Đề tài Giải trình tự gen vùng đích phát hiện đột biến dị hợp tử mới trên gen TGM1 gây bệnh vảy da cá ở một bệnh nhi tại Việt Nam: Báo cáo ca bệnh - Trần Vân Khánh

GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1 GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH Trần Vân Khánh1, Lương Hoàng Long1, Diệp Minh Quang2, Đinh Thị Lan Oanh2, Nguyễn Đình Tưởng2, Phạm Vân Anh2, Ngô Kim Ngân2, Bùi Văn Tuấn2 TÓM TẮT NGHIÊN CỨU Khái quát: Bệnh vảy da cá di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (ARCI) là một nhóm tập hợp các rối loạn của sự sừng hoá da, bao gồm ba thể bệnh là vảy da cá dạng phiến mỏng (LI), chứng đỏ da dạng vảy da cá bẩm sinh (CIE) và dạng Harlequin. Trong các thể bệnh trên, LI và CIE có các dấu hiệu lâm sàng tương tự nhau, phần lớn các trường hợp đều do đột biến trên một số gen, bao gồm gen mã hoá Transglutaminase 1 (TGM1) nằm trên Nhiễm sắc thể 14q12. Báo cáo ca bệnh: Báo cáo này phân tích di truyền của một trường hợp sơ sinh nữ được chẩn đoán bệnh vảy da cá thể (ARCI). Bệnh nhi là con thứ ba trong gia đình, tiền sử gia đình không ghi nhận bất cứ trường hợp bệnh có kiểu hình tương tự. Bệnh nhi được sinh ra với biểu hiện đặc trưng dạng Collodion baby. Chẩn đoán trước sinh không phát hiện bất thường. Tại thời điểm của nghiên cứu này, lớp da Collodion đã được thay thế bằng lớp da sừng hoá dày với các vảy da tối màu, kết tạo mảng. Giải trình tự gen vùng đích với panel 56 gen thực hiện bởi kỹ thuật Giải trình tự gen thế hệ mới, đột biến được phát hiện sau đó được kiểm chứng bằng kỹ thuật Sanger. Chúng tôi đã tìm thấy 3 đột biến dị hợp tử trên gen TGM1: c.968G>A(p.Arg323Gln), c.1756C>T(p.Gln586Ter) và c.2185G>A(p.Glu729X). Trong đó, đột biến c.968G>A(p.Arg323Gln) đã được báo cáo trước đây, hai đột biến còn lại là đột biến mới. Theo sự hiểu biết của chúng tôi thì hai biến thể này chưa được từng công bố trước đây. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành phân tích di truyền phả hệ 3 đời của ca bệnh này nhằm nhận biết tính di truyền của các đột biến trên. 1 Đại Học Y Hà Nội 2 Bệnh viện Sản Nhi tỉnh Quảng Ninh Chịu trách nhiệm chính: Trần Trọng Kiểm. Email: kiemthuytb@gmail.com Ngày nhận bài: 15/01/2019; Ngày phản biện khoa học: 22/02/2019; Ngày duyệt bài: 28/02/2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 71 NGHIÊN CỨU I. GIỚI THIỆU Bệnh vảy da cá di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (ARCI) là một nhóm tập hợp các rối loạn của sự sừng hoá da, bao gồm ba thể bệnh là vảy da cá dạng phiến mỏng (LI), chứng đỏ da dạng vảy da cá bẩm sinh (CIE) và dạng Harlequin. Không có một sự tương quan rõ ràng giữa kiểu gen và kiểu hình trong những bệnh này, các đột biến ở cùng một gen có thể có các biểu hiện đa dạng về kiểu hình. LI và CIE: mặc dù được xem xét là hai biến thể khác nhau của bệnh vảy da cá tuy nhiên hai thể này có dấu hiệu lâm sàng và kiểu gen trùng lặp nhau tương đối [1]. Phần lớn các trường hợp gây ra bởi đột biến trên một số gen như TGM1, NIPAL4, ALOX12B, ALOXE3, ABCA12, PNPLA1 và CYP4F22. LI và CIE thường có biểu hiện lúc sinh với dấu hiệu “Màng Collodion”, là một màng da mờ kín bao phủ cơ thể của trẻ sơ sinh và thường bong ra sau khi sinh một vài tuần nếu được điều trị bằng các phương pháp làm mềm da. Ở thể bệnh LI, màng bọc collodion được thay thế bằng các mảng sừng da tối màu, dính. Tật lộn mắt cũng là một dấu hiệu lâm sàng nổi bật kèm theo tăng sừng hoá của da (dày da lòng bàn tay và chân) cũng là dấu hiệu thường xuất hiện. Ở thế bệnh CIE, các mảng sừng hoá của da thường nhẹ hơn thể LI, với đa dạng các biểu hiện của chứng đỏ da và lộn mi mắt. Trong ARCI thì các biến thể của gen TGM1 được xác nhận là có tần suất xuất hiện phổ biến hơn so với các gen khác [2]. Trước đây người ta cho rằng chỉ có các đột biến đồng hợp tử mới dẫn tới suy giảm chức năng của enzym transglutaminase làm phá vỡ sự tạo thành lớp vỏ bao bọc tế bào và hậu quả là gây nên giảm chức năng của da [3]. Tuy nhiên, một nghiên cứu gần đây ở Nhật Bản cho thấy rằng dạng dị hợp tử kép của một số biến thể cũng có thể gây ra các biểu hiện kiểu hình nặng nề [8]. Kết luận: Hiểu biết được các đột biến gen này cho phép xác định người mang đột biến từ đó có ích cho việc tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh hoặc chẩn đoán di truyền tiền làm tổ cho các đối tượng có nguy cơ mắc rối loạn này. Từ khoá: Bệnh vảy da cá, ARCI, Giải trình tự gen đích, TGM1, đột biến mới. Bảng 1. Danh sách panel gen giải trình tự. No. Gene name No. Gene name No. Gene Name 1 ABCA12 21 SPINK5 41 DUSP6 2 ALOX12B 22 ST14 42 FGF17 3 ALOXE3 23 STS 43 FLRT3 4 CLDN1 24 TGM1 44 PROKR2 5 COL7A1 25 KAL1 45 ABHD5 6 CYP4F22 26 FGRR1 46 PHYH 7 FLG 27 PROKR2 47 PEX7 72 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1 GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH II. BÁO CÁO CA BỆNH 2.1. Phương pháp Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu một ca bệnh sơ sinh và gia đình của bé với bệnh lý vảy da cá di truyền lặn trên Nhiễm sắc thể thường. Chúng tôi kết hợp giải trình tự gen vùng đích NGS để phát hiện các gen bị biến đổi (Bảng 1) và sau đó kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger với các gen nhận từ kết quả phân tích NGS. DNA được tách chiết từ mẫu ối máu của bệnh nhân. DNA sau đó được chia nhỏ ra và được dùng để tạo thư viện, và sau đó được tập trung vào các vùng mã hoá và cạnh vùng mã hóa bằng cách sử dụng các chip đặc biệt, cuối cùng được giả trình tự bằng phương pháp NGS. Các đột biến điểm, vi mất đoạn thêm đoạn và nhân đoạn dưới 20bp cũng như các mất đoạn đồng hợp tử ở mức độ exon đều có thể được phát hiện cùng một lúc (Bảng 2) Bảng 2. Thông số giải trình tự NGS. Number of Genes 60 Length of target region (bp) 155295 Coverage of target region (%) 100% Average depth of target region (X) 354.84 Proportion of target region with sequencing depth more than 30X (%) 99.90% Kiểu gen bình thường của TGM1 được tìm thấy tại Ensembl Genome Browser. Các biến thể được lựa chọn sau đó được giải trình tự theo phương pháp Sanger sử dụng các primers thiết kế bằng phần mềm Primers3plus. Các exon đích được PCR từ mẫu DNA cùng với GoTaq green master mix (Promega, USA). Các sản phẩm này sau đó được chạy trên máy giải trình tự ABI 3500 (Life Technologies, USA). Dữ liệu giải trình No. Gene name No. Gene name No. Gene Name 8 ITGA6 28 CHD7 48 ALDH3A2 9 ITGB4 29 FGF8 49 DDB2 10 KRT14 30 FGFR1 50 ERCC1 11 KRT5 31 SPRY4 51 ERCC2 12 LAMA3 32 PROKR2 52 ERCC3 13 LAMB3 33 CHD7 53 ERCC4 14 LAMC2 34 GNRHR 54 ERCC5 15 MBTPS2 35 KISS1R 55 POLH 16 NIPAL4 36 TACR3 56 XPA 17 PLEC 37 GNRH1 57 XPC 18 PNPLA1 38 KISS1 58 TAC3 19 SLC27A4 39 WDR11 59 COL17A1 20 SNAP29 40 IL17RD 60 FGF8 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 73 NGHIÊN CỨU tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit Công cụ Variant effect predictor (VEP) được sử dụng để tiên đoán khả năng gây bệnh của các biến thể TGM1 tìm thấy. Sử dụng VEP cùng với Human Genome Assembly GRCh37. Các miêu tả chi tiết của VEP về đầu vào, đầu ra và nguyên lý được miêu tả trong phần trích dẫn [4]. Từ kết quả đầu ra chúng tôi lựa chọn điểm Mendelian Clinically Applicable Pathogenicity (M- CAP) cho các đột biến sai nghĩa để hiểu được kết quả của các biến thể. III. KẾT QUẢ 3.1. Bệnh sử Bệnh nhi được sinh ra trong một gia đình không có kết hôn cận huyết. Bố mẹ của bệnh nhân kể lại không có ghi nhận bệnh tương tự trong gia đình. Bệnh nhi được sinh ra với hình ảnh đặc trưng của Collodion baby. Quá trình mang thai bình thường. Da của bệnh nhi khô ráp với các biểu hiện tăng sừng hoá ( dày da lòng bàn tay và chân). Da vùng bụng bị nứt. Vùng lưng và thân trên nổi bật bởi các mảng vảy da tối màu. Những mảng này cũng xuất hiện ở tay và chân. Bệnh nhi mọc răng bình thường. Các bộ phận khác của cơ thể không phát hiện bất thường. 3.2. Giải trình tự gen thế hệ mới Có 192 biến thể được tìm thấy từ dữ liệu ban đầu của NGS. Tất các các biến thể này đều được ghi nhận trước đây có liên quan đến bệnh vảy da cá bẩm sinh. Trong đó có 11 biến thể có khả năng nhất gây ra bệnh. Cuối cùng 3 biến thể được lựa chọn có khả năng cao nhất gây ra các biểu hiện về kiểu hình, bao gồm 1 biến thể pathogenic, 1 biến thể likely pathogenic và 1 biến thể VUS. a c b Ảnh 1: Biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân (a) (b) 2 ngày sau sinh: màng colodion điển hình kèm theo lộn mi mắt. (c) 3 tuần sau sinh, lớp màng collodion được thay thế bằng các mảng vảy tối màu 74 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) 3.3. Giải trình tự Sanger cho các biến thể của TGM1 Giải trình tự gen Sanger xác nhận 3 biến thể phát hiện bởi NGS. Ba đột biến đó là c.968G>A (p.Arg323Gln; Het) taị exon 6 và c.1756C>T(p.Gln586Ter; Het) tại exon 12 và c.2185G>A(p.Glu729X; Het) tại exon 14. Tất cả các biến thể này đều nằm trên gen TGM1. Đột biến c.968G>A đã được báo cáo trước đây với biểu hiện bệnh. Hai đột biến còn lại chưa được công bố. Chúng tôi sử dụng phương pháp Sanger để kiểm chứng lại các đột biến được miêu tả ở trên cho các thành viên khác trong gia đình bao gồm anh em (Ảnh 3a), bố mẹ và ông bà (Ảnh 3b). Kết quả: người mẹ mang đột biến dị hợp tử c.968G>A tại exon 6 gen TGM1. Người bố mang hai đột biến dị hợp tử c.1756C>T tại exon 12 và c.2185G>A tại exon 14 gen TGM1. Người bố thừa hưởng hai đột biến này từ ông nội còn người mẹ nhận đột biến từ ông ngoại. 3.4. Phân tích Protein của biến thể gen TGM1 Có 3 biến thể được tìm thấy bao gồm: 1 biến thể đã được công bố C.968G>A (p.Arg323Gln) và 2 đột biến mới c.1756C>T(p.Gln586Ter) và c.2185G>A(p.Glu729X. Chúng tôi chỉ tập trung phân tích hai biến thể mới. Công cụ VEP cho thấy rằng biến thể c.1756C>T là đột biến sai nghĩa ở vùng gen mã hoá với điể điểm SIFT và Polyphen lần lượt là 0.23 và 0.015. Phân tích protein sản phầm được mã hoá từ đột biến trên cho thấy điểm M-CAP là 0.019, với bất cứ biến đổi nào có điểm M- CAP > 0.5 được cho là có nguy cơ cao gây hại so với protein bình thường [5]. Vì vậy p.Gln586Ter là biến thể có khả năng không gây bệnh chủ yếu trong trường hợp này. (ảnh 2b) Ảnh 2: (a) the VEP calling of variant c.1756C>T. (b) M-CAP score of variant c.1756C>T a b GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1 GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 75 NGHIÊN CỨU IV. THẢO LUẬN NGS ngày nay được sử dụng rộng rãi như là một công cụ hiệu quả để chẩn đoán các bệnh lý di truyền đơn gen. Kết hôn cận huyết làm tăng nguy cơ mắc các bệnh lý di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường. Enzym TGM-1 được tìm thấy trong biểu bì, nơi chịu trách nhiệm cho các liên kết chéo của tiền chất của keratin và để định hình lớp bao bọc bên ngoài tế bào. Liên kết này cung cấp sự mạnh mẽ cơ học và tính ổn định của lớp biểu bì da. Người bố và mẹ của bệnh nhân đều là người lành mang gen, trong đó người bố mang hai đột biến dị hợp tử. Điểm đặc biệt là người bố dù mang hai đột biến nhưng đều là đột biến mới và không gây ảnh hưởng tới chức năng của protein. Bệnh nhân mang cả 3 đột biến thể và có lẽ sự kết hợp của 3 biến thể này ảnh hưởng tới chức năng của protein. Do đó bệnh nhân có biểu hiện kiểu hình của ARCI. Anh trai của bệnh nhân cũng có kiểu gen tương tự người bố và không mắc bệnh. Một điểm thú vị khác nữa là trong quá trình theo dõi lâm sàng, tác giả nhận thấy rằng các dấu hiện trên da như các mảng sừng hoá thẫm màu dần dần biến mất và được thay thế bằng lớp da bình thường. Hiện tại sau sinh 5 tháng, phần da của bệnh nhân hầu Ảnh 3a: Kết quả giải trình tự Sanger của các biến thể TGM1. Panel bên trái thể hiện bố là người mang đột biến c.1756C>T và c.2185G>A. Panel bên phải thể hiện người mẹ là ngừoi mang gen c.968G>A. Panel ở giữa thể hiện bệnh nhân mang cả 3 đột biến ở dạng dị hợp tử kép. Với biến thể c.2185G>A, công cụ VEP thể hiện rằng đây là đột biến hình thành bộ ba kết thúc, kết quả dẫn tới tạo ra 1 protein có kích thước ngắn hơn một protein bình thường. Ảnh 4: the VEP calling of variant c.1285G>A 76 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) như bình thường. Nhóm tác giả cho rằng trường hợp này là một biến thể của ARCI có tên là Collodion baby tự lành ( Self-healing baby collodion). Cho đến nay chỉ có 1 vài ca bệnh được báo cáo trên thế giới. Ảnh 5: Bệnh nhân hiện tại (sau sinh 5 tháng) Ảnh 3b: Phả hệ Mũi tên chỉ vào người bệnh. Phả hệ thể hiện các biến thể của gen TGM1 ảnh hưởng tới một số thành viên trong gia đình. Người mẹ thừa hưởng gen từ ông ngoại, Người bố nhận gen từ ông nộ. Tất cả họ đều không có biểu hiện lâm sàng của ARCI GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÙNG ĐÍCH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DỊ HỢP TỬ MỚI TRÊN GEN TGM1 GÂY BỆNH VẢY DA CÁ Ở MỘT BỆNH NHI TẠI VIỆT NAM: BÁO CÁO CA BỆNH TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019) I 77 NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1. Rodríguez-Pazos L, Ginarte M, Vega A, Toribio J. Autosomal recessive congenital ichthyosis. Actas Dermosifiliogr 2013; 104:270. 2. Takeichi T, Akiyama M. Inherited ichthyosis: non-syndromic forms. J Dermatol. (2016) 43:242–51. doi: 10.1111/1346- 8138.13243 3. Hennies HC, Raghunath M, Wiebe V, Vogel M, Velten F, Traupe H, et al. Genetic and immunohistochemical detection of mutations inactivating the keratinocyte transglutaminase in patients with lamellar ichthyosis. Hum Genet. (1998) 102:314–8. 4. McLaren W, Gil L, Hunt SE, Riat HS, Ritchie GR, Thormann A, et al. The ensembl variant effect predictor. Genome Biol. (2016) 17:122. doi: 10.1186/s13059-016- 0974-4 5. Jagadeesh KA, Wenger AM, Berger MJ, Guturu H, Stenson PD, Cooper DN, et al. M-CAP eliminates a majority of variants of uncertain significance in clinical exomes at high sensitivity. Nat Genet. (2016) 48:1581–6. doi: 10.1038/ng.3703 6. Zhang H, Ericsson M, Westrom S, Vahlquist A, Virtanen M, Torma H. Patients with congenital ichthyosis and TGM1 mutations overexpress other ARCI genes in the skin: part of a barrier repair response? Exp Dermatol. (2018) doi: 10.1111/exd.13813. [Epub ahead of print. 7. Rasheed M, Karim N, Shah FA, Naeem M. Novel TGM1 mutation in a Pakistani family affected with severe lamellar ichthyosis. Pediatr Neonatol. (2018) 59:628–9. doi: 10.1016/j.pedneo.2018.01.003 8. Takeda M, Nomura T, Sugiyama T, Miyauchi T, Suzuki S, Fujita Y, et al. Compound heterozygous missense mutations p.Leu207Pro and p.Tyr544C in TGM1 cause a severe form of lamellar ichthyosis. J Dermatol. (2018) 45:1463–7. doi: 10.1111/1346- 8138.1467 V. KẾT LUẬN Dựa vào các kết quả có được chúng tôi cho rằng ARCI ở bệnh nhân này là sự kết hợp của 3 đột biến được thừa hưởng từ bố mẹ. Tất cả các đột biến góp phần làm giảm chức năng của enzym TGM1 dẫn tới bất thường chức năng của lớp ngoài cùng của biểu bì và dẫn tới bất thường của da và gây biểu hiện bệnh ARCI. VI. GIỚI HẠN CỦA NGHIÊN CỨU Nghiên cứu này thừa nhận rằng thiếu các phương tiện phân tích chức năng sinh học là một trong các hạn chế chính để biết chắc chắn về vai trò của gen TGM1 với gia đình này. Cụ thể, chúng tôi chưa làm sáng tỏ được mối liên quan giữa đột biến c.2185G>A đối với chức năng của protein. Sự kết hợp của 3 đột biến làm ảnh hưởng tới protein ở mức độ cụ thể như thế nào cũng là một câu hỏi chưa được giải đáp hoàn toàn. Tuy nhiên, dữ liệu thu nhận được từ nghiên cứu này có vai trò quan trọng đối với chẩn đoán trước sinh, phòng ngừa bệnh ở những nhóm, cá nhân có nguy cơ cao và trải đường cho các liệu pháp tương lai về cá thể hoá y học. 78 I TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC HÀNH NHI KHOA I Số 2 (4-2019)