Trong báo cáo này, em xin trình bày về phương pháp sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc xuất hiện kết tủa mà em đã thực hiện. 31 2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid [7, 11] 2.1.1 Thuốc thử alkaloid Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa với alkaloid. * Phản ứng tạo kết tủa có màu: − Thuốc thử Mayer: • Công thức: 1.35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%. • Dấu hiệu: Tạo kết tủa vô định hình màu trắng vàng. − Thuốc thử Dragendoff: • Công thức: + Dung dịch A: 850mg Bismut nitrat trong 40ml H2O và 10ml acetic băng. + Dung dịch B: Hòa tan 8g KI trong 20ml H2O. Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử. • Dấu hiệu: Tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ. − Thuốc thử Wagner: • Công thức: Hòa tan 5g Iod trong 100ml dung dịch KI 10%. • Dấu hiệu: Cho kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen. − Thuốc thử Bouchardat: • Công thức: 2.5g Iod và 5.0g KI hòa tan trong 10ml nước cất. • Dấu hiệu cho kết tủa màu nâu hoặc màu vàng đậm. 2.1.2 Định tính alkaloid Thí nghiệm: Tẩm 10g bột trái mướp đắng bằng 5ml dung dịch NH4OH 25%. Đậy kín bằng giấy lọc rồi để qua đêm. Sau đó đem chiết với 25ml CHCl3. Dịch CHCl3 được lắc với 10ml dung dịch H2SO4 2%. Lấy dịch acid làm mẫu thử. -Với thuốc thử Wagner: Cho kết tủa màu nâu. 32 -Với thuốc thử Mayer: Dung dịch có màu trắng đục. 2.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid [6, 7] 2.2.1 Thuốc thử flavonoid Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với acetate chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với FeCl3. Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Cindin của Willstater. Thuốc thử là tập hợp các hóa chất gồm: dung dịch HCl đậm đặc, bột Mg kim loại, rượu isoamyl [CH3(CH3)CHCH2CH2CH2OH]. 2.2.2 Định tính flavonoid Thí nghiệm: Đun hoàn lưu 5g bột trái mướp đắng trong 50ml EtOH 95o trong 30 phút. Lọc, lấy 1ml dịch EtOH vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg vào lắc thì thấy dung dịch có màu tím. 2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất anthraglycoside 2.3.1 Thuốc thử anthraglycoside Anthraquinon (phản ứngBotrager): Pha hữu cơ của dịch chiết anthraquinon sẽ có màu đỏ khi có sự hiện diện của chất kiềm. Do vậy dạng kết hợp phải được thủy phân và chuyển sang dạng oxy hóa trước khi thực hiện phản ứng. Anthron và anthranol: − Phản ứng Schouteten: Cho huỳnh quang xanh với natri borat. − Phản ứng tạo màu xám với natri nitrodimethyl alanin. 2.3.2 Định tính anthraglycoside [7 ] Thí nghiệm: Đun hoàn lưu 5g bột trái mướp đắng trong 30ml ether ethyl. Lọc và lặp lại nhiều lần cho đến khi dịch ether không còn màu. Tập trung dịch lọc và lắc với 50ml dung dịch KOH 10%. Lớp kiềm được trung hòa với dung dịch HCl 25% đến pH=7. Lọc, lấy phần kết tủa trên giấy lọc, đem hòa tan bằng EtOH 95o. Nhỏ vài giọt dung dịch KOH 10% vào dịch EtOH thấy có màu vàng cam. 33 Bã sau khi đã loại các chất tan trong ether được chiết tiếp với EtOH 95o. Nhỏ vào dịch EtOH vài giọt KOH 10% thấy có màu đỏ cam. 2.4.Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid [6, 7] 2.4.1 Thuốc thử steroid − Liebermann-Burchard: − Anhydrid acetic: 20ml. H2SO4 đậm đặc: 1ml. Cho 1 giọt thuốc thử vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ có màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ bền vững trong một thời gian. − Phản ứng Rosenheim: Cho vài giọt dung dịch acid tricloacetic 90% vào dịch CHCl3, nếu có sterol sẽ xuất hiện màu tím, sau 20 phút chuyển sang màu xanh lơ. − Salkowski: Dung dịch tách làm 2 lớp: Lớp H2SO4 có màu xanh, lớp CHCl3 có màu nâu đỏ. 2.4.2 Định tính steroid Thí nghiệm: Hòa tan 1g bột trái mướp đắng khô trong 20ml CHCl3. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử. Với mẫu cao, sử dụng 0.1g hòa vào 30ml CHCl3, lấy dịch lọc làm mẫu thử. • Với thuốc thử Liebermann- Burchard: Có màu hồng đỏ. • Với thuốc thử Salkowski: Thêm 0.5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc. Dung dịch tách làm hai lớp, lớp H2SO4 (lớp trên) có màu xanh và lớp CHCl3 (lớp dưới) có màu đỏ với thuốc thử Salkowski. 2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin [7] 2.5.1 Thuốc thử saponin Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin. 34 Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện qui định. Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml (thu được nước sắc). Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, …10ml nước sắc. Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao các cột bọt. Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin. − Phản ứng Liebermann: • Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 1ml anhydrid acetic, thêm từ từ 0.3 – 0.5ml H2SO4 đậm đặc. • Dấu hiệu: + Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene. + Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid. − Phản ứng Kahlenberg: • Cách thực hiện: Hòa tan mẫu bằng 0.5ml dung dịch SbCl3 bão hòa trong CHCl3, khuấy đều, đem soi UV. • Dấu hiệu: + Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene. + Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid. 2.5.2 Định tính saponin Thí nghiệm: Cân 1g bột trái mướp đắng cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa. Lọc, để nguội. Cho khoảng 35 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ và lắc mạnh trong 15 giây thì thấy rất nhiều bọt (cột bọt cao 6cm). 2.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử [11] Thí nghiệm: Acid hóa 2g bột trái mướp đắng bằng 20ml dung dịch H2SO4 1%. Lọc, cô cạn còn 5ml. Nhỏ vào mẫu thử 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B. Đun nhẹ thấy xuất hiện tủa màu đỏ nâu. 2.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin [6, 7 ] 2.7.1 Thuốc thử tannin • Stiasny: Formol (36%): 20ml. Dung dịch HCl đậm đặc : 10ml. • Dung dịch gelatin mặn: Gelatin: 2g. Dung dịch NaCl bão hòa: 10ml. • Dung dịch acetate chì bão hòa cho kết tủa màu vàng nhạt. • Dung dịch FeCl3 1% trong nước tạo phức màu đen. 2.7.2 Định tính tanin Thí nghiệm: Lấy 5g bột trái, thêm 100ml nước cất rồi đun sôi trong 10 phút. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 – 4 giọt dung dịch acetate chì bão hòa thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt. Lấy 2ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin mặn, xuất hiện kết tủa trắng. Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2ml dung dịch FeCl3 1%, dung dịch chuyển thành màu nâu đen. 2.8 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside [6, 7 , 11] 2.8.1 Thuốc thử glycoside Thuốc thử tác dụng lên phần aglycon. 36 − Thuốc thử Tollen (xác định theo đường khử trong glycoside): • Công thức: Pha 0.5ml dung dịch AgNO3 10% với 0.5ml dung dịch NaOH 10%. Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan kết tủa. • Dấu hiệu: Có Ag kết tủa. − Thuốc thử Molish: • Công thức: Nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1ml H2SO4 đậm đặc. • Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ thẳm. − Thuốc thử Baljet: • Công thức: Pha dung dịch acid picric 1% trong EtOH với dung dịch NaOH 10% trong nước theo tỷ lệ thể tích 1:1. • Dấu hiệu: Nhỏ 3 – 4 giọt thuốc thử vào 1mg chất thử, nếu có màu vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính. − Thuốc thử Legal: • Công thức: Hòa tan 1mg chất thử trong 2 – 3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0.5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2N. • Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ tím. 2.8.2 Định tính glycoside Thí nghiệm: Lấy 10g bột trái mướp đắng khô, loại các chất không phân cực bằng ether petrol. Tiếp tục chiết bằng soxhlet với dung môi EtOH 50o. Dịch lọc EtOH 50o được loại tạp bằng acetate chì cho đến khi không còn trầm hiện. Sau đó, loại acetate chì dư bằng Na2SO4 bão hòa. Cô cạn dịch lọc được cao glycoside thô. Hòa tan cao bằng EtOH 95o và lấy dung dịch này làm mẫu thử. - Với thuốc thử Tollen: Xuất hiện kết tủa trắng. - Với thuốc thử Molish: Có màu đỏ carmine. 37 3.TÁCH CHIẾT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1 Thiết bị - Điểm chảy (mp oC) được đo trên máy Electrothermal IA 9000 Series. - Sắc ký cột thường dùng silicagel 60, MERCK, đường kính hạt: 0.04 – 0.63mm. - Sắc ký bản mỏng TLC được thực hiện trên bản silicagel 60 F254, MERCK tráng sẵn. - Máy cô quay chân không. - Máy soi UV Hình 2.2: Sắc ký cột thường Hình 2.3: Sắc ký bản mỏng (TLC) 3.1.2 Hóa chất - Petroleum ether, Trung Quốc - Diethyl ether, Trung Quốc - Chloroform, Trung Quốc - Ethyl acetate, Trung Quốc 38 - Acetone, Trung Quốc - Methanol, Trung Quốc - Nước cất - Ethanol 95o 3.2. Chiết xuất các nhóm hợp chất Trái mướp đắng sấy khô, xay nhỏ (4.5 kg), được chiết với ethanol 95o. Sau đó, cô loại dung môi thu được cao dạng sệt gọi là cao tổng (cao EtOH 95o) (537 g). Cao tổng hòa tan trong một lượng nước vừa đủ sệt. dung dịch này được lắc với petroleum ether (PE), thu lấy dịch PE và cô loại dung môi thu được cao PE. Pha nước còn lại sau khi lắc với EP được lắc tiếp tục với ethyl acetate (EtOAc), dịch EtOAc cô loại dung môi thu được cao EtOAc (219 g). Pha nước còn lại sau khi lắc với EtOAc được lắc tiếp tục với methanol (MeOH), dịch MeOH cô đuổi dung môi thu được cao MeOH (254 g). 39 Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết xuất các nhóm hợp chất của trái mướp đắng 3..3. Phân lập và tinh chế các hợp chất Sau khi thu được các cao chiết, chúng tôi đã sử dụng sắc ký bản mỏng để kiểm tra xem trong mỗi loại cao chiết có khoảng bao nhiêu hợp chất. So sánh với những hợp chất đã phân lập được từ trái mướp đắng trước đây, chúng tôi phát hiện trong cao EtOAc có nhiều hợp chất. Vì vậy, chúng tôi đã dùng cao EtOAC để phân lập các hợp chất sử dụng phương pháp sắc ký côt thường. Bột trái mướp đắng Cao EtOH 95o Dịch nước Dịch nước Cao EtOAc Dịch nước Cao MeOH Cao PE Chiết với ethanol 95o Cô đuổi dung môi Chiết với petroleum ether Cô đuổi dung môi Chiết với ethyl acetate Cô đuổi dung môi Chiết với methanol Cô đuổi dung môi 40 Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ trái mướp đắng Từ cao EtOAc, tiến hành lên cột thường với các thông số sau: - Khối lượng cao: 219 g - Khối lượng silica gel: 600 g - Đường kính cột: 9 cm - Chiều cao lớp silica gel: 35 cm - Dung môi ổn định cột: Petroleum ether. - Thể tích lấy mỗi phân đoạn: 500ml Tăng dần độ phân cực của hệ dung môi giải ly bằng cách tăng dần tỉ lệ CHCl3 trong hệ PE:CHCl3. Theo dõi cột bằng sắc ký bản mỏng, hiện vết bằng cách phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện. − Sắc ký cột thường − Sắc ký bản mỏng Tinh chế Tinh chế MC 5 Ph ân đ oạ n 14 MC 1 MC1A & MC1B MC 6 Cao EtOAc Ph ân đ oạ n 11 Ph ân đ oạ n 10 − Sắc ký cột thường − Sắc ký bản mỏng Ph ân đ oạ n 1 Ph ân đ oạ n… Ph ân đ oạ n 8 Ph ân đ oạ n 9 41 Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC (hệ dung môi giải ly CHCl3:MeOH:H2O = 9:1; 85:15; 8:2; 7:3:0.5; 6:4:1). Gom các phân đoạn có Rf giống nhau, thu được tất cả 14 phân đoạn chính. Bảng 2.1: Kết quả sắc ký cột thường Phân đoạn Hệ dung môi Kết quả thử TLC 1 PE:CHCl3 = 8:2 Vết kéo dài 2 PE:CHCl3 = 7:3 Nhiều vết 3 PE:CHCl3 = 6:4 Vết kéo dài 4 PE:CHCl3 = 4:6 Nhiều vết 5 PE:CHCl3 = 3:7 Nhiều vết 6 PE:CHCl3 = 2:8 Vết kéo dài 7 CHCl3 100% Vết kéo dài 8 CHCl3:MeOH = 95:5 Có 2 vết đậm 9 CHCl3:MeOH = 93:7 Vết kéo dài 10 CHCl3:MeOH = 9:1 Có 2 vết đậm 11 CHCl3:MeOH = 88:12 Có 1 vết đậm 12 CHCl3:MeOH = 85:15 Vết kéo dài 13 CHCl3:MeOH=8:2 Nhiều vết 14 CHCl3:MeOH=75:25 Vết kéo dài 42 ™ Tại phân đoạn 8 (dung môi giải ly CHCl3:MeOH = 95:5), chạy sắc ký bản mỏng thu được hai vết đậm. Rửa bằng ethyl acetae và kết tinh lại nhiều trong chloroform thu được hai chất . Kí hiệu MC1và MC6 . ™ Tại phân đoạn 10 (dung môi giải ly CHCl3:MeOH = 9:1), chạy sắc ký lớp mỏng thu được hai vết đậm. Rửa bằng ethyl acetate, kết tinh lại nhiều lần thu được một chất tinh khiết. Kí hiệu MC5. 43 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT TRONG TRÁI MƯỚP ĐẮNG Qua khảo sát sơ bộ các hợp chất trong trái mướp đắng, kết quả chi tiết như sau: Bảng 3.1: Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong trái mướp đắng TT HỢP CHẤT THUỐCTHỬ HIỆN TƯỢNG KẾTLUẬN 1 FLAVONOID Mg/HCl đđ Tủa hồng nhạt + 2 ACID BÉO Nhỏ trên giấy lọc và bốc hơi Để lại vết không khô + 3 ANTHRAGLYCOSIDE KOH 10% Màu đỏ cam ++ 4 STEROID Liebermann Xanh lục ++ Acetate chì Vàng nhạt ++ Gelatin Tủa trắng ++ 5 TANIN FeCl3 Màu đen ++ Mayer Tủa trắng + 6 ALKALOID Dragendoff Dung dịch có màu cam + 7 SAPONIN Tạo bọt Tạo bọt bền ++ 8 ĐƯỜNG KHỬ Fehling A+B Tủa đỏ nâu ++ Thymol 20% và H2SO4 đđ Cho màu đỏ thẩm +++ 9 GLYCOSIDE Tollen Kết tủa trắng +++ Chú thích: (+): ít, (++): nhiều, (+++): rất nhiều 44 2. NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TINH KHIẾT 2.1. Hợp chất MC 1 2.1.1 Kết quả phân tích độ tinh khiết của MC1 bằng HPLC Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy MC1 là hỗn hợp của hai chất, ký hiệu MC1A và MC1B. Tiến hành xác định cấu trúc của 2 chất bằng các phương pháp phổ. Các hợp chất trong MC1 được cô lập bằng HPLC điều chế, thu được 12mg MC1A và 9mg MC1B. Kiểm tra TLC của MC1A, MC1B so với MC1 đều cho một vết tròn rõ màu tím, Rf = 0.25 (hệ giải ly CHCl3:MeOH = 9:1). Vậy chúng tôi dự đoán MC1 là charantin. Hình 3.1: Tinh thể MC1 Hình 3.2: TLC của MC1, MC1A và MC1B 2.1.2. Nhận danh cấu trúc hóa học của MC1A và MC1B 2.1.2.1. MC1B Các đặc tính của MC1B − Dạng bột, màu trắng, kết tinh trong MeOH. − Điểm nóng chảy: mp = 281 – 283oC. − Sắc ký bản mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH: 45 • Giải ly bằng hệ CHCl3:MeOH = 9:1 cho vết tròn màu tím có Rf = 0.25. • Giải ly bằng hệ CHCl3:MeOH = 85:15 cho vết tròn màu tím có Rf = 0.37. Hệ giải ly CHCl3:MeOH = 9:1 Hệ giải ly CHCl3:MeOH = 85:15 Hình 3.3: TLC của MC1B ở các hệ giải ly khác nhau Nhận danh cấu trúc MC1B Phổ 13C-NMR ( phụ lục 1.1) cho biết MC1B có 35C. Trong đó có 2 mũi ở vùng nối đôi có δ = 140.11 và 121.98 ppm chứng tỏ trong cấu trúc của MC1B có 1 nối đôi. Mũi 140.11 biến mất trên phổ DEPT (phụ lục 1.2) chứng tỏ đây là C tứ cấp có nối đôi. Đồng thời trên phổ DEPT (phụ lục 1.2 và 1.2a) còn cho thấy trong phân tử MC1B có 6 nhóm – CH3, 12 nhóm –CH2– (trong đó có 1 nhóm –CH2OH của phần đường ở 61.716 ppm), 14 nhóm >CH–, 3C tứ cấp. Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của MC1B Vị trí C 13C (δppm) DEPT90 DEPT135 Kết luận 1 36.53 Biến mất Mũi âm –CH2– 2 29.42 Biến mất Mũi âm –CH2– 3 77.01 Mũi dương Mũi dương >CH–O 46 4 38.52 Biến mất Mũi âm –CH2– 5 140.11 Biến mất Biến mất >C=C 6 121.98 Mũi dương Mũi dương –CH= 7 31.74 Biến mất Mũi âm –CH2– 8 31.70 Mũi dương Mũi dương –CH< 9 49.59 Mũi dương Mũi dương –CH< 10 36.54 Biến mất Biến mất >C< 11 20.87 Biến mất Mũi âm –CH2– 12 39.58 Biến mất Mũi âm –CH2– 13 42.15 Biến mất Biến mất >C< 14 56.57 Mũi dương Mũi dương –CH< 15 24.09 Biến mất Mũi âm –CH2– 16 28.04 Biến mất Mũi âm –CH2– 17 55.88 Mũi dương Mũi dương –CH< 18 11.62 Biến mất Mũi dương –CH3 19 18.77 Biến mất Mũi dương –CH3 20 35.96 Mũi dương Mũi dương –CH< 21 18.54 Biến mất Mũi dương –CH3 22 33.77 Biến mất Mũi âm –CH2– 47 23 25.90 Biến mất Mũi âm –CH2– 24 45.69 Mũi dương Mũi dương –CH< 25 28.98 Mũi dương Mũi dương –CH< 26 19.54 Biến mất Mũi dương –CH3 27 19.08 Biến mất Mũi dương –CH3 28 22.88 Biến mất Mũi âm –CH2– 29 11.72 Biến mất Mũi dương –CH3 1’ 100.93 Mũi dương Mũi dương O–CH–O 2’ 73.36 Mũi dương Mũi dương >CH–OH 3’ 76.22 Mũi dương Mũi dương >CH–OH 4’ 70.00 Mũi dương Mũi dương >CH–OH 5’ 76.75 Mũi dương Mũi dương >CH–O 6’ 61.72 Biến mất Mũi âm –CH2–OH Mũi đặc trưng cho vị trí 1’ của đường ở 100.98 ppm và các mũi trong vùng 61.72 đến 77.00 ppm của nối C–O trên 13C-NMR (phụ lục 1.1 và 1.1b) chứng tỏ MC1B là 1 glycoside có 1 đơn vị đường. Dấu hiệu định tính trên TLC cho vết có màu tím hồng khi phun dung dịch H2SO4 và hơ nóng cho phép giả thiết phần aglycon là 1 sterol. Phần đường có các mũi ở δppm : 100.98; 76.36; 76.75; 73.36; 70.00 và 61.72 trên 13C-NMR (phụ lục 1.1 và 1.1b) chứng tỏ đây là đường glucose. Hằng số tương tác spin – spin của proton 1’ và 2’ trên 1H-NMR J = 8 Hz chứng tỏ 2 proton này đều ở vị trí trục, vì vậy liên kết giữa phần đường và aglycon theo kiểu β (phụ lục 1.3 và 1.3b). 48 Vậy MC1B có tất cả 35 nguyên tử carbon, 6 nguyên tử oxy. Như vậy công thức phân tử là C35H60O6; phân tử khối là 576 đvC. Từ những số liệu trên và so sánh với tài liệu [5,32], xác định cấu trúc hóa học của MC1B là β-sitosterol-3-O-β−glucopyranoside. O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O Hình 3.4: Công thức cấu tạo MC1B Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT của MC1B Vị trí C/H 1H-NMR δppm (số H; dạng mũi; J = Hz) 13C- NMR δppm Loại carbon 1 1.80; 0.99 (2H, m) 36.53 –CH2– 2 1.80; 1.47 (2H, m) 29.42 –CH2– 3 3.43 (1H, m) 77.00 –CH–O 4 2.12 (1H, t, J = 11.5) 2.37 (1H, dd, J = 3.0 và 13.0) 38.52 –CH2– 49 5 140.11 >C=C 6 5.32 (1H, s) 121.98 –CH= 7 1.90; 1.51 (2H, m) 31.74 –CH2– 8 1.39 (1H, m) 31.70 –CH< 9 0.91 (1H, m) 49.59 –CH< 10 36.54 >C< 11 1.41; 1.50 (2H, m) 20.87 –CH2– 12 1.17; 1.97 (2H, m) 39.58 –CH2– 13 41.15 >C< 14 0.96 (1H, m) 56.57 –CH< 15 1.05; 1.52 (2H, m) 24.09 –CH2– 16 1.25; 1.80 (2H, m) 28.04 –CH2– 17 1.10 (1H, d, J = 10) 55.88 –CH< 18 0.67 (3H, d, J = 10) 11.62 –CH3 19 0.93 (3H, m) 18.77 –CH3 20 1.38 (1H, m) 35.96 –CH< 21 0.91 (3H, m) 18.54 –CH3 22 1.0; 1.32 (2H, m) 33.77 –CH2– 23 1.18 (2H, m) 25.90 –CH2– 50 24 0.93 (1H, m) 45.69 –CH< 25 1.61 (1H, m) 28.98 –CH< 26 0.81 (3H, m) 19.54 –CH3 27 0.80 (3H, m) 19.08 –CH3 28 1.20; 1.22 (2H, m) 22.88 –CH2– 29 0.82 (3H, m) 11.72 –CH3 1’ 4.32 (1H, d, J = 8.0) 100.93 O–CH–O 2’ 2.90 (1H, m) –OH2’ = 4.84 73.36 >CH–OH 3’ 3.12 (1H, m) –OH3’ = 4.85 76.22 >CH–OH 4’ 3.02 (1H, m) –OH4’ = 4.82 70.00 >CH–OH 5’ 3.07 (1H, m) 76.75 >CH–O G LU C O SE 6’ 3.40; 3.64 (2H, m) –OH6’ = 4.38 61.71 –CH2–OH 2.1.2.2. MC1A Các đặc tính của MC1A − Dạng bột, màu trắng, kết tinh trong MeOH. − Điểm nóng chảy: mp = 271 – 276oC. 51 − Sắc ký bản mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH: • Giải ly bằng hệ CHCl3:MeOH = 9:1 cho vết tròn màu tím có Rf = 0.25. • Giải ly bằng hệ CHCl3:MeOH = 85:15 cho vết tròn màu tím có Rf = 0.37. Hệ giải ly CHCl3:MeOH = 9:1 Hệ giải ly CHCl3:MeOH = 85:15 Hình 3.5: TLC của MC1A ở các hệ giải ly khác nhau Nhận danh cấu trúc MC1A Theo tài liệu [5,32] thì charantin là hỗn hợp của hai steroid là 3-O-[β-D- glucopyranosyl] stigmasta-5,25(27)-diene và β-sitosterol-3-O-β-glucoside. Vì thế, theo chứng minh trên thì MC1A là 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-stigmasta- 5,25(27)-diene. Vậy MC1A có tất cả 35 nguyên tử carbon, 6 nguyên tử oxy, có hai nối đôi ở vị trí C-5 và C-27. Như vậy công thức phân tử là C35H58O6, phân tử khối là 574 đvC. 52 O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O Hình 3.6: Công thức cấu tạo MC1A 2.2. Hợp chất MC 6 Các đặc tính của MC 6 - Khối lượng thu được m = 20 mg - Dạng bột, hơi vàng - Sắc ký bản mỏng (TLC) hiện màu xám dưới đèn tử ngoại và màu vàng trong hơi Iod, không hiện màu với dung dịch H2SO4 10% trong EtOH có Rf = 0.24 (CHCl3:MeOH = 85:15) - Điểm chảy mp= 250oC ( chất bắt đầu chuyển sang màu đen) . - Tan ít trong Methanol, tan nhiều trong Dimetyl sulfoxide (DMSO) 53 Hình 3.7: Mẫu chất MC6 Hình 3.8: TLC hợp chất MC6 Nhận danh cấu trúc của MC 6 - Phổ hồng ngoại IR (KBr, νmax, cm-1) ( phụ lục 2.1) cho: + Tín hiệu hấp thu của nhóm N-H ở 3112. + Tín hiệu thể hiện sự dao động của C-H ở 2986 - 2821. + Tín hiệu đặc trưng cho 2 liên kết đôi kề nhau có UV ở 1990. + Tín hiệu đặc trưng cho 2 liên kết C=O ở 1717. + Tín hiệu đặc trưng cho liên kết C=C ở 1669. - Phổ 13C-NMR (DMSO, δppm) (phụ lục 2.2) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 2.3) (bảng 2.5) cho biết có: + 2 tín hiệu dương là carbon olefin (-CH=) ở 100.16 và 142.09 ppm. + 2 tín hiệu là carbon tứ cấp của nhóm cacbonyl (>C=O) ở 151.44 và 164.26 ppm. 54 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của chất MC 6 Vị trí C/H 13C-NMR (δ ppm) DEPT 90 DEPT 135 Nhóm C 5 100.16 Tín hiệu dương Mũi dương –CH< 6 14.2.09 Tín hiệu dương Mũi dương –CH< 2 151.44 Biến mất Biến mất >C=O 4 164.26 Biến mất Biến mất >C=O - Phổ 1H- NMR (DMSO, δppm) (phụ lục 2.4 và 2.4a) cho các mũi tín hiệu của: + 1 tín hiệu proton metin (-CH<) ở 5.43 - 5.45 (d, J = 7.5). + 1 tín hiệu proton metin (-CH< ở 7.36 - 7.38 (d, J = 7.5). + 2 tín hiệu proton ở 10.89 (2H, brs). - Phổ HMBC (phụ lục 2.6) cho thấy sự tương tác của proton với các vị trí carbon được thể hiện trong bảng 3.5. Như vậy, MC 6 có công thức phân tử là C4H4O2N2, phân tử khối là 112 đvC; độ bất bão hòa là 4, trong đó có: 1 nối C=C chiếm 1 độ bất bão hòa, 2 nối C=O chiếm 2 độ bất bão hòa và 1 độ bất bão hoà của vòng. Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và HMBC của chất MC 6 Vị trí C/H 13C-NMR (δ ppm ) Nhóm C 1H-NMR (δ ppm, J = Hz) HMBC (H → C) 1 >N–H 10.89 (1H, brs) 2 151.44 >C=O 3 >N–H 10.89 (1H, brs) 55 4 162.26 >C=O 5 100.16 –CH= 5.43 – 5.45 (1H, d, J = 7.5) H5 → C6, C4 6 142.09 –CH= 7.36 – 7.38 (1H, d, J = 7.5) H6 → C5, C2, C4 Bảng 3.6: So sánh dữ liệu phổ của MC 6 với tài liệu [20] MC6 Uracil mp (oC) 246 - 247oC 250oC Vị trí C/H 13C-NMR 1H-NMR 13C-NMR 1H-NMR 5 100.16 5.43 - 5.45 (d, J = 7.5) 101.78 5.63 (d, J = 7.6) 6 142.09 7.36 - 7.38 (d, J = 7.5) 143.46 7.41 (d, J = 7.6) 2 151.44 153.57 4 164.26 167.36 Tóm lại, dựa vào các kết quả phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố [20], chúng tôi nhận danh chất MC6 là Pyrimidine-2,4-(1H, 3H)-dione (hay Uracil). HN H N OO 1 2 3 4 5 6 H N H N O H H 5 2 1 3 6 O 4 Hình 3.9: Công thức cấu tạo của MC6 và tương quan phổ HMBC 56 2.3. Hợp chất MC5 (Chưa nhận danh được cấu trúc của MC5) Các đặc tính của MC 5 - Khối lượng thu được m=331 mg - Dạng bột, màu trắng - Sắc ký bản mỏng (TLC) không hiện màu dưới đèn tử ngoại, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH có Rf = 0.36 (CHCl3:MeOH = 85:15) cho vết tròn màu xám. - Điểm chảy mp= 194.6oC - Tan trong MeOH Hình 3.10: Mẫu chất MC5 Hình 3.11: TLC của MC5 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC Bước đầu khảo sát thành phần hóa học của trái mướp đắng loại trái nhỏ, gai nhọn, rất đắng được trồng ở Phú Yên chúng tôi đạt được các kết quả sau: 1) Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học nhận thấy: trái mướp đắng có saponin, steroid, alkaloid, glycoside, tanin, anthraglycoside, đường khử, acid béo. 2) Từ dịch chiết cồn 95o, chúng tôi tiến hành tách riêng 3 loại cao dựa trên độ phân cực của các hợp chất có trong trái: cao PE, cao EtOAc và cao MeOH. 3) Từ cao EtOAc, chúng tôi đã phân lập được ba chất tinh khiết và đã nhận danh được cấu trúc của chúng. Gồm hai glycoside steroid là 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-stigmasta- 5,25(27)-diene (MC1A) và β-sitosterol-3-O-β−glucopyranoside (MC1B) và một là pyrimidine-2,4-(1H, 3H)-dione (hay Uracil) (MC6). Tất cả các chất được nhận danh cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại như IR, phổ 13C-NMR, phổ 1H-NMR và so sánh với tài liệu đã công bố. Bảng 4.1: Các chất đã phân lập được STT DANH PHÁP CÔNG THỨC CẤU TẠO 1 3-O-[β-D-glucopyranosyl]- stigmasta-5,25(27)-diene O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O 2 β-sitosterol-3-O- β−glucopyranoside O H HO H HO H H OHH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2018 19 2221 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' O 3 pyrimidine-2,4-(1H, 3H)-dione HN H N OO 1 2 3 4 5 6 58 2. KIẾN NGHỊ - Tinh chế MC5 và nhận danh cấu trúc của hợp chất này. - Tiếp tục khảo sát cao EtOAc để phân lập các hợp chất còn lại trong cao. - Khảo sát thành phần hóa học các cao PE, MeOH. - Thử hoạt tính của các hợp chất đã phân lập được để ứng dụng trong chữa bệnh. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Y Tế, Dược điển Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 2002 [2] Bùi Chí Hiếu, Dược lý trị liệu thuốc nam, 1999, trang 212. [3] Đỗ Tất Lợi, Những Cây Thuốc và Vị Thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, 1982, trang 736-737. [4] Hải Ân, Món ăn vị thuốc, Nhà xuất bản Thuận Hóa, 2002, trang 161-162. [5] Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu tập I, Nhà xuất bản Bộ Y Tế và Giáo dục Đào tạo, 1998. [6] Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Bài giảng chiết xuất dược liệu, khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Tp.HCM, 2000. [7] PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, Các phương pháp tách chiết hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2007. [8] PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2005. [9] PGS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng, Khối phổ sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2005. [10] Nguyễn Minh Đức, Trần Thị Vy Cầm, Khảo sát hóa học các chất có tác dụng sinh học từ hạt mướp đắng (Momordica charantia L.), Y Học TP. Hồ Chí Minh, 2002 Tập 6, Phụ bản của Số 1. [11] TS Nguyễn Ngọc Hạnh , Giáo trình cao học – Tách chiết và cô lập hợp chất tự nhiên, 2002. [12] TS. Nguyễn Thanh Hồng, Các phương pháp phổ trong hóa học hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, 2007. [13] Phạm Thị Thọ, Đỗ Huy Bích, 101 Cây Thuốc Với Sức Khỏe Sinh Sản Phụ Nữ, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, 2003, trang 151-156. [14] Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng, Tạp chí Dược liệu, tập 6, số 2+3, 2001, trang 48-54. [15] Tạ Duy Chân, Những phương thuốc hay “chữa bệnh bằng hoa”, Nhà xuất bản Nghệ An, 1999,trang 161-255. [16] Tạ Duy Chân, Những phương thuốc hay “rau cỏ trị bệnh”, Nhà xuất bản Nghệ An, 1999, trang 293-297. 60 [17] Tấn Cường, Nguyễn Văn Phấn, Những cây thuốc nam thông dụng dễ tìm và Tcác bài thuốc gia truyền, Nhà xuất bản Thanh Hóa, 2000, trang 61-62. [18] Thi Xuân Mi, Thảo dược chữa bệnh (Nguyễn Thanh Tùng dịch, BS Ngọc Tám hiệu đính), Nhà xuất bản Thanh Hóa, 2002, trang 62. [19] Trần Nam Hưng, Y học dân gian trị bệnh tại nhà, Nhà xuất bản Tổng hợp Đồng Tháp, 1998, trang 104-105. [20] Võ Thị Nga, Gerhard Maas, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Tuyển tập các công trình hội nghị Khoa học và Công nghệ Hoá học hữu cơ toàn quốc lần thứ tư, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 2007, trang 465 – 469. [21] Võ Văn Chi, Từ Điển Cây Thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 1999, trang 795. [22] Vương Thừa Ân, Phòng và chữa bệnh bằng món ăn hàng ngày, Nhà xuất bản Thuận Hóa, 2002, trang 35. [23] Anjali Singh, Satya Parakash Singh, Ramesh Bamezai, Momordica charantia L. (Bitter Gourd) peel, pulp, seed and whole fruit extract inhibits mouse skin papillomagenesis, Toxicology Letters, Vol 94, 1998, pp. 37-46. [24] Catherine Jilka, Beth Strifler, G. William Fortner, Esther F. Hays, and Dolores J. Takemoto, In Vivo Antitumor Activity of the Bitter Melon (Momordica charantia L.), Cancer Research, Vol 43, 1983, pp. 5151-5155. [25] Hikaru Okabe, Yumi Miyahara, Tasuo Yamauchi, Kazmoto Miyahara and Toshio Kawasaki ,Studies on the Constituents of Momordica charantia L. I. Isolation and Characterization of Momordicosides A and B, Glycosides of a Pentahydroxy- cucurbitane Triterpene, Chem. Pharm. Bull. ,Vol 28 (9), 1980, pp. 2753-2762. [26] Hikaru Okabe, Yumi Miyahara, and Tasuo Yamauchi, Studies on the Constituents of Momordica charantia L. II. Isolation and Characterization of Mimor Seed Glycosides, Momordicosides C, D and E, Chem. Pharm. Bull., Vol 29 (6), 1981, pp. 1561-1566. [27] Hikaru Okabe, Yumi Miyahara, and Tasuo Yamauchi, Studies on the Constituents of Momordica charantia L. III. Characterization of New Cucurbitacin Glycosides of the Immature Fruits. Structures of Momordicosides G, F1, F2, and I, Chem. Pharm. Bull. , Vol 30 (11), 1982, pp. 3977-3986. [28] Hikaru Okabe, Yumi Miyahara and Tasuo Yamauchi, Studies on the Constituents of Momordica charantia L. IV. Characterization of New Cucurbitacin Glycosides of 61 the Immature Fruits. Structures of the Bitter Glycosides, Momordicosides K and L, Chem. Pharm. Bull. ,Vol 30 (12), 1982, 4334-4340. [29] Holm, L. et al., A geographical atlas of wo ld weeds, 1979. [30] Mai Phương Mai, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Hạnh, Hypoglycemic activity of Momordica charantia L. fruit extracts in streptozotoxin – induced diabetic mice, Proceedings of the thirth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Bangkok, Thailand, 2003, May 20-23. [31] Mee Jung Jung et al., Isolation of Flavonoids and a Cerebroside from the Stem Bark of Albizzia julibrissin, Arch Pharm Res, Vol 27, No. 6, 2004, pp. 593-599. [32] M. M. Lotlikar, M. R. Rajarama Rao (1966), Pharmacology of a Hypoglycaemic Principles Isolated from the Fruits of Momordica charantia Linn, The Indian Journal of Pharmacy, Vol 28, No. 5, pp. 129-133. [33] Sabira Begum, Mansoor Ahmed, Bina S. Siddiqui, Abdullah Khan, Zafar S.Saify and Mohammed Arif, Triterpenes, a Sterol and a Monocyclic Alcohol from Momordica charantia L., Phytochemistry, Vol 44, No. 7, 1997, pp. 1313-1320. [34] Mr. Jesada Pitiphanpong, Extraction of charantin from the fruits of Momordica charantia using high pressure solvent, A Thesis for the Degree of Master of Engineering in Chemical Engineering, Chulalongkorn University, Thailand,2004. 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Trang Phụ lục 1.1: Phổ 13C-NMR của MC1B PL1 Phụ lục 1.1a: Phổ 13C-NMR của MC1B PL2 Phụ lục 1.1b: Phổ 13C-NMR của MC1B PL3 Phụ lục 1.2: Phổ 13C-NMR và DEPT của MC1B PL4 Phụ lục 1.2a: Phổ 13C-NMR và DEPT của MC1B PL5 Phụ lục 1.3: Phổ 1H-NMR của MC1B PL6 Phụ lục 1.3a: Phổ 1H-NMR của MC1B PL7 Phụ lục 1.3b: Phổ 1H-NMR của MC1B PL8 Phụ lục 1.3c: Phổ 1H-NMR của MC1B PL9 Phụ lục 2.1: Phổ IR của MC6 PL10 Phụ lục 2.2: Phổ 13C-NMR của MC6 PL11 Phụ lục 2.3: Phổ 13C-NMR và DEPT của MC6 PL12 Phụ lục 2.4: Phổ 1H-NMR của MC6 PL13 Phụ lục 2.4a: Phổ 1H-NMR của MC6 PL14 Phụ lục 2.5: Phổ HSQC của MC6 PL15 Phụ lục 2.6: Phổ HMBC của MC6 PL16 63 Phụ lục 1.1: Phổ 13C-NMR của MC1B 64 Phụ lục 1.1a: Phổ 13C-NMR của MC1B 65 Phụ lục 1.1b: Phổ 13C-NMR của MC1B 66 Phụ lục 1.2: Phổ 13C-NMR và DEPT của MC1B 67 Phụ lục 1.2a: Phổ 13C-NMR và DEPT của MC1B 68 Phụ lục 1.3: Phổ 1H-NMR của MC1B 69 Phụ lục 1.3a: Phổ 1H-NMR của MC1B 70 Phụ lục 1.3b: Phổ 1H-NMR của MC1B 71 Phụ lục 1.3c: Phổ 1H-NMR của MC1B 72 Phụ lục 2.1: Phổ IR của MC6 73 Phụ lục 2.2: Phổ 13C-NMR của MC6 74 Phụ lục 2.3: Phổ 13C-NMR và DEPT của MC6 75 Phụ lục 2.4: Phổ 1H-NMR của MC6 76 Phụ lục 2.4a: Phổ 1H-NMR của MC6 77 Phụ lục 2.5: Phổ HSQC của MC6 78 Phụ lục 2.6: Phổ HMBC của MC6