Đề tài Enzym thực vật

MỤC LỤC PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT TỔNG QUAN 5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT 5 Quy trình công nghệ 5 Thuyết minh quy trình công nghệ 6 Phá vỡ tế bào 6 Thu dịch enzym thô 6 Tách enzyme 8 Tinh sạch 13 Kết tinh 14 NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM 14 ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT 14 Bromelin 14 Đặc điểm 14 Sản xuất 18 Ứng dụng 21 Sản phẩm thương mại 24 Hướng nghiên cứu 27 Papain 29 Đặc điểm 29 Sản xuất 33 Ứng dụng 34 Sản phẩm thương mại 37 1.4.3. Ficin 39 1.4.3.1. Đặc điểm 39 1.4.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzym ficin 41 PHẦN 2 : ENZYM ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2.1. ENZYM PECTINASE 44 2.1.1. Phân loại 46 2.1.2. Đặc điểm enzym pectinase 46 2.1.2.1. Enzym pectinase từ thực vật 46 2.1.2.2. Enzym pectinase từ vi sinh vật 50 2.1.3. Ứng dụng enzym pectinase trong thực phẩm 52 2.1.4. Ứng dụng enzym pectinase trong sản xuất nước dứa 55 2.2. ENZYM AMYLASELASE 57 2.2.1. Phân loại 58 2.2.2. Đặc điểm 58 2.2.2.1. Enzym amylase từ thực vật 58 2.2.2.2. Enzym amylase từ vi sinh vật 60 2.2.3. Ứng dụng amylase trong thực phẩm 61 2.2.4. Một số chế phẩm thương mại 64 2.3. ENZYM CENLLULASE 64 2.3.1. Phân loại 65 2.3.2. Đặc điểm 65 2.4. ENZYM OXY HÓA – KHỬ 67 2.4.1. Enzym peroxydase 67 2.4.2. Enzym polyphenoloxydase 67 2.4.3. Enzym glucooxydase 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin 15 Bảng 1.2: Những tính chất vật lý của protein thân 16 Bảng 1.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin 16 Bảng 1.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin 17 Bảng 1.5: Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau của bromelin thân 17 Bảng 1.6: Ảnh hưởng trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của bromelin 18 Bảng 1.7: Tính chất vật lý của papain 30 Bảng 1.8: Giá trị dinh dưỡng trên100 g chất quả 33 Bảng 1.9: %RDI 34 Bảng 1.10: Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng thái cơ chất của papain 38 Bảng 1.11: Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin 40 Bảng 1.12: Tính chất vật lí của ficin 41 Bảng 2.1 : Phân loại enzym pectinase 53 Bảng 2.2 : Hàm lượng pectin của một số quả và dịch quả 53 Bảng 2.3 : Một số tính chất của amylase từ các nguồn khác nhau 59 Bảng 2.4 : Ứng dụng enzym amylase 61 Bảng 2.5 : hiệu suất chuyển hóa tinh bột bằng enzym cố định trong sản xuất syro fructose 64 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 : Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin 14 Hình 1.2 : Chất chiết từ lá và thân dứa (Ananas comosus) với hàm lượng bromelain cao, được sản xuất dưới dạng viên nén, chứa 200mg bromelin/viên 24 Hình 1.3 : Chế phẩm bromelin có hoạt lực cao (1200gdu/g hay 1800mcu/g) 25 Hình 1.4: Bột bromelin bổ sung vào thức ăn cho gia súc 25 Hình 1.5: Quercetin & Bromelain - Thuốc giúp bệnh thống phong 25 Hình 1.6: Bromelain - Tinh chất quả dứa trị viêm mũi 26 Hình 1.7: Tâm hoạt động của papain 30 Hình 1.8: Cơ chế ảnh hưởng của pH 32 Hình 1.9: Cơ chế hoạt động 33 Hình 1.10: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa 34 Hình 1.11: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ 35 Hình 1.12: Papain ứng dụng trong mỹ phẩm 39 Hình 1.13: Papain trongcác loại dược phẩm 39 Hình 2.1 : Cấu trúc của pectinase từ carrot 47 Hình 2.2 : Polygalacturonase từ erwinia carotovora ssp. carotovora 49 Hình 2.3 : Ảnh hường của pectinase đến hiệu suất trích ly nước dứa 56 Hình 2.4 :Ảnh hưởng của pectinase Ultra SP-L đến hiệu suất trích ly dứa 57 Hình 2.5: Ảnh hường pectinase 3XL đến quá trình làm trong dịch dứa 57 PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT 1.1 TỔNG QUAN [3]: Enzym là những chất không thể tổng hợp bằng phương pháp hoá học, chỉ có thể thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzym có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme gặp rất nhiều khó khăn, nhất là tách với quy mô công nghiệp một cách thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành đối với nguyên liệu có chứa hàm lượng lớn enzym. Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. Từ thực vật người ta cũng thu được một số chế phẩm enzym thuỷ phân như papain, bromelin, ficin, amylase, urease, … Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách khuấy nhựa một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đem sấy khô nghiền nhỏ. Bromelin thu từ thân dứa. Sau khi hái quả người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzym trong dịch ép. Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus. Amylase được thu nhận từ nguồn malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác, được sử dụng chủ yếu trong công nghệ sản xuất rượu bia, bánh kẹo. Urease từ hạt đậu tương, lipase từ hạt thầu dầu, b_amylase từ củ khoai lang, saccharase từ lá củ cải đường … 1.2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT [3],[4]: 1.2.1. Quy trình công nghệ: 1.2.2. Thuyết minh quy trình công nghệ: 1.2.2.1. Phá vỡ tế bào: Trong cơ thể sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân microxom, mitochrondri..…) của tế bào. Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử (mitochrondri) của tế bào. Do đó, để có thể chiết rút các enzym nội bào cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp: Xay nhuyễn Nghiền: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát sạch. Đồng hóa: dùng áp lực cao để phá vỡ tế bào mô thực vật, từ đó làm giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzym nội bào mà không làm biến tính chúng. Điều này cũng tạo thuận lợi khi ta sử dụng phương pháp siêu lọc để làm tinh sạch enzym. Sử dụng sóng siêu âm. Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine... 1.2.2.2.Thu dịch enzym thô: Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. Có thể sử dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly. 1.2.2.3.Tách enzym: Có thể sử dụng nhiều phương pháp như: Phương pháp kết tủa enzym: Nguyên tắc: Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kết hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước cũng như các ion dương. Điều này làm cản trở sự kết tủa của chúng. Enzym có bản chất protein, do đó để kết tủa được enzym phải phá vỡ lớp nước xung quanh bằng cách bổ sung vào dung dịch enzym các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein, giúp protein tủa xuống. Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ở nồng độ cao như ammonium sulphate. Những yếu tố chính ảnh hưởng hiệu suất và chất lượng chế phẩm enzym là: Nồng độ của ammonium sulphate. pH của dịch chiết. Nhiệt độ kết tủa. Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết. Phương pháp siêu lọc: Dung dịch enzym thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa nhiều tạp chất. Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang dùng phương pháp siêu lọc để loại bỏ các chất có phân tử lượng thấp hơn enzym đồng thời cô đặc enzym. Màng siêu lọc: được cấu tạo bằng các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có chứa nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các loại polymer bền như fluoro polymer (FS), cellulose acetate (CA), polysulphone(GR)…. Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp. Ví dụ: Cô đặc protein dùng màng FS, GR. Cô đặc enzym dùng màng GR. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với loại sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng. Áp suất: thường áp suất của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc: Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể. Đối với enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính. Siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym. Trong quá trình thực hiện, nếu cho thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzym càng cao. Trong quá trình siêu lọc, nếu nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzym, do đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất mà không làm mất hoạt tính enzym càng cao. Trong quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC). Phương pháp hấp phụ: Hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào trong dịch enzym) hoặc trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Hấp phụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách: chất hấp phụ protein tạp hoặc chất hấp phụ enzym. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Enzym sau đó được chiết bằng các dung môi thích hợp. 1.2.2.4.Tinh sạch Enzym rất dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài. Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính enzym, cần tiến hành nhanh ở điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn, môi trường có pH thích hợp và không có mặt các tác nhân gây biến tính. Các phương pháp thường được áp dụng khi tinh chế enzym là: Hấp phụ trên gel Phương pháp thẩm tích Cột sắc kí (ví dụ: DEAE –cellulose) Kết tủa phân đoạn hay bằng dung môi hữu cơ Để tinh chế enzym hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Phương pháp hấp phụ có chọn lọc: Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzym quan trọng và thành công nhất, thường được dùng để làm đặc dung dịch enzym. Nguyên tắc: cho dịch enzym chảy từ từ qua cột chất hấp phụ. Tùy theo khả năng tương tác của các chất hấp phụ với từng loại enzym, các enzym khác nhau sẽ được hấp phụ trên chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút enzym ra khỏi cột. Có thể hấp phụ chọn lọc enzym theo hai cách: Hấp phụ âm tính: Dùng chất hấp phụ để tách tạp chất ra khỏi dung dịch enzym. Hấp phụ dương tính: Enzym được hấp phụ và được tách ra khỏi những cấu tử khác trong dung dịch, sau đó được rửa giải bởi dung dịch đệm pH kiềm hoặc các dung dịch đệm khác. Sau khi ly tâm để loại các hợp chất không tan, dung dịch enzym có thể được thẩm tách để loại dung dịch đệm. Để hấp phụ enzym tốt nhất, cần tuân theo những nguyên tắc chung sau: Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%. Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1 Môi trường acid pH = 5 – 6 Nồng độ chất điện ly (muối) thấp trong dung dịch. Sự tồn tại của bất kì một lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ. Vì thế một lượng lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quả mong muốn. Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0oC trong lúc trộn dung dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng. Đây là một phương pháp nhanh, sự cân bằng giữa các chất hấp phụ và dung dịch hình thành rất sớm và chỉ sau vài phút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ. Quá trình được tiến hành tuần tự như sau: Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng gel thích hợp. Trộn đều Quay lắng Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào. Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụ phải được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên (phần sẽ được loại bỏ) lấy đi khoảng 10% enzym và sau khi thu những phân đoạn hoạt động, phải còn lại 10% enzym trong dung dịch. Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ. Nếu enzym không được rửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp phụ vào nước và ly tâm lại. Trong sản xuất, để gel phân tán tốt trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải có cánh khuấy với tốc độ cao. Giải hấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịch đệm base nhẹ (pH = 7,6). Quá trình càng hiệu quả với dung dịch (NH4)2SO4 10%. Thể tích dung dịch rửa giải không nên quá lớn, thường là ít hơn thể tích gel ly tâm. Nên tiến hành rửa giải nhiều lần với thể tích nhỏ hơn là một lần với thể tích lớn. Phương pháp thẩm tích Lấy enzym thô pha trong dung dịch đệm thích hợp, sau khi tất cả enzym đã hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa dung dịch đệm ban đầu. Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm trên. Tiến hành thẩm tích trong thời gian thích hợp, nếu có thể thì nên thay dung dịch đệm bên ngoài nhiều lần để đạt tinh sạch cao. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ. Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì protein enzym sẽ bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym. Chính vì vậy, để làm giảm sự biến tính của enzym do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp. Cột sắc ký: Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzym tinh khiết. Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử. Nhưng trên thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả ba quá trình trên. Nguyên tắc: cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung dịch đệm với cột trao đổi ion đã được cân bằng, tiến hành giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải (gradient muối) với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi cột các enzym vừa liên kết với nhựa. Khi đó enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất, lần lượt các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó có phần chứa enzym cần thu với nồng độ cao nhất. Các chất trao đổi ion có thể được sử dụng là nhựa resin trao đổi ion (đặc biệt là amberlite IRC-50, XE-64), những dẫn xuất khác nhau của cellulose như diethylaminoethyl cellulose (DEAE-cellulose), carboxymethyl cellulose (CMC). Dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu được hiệu quả tốt đối với những enzym có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ, có điểm đẳng điện trong vùng kiềm, đồng thời việc rửa giải những enzym phân tử lớn ra khỏi cột cũng gặp không ít khó khăn. Vì thế DEAE-cellulose và CMC thường được sử dụng rộng rãi hơn do có khả năng loại bỏ được các tạp chất acid nucleic. Quá trình phân tách được tiến hành tuần tự như sau: Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy một lần qua cột để loại muối ra khỏi dung dịch protein. Protein chảy ra khỏi cột với một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với thể tích của nó lúc đưa vào cột. Trên các cột chứa sephadex G-75, G-100, G-200 đồng thời xảy ra sự phân tách từng phần các protein tùy theo phân tử lượng của chúng. Ngoài sephadex, tất cả các cột đều cần gradient muối cho việc rửa giải. Các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kết với nhựa. Đẩy protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau: Tăng nồng độ các dung dịch đệm. Tăng nồng độ dung dịch NaCl hay KCl thêm vào dung dịch. Thay đổi pH của dung dịch tách. Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất (là phân đoạn chứa enzym cần thu) được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc (hoặc làm khô) bằng cách loại hơi ẩm trong chân không ở nhiệt độ thấp. Phương pháp sắc kí trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân tách hỗn hợp protein và trong tách riêng những enzym và hormone tinh khiết tới mức tối đa. Nhờ đó, người ta đã loại được những tạp chất protein nhỏ ra khỏi những chế phẩm enzym thuần nhất về điện ly. Điện di: Là phương pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzym và cũng là phương pháp để xác định sự tinh khiết của các chế phẩm protein. Gần đây, phương pháp này được áp dụng ở những giai đoạn tinh chế enzym cuối cùng. Nguyên tắc: Phân tử protein có điện tích tự do chứa nhóm acid, base. Nếu các phân tử protein enzym không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dương) thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển trong điện trường ở những điều kiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau. Do đó, hỗn hợp protein được phân tách ra thành một số vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt. Những phân đoạn enzym thu được sẽ được xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzym và biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ. 1.2.2.5.Kết tinh: Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh. Tuy nhiên, kết tinh không có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết. Hoạt độ riêng của tinh thể tăng khi các enzym tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần lặp lại nhiều lần cho đến khi hoạt độ riêng tăng đến một giá trị cao nhất, không tăng được nữa. Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzym như là một phương pháp phân đoạn protein có giá trị. Vì thế, tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như là một phương pháp cụ thể của quá trình phân đoạn, và được sử dụng ở những giai đoạn tinh thể cuối cùng. Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch ammonium sulfat. Để thu được những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ qua nhiều ngày hoặc tuần. Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dung dịch enzym đậm đặc cho đến khi bắt đầu thấy đục rõ. Có thể thêm dung dịch muối nồng độ cao từng giọt, từng giọt hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩm tích ( trong một số trường hợp dung dịch enzym được thẩm tích đối với dung dịch ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hoặc dung dịch đơn giản được làm bay hơi chậm. Sau đó, người ta để yên các dung dịch, không khuấy trộn trong vài ngày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể enzym sẽ xuất hiện như ý muốn. Khi thêm nồng độ muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định hình. Ngoài ra cần thử thực nghiệm nhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết tinh. Thay vào đó, quá trình kết tinh được tiến hành ở những nồng độ muối xác định bằng cách thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt độ. Nếu trước khi kết tinh mà thấy dung dịch enzym loãng thì cần cô đặc dung dịch trước. Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó là quá trình phân đoạn với dung môi hữu cơ. Những tinh thể lắng xuống đựơc tách riêng và tái kết tinh nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng. Sự tái kết tinh làm đi làm lại nhiều lần cho tới khi hoạt độ riêng của chế phẩm không tăng lên nữa. Phối hợp những phương pháp phân đoạn khác nhau khi tinh chế: Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương pháp phân đoạn khác nhau phải được xác định. Trình tự hiệu quả nhất được xác định thông qua thực nghiệm, nhưng cần lưu ý một số điểm sau: Quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng. Quá trình đun nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêng một phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoá những lượng lớn dịch chiết ban đầu. Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulphate hoặc kết tủa bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên, khi đó ta có những thể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chóng tách riêng protein tủa xuống. Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trên aluminum hydroxide hoặc calcium phosphate. Những tủa thu được khi đó dễ tách bằng cách để lắng cặn hay ly tâm ở tốc độ nhỏ. Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích do enzym rất kém bền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân thông thường nhất (trừ khi sử dụng nước tinh khiết) là do các kim loại ức chế có trong nước như Cu. Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích. Cột chứa jela sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn toàn khỏi những thể tích dung dịch lớn. Các phương pháp sử dụng cột thường không tiện lợi khi áp dụng trong phạm vi sản xuất lớn vì thế nó thích hợp hơn cho những giai đoạn sau của quá trình tinh chế. So với các phương pháp khác, những phương pháp sử dụng cột tiêu hao một không gian đáng kể cho việc lắp cột, rửa và rửa giải cột, đồng thời sự hoà tan enzym trong quá trình rửa giải có thể xảy ra. Sự đun nóng thường đưa lại kết quả tốt đẹp khi kết tủa những enzym không có hoạt tính. Tuy nhiên nó lại ức chế đáng kể một số enzym, do đó hoạt tính của enzym chỉ tăng lên rất ít. Những phương pháp làm đặc dung dịch protein như thổi không khí từ quạt máy vào dung dịch đựng trong các túi cellophane, làm đông đặc bằng cách làm bốc hơi chân không, làm đông khô,… thường gây biến tính enzym. Tốt nhất để cô đặc dung dịch protein-enzym, ta tiến hành siêu ly tâm hoặc xử lý bằng huyền phù dextran sephadex khô. Nếu chế phẩm enzym đã được tinh chế tương đối tốt và chỉ còn chứa một lượng nhỏ protein không hoạt động thì điện di có thể đưa lại những kết quả mỹ mãn về mặt làm giàu enzym. Muốn vậy ta cần có enzym với thể tích nhỏ. Phương pháp sắc kí trao đổi ion trên các ionit cellulose có thể được sử dụng để chiết xuất sơ bộ các enzym. Từ hỗn hợp protein phức tạp, ta có thể tách riêng từng phân đoạn protein enzym. Vì thế phương pháp này cùng với sự sử dụng các chất trao đổi ion khác nhau có thể được sử dụng trước hoặc sau khi điện di. Ở bất kì giai đoạn tinh chế nào, enzym đều có thể được chiết ra dưới dạng khô bằng cách đông khô. Thế nhưng, cùng với việc tinh chế loại trừ những chất lẫn theo, tính dễ hỏng của enzym cũng tăng lên. Các chế phẩm enzym thô có thể được duy trì khá lâu ở 40oC. Các phương pháp khác: Ngoài những phương chính kể trên còn có một số phương pháp khác sử dụng cho từng trường hợp riêng cụ thể và được áp dụng khi các phương pháp nêu trên không đem lại hiệu quả cao. Có thể kể đến ba phương pháp sau: +Làm biến tính bởi chloroform: lắc dung dịch enzym với hỗn hợp cồn và chloroform để tách các protein không hoạt động ra trước. +Sử dụng các chất gây tủa khác: thêm vào thận trọng một lượng xác định muối kim loại nặng (Pb) ở giai đoạn đầu để loại bỏ những protein không mong muốn mà không làm giảm hoạt độ enzym. +Cô đặc: đối với những trường hợp chất hấp phụ có ái lực cao với enzym thì nước giải hấp phụ chỉ chứa enzym với nồng độ thấp, do đó nếu ta cô đặc dung dịch enzym tới một lượng nhỏ hơn sẽ đạt được hiệu quả tinh chế cao hơn. Có thể sử dụng các cách sau: Đông lạnh dung dịch enzym và tách bỏ đá. Đặt dung dịch enzym vào ống thẩm tích và để trong dòng không khí ấm. Làm đông khô (thường được sử dụng, cô đặc cả enzym và muối). Cô đặc dung dịch bằng siêu lọc: muối và nước chảy qua màng lọc, còn enzym bị giữ lại, sau đó rửa màng lọc thu nhận enzym. Thêm sephadex khô vào giúp giữ lại cả muối và nước và làm tăng nồng độ enzym trong dung dịch. Trong tất cả các phương pháp phân đoạn enzym (điện di, sắc kí…), cần phải loại trừ những ion kim loại nặng, chất oxi hóa… độc đối với enzym có trong dung dịch muối trong nước hoặc những pha rắn bất động bằng cách dùng thuốc thử tiolic, các chất khử thích hợp (EDTA, mercaptoethanol, unitiol), complexon… 1.3. NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM [3]: Để xác định xem enzym được chiết ra có phải là tinh khiết không hay còn lẫn các protein không hoạt động khác, ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên tính chất vật lý của protein. Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máy siêu ly tâm: nếu phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần nhất, tuy nhiên kết quả không chính xác lắm vì những protein có phân tử lượng bằng nhau sẽ lắng với tốc độ như nhau và cho cùng một đỉnh. Điện di: dung dịch enzym khi được điện di khu vực trong jella tinh bột hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối là enzym thuần khiết, tuy nhiên khi hàm lượng những protein tạp nhỏ (<1%) thì khó phát hiện ra đúng. Xác định hoạt độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quang phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngoại đặc hiệu. Kết hợp phân tích điện di và những phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên thạch theo grabar. Phương pháp này khá nhạy. Định độ hòa tan của enzym theo norchrop: ít nhạy nhưng có triển vọng. Thường để xét độ thuần nhất của enzym thì phải dựa trên sự so sánh các kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau. Cần lưu ý rằng, những chế phẩm enzym càng tinh khiết thì càng dễ hỏng và khi bảo quản các dung dịch ở 4oC đều nhanh chóng mất hoạt tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzym lặp lại, ta thường thấy có sự giảm hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzym bị ức chế. 1.4. ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT [3]: 1.4.1.Bromelin [3]: 1.4.1.1.Đặc điểm: Cấu tạo enzym bromelin: Bromelin là một glycoprotein, mỗi phân tử glycan gồm 3 manose, 2 glucoamin, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydrate cacbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide. Trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da (lớn gấp 1,5 lần so với papain) Hình 1.1 : Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và bromelin quả thì tuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khác nhau. Bromelin thân có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 321-144 amino acid và bromelin quả là 283-161 amino acid. Bromelin thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầu cacbonhydrate là glycin, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanin. Bảng 1.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin.(mg/100g protein) Amino acid Thân Quả xanh Quả chín Aspartic acid 29 – 29,4 29,8 29,8 Glutamic acid 23 23,2 23,4 Glycine 24,6 – 35 32,6 32,2 Alanine 35 – 35,4 23,8 24,4 Valine 21,6 – 22 19,8 20,1 Leucine 10 10 10 Threonine 21 – 21,2 16,4 16,2 Cysteine 28 – 28,2 32,2 32 Methionine 13,6 – 14 13,5 13,8 Proline 14 – 14,2 11,6 12,1 Phenylalanine 8,8 – 9 7,6 8 Tyrosine 20,8 – 21 22,4 22,2 Tryptophan 8 – 8,1 5,6 - Histidine 1,9 – 2 1,4 1,3 Lysine 22,9 – 23 7,8 8,3 Arginine 11,5 – 12 8,6 9,1 Amid 41,6 – 42 43 43,4 Glucoamine 5,8 – 6 0,2 0,2 Cacbonhydrate 1,46 3,2 3,2 Cấu trúc không gian của bromelin: Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau: Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp – -Gly – Cys – Lys - Bromelin là một protease trong tâm hoạt hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S-. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp. Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử còn có có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzym. Tính chất vật lý: Bromelin tan ít trong nước và glycerine, nhưng không tan trong dung môi hữu cơ. Bromelin hoạt động tốt nhất ở vùng pH trung tính, nhiệt độ 700C. Vì tâm hoạt động của bromelin có chứa nhóm -SH nên dễ dàng bị ức chế bởi chất oxi hóa như H2O2, metyl bromua, ion kim loại …và được hoạt hóa bởi chất khử (cystein, sunfit, bisunfit, cyanid…). Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được Murachi và cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau: Bảng 1.2: Những tính chất vật lý của protein thân: Tính chất vật lý Kí hiệu Giá trị Hằng số sa lắng S 2.73S Hằng số khuyếch tán D 7.77 x 10-7 cm2/s Thể tích riêng phần V 0.743 mL/g Độ nhớt bên trong [l] 0.039 dl/g Tỷ số ma sát f/f0 1.26 Điểm đẳng điện pI 9.55 Sự hấp thu A1%cm ở 280 nm 20.1 Trọng lượng phân tử 33.200* 32.100** 35.500*** * : tính từ phương pháp sa lắng- khuếch tán ** : tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong *** : tính bằng phương pháp Archibald Tính chất hóa học : Hoạt tính của bromelin: Hoạt tính phân giải của bromelin: Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase. Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiện và có thể thuỷ phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp. Bảng 1.3 : Hoạt tính phân giải casein của bromelin Cơ chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín Casein 7,4 4,0 3,0 Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn bromelin quả xanh và bromelin quả chín. Bảng 1.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin Cơ chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín BAA 3,7 9,1 7,2 Bảng 1.5: Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau của bromelin thân Cơ chất tổng hợp BAA BAEE BAEM 1,2 x 10-3 1,7 x 10-1 3,2 x 10-2 BAA: Benzoyl-L-Arginine amide BAEE : Benzoyl-L-Arginine ethyl ester BAEM : Benzoyl-L-Arginine methyl ester Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân và bromelin quả chín. So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao gấp 140 lần. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin Giống như các chất xúc tác sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp trích ly, phương pháp tinh sạch... Ảnh hưởng bởi cơ chất : Trên những loại cơ chất khác nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì bromelin mạnh gấp 4 lần papain, với casein tương đương, với cơ chất như BAA, BAEE thì thấp hơn. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym. Ở dịch chiết quả (pH 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫn còn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 5oC, pH 6,1 thì enzym bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính. Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym. pH tối thích của bromelin không ổn định mà tuỳ thuộc nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt. Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là amonium sulfate hoặc molypdenum carbonate thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH 4,6 – 5,4. Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6,0 và pH 8,0 ổn định ở pH 3,5 – 5,6 với nhiệt độ 63oC. Enzym bromelin đã tinh sạch chỉ còn lại 60-70% hoạt tính. Enzym bromelin có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH tối thích của enzym là 5-8 tuỳ thuộc vào cơ chất. Ảnh hưởng bởi ion kim loại: Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym do chúng thường gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme. Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzym bromelin và mức độ kiềm hãm thay đổi tuỳ thuộc nồng độ muối. Ngoài ra còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp với nhóm -SH của trung tâm phản ứng của enzyme. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản: Bảng 1.6: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của bromelin Điều kiện bảo quản Hoạt tính (UI/mg protein) Dịch chiết Đông khô Nguyên liệu tươi 1600 1150 Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày 830 630 Sấy khô ở 4oC 1880 1360 1.4.1.2.Sản xuất: a. Nguồn nguyên liệu : Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromecliaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Dứa là một cây thảo lâu năm. sau khi thu hoạch quả, các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển nhưng cho quả bé hơn quả trước. Các bộ phận của cây gồm có: Thân, trục của cây; thường gọi là gốc. Lá xếp hình hoa thị trên thân theo một kiểu phân bố nhất định. Rễ thường là rễ bất định và mọc ngang mặt đất. Cán quả hay cuống mang quả kép bên trên có một phần chồi ngọn. Chồi có nhiều kiểu kèm theo vị trí đính trên cây: Chồi ngọn Chồi thân: phát triển từ mầm nách trên thân Chồi ngầm: phát sinh từ phần dưới đất của thân hoặc của cổ rễ. Chồi cuống: phát triển từ mầm nách trên cuống. Chồi nách: là chồi trung gian giữa chồi thân và chồi cuống. Dứa là một loại quả rất được ưa thích ở tất cả các nước nhiệt đới, thịt nhiều nước, vị thơm ngon, hơi chua, giải khát rất tốt. Dứa thường được dùng dưới dạng nước uống, thức ăn tráng miệng hoặc ăn trộn với các loại rau quả khác. Một cốc nước dứa ( khoảng 150ml) đem lại cho cơ thể trung bình 150 calo. Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusus được sử dụng như thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzym và ngoài ra còn được sử dụng trong một số lĩnh vực khác như dược phẩm, mỹ phẩm, … Phần thân, chồi và lá sau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng để thu nhận enzym bromelin, làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón. Theo các tài liệu nghiên cứu khoa học, cho kết luận chính xác rằng hàm lượng bromelin chứa trong thân và chồi dứa lớn hơn nhiều so với trong quả. Do đó, xu hướng hiện nay là nghiên cứu thu nhận bromelin từ đọt dứa. b. Quy trình sản xuất: Phá vỡ tế bào Quả, thân hoặc chồi dứa được xay nhuyễn để phá vỡ tế bào mô dứa. Ta có thể dùng phương pháp đồng hóa để vừa phá vỡ tế bào vừa giảm độ nhớt của dịch chiết. Thu dịch enzym thô Tiến hành: quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin. Tách enzym Ta có thể sử dụng các phương pháp: Phương pháp kết tủa Tủa bằng acetone: thêm 1 thể tích acetone 99,5o (đã được làm lạnh) hoặc 20% vào một thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm (cũng được làm lạnh). Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-4oC. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm hai thể tích acetone lạnh vào, để 1 giờ ở 0-4oC, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh. Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 960 vào theo tỷ lệ nước dứa : cồn = 4:1, trộn đều, để ở nhiệt độ 0oC trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp ở 6000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tủa bằng acetone và thu tủa. Tủa bằng ammonium sulphate: chuẩn bị 1 lít dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g ammonium sulphate vào và khuấy đều (dung dịch đạt bão hòa là 70%). Để yên ở nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 5 phút để thu nhận tủa. Phương pháp hấp phụ: Có thể sử dung kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin. Cấu tạo kaolin: kaolin có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do đó chúng có tính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo hình kết dính. Một tính chất quan trọng là kaolin có độ phân tán cao nên có tính hấp phụ tốt. Kích thước hạt nhỏ hơn 1mm do đó diện tích tiếp xúc tăng lên rất nhiều. Một lý do khác dẫn đến khả năng hấp phụ của kaolin cao là do trên bề mặt kaolin có chứa rất nhiều ion OH- và O2-, những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với các chất bị hấp phụ. Tiến hành: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa thu được gọi là bromelin-kaolin. Phương pháp siêu lọc: Dung dịch sau ly tâm được cho qua màng siêu lọc có kích thước 0,45mm, trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc. Để tăng khả năng tinh sạch, ta có thể tiến hành theo kiểu lọc lô và lọc thể tích không đổi. Phương pháp sử dụng CMC: Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu được bromelin ở dạng bột trắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh và đơn giản hơn các phương pháp khác. CMC vải màn được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphat 0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào, thỉnh thoảng khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein bằng đệm phosphat 0,05M, pH 7,1, và NaCl 0,5M khuấy trộn 3-4 lần. Sau hai giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin. Tiếp tục hấp phụ lần thứ 2 như lần thứ nhất. Sau đó gộp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzym. Với phương pháp này hiệu suất thu đạt 0,1% so với chồi dứa tươi và có hoạt tính 24nk/mg chế phẩm enzym. So với tủa (NH4)2SO4 thì độ sạch của chế phẩm enzym cao gấp 2 lần, thời gian nhanh hơn và tiến hành thuận lợi. Tủa thu được sau đó đem sấy chân không ở nhiệt độ 40oC để thu nhận chế phẩm enzym. Phương Pháp Tinh Sạch Bromelin : Enzym bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua sephadex, phương pháp sắc kí. Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích: Tiến hành: + Cân 1g protein thô + Dung dịch đệm: 10ml dung dịch sodium phosphate 0,03M, pH 7,2 + Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau 2 giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng máy khuấy từ. Enzym sẽ bị giữ lại trong túi cellophane. Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex: Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50: Cân 100 mg enzym thô hòa tan vào trong 1mL dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Khi enzym đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzym từ từ vào cột. Cho dung môi phân ly enzym qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2mL trong 7 phút. Loại bỏ 5 mL đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzym. Dịch enzym được thu đến khi dùng Ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzym. Dịch enzym thu nhận được làm đông khô. Quá trình lọc enzym nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để giảm thiểu sự biến tính protein. Thời gian tiến hành khoảng 1 giờ. Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100: Cân 100 gam enzym thô hòa vào 1mL dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột. Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzym là 1mL/phút. Thu từng phân đoạn enzym (mỗi phân đoạn là 3mL) và đo độ hấp thu OD ở bước sóng 280nm. Tính trọng lượng phân tử bromelin theo công thức: Vo = 40%Vt (Vt là thể tích tổng cộng của cột) Ve: thể tích dung môi phân ly enzym được tính từ lúc cho mẫu vào đến khi thu nhận mẫu. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký: Bromelin thân cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagon. Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần amino acid. Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzym. Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trên sephadex G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfoethyl sephadex chỉ cho một phân đoạn đơn có hoạt tính phân giải protein. Còn nếu sắc ký hoán vị gel ở pH 7 rồi sau đó sắc ký trên sulfoethyl sephadex cho thấy có sự hiện diện của hai protease riêng biệt được đặt tên là bromelin II và bromelin III, hai protease này có tốc độ di chuyển khác nhau khi điện di trên polyacrylamide ở pH 9,5. Bromelin thân khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 và sắc ký trao đổi ion trên DEAE- cellulose thì thấy có 1 thành phần chính và 5 thành phần phụ. Bromelin quả khi dùng sắc ký trên DEAE–cellulose và sulfoethyl sephadex thì thấy có 1 thành phần chính và 2 thành phần phụ. 1.4.1.3. Ứng dụng [2],[3],[4]: Thủy phân Protein: Các enzym thương mại có mức độ ứng dụng rất đa dạng và hiệu quả trong lĩnh vực y dược và công nghiệp .Trong công nghệ thực phẩm, protease là công cụ xác định cấu tạo, khả năng hòa tan và những tính chất khác của thịt cá. Bromelin còn dùng để biến đổi protein thịt cá thành dịch thủy phân giàu acid amin phù hợp cho sự tiêu hóa của người hay làm thức ăn cho gia súc. Protease thương mại được sử dụng để làm mềm thịt, sản xuất chế phẩm protein cá bằng protease hòa tan và sản xuất enzym cố định. Hiện nay việc nghiên cứu triển khai quá trình sản xuất các chế phẩm thủy phân cá bằng enzym là mối quan tâm chung nhằm tận dụng được nhiều hơn những thủy hải sản chưa được sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho người. Việc sản xuất chế phẩm protease dùng trực tiếp cho người cho người còn gặp khó khăn do: Sự phân giải nhanh của enzym đưa đến sự hình thành các peptid có vị đắng trong dịch thủy phân. Protease sấy khô mất nhiều tính chất, chức năng. Sự tạo nhũ tương của sản phẩm có giá trị dinh dưỡng nhưng mùi vị không hợp. Tuy vậy thủy phân protein bằng enzym có một triển vọng lớn. Nhiều vấn đề đang tiếp tục được nghiên cứu giải quyết và người ta có nhiều căn cứ để tin tưởng rằng quá trình sinh học này sẽ đưa đến những thành công trong việc chế tạo các sản phẩm protein từ phế liệu thịt cá. Việc lựa chọn enzym và các điều kiện thủy phân thích hợp là vấn đề cần thiết. Việc xử lí protease cho thịt cá có liên quan một phần đến bản chất phức tạp của cơ chất. Tiến trình của phản ứng enzym không phải luôn dễ điều khiển để cho ra sản phẩm với tính chất đặc biệt mà ta đang đợi. Hiện nay các protease đang được chú ý sử dụng là papain, bromelin, ficin và enzym có nguồn gốc vi sinh vật. Enzym bromelin thương mại là hỗn hợp gồm các protease và một lượng nhỏ photphatase, cellulase. Vì bromelin có phổ tác dụng rộng như papain nên ngày càng được sử dụng nhiều thay cho papain. Trong chế biến thủy sản và trong y dược, đặc biệt trong thủy phân protein cá, sự làm mềm thịt, thủy phân gan bò. Thủy phân protein cá Việc sử dụng protease để sản xuất chế phẩm cá đậm đặc là phương pháp biến đổi những loại cá rẻ tiền, những thành phần không ngon của cá thành chế phẩm đậm đặc có tính chất chức năng tốt hơn bột cá cổ truyền. Trong những quá trình cổ điển, người ta lợi dụng enzym vi sinh vật thủy phân có sẵn trong cá để phân giải protein một cách chậm chạp trong thời gian dài và nhiệt độ thích hợp. Ngày nay enzym được sử dụng trong quá trình thủy phân với những đặc điểm thỏa mãn cho sản xuất công nghiệp. Cần phải lựa chọn những điều kiện để ngăn ngừa hoạt động của vi khuẩn phân giải. Enzym bromelin có top = 700C, ở nhiệt độ này loại trừ sự tồn tại của hầu hết vi khuẩn phân giải. Sản phẩm phân giải có phân tử lượng trung bình tương đối thấp. Tùy theo điều kiện thủy phân mà sử dụng một hay nhiều loại enzym. Sản xuất dịch thủy phân protein cá bằng enzym thực vật để thêm vào nước mắm cổ truyền có những ưu điểm to lớn: + Cho phép tăng thể tích thu hồi mà không làm thay đổi giá trị dinh dưỡng + Thay thế các loại cá được dùng trong sản xuất nước mắm hiện nay bằng các loại cá có giá trị thương phẩm kém hơn + Rút ngắn được quy trình sản xuất cổ truyền để rút ngắn quá trình lên men, người ta cho bromelin vào khối chượp, nhờ hoạt động của bromelin protein của cá được thủy phân nhanh hơn, để tránh biến tính bromelin, thay vì cho muối một lần trong lên men, người ta cho muối vào nhiều lần. Theo cách này ta có thể sản xuất nước mắm khoảng từ 5 – 7 tháng thay vì chín tháng hay hơn một năm. + Gia tăng sự chuyển lượng protein không hòa tan thành protein hòa tan. Sự làm mềm thịt Chỉ cần một phần bromelin là có khả năng thủy phân 1.000 phần thịt, tương tự như papain. Các enzym được rải lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch enzym hoặc tiêm dung dịch enzym vào thịt. Thủy phân gan bò: bromelin dùng để thủy phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ. Gan bò được xử lí bằng chế phẩm bromelin trong thời gian 10 giờ ở nhiệt độ 550C, sau đó xử lí nhiệt 100oC trong vòng 3 - 5 phút. Dịch thủy phân được tách lọc và đông khô. Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta dùng renin. Renin là loại enzym được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế. Gần đây sử dụng enzym thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelin chồi dứa đang được quan tâm sử dụng vào mục đích này. Sử dụng bromelin thu nhận chất ức chế protease: Trong tế bào cơ quan động thực vật tồn tại các chất ức chế enzym, trong đó có các chất ức chế protease. Các chất ức chế trong tế bào thường có bản chất protein như enzym. Hiện nay trong công nghiệp và y tế thường sử dụng rộng rãi các chất ức chế này. Chế phẩm bromelin được sử dụng để thu nhận các chất ức chế các chất ức chế protein có chứa nhóm –SH. Bromelin được tinh sạch sau đó được cố định trong gel sepharose. Dịch nghiền đầu và lõi dứa sau khi lọc và li tâm được cho qua cột chứa bromelin cố định, trước tiên trong dung dịch đệm phosphat, pH = 4,6 sau đó pH = 7,6 - 7,8, khi đó xảy ra quá trình liên kết giữa bromelin và chất ức chế của chúng có mặt trong dịch nghiền nói trên , sau đó thu hồi chất ức chế bằng dung dịch 0,01M NaOH có chứa 0,1M NaCl, pH = 11,5 - 12. Bằng phương pháp này sẽ thu được chất ức chế protein ở dạng tinh sạch, chất ức chế này tác động mạnh lên enzym như papain, ficin. Các lĩnh vực ứng dụng khác: Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hóa protein, bromelin được điều chế với vài chất khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hóa tự nhiên. Những dược phẩm này chứa bromelin và các enzym khác như lipase, amilase, những chất bổ hay vitamin. Bromelin cũng có thể giúp giảm triệu chứng của bệnh hen, đau thắt ngực, viêm phế quản. Bromelin làm tăng hệ miễn dịch, ức chế quá trình viêm, làm giảm phù nề và tụ huyết, bôi lên nơi tổn thương (vết thương, vết bỏng, vết mổ) làm sạch các mô hoại tử, mau lành sẹo. Những nghiên cứu mới gần đây cho thấy, bromelin có tác dụng làm giảm hiện tượng sưng phồng, bầm giập và đau đớn đối với những sản phụ trải qua các phẩu thuật nhỏ trong khi sinh. Bromelin phối hợp với thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophylllin, ephedrine…) làm tăng tác dụng chống hen. Mới đây, một nghiên cứu đăng trên tạp chí Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng bromelin làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen, hàm lượng càng cao thì hiệu quả càng được cải thiện. Ngoài ra, bromelin còn giúp giảm triệu chứng sổ mũi, giúp mau lành những vết thương nhỏ, đặc biệt là căng nhức cơ, bong gân. Bromelin còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 – 300 mg/kg thể trọng kết hợp với hóa trị hay xạ trị. Trong công nghiệp dược phẩm, nhiều hãng dược phẩm ở châu Âu đã đưa bromelin vào trong thành phần thuốc, nó thường được bào chế chung với nhiều chất khác. Ở Mỹ, MỹLatinh và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế tại Philadel. Từ thịt quả dứa xay hoặc giã nát, người ta còn dùng làm mặt nạ (đắp lên mặt) nhằm lột nhẹ lớp tế bào sừng phía ngoài, bộc lộ lớp da non bên trong mịn màng hơn và trắng hơn. 1.4.1.4. Sản phẩm thương mại: Hình 1.2: Chất chiết từ lá và thân dứa (Ananas comosus) với hàm lượng bromelain cao, được sản xuất dưới dạng viên nén, chứa 200mg bromelin/viên. Hình 1.3 : Chế phẩm bromelin có hoạt lực cao (1200gdu/g hay 1800mcu/g) Hình 1.4: Bột bromelin bổ sung vào thức ăn cho gia súc Hình 1.5: Quercetin & Bromelain - Thuốc giúp bệnh thống phong Dược phẩm này bao gồm tinh chất quả dứa Bromelain và dược thảo Quercetin, một chất “flavonoid” có công dụng chống oxít hóa rất mạnh, giúp bồi bổ tim, phòng ngừa tai biến mạch máu não, phòng ngừa ung thư. Quercetin có nhiều trong rượu vang đỏ, quả bưởi, hành tây, quả táo và trà đen. Thuốc có thể giúp các bệnh sau đây: • Bệnh thống phong (Gout): giúp ngăn ngừa cơ thể sản xuất ra uric acid, giảm đau và chống viêm. • Bệnh viêm nhiếp hộ tuyến (Prostatitis): một thử nghiệm cho thấy sau một tháng dùng Quercetin & Bromelain thì những triệu chứng của bệnh viêm nhiếp hộ tuyến đã giảm đi rất nhiều. • Bệnh dị ứng (Allergy): dược phẩm này rất công hiệu cho các bệnh dị ứng, hắt hơi, chảy nước mắt, nước mũi do dị ứng gây nên. • Bệnh ung thư: Quercetin & Bromelain có công dụng làm giảm bớt sự sản xuất của chất “mutantap53 protein”, một chất xấu giúp các tế bào ung thư sinh sôi nẩy nở nhanh. Ngoài ra, Quercetin & Bromelain còn giúp làm chậm sự phát triển của bứu ung thư bằng cách ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme có tên là “tyrosine kinases” (các enzymes này có công dụng giúp tế bào ung thư sinh sôi nẩy nở nhanh hơn). Hình 1.6: Bromelain - Tinh chất quả dứa trị viêm mũi Tinh chất quả dứa, hay đúng hơn từ cuống của quả dứa, một dược thảo với nhiều tác dụng đối với một số các căn bệnh như: • Bệnh viêm xoang mũi (sinusitis): Tốt nhất là dùng thuốc Bromelain tinh chất quả dứa cộng với thuốc có tinh chất củ nghệ để giúp căn bệnh viêm xoang mũi. Rất nhiều khách hàng bị viêm xoang mũi kinh niên đã dùng qua nhiều loại thuốc tây lẫn dược thảo bao năm nay mà vẫn không khỏi bệnh. Thế mà họ chỉ dùng tinh chất quả dứa cộng với tinh chất củ nghệ chưa đầy một tháng mà đã có hiệu quả rất cao (dùng cả hai loại chung nhau, uống lúc bụng đói). • Ung thư: Theo các cuộc nghiên cứu khoa học về dược thảo giúp chữa trị ung thư, tinh chất quả dứa có công dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và giúp phá vỡ các lớp vỏ bao bọc tế bào ung thư và nhờ vậy, tế bào của hệ thống miễn dịch sẽ dễ dàng giết chết tế bào ung thư hơn. • Chống viêm: Tinh chất quả dứa giúp giảm viêm và giảm đau của bệnh viêm khớp, viêm nhiếp hộ tuyến, trị bong gân, trặc gân, giúp làm tan máu bầm, rất hiệu quả để làm bớt đau lưng. 1.4.1.5.Hướng nghiên cứu: a. Tạo chế phẩm Bromelain để phối hợp và tăng cường độ bền với α-chymotropsin dược dụng: Đề tài do các tác giả Nguyễn Văn Rư, Nguyễn Ích Tuấn, Nguyễn Bá Huynh (Đại học Dược Hà Nội) thực hiện nghiên cứu tạo chế phẩm enzym có tác dụng điều trị nhưng có độ bền hoạt tính enzym cao để sử dụng thay thế phối hợp đồng thời tiến hành nhiệt đới hoá các chế phẩm enzym cho phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam. Viên α-chymotropsin (ACT) là một dạng thuốc enzym được sản xuất dưới dạng tiêm và uống, có tác dụng chữa viêm, chống phù nề và bổ trợ tiêu hoá. Tuy vậy, với điều kiện nước ta thì giá thuốc còn cao và việc bảo quản (đòi hỏi ở lạnh dưới 150C) còn nhiều khó khăn. Nghiên cứu tiến hành với nguyên liệu là chế phẩm enzym ACT USP 24 GMBH 1100 USP/1mg, quả dứa Ananas comusus L. họ dứa Bromeliaceae, các hoá chất… và phương pháp chiết tách cơ học, hoá học, lọc gel... Kết quả cho thấy, tạo được chế phẩm bromelain từ lõi và vỏ quả dứa ở 3 cấp độ tinh chế khác nhau: BRO1, BRO2, BRO3, lựa chọn BRO3 có độ tinh chế cao nhất để phối hợp thay thế một phần chế phẩm ACT. Đã xác định được hoạt độ riêng của BRO3 bằng ¼ của ACT (1,25/5Nk). Trên cơ sở đó đã xác định được tỉ lệ của BRO3 phối hợp với ACT theo khối lượng chế phẩm là 4/1 và đề nghị thay công thức viên ACT 5 mcg bằng viên ACT-BRO3E có hàm lượng 2,5 mcg ACT và 10,0 mcg BRO3, hai công thức viên này có hoạt độ riêng tương đương. Kết quả này cũng đánh giá được độ bền hoạt tính của hỗn hợp enzym trong 2 điều kiện bảo quản: điều kiện nhân tạo (450C, độ ẩm 60-70%) hoạt độ riêng của hỗn hợp ACT-BRO3 có độ ổn định cao hơn của ACT là 1,5 lần và hỗn hợp có thêm PEG còn có độ ổn định cao hơn hỗn hợp của nó 1,2 lần và cao hơn ACT tới 1,8-2,9 lần, đó là cơ sở quan trọng để tính tuổi thọ cũng như độ ổn định của sản phẩm thuốc ở điều kiện tự nhiên của Việt Nam (30 ± 200C, độ ẩm 75-85%), tuy thời gian thử mới có 2 tháng nhưng kết quả bước đầu cho thấy hoạt độ riêng của 2 hỗn hợp có độ ổn định cao, có ý nghĩa thiết lập công thức bào chế, pha chế viên có chứa CPE. Việc phối hợp chế phẩm BRO3 với ACT để sản xuất thuốc chữa viêm, chống phù nề mang lại hiệu quả về kinh tế, giảm được chi phí cho sản xuất, tăng tính khả thi để ứng dụng vào thực tế sản xuất, giúp giảm giá thành, ổn định giá bán sản phẩm và tăng độ ổn định của chế phẩm.  b. Enzym và bệnh nhân HIV/AIDS: Trong quá trình sinh sản trong tế bào người bệnh, virus suy giảm miễn dịch (HIV) cần một enzym hoạt hóa protease (protein - digesting enzym) để sao chép ngược nhằm cô đọng nhân protein để nhân bội virus. Thuốc điều trị HIV/AIDS theo cơ chế ức chế protein - digesting enzym này gọi là protease inhibitor hay anti-protease khá hữu hiệu nhưng rất đắt tiền và cũng gây nhiều phản ứng phụ. Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khả năng ngăn ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất có tác dụng tương tự thuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và có thể ăn, uống để trị HIV/AIDS. Thuốc cô đọng, bào chế từ enzym bromelain dứa này cũng rất đắt, nhưng người bệnh có thể dùng trực tiếp quả thơm, đọt thơm (phần trắng, mềm sau khi lột bỏ vỏ ngoài của chồi bên hoặc chồi ngọn quả thơm chứa enzym đậm đặc nhất). Các nhà bào chế chiết xuất enzym từ thân cây thơm. Enzym bromelain sẽ bị phân hủy khi đun nóng trên 600C. c. Nghiên cứu chế tạo thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu trong nước : Đây là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học của Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ do Viện Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) tiến hành. Theo PGS-TS. Dương Anh Tuấn, Giám đốc Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ, bromelain là hoạt chất có hàng loạt tính năng như trị chứng khó tiêu, phòng các bệnh viêm phế quản, viêm khớp xương mãn tính, viêm xoang, làm sạch bên trong động mạch vành. Ngoài ra, bromelain còn có tác dụng chống viêm đường ruột và làm tăng khả năng đề kháng của cơ thể.     Trên cơ sở nghiên cứu chiết, tách, tinh chế thành công bromelain, nhóm nghiên cứu đã bổ sung hoạt chất curcumin được chiết, tách từ củ nghệ để sản xuất thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa. Cùng với tác dụng của curcumin là điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật..., sự kết hợp giữa curcumin và bromelain cho phép tinh nghệ - dứa có khả năng tăng cường miễn dịch và khả năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh, đồng thời hỗ trợ điều trị các bệnh nan y nhờ hoạt tính sinh học cộng hưởng của curcumin và bromelain cùng các chất dinh dưỡng thiên nhiên.   Nhằm làm tăng giá trị sử dụng và tác dụng sinh học của curcumin trong các sản phẩm từ nghệ và bromelain từ quả dứa, nhóm nghiên cứu khoa học của GS.TSKH Trần Đình Toại và PGS.TS Dương Anh Tuấn thuộc Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hợp tác với TS Lục Văn Puyvelde (Vương Quốc Bỉ) đã thành công trong việc nghiên cứu qui trình công nghệ chiết, tách, tinh chế bromelain từ quả dứa, đồng thời bổ sung vào sản phẩm curcumin làm thực phẩm chức năng đó là tinh nghệ - dứa. Qui trình công nghệ chiết, tách, tinh chế bromelain từ quả dứa được thực hiện trên các thiết bị của Viện Hóa học. Đây là lần đầu tiên sản phẩm thực phẩm chức năng này được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta từ nguồn nguyên liệu nghệ và dứa sẵn có trong nước. Sản phẩm ở dạng bột, sử dụng đơn giản, thuận tiện và an toàn. Sản phẩm gồm có bột nghệ tinh (đã được chiết, tách loại bỏ tinh dầu, sáp và các chất nhựa) chứa hoạt chất chính curcumin và hoạt chất bromelain chiết từ quả dứa được phối trộn với nhau ở tỷ lệ thích hợp. Ngoài việc làm tăng tác dụng của curcumin, bản thân chất bromelain có khả năng làm tan biến các nội chất gây ra chứng nhồi máu cơ tim, tăng khả năng tiêu hóa và trị chứng khó tiêu, chống viêm đường ruột... Nhờ đó, việc sử dụng thực phẩm chức năng nói trên có tác dụng tăng cường miễn dịch và khả năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh, đồng thời hỗ trợ trong điều trị các bệnh nan y, hiểm nghèo. Sản phẩm tinh nghệ - dứa nói trên đã được gần 100 bệnh nhân khác nhau sử dụng và đều cho kết quả rất tốt. Hiện nay Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế đã cấp giấy chứng nhận sản phẩm thực phẩm chức năng “tinh nghệ - dứa” nêu trên đạt tiêu chuẩn chất lượng, vệ sinh, an toàn thực phẩm và được phép lưu hành. Hiện nay, dựa trên các kết quả nghiên cứu đã đạt được và được sự đầu tư kinh phí của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhóm các cán bộ nghiên cứu này đang mở rộng hợp tác với các doanh nghiệp trong nước và quốc tế, để đẩy mạnh sản xuất sản phẩm tinh nghệ - dứa phục vụ tiêu dùng trong nước cũng như xuất khẩu, góp phần tích cực vào công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 1.4.2.Papain [3]: 1.4.2.1.Đặc điểm: Cấu tạo : Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S. Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212 amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí cysteine 25. Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine. Cấu trúc không gian: Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn a chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn a. Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử. Cấu trúc tâm hoạt động của papain: Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với amino acid là: Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys. Hình 1.7: Tâm hoạt động của papain Tính chất vật lý: Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine, bền nhiệt) Bảng 1.7: Tính chất vật lý của papain: Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8,75 Hằng số lắng S20 2,42 ± 0,04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10,27 ± 0,13 Phân tử lượng 20700 Độ triền quang [a]D -66,7o Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng coton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0,724 Trị số ma sát f/fo 1,16 Tính chất hóa học : Khi chưa được hoạt hóa, papain có hoạt lực rất yếu. Dưới tác dụng của các chất có tính khử, nhất là kèm theo sự có mặt của các chất kết hợp với kim loại, papain được hoạt hóa. Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng: Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid: (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (-NH-CH(R)-COOH)i + (H2N-CH(R)-CO-)k i + k = n Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid (H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (H2N-CH(R)-COOH)n’ + (H2N-CH(R)-CO-)k’ n’ + k’ = n So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain. Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase. Hoạt hoá papain: Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glutation acid, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. Bất hoạt: Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hoá như: O2, O3, H2O2, iodua acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên, papain rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M). Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain: Nhiệt độ: Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ trên 100oC thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bị phá hủy hoàn toàn. Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn định (có cấu trúc không gian ổn định) ở trạng thái khô có thể chịu được nhiệt độ sấy ở 115oC trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%. pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 10 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH 12. Tuỳ thuộc bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn định có thể chịu được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. Hình 1.8: Cơ chế ảnh hưởng của pH Hình 1.9: Cơ chế hoạt động Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bị giảm hoạt tính trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dịch TCA 10% papain bị biến đổi bất thuận nghịch. 1.4.2.2.Sản xuất [3]: a. Nguồn nguyên liệu: Quả đu đủ có tên khoa học là Carica Papaya Linn. Ðu đủ thuộc họ nhỏ Caricaceae có hai giống: họ Caricaceae, thường xếp chung vào họ Passifloraceae, người ta còn gọi Papaya theo tiếng Anh là Paw-paw. Ðu đủ là một loại quả nhiệt đới, được trồng nhiều ở các nước Nam Mỹ, châu Phi, Ấn Ðộ, Ðông Nam Á. Các nước có sản lượng thu hoạch đu đủ cao nhất thế giới là Brazil, kế đến là Nigeria, Ấn Ðộ... Bảng 1.8: Giá trị dinh dưỡng trên100 g chất quả Nước (%) 88 Năng lượng (Calories) 43 Protein (%) 0.6 Chất mỡ (%) 0.1 Carbohydrates (%) 10 Chất xơ 0.3 Bảng 1.9: %RDI Vitamin A 48 Vitamin B1 3.6 Vitamin B2 8.1 Niacin 2.2 Vitamic C 80 Calcium 2.4 Phosphorus 1.6 Sắt 3 Natri - Kali - * RDI, recommended daily intake: nhu cầu tiêu thụ trong 1 ngày do FDA Mỹ đề xuất, thiết lập dựa trên nhu cầu trung bình của một người nam, nặng 70kg, mức năng lượng tiêu thụ 2700kcal/ngày. Khoảng 1500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650 gram papain: Theo các nghiên cứu khoa học, papain có nhiều nhất chủ yếu trong nhựa cây và quả đu đủ xanh. Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%. Điều kiện lấy nhựa: + Cây đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều. + Quả: lấy ở những quả xanh, vỏ mịn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt nhất. + Thời gian lấy nhựa: sáng sớm. Hình 1.10: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa Cách tiến hành: + Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm để dịch nước và tinh bột từ quả không bị trộn lẫn vào nhựa làm giảm chất lượng nhựa). + Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấy nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào. Hình 1.11: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ Lưu ý: Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa. Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước đó. Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng… vì sẽ làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lọ, dao, muỗng… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ. Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm. b.Quy trình công nghệ: Chuẩn bị : Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau: Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa pH dịch chiết tới 5,7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1l. Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5,7. Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym tiến hành trong điều kiện lạnh. Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong. Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4: Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzym đến 40% độ bão hòa, sau 1 - 2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa lại một lần nữa với 400 - 500mL dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa. Quá trình phân đoạn bằng NaCl: Hòa tan tủa trong 600mL dung dịch cysteine 0,02M, dung dịch thu được có pH 7-7,5, sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng. Kết tinh: Hoà tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một dung dịch huyền phù có pH = 6,5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể. Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất ở nhiệt độ phòng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10mL/300mL dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4 - 5 giờ để thu nhận tinh thể. Hoạt độ riêng của enzym có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên. Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000Ao và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc. Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ 40oC thu nhận papain tinh chế. Nghiên cứu phương pháp mới thu nhận papain: Sử dụng dung dịch EDTA có pH = 7 thêm vào nhựa tươi đến nồng độ 1mM, sục nitơ vào trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng có lắc đảo. Dịch huyền phù đem ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ phòng bằng máy ly tâm Sorvall RC-2B để tách những chất không tan thu được dịch lỏng (phân đoạn 1) Chỉnh pH lên 9 bằng cách thêm từ từ dung dịch NaOH 0,1M khuấy liên tục, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để tách tủa. Phần dịch trong (phân đoạn 2) được bảo quản lạnh ở OoC. Sau 72 giờ bảo quản ở OoC, papain sẽ kết tinh tự nhiên (kết tinh lần 1), đem ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 20 phút ở OoC thu tủa (phân đoạn 3). Phân đoạn 3 được rửa 3 lần bằng một lượng dung dịch EDTA 1mM ít nhất có thể có pH = 7 ở 4oC. Sau đó tiến hành ly tâm ở 12100 vòng/phút trong 20 phút ở OoC thu tủa (phân đoạn 4). Phân đoạn 4 được hòa tan trong một lượng dung dịch EDTA 1mM, pH = 7 ở 37oC trong 30 phút với tỷ lệ 25mg protein/mL EDTA. Sau đó tiến hành kết tinh tự nhiên ở nhiệt độ OoC (tái kết tinh). Toàn bộ quá trình được tiến hành trong điều kiện khí trơ để chống lại sự oxi hoá của không khí. Hàm lượng protein được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 280nm. Phương Pháp Tinh Sạch Papain : +Điện di: Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm là b-alanine 34mM, pH = 4,3 và cường độ dòng điện không đổi là 4mA. Mẫu sẽ được chuẩn bị trong Tris-glycerol-b-mercaptoethanol cho vào nước sôi trong 40 giây. Gel sẽ được hiện màu bằng thuốc thử Coomassie-Blue R-250 và Brilliant Blue G-colloidal. +Lọc qua Sephadex G-75: Để xác định phân tử lượng của papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có kích thước là 1,1x100 cm. Cột được cân bằng trước bằng dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0,1M và dung dịch EDTA (ethylenediamine-tetraacetic acid) pH = 7. 1.4.2.3.Ứng dụng: a. Trong công nghệ thực phẩm: Papain được sử dụng rất rộng rãi trong công nghiệp chế biến thịt.Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thịt cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn. Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym vi sinh vật thuỷ phân protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thích hợp. Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rút ngắn thời gian thuỷ phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ hoạt động tối ưu của nó là 70oC. Bảng 1.10 : Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng thái cơ chất của papain: Tên cơ chất Trạng thái cơ chất Sống Chín Casein 40,31 51,15 Lòng trắng trứng 0 35,42 Albumin bò 22,33 41,86 Protid cá 28,59 50,02 Protid tôm 38,22 50 Ngoài ra, papain còn ngăn ngừa sự làm đục bia và các loại nước trái cây khi ướp lạnh do nó phân huỷ các vết protein hoà tan. b.Trong y học: Là thành phần chính của các loại thuốc trị bệnh biếng ăn, ăn không tiêu. Papain khi kết hợp với lipase, amylase trợ giúp cho hệ tiêu hóa hoạt động hiệu quả. Còn được dùng để điều trị lở loét; làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu; chống kết dính sau phẫu thuật. Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dịch trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4 liều độc của toxin uốn ván . Papain còn có tác dụng làm ngăn cản quá trình thụ thai ở phụ nữ. Qua kết quả nghiên cứu, họ đưa ra hai thuyết về tác dụng ngừa thai của quả đu đủ;: chất Papain trong đu đủ có tác dụng ức chế hoocmon (nội tiết tố) progesterone và làm ngăn cản quá trình thụ thai, thứ hai là chính tác dụng làm mềm thịt của papain có thể phá hủy màng tế bào phôi thai. Tiêu huỷ các dị vật thừa, các protein chết trong cơ thể. Hỗn hợp papain- bromelin- cellulase được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận. Papain còn có hoạt tính kháng sinh trong tri bệnh hen suyễn, viêm cuống phổi. Có khả năng sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh giun kim, giun đũa. Ức chế một số vi khuẩn gram (+), vi trùng thương hàn, Staphylococus. Dung dịch papain cysteine salicilate có công dụng chữa bỏng. c. Trong các ngành công nghệ khác : Trong công nghệ sản xuất dầu cá, nếu cho papain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng lên. Khi tinh chế dầu gan cá ngừ, người ta tiêm papain vào gan cá trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin D và A hơn. Papain có thể sử dụng kết hợp với một số chất khác để điều chế ra mỹ phẩm chăm sóc da, giúp làm da mềm mại, tẩy các tế bào chết trên da. Papain làm mềm da trong công nghệ thuộc da. Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độ sạch và nhuộm được những màu sống động. Papain là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su. Hình 1.12: Papain ứng dụng trong mỹ phẩm 1.4.2.4. Sản phẩm thương mại: Hình 1.13: Papain trong các loại dược phẩm Ficin [3]: 1.4.3.1. Đặc điểm: Ficin là một protease được tìm thấy trong nhựa của cây thuộc họ Ficus (sung, vải). Người ta thấy rằng hoạt tính của enzym ficin cao khi nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm do đó nhựa sung thường được thu nhận vào buổi sáng sớm, sấy khô thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm. Tính chất của Ficin Cấu tạo hóa học Ficin là một protease thực vật trong cấu trúc bậc một có chứa sulfhydryl. Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin. Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng của ficin như sau: Pro-Leu-Arg-Gln-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys-Tryp- Tùy theo nguồn thu nhận enzim ficin từ các loại sung khác nhau, tiến trình xác định khác nhau mà thành phần hóa học của enzim ficin sẽ khác nhau Bảng 1.11: Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin STT Amino acid Tên tác giả nghiên cứu Marini Metrione Gould Englund 1 Lysine 7 9 9 5 2 Histidine 2 2 2 1 3 Amonia - 52 52 25 4 Arginine 8 10 10 10 5 Aspartic acid 20 21 21 17 6 Threonine 10 10 10 8 7 Serine 13 16 16 14 8 Glutamic acid 22 25 25 25 9 Proline 11 13 13 11 10 Glycine 28 32 32 28 11 Alanine 19 21 21 20 12 Half-cystine 7 9 9 8 13 Valine 15 19 19 18 14 Methionine 3 4 4 5 15 Isoleucine 10 10 10 7 16 Leucine 17 17 17 15 17 Tyrosine 14 15 15 15 18 Phenylalanine 5 6 6 5 19 Tryptophan - 9 9 2 Tổng số gốc aminoacid* 206 211 300 243 * số lượng các gốc aminoacid trên 1 mol protein Tính chất vật lí: Tùy theo nguồn thu nhận enzim mà các tính chất vật lí của chúng không giống nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này không lớn lắm. Một số tính chất vật lí của ficin có thể được trình bày như sau: Trọng lượng phân tử: 23.000-27.000 Da Nhiệt độ hoạt động: 30-80o. Nhiệt độ tối thích: 50-65oC Hệ số sa lắng: 2.5-2.7S Điểm đẳng điện: 9-10 Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nước và glycerine Bảng 1.12: Tính chất vật lí của ficin Nguồn thu nhận Phương pháp tinh sạch Hệ số sa lắng (S0) Trọng lượng phân tử Điểm đẳng điện Hệ số tinh sạch A280, A260 Hệ số tắt Bước sóng hấp thu (nm) Tác giả F.glabrata Tủa muối sắc ký trên CM-cellulose,pH7 25.500750 23.800700 21,1 267 Englund F.glabata Tủa muối 2,56 26.000 Bernhard và Gulfreund Liener F.glabata Tủa muối sắc ký trên CM-cellulose, pH4.4 2,61 F.carica var kadota Các hợp phần có hoạt tính được tách từ nhựa sung bằng phương pháp sắc ký trên CM-cellulose, pH7 >9,6 1,88 20,2 Kramer và Whitaker F.anthelmitica 26.500 Marini bettolo Tính chất hóa học pH hoạt động của ficin rộng: 4-9.5(dịch nhựa sung có pH 5), pH tối thích của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzim: gelatin: pHopt=5 casein: pHopt=9.5 hemoglobin: pHopt=7 Ở dạng nhựa tươi, ficin dễ bị oxi hóa bởi không khí làm cho dịch nhựa chuyển sang màu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt tính xúc tác bị giảm. 1.4.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ficin - Các yếu tố hoạt hóa: - Khi có mặt của kim loại kiềm, hoạt tính thủy gỉai của protein của ficin tăng lên. Hoạt tính của ficin cũng sẽ tăng lên khi nó kết hợp với một trong số các nhân tố khử như: cyanide, cystein, 1,2-dimercaptopropanol hoặc mercaptoethanol. - Cystein hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0,005-0,05M có thể làm tăng hoạt tính của ficin ở dạng tinh thể và HCN 0,075M làm tăng hoạt tính của ficin cao nhất so với các tác nhân hóa học khác. Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn nữa khi phối hợp giữa HCN với cystein( cao hơn nữa khi sử dụng HCN riêng lẽ). - Các yếu tố kìm hãm: Cũng như các loại enzym thủy gỉai khác , nhóm SH tham gia trực tiếp vào các hoạt động của enzym ficin. Khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalenine, iod acetic acid, chloroacetamide hay iodacetamide kết hợp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzym sẽ bị bất hoạt. Các chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật khi liên kết với gốc cystein của enzym ficin cũng có thể bất hoạt ficin như: những dẫn xuất chloromethyl ceton của N-tosyl-L-phenylalanine và N-tosyl-L-Lysine, 1,3-dibrommoacetone cũng gây ra sự bất hoạt ficin. Trong lòng trắng trứng có một loại protein có khả năng kìm hãm hoạt động của ficin. Người ta cho rằng khi protein này kết hợp với ficin sẽ tạo ra một chất có hoạt tính kìm hãm enzym. - Tính chuyên biệt: Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả ascaris sống đều có thể bị thủy giải bởi enzim ficin. Ficin còn có thể thủy phân các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo. - Tính bền vững: Bền vững với nhiệt độ: Ở dạng tinh thể, Cohen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt tính trong hai giờ ở 50oC Dịch enzym ficin sẽ bị mất hoạt tính quathời gian bảo quản đông lạnh kéo dài mà nguyên nhân có thể do từng phần của enzym bị chuyển về dạng bất hoạt do hiện tượng oxi hóa Bền vững với pH:Trong một vùng pH khá rộng(4.5-9.5) độ bền vững của enzym ficin đạt đến mức cực đại nhưng trong một vùng pH hẹp dao động quanh pH=8 thì nó lại có tính bền vững ở mức độ tối thiểu. Nguyên nhân là do một nhóm SH tối cần thiết bị oxi hóa. Tuy nhiên, sự suy giảm tính bền vững ờ pH sẽ mất đi khi gia tăng nồng độ cystein từ 0,01-0,25M. Ficin có độ bền vững cực đại ở pH 7.5 và pHopt trung bình ở khoảng 6-7.5 Khi hòa tan các kết tủa enzymvào trong nước hay trong các dung dịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự bất hoạt enzym. Do đó, để tránh hiện tượng này người ta thường hòa tan kết tủa enzym vào trong dung dịch đêm phosphate 0.01M, pH7 có NaCl 0.1M và việc gắn enzym lên các nhân tố mang như blue acid 83, redacid 17, …để làm tăng tính bền vững của enzym. Cơ chế xúc tác của enzyme: các loại enzyme protease thu dược từ đu đủ, sung, vải, dứa có tên gọi là thiol-proteae, cystein-protease hay sulfhydryl-protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 600 - 800C ở pH tự nhiên. Tâm hoạt động của các enzyme này gồm có 2 amino acid là cystein và histidine Cơ chế thuỷ giải protein xảy ra qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: giai đoạn “acyl hoá” Giai đoạn 2: giai đoạn “deacyl hoá “có sự tham gia của phân tử nước d. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein của ficin - Nhiệt độ: hoạt động thủy phân protein của enzym ficin chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ. Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzym, tốc độ phản ứng của enzym tỉ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ và nhiệt độ. Mỗi enzym có một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác của nó, tại đó tốc độ phản ứng của enzym đạt đến tối đa. Điểm nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme. - Độ pH: pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng của enzym. Mỗi enzym có một trị số pH thích hợp cho hoạt động của enzym gọi là pH tối thích, tại đó tốc độ phản ứng của enzym đạt đến mức cực đại Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym do: Tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzym Tác động vào trạng thái ion hóa của cơ chất Tác dụng vào độ bền của phân tử enzym Tác dụng vào sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của phân tử enzym. PHẦN 2: NHỮNG ENZYM ỨNG DỤNG VÀO THỰC PHẨM 2.1. Enzym pectinase[2]: Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả 2.1.1.Phân loại : Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng. Bảng 2.1: Phân loại enzym pectinase Stt Enzym (tên gọi theo hệ thống) Enzym (tên thường gọi) Phản ứng xúc tác 1 Pectin-pectinhydrolase pectinesterase Pectin + H2O = n metanol + pectic acid 2 Poly-a-1,4 galacturonid-glycano hydrolase-PG Endopoly galacturonase (endo-PG) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong galacturonid không theo một trật tự nào 3 Poly-a-1,4-D-galacturonidgalacturon-hydrolase Exopoly galacturonase (exo-PG) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự đứt mạch của acid galacturonic 4 Poly-a-1,4-D-galacturonidmetilester-glycanohydrolase Endopolymetil-galacturonase (Endo-PMG) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectin không theo một trật tự nhất định. 5 Poly-a-1,4-D-galacturonid digalacturonoliase Exo-pectatliase (exo-PKTE) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectat với sự tạo thành D-4,5 aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định. 6 Poly-a-1,4-D-galacturonid glicanoliase Endopectatliase (PETE) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định 7 Poly-a-1,4-D-galacturonid metylester glicanoliase Endopectinliase (Endo-PTE) Thủy phân liên kết a-1,4-D-galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+. Polygalacturonase còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết –1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4--D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4--D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại: * Polymethylgalacturonase hay còn gọi là -1,4-galacturonite-methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu II. * Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả. Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A, awamori. Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4--D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4--D-galacturonic lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. Ngoài ra còn có: Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly –1,4-galaturonite –methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid. Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly -1,4D-galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme Đặc điểm của Enzyme pectinase: 2.1.2.1 . Enzym pectinase từ nguồn thực vật: Pectinesterase: Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme. Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự. PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quá trình để methyl hoá các phân tử galacturonic acid. Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại Polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose. PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0. Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyem, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự. Hình 2.1: Cấu trúc của pectinesterase từ carrot Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt. Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín. - Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme. PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC. PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57oC. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6. - Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế. Sự thủy phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan. 2.1.2.2 . Enzym pectinase từ vi sinh vật Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Nấm mốc: penicillium glaucum, p.ehrlichii, p.chrysogenum, p.expanam, p.cilrimim, aspergillus awamori, a.foetidus, a.niger, a.terrus, a.saitoi, a.aureus, a.oryzae, a.wentii, fusarium moniliforme,… Nấm men: saccharomyces fragilis Vi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella aerogenes… các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật. người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc. các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này a.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase. con.diplodiella, pen.citrimin tạo ra chủ yếu là polygalacturonase. nấm men sacch.fragilis dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase. vi khuẩn bac.polymyxa, bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase. Pectinesterase: Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị ph tối ưu khác nhau: ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có ph tối ưu từ 2,0 đến 6,5. trái lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6 đến 7,5 – 8. Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C. từ 55 đến 620c thì enzime bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600c Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oc, phopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oc và từ thực vật (phopt=7,5-8, toopt= 55-60oc). khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của na, k và ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc conithyrium diplodiella và từ a.niger. trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đông thể. và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân tử enzime là phenylalanin Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. và enzime sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin. hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa. chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc a.niger, cần thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%. Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về pg đều trên cơ sở các nguồn vi sinh vật. pg thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: saccharomyces fragilis, asperigillus niger, lactobacillus plantarum, cochlibolus carbonum, neurosrora crassa, các loài ascomycete, rhizopus arrchizus và fusarium oxysrorum. pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất. chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5. cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có ph tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì ph tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6 Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6 Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5 Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -450c. trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650c Các polygalacturonase cũng như pectinesterase đều được hoạt hóa bởi các caiton của kim loại kiềm cũng như cation amon Hình 2.2: polygalacturonase từ erwinia carotovora ssp. carotovora 2.1.3 Những ảnh hưởng và ứng dụng enzym pectinase trong công nghệ Thực phẩm: Những ảnh hưởng có lợi khi sử dụng enzyme pectinase: Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp. Số lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%. Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm sau: sản xuất rượu vang; sản xuất nước quả và nước uống không có cồn; sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, … ; sản xuất nước giải khát. sản xuất cà phê và cà phê hòa tan. Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được. Nhờ pectinase phân giải các cơ chất pectin, làm các chất chiết trong dịch bào dễ thoát ra ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơn nữa dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzym pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm. Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu sau: - Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm; nghĩa là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang. - Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suất chung và đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao. Để tăng nhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzym chính như endo – PMG là 55,0.102 đơn vị/mg protein chứa trong chế phẩm, còn enzym Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch. Trong trường hợp này không cần có mặt PE. Nhưng nếu hoạt độ của endo – PMG ở trong chế phẩm là 31,0.102 đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein. Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng enzym endo – PMG va Cx phải có sự tương quan nhất định. Khi chế phẩm có hoạt độ endo – PMG là 28,2.102 đơn vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo – PMG là 25,4.102 đơn vi/mg P và Cx là 55,0 đơn vị/mgP. - Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa enzym proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin. - Để tránh gây tổn thất các chất màu cùa vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzym oxy hoá trong chế phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế phẩm. - Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn được hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện có độ pH nhất định. - Để xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế phẩm pectinase có hoạt độ cao (12000đv/g) hoặc dùng chế phẩm pectinase không tan. Chẳng hạn trong sản xuất vang nho, khi sử dụng chế phẩm pectawamorin PM10x, người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%. Trung bình thể tích của phần dịch tự chảy có thể tăng được 10%, còn hiệu suất chung của dịch tăng lên 1 – 2%. Hoặc khi ép bã nghiền nho trắng đã được xử lý bằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh hơn. Hiệu suất dịch khi đó tăng lên 9,6%. Vậy dùng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng tốc độ làm trong và tốc độ lọc của dịch. Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch như protein, pectin … sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc. Trong 1 giờ dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý. A.A.Martakov đã chứng tỏ rằng khi xử lý bã nghiền bằng enzym thì độ nhớt của dịch bị giảm đi ít hơn là khi xử lý dịch, vì lẽ khi đó protopectin của thành tế bào cũng bị phân giải. Khi dịch không được xử lý bằng enzym thì trong quá trình lắng, các hạt vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzym thì các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng. Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của vang. Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần hóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol. Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quá trình oxy hoá catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng. Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường có họat tính của vitamin P. Như vậy xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang. Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn. Người ta cho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc, Botrylis cinerea gây ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương thơm mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao. Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase. Trong đó, enzym pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất. Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặc biệt không được chứa enzym endopolygalacturonase. Những enzym này thường làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả. Việc ứng dụng enzymvào chế biến nước quả và trong sản xuất rượu vang bắt đầu từ năm 1930. Khi đó, Z,J.Kertesz và A.Meilliz được xem như những người đầu tiên đưa ra ý tưởng sử dụng enzym trong chế biến rau quả. Từ đó đến nay, trên thế giới có rất nhiều loại chế phẩm thương mại được sản xuất và ứng dụng trong chế phẩm rau quả. Cơ chế tác động của enzym pectinase: Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục đích cơ bản. - Phá vỡ thành tế bào thức vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả. - Làm trong và ổn định chất lượng nước. Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế bào). Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào. Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong nhóm cellulase. Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu nhận dịch tế bào tốt hơn. Làm trong nước quả. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứa nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả. Hàm lượng pectin ở một số loại quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 2.2:Hàm lượng pectin của một số loại quả và dịch quả Stt Nguồn pectin Pectin (%) Chất ester hóa (%) Stt Nguồn pectin Pectin (%) Chất ester hóa (%) 1 Nho 0,2 -1,0 10 -