Đề tài Điều tra và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống hoa cúc và hoa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt -----------o0o------------ ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM MÃ SỐ: B2005-29-41-TĐ Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt -----------o0o------------ ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM MÃ SỐ: B2005-29-41-TD Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết NHĨM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Cán bộ tham gia thực hiện đề tài: 1. TS. Nguyễn Văn Kết 2. Th.S. Cao Thị Làn 3. Th.S. Nguyễn Thành Sum 4. NCV. Đỗ Phương Mai 5. NCV. Trương Thị Lan Anh Các đề tài sinh viên đã báo cáo 1. Khảo sát hiệu quả ức chế virus của ribazole trên năm giống cúc nuơi cấy in vitro. Đinh Thị Hạnh. Sinh viên Nơng học khĩa 27 2. Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Farm trắng, Farm tím, Nữ hoàng tím, Thọ đỏ, Thọ vàng chanh) in vitro. Nguyễn Thị Thắm. Sinh viên Tại chức Sinh học khĩa 13 3. Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Chrysanthemum sp.) in vitro. Phạm Thị Hằng Hương. Sinh viên Sinh học khĩa 27 4. Phục tráng giống hoa cúc (Farm hồng, Pingpong vàng, Nút vàng, Nút tìm, Tia muỗng vàng) bằng ribazole. Cao Viết Tuấn. Sinh viên Nơng Học Khĩa 27 5. Khảo sát ảnh hưởng của biện pháp bổ trợ ribazole trong việc làm sạch virus lên sự sinh trưởng và phát triển của ba giống địa lan (Đỏ Bà Mai, Tím hột, Vàng Ba Râu) tại Đà Lạt. Vũ Thị Phương Thanh. Sinh viên Nơng học khĩa 27 6. Khảo sát về tình hình sản xuất các giống cúc tại Đà Lạt hiện nay. Nguyễn Thị Như Quỳnh. Sinh viên Nơng học khĩa 28. 1 TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tĩm tắt Qua điều tra thực tế các loại cúc và lan cắt cành tại Thành phố Đà Lạt cho thấy hiện nay cĩ khoảng 38 giống lan đang trồng với mục đích cắt cành, trong đĩ cĩ khoảng 14 giống cĩ giá trị và được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Các giống cúc cắt cành nhập vào Đà Lạt cĩ trên 72 giống, tuy nhiên nhiều giống đã bị lãng quên, chỉ cịn lại khoảng 54 giống cịn cĩ thể phục hồi. Nhằm bảo tồn các giống hoa này, chúng tơi đã tiến hành các biện pháp kiểm tra hiện trạng lây nhiễm các loại virus, và đã phục tráng thành cơng 14 giống địa lan, 54 giống cúc in vitro. Abstrast Lam Dong Province of Vietnam has an exceptional diversity of cutting flower of Cymbidium and Chrysanthemum with approximately 38 and 72 varieties respectively. Plant tissue culture and micropropagation techniques play an important role in conservation programme and management of botanical collection. Chrysanthemum and Cymbidium plants collected from farmers were identified the highest virus infection rate among of these species. The results obtained by observation samples of 54 varieties Chrysanthemum and 14 varieties Cymbidium. Using meristem culture and treated with Virazol in vitro suggest that the possibility could be obtained virus free plants through cultures. 2 Mở đầu 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc du nhập ngày càng nhiều các giống hoa cắt cành là một xu hương cần thiết đề đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa của người dân cũng như để xuất khNu. Tuy nhiên song song với việc chạy đua thay đổi về giống trên thị trường sản xuất hiện nay thì đồng thời cũng cĩ rất nhiều giống dần dần bị lãng quên, khơng phải vì các giống hoa này khơng đảm bảo chất lượng mà là do thị hiếu của người tiêu dùng. Việc nghiên cứu các biện pháp cơng nghệ trong lĩnh vực nhân giống các lồi hoa cắt cành cĩ giá trị kinh tế của địa phương nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen trong tập đồn hoa cắt cành là một biện pháp cần thiết cho xu hướng phát triển đa dạng về hoa cắt cành trong tương lai và tránh lãng phí một số lớn các giống hoa mà bản thân đất nước chúng ta hiện nay chưa thể lai tạo được. 2. Mục tiêu đề tài Đề tài thực hiện nhằm những mục đích sau: - Điều tra tình hình sản xuất hoa cắt cành hiện cĩ tại Đà lạt. - Sưu tập và bảo tồn các nguồn gen quí về hoa cúc, hoa lan cắt cành, v.v...cĩ giá trị tại tình Lâm Đồng bằng kỹ thuật nuơi cấy in vitro. - Nghiên cứu các điều kiện mơi trường sinh trưởng thích hợp của các giống cây con bảo tồn trong điều kiện in vitro. - Nghiên cứu các điều kiện mơi trường giá thể sinh trưởng thích hợp của các giống cây con vườn ươm. - Tạo mơi trường thực tập và nghiên cứu cho giáo viên và sinh viên. 3. Phạm vi và giới hạn của đề tài Đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu bảo tồn các giống cúc và các giống hoa lan cắt cành hiện cịn tồn tại và đang sản xuất tại Thành phố Đà Lạt. 3 CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP 6-benzyl-aminopurine dSm-1 deciSiemen per meter – Đơn vị biểu thị độ dẫn điện của dung dịch EC Độ dẫn điện (Electrical conductivity) IAA Indol-3-acetic acid IBA Indolbutyride acid KC Knudson (1946) Kin Kinetin (6-furfuryl-aminopurine) LM Lindemann(1970) MS Murashige and Skoog (1962) NAA
-naphthalene acetic acid NCV Nghiên cứu viên PLB Protocorm like body TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW Vacin and Went (1949) 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. LSD 0.5: Sai khác tối thiểu cĩ ý nghĩa ở P = 0.5 CV% Hệ số sai dị FrW: Trọng lượng tươi NTL: Đường Nguyên Tử Lực – Đà Lạt 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về cấy mơ trong cơng tác nhân giống cây trồng 1.1 Tính tồn năng của tế bào thực vật trong nuơi cấy mơ Nuơi cấy mơ thực vật (hay cịn gọi là nuơi cấy thực vật in vitro) là quá trình nhân giống vơ tính thực vật trong ống nghiệm. Nuơi cấy mơ thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuơi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mơ, cơ quan) thực vật trong mơi trường nhân tạo dưới điều kiện vơ trùng (15, 22, 29).. Kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính tồn năng và khả năng phân hĩa, phản phân hĩa của tế bào thực vật. Cuối thế kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuơi cấy mơ tế bào thực vật để chứng minh tính tồn năng của tế bào. Theo ơng, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền của cả sinh vật đĩ, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều cĩ thể phát triển thành cơ thể hồn chỉnh (15, 22). Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuơi cấy mơ thực vật, khi White, người Mỹ, nuơi cấy thành cơng đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với một mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose và nước chiết nấm men. Sau đĩ White chứng minh rằng cĩ thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhĩm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit. Từ đĩ việc nuơi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau. Năm 1958, tính tồn năng của tế bào đã được khẳng định bằng cơng trình nghiên cứu của Stewart và cs. (1958) trên mơ rễ cây cà rốt. Các tác giả này đã nuơi cấy mơ rễ cà rốt trên mơi trường đặc cĩ nước dừa và đã thu nhận được khối mơ sẹo gồm các tế bào nhu mơ. Khi chuyển mơ sẹo này sang mơi trường lỏng cĩ cùng thành phần và nuơi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhĩm tế bào. Tiếp tục nuơi cấy trên mơi trường lỏng, khơng cấy chuyển thì thấy hình thành rễ. Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thơng báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuơi cấy trên mơi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phơi, các phơi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phơi bình thường ở cà rốt, lúc này tính tồn năng của tế bào càng được khẳng định. Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính tồn năng của tế bào đã được thơng báo, hầu như tất cả các cơ quan đều cĩ thể phát triển phơi. Phơi soma đã được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza... Ngày nay bằng kỹ thuật nuơi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng cĩ giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả.... Việc nhân giống này đã trở thành cơng nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới (10, 11, 15. 22, 30). 5 1.2 Cơng nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng Cơng nghệ sinh học thực vật hình thành do áp lực tự nhiên của xã hội theo hai khuynh hướng: áp lực gia tăng năng suất và áp lực giảm năng suất mùa màng. Trước những xu hướng đĩ, địi hỏi ngày càng phải đưa nhanh kỹ thuật mới vào cơng tác lựa chọn, nhân giống cây trồng. Sự phát triển của cơng nghệ sinh học thực vật theo thời gian cĩ thể được tĩm tắt như sau: từ những năm 1920 bắt đầu là lai chéo, năm 1960 là kỹ thuật gây đột biến, năm 1970 là sự phát triển kỹ thuật cấy mơ, đến năm 1980 là kỹ thuật dung hợp tế bào trần và từ những năm 1990 đến nay là sự phát triển của kỹ thuật gen (10, 12, 15. 22, 30). Nhờ sự kết hợp giữa nuơi cấy mơ thực vật và cơng nghệ gen, người ta đã tạo ra được những thuộc tính mới cho cây trồng một cách cĩ định hướng và hiệu quả. Nhờ thuộc tính totipotent của thực vật, người ta cĩ thể hồn tồn tái tạo nên một loạt các cây mới hồn chỉnh từ một tế bào mang đặc tính mới chỉ trong một thời gian ngắn. Nhờ sự kết hợp này đã giúp cho cơng nghệ sinh học thực vật nĩi chung và nuơi cấy mơ nĩi riêng cĩ những bước tiến mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn. Cĩ thể nĩi một cách khái quát những ưu điểm của cơng nghệ này là: - Chọn lọc nhanh những tính trạng mong muốn, nuơi cấy mơ là con đường nhanh nhất giúp chọn lọc và biểu hiện tính trạng. - Nuơi cấy mơ tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho quá trình chuyển gen ở thực vật. - Nuơi cấy mơ kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần và đột biến cĩ thể tạo ra các dịng lai khác lồi. - Giúp nhân giống vơ tính với tốc độ và số lượng lớn. - Giúp tạo được cây sạch bệnh. - Thực vật nuơi cấy mơ là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất các chất quý hiếm, đặc biệt là các dược chất. - Các cây mơ là đối tượng tốt và hiệu quả của những nghiên cứu về sinh lý, sinh hĩa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử. - Các cây mơ giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật rất dễ dàng. - Các cây mơ cĩ thể cung cấp quanh năm. 1.3 Vai trị của chất điều tiết sinh trưởng trong nuơi cấy mơ Chất điều tiết sinh trưởng hay cịn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hĩa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chất điều tiết sinh trưởng thực vật cĩ thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đĩ của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo. Những chất điều tiết sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ phận khác của cơ thể gây nên những tác động điều tiết của cây. 6 Vai trị điều hịa của chất điều tiết sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hỗn quá trình đĩ. Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhĩm chính là auxin và cytokinin, ngồi ra gibberelin và ethylen cũng cĩ vai trị quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật. 1.3.1 Các auxin Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA). IAA cĩ tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ. Ngồi IAA, cịn cĩ những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 – diclophenoxyl axetic axit (2,4-D). Các chất này cũng đĩng vai trị quan trọng trong sự phân chia mơ và trong quá trình tạo rễ (10, 12, 40, 41). NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, cĩ hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Chúng cĩ vai trị quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Đối với rễ, về cơ bản auxin ức chế sự phát triển của rễ, chỉ ở nồng độ cực thấp (10-9 -10-12g/ml) thì mới cĩ tác dụng kích thích sinh trưởng của rễ, vượt qua ngưỡng này (10-8mg/l) thì lại thể hiện tác dụng ức chế. IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus. Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong mơi trường nuơi cấy. Mặc dù cùng nhĩm chất auxin nhưng hai chất này lại cĩ tính chất đối kháng.. NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra. Chất này cĩ tác dụng làm tăng hơ hấp của tế bào và mơ nuơi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong mơi trường nuơi cấy (10, 12, 40, 41). 1.3.2 Cytokinin Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng cĩ tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là 6-benzyl aminopurin (BAP), Kinetin. Kinetin được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. Kinetin là dẫn xuất của base nitơ adenin. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng cĩ hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và BAP cùng cĩ tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hĩa già của tế bào. Ngồi ra các chất này cĩ tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzim (10, 40, 41). Benjamin và cs. (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona. Lat và cs. (1988) cho rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1- 5mg/l. Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy khơng phải các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh 7 trưởng nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin cĩ tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mơ. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mơ sẹo. Barna và Wakhlu (1998) chỉ ra rằng tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago ovata tăng cao khi trên mơi trường sử dụng KIN 4-6 µM phối hợp với NAA 0,05µM. Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào. Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trị của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường (10, 12, 40, 41). 1.3.3 Các nhĩm chất khác Ngồi những nhĩm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuơi cấy in vitro cịn sử dụng một số nhĩm chất khác như Abscicis acid, ethylen, các amino acid... Abscisis acid sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái nghỉ bắt buộc. Ethylen được sinh ra trong quá trình nuơi cấy thực vật. Ethylen cĩ thể kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đNy nhanh sự lão hĩa trong quá trình nuơi cấy mơ. Silver nitrat cĩ thể được sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành trong quá trình nuơi cấy mơ (40, 41). Amino acid cĩ thể nâng cao sự tăng trưởng của tế bào và sự tái sinh cây. L. Glutamine cĩ thể được xem như là nguồn nitơ. Enzim hydrolyzed protein N-Z amin Type A như casein hydrolyzate cĩ thể được sử dụng hiệu quả đến 2g/l. Thêm vào đĩ malate, citrate, pyruvate và acid vơ cơ tương tự cĩ thể cĩ hiệu quả trong mơi trường nuơi cấy protoplast và cĩ thể làm giảm bớt độc hại của muối amonium (Gamborg & Shyluk, 1970; Gamborg, 1986). Ngồi ra, các chất chiết của cây như coconut milk của cây quả hạch xanh cĩ thể rất hiệu quả trong việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vơ cơ khơng xác định và các nhân tố sinh trưởng. 1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) Trong 5 thập kỷ qua đã cĩ nhiều báo cáo về kỹ thuật vi nhân giống (Arditi và Krikorian, 1996; Chakrabarty và cs., 2001; Rasai và cs., 1995; Rout và cs., 2000). Vi nhân giống là sự nhân giống vơ tính với số lượng của cây trồng thơng qua nuơi cấy mơ in vitro. Kỹ thuật nuơi cấy này đã được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân giống các lồi cây cảnh và những lồi khác trên tồn thế giới (Chu 1992; Huetteman và Preece 1993; Mantell và cs., 1985; Prerik, 1987). Một trong những dạng thú vị và quan trọng của kỹ thuật nuơi cấy mơ in vitro là khả năng tái sinh và sinh sản của cây từ nuơi cấy tế bào và mơ. Dạng đơn giản nhất của tái sinh cây in vitro là kích thích sự phát triển của chồi. Kỹ thuật này tận dụng sự phát triển cá thể cho sự phát triển chồi bằng đỉnh sinh trưởng hoặc chồi bên. Trạng thái ngủ của những chồi này bị phá hũy và sự phát triển của các chồi non được kích 8 thích bằng tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng (thường sử dụng cytokinin) để tái sinh ra chồi con. Các chồi con này sau đĩ được tách ra cho phát triển rễ để tái sinh cây con. Sự tái sinh cây từ nuơi cấy mơ cĩ thể được thực hiện bằng cách nuơi cấy từ đỉnh sinh trưởng, từ callus và từ tế bào, hoặc chồi nách vì chồi nách là tiền thân của đỉnh sinh trưởng. Ngược lại, sự tái sinh bất định diễn ra tại những vị trí khác như là các đốt thân, từ lá mầm, vùng kéo dài ra của rễ. Sự tái sinh chồi bất định thường phụ thuộc vào sự cĩ mặt của gen cấu trúc. Nhưng sự tái sinh cây từ callus và từ tế bào thường khơng cĩ mặt của gen cấu trúc. Sự phát sinh cơ quan là sự hình thành các cơ quan riêng biệt như chồi hoặc rễ. Sự tái sinh phơi soma là sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả chồi và rễ. Hầu hết các cây trồng cĩ thể tái sinh cây theo cách phát sinh cơ quan hoặc phơi soma nhưng rất ít lồi cĩ thể được cả hai cách. Một số lồi cĩ thể tái sinh một cách dễ dàng từ nuơi cấy mơ và tế bào trong khi một số lồi chỉ cĩ thể tái sinh bằng quá trình bất định. Sự tái sinh cây từ chồi nách hoặc chồi đỉnh được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống do cĩ sự biến dị ít nhất. Ngược lại sự phát sinh chồi bất định và sự tái sinh cây từ callus bởi sự phát sinh cơ quan hoặc bởi phơi soma cĩ biến dị cao như tốc độ tái sinh của nĩ. 1.4.1 Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống Trong kỹ thuật vi nhân giống cĩ 4 giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974, George và cs. 1984). Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy và nuơi cấy khởi đầu. Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi con hoặc chồi mầm từ mẫu ban đầu. Sự tái sinh chồi bất định là kỹ thuật nhân nhanh được sử dụng thường xuyên nhất trong vi nhân giống (Chu 1992). Mơi trường nuơi cấy và điều kiện sinh trưởng trong giai đoạn này được cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa. Giai đoạn 3 : là giai đoạn tái sinh rễ từ chồi con để tái sinh cây con. Giai đoạn này cần mơi trường đặc trưng hoặc khơng, điều này phụ thuộc vào kiểu gen của lồi. Giai đoạn 4: hồn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn hợp đất trong nhà kính để sau đĩ chuyển ra đồng ruộng. 1.4.2 Các nhân tố trong mơi trường nuơi cấy invitro Mức độ thành cơng của bất kỳ một kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào hoặc nuơi cấy cơ quan đều liên quan đến nhiều nhân tố. Nhân tố quan trọng là lựa chọn thành phần dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng. Trong hai đến ba thập kỷ qua đã cĩ nhiều báo cáo về thành phần của các mơi trường cơ bản (Sheet và Shillito, 1997; Perik 1987; Torres, 1989). Mơi trường nuơi cấy Cĩ hơn 50 cơng thức mơi trường khác nhau được sử dụng cho nuơi cấy in vitro nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige, 1977). Trong đĩ mơi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, cĩ cải biên bằng sự thay đổi thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., 1999; Saxena và cs., 1988). 9 Mơi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vơ cơ, nguồn cacbon, vitamin và chất điều tiết sinh trưởng. Một số thành phần khác cĩ thể được bổ sung thêm như nitơ vơ cơ, acid vơ cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986). Các muối khống được sử dụng như là thành phần của mơi trường nuơi cấy mơ tế bào. Hầu hết các mơi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vơ cơ và kali vơ cơ. Muối amonium cĩ thể được sử sụng từ 2-20mM. Ảnh hưởng của muối amonium cĩ thể thay đổi từ ức chế đến hiệu quả. Nồng độ Ca, SO4, photphat và muối Mg từ 1-3 mM là thích hợp. Ngồi ra trong mơi trường cũng cần bổ sung thêm một số khống vi lượng. Mơi trường MS (1962) hoặc Linsmainer và Skoog (1965) (LS) được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là trong quá trình tái sinh cây. Mơi trường B5 (Gamborg và cs., 1968), N6 (Chu, 1978), Nisch và Nitsch (1969) (NN) và các dẫn xuất từ các mơi trường này cĩ thể được sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây. Theo Huang và cs., Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar (2000), cây dâu tây phát triển thích hợp trên mơi trường MS. 1.4.2.2 Các chất điều tiết sinh trưởng. Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên mơi trường nuơi cấy quyết định rất lớn đến sự thành cơng của nuơi cấy mơ thực vật. Mor và Zieslin (1987), Rout và cs. (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và mối tương tác giữa chúng lên vi nhân giống của nhiều loại cây khác nhau, trong đĩ đã cĩ báo cáo rất rõõ về ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của nhiều loại cây khác nhau. Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi. Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi sử dụng BA, Kinetin, 2-ip trên mơi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA. Theo kết quả nghiên cứu của Kang và cs. (1994), BA là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân nhanh chồi từ mẫu lá của cây dâu Fragaria x ananassa. Loại dâu này sẽ cho số lượng chồi cao, hiệu quả nhất trên mơi trường MS cĩ bổ sung 4,0 µM BA kết hợp với 0,1 µM NAA. Tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi (Uppadhaya và Chandra, 1983). Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, nhưng khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi khơng tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc. Trong nuơi cấy rễ in vitro, sự cĩ mặt của cytokinin trên mơi trường thường hạn chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành rễ trong mơi trường cĩ bổ sung auxin hoặc khơng cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Rout và cs., 2000). 1.4.2.3 Nguồn cacbon và những cơ chất khác Nguồn cacbon được sử dụng trong mơi trường thường từ 2-3 % đường saccaro hoặc glucose (nhưng rất ít). Những nguồn cacbon khác cĩ thể là lactose, maltose, galactose nhưng rất ít sử dụng. Nguồn cacbon này đĩng vai trị trong sự phát triển tế bào. Hầu hết các cây trồng cĩ thể tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển nhưng với những vitamin đặc trưng như vitamin B1), vitamin B3, vitamin B6 và myo- inositol cần được bổ sung vào mơi trường trong nuơi cấy in vitro để nâng cao sự sinh trưởng và sự phân hĩa (Gamborg và cs., 1968). 10 Agar được sử dụng rộng rãi trên các mơi trường đặc và bán đặc, nhưng một vài egllin agent khác cĩ thể sử dụng như gelatin, agrose, aglinate và gebrite. Than hoạt tính được bổ sung vào mơi trường ở các giai đoạn khác nhau của quá trình nuơi cấy in vitro. Than hoạt tính khơng phải là chất điều tiết sinh trưởng, nĩ đĩng vai trị như là chất hút Nm của mơi trường. Than hoạt tính cĩ khả năng hấp thụ một số chất khơng cĩ lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra trong quá trình khử trùng mơi trường nuơi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra. Đơi lúc than hoạt tính cũng đĩng vai trị như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs., 1993; Eymar và cs., 2000; George và Sherrington, 1984). Bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường cĩ thể cĩ lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính cĩ tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính cĩ khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ cĩ trong mơi trường nuơi cấy. (Dumas và cs.,1995; George và Sherrington, 1984). 1.4.2.4 Nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành cơng trong nuơi cấy in vitro. Cĩ 3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống : thơng qua callus, sự hình thành chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996). Trong trường thơng qua nuơi cấy chối nách, tốc độ nhân nhanh phụ thuộc vào nồng độ cytokinin thích hợp trên mơi trường và sự cấy chuyển trong quá trình tái sinh cây. Trên cây dâu tây Fragaria x ananasa, tốc độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi bổ sung vào mơi trường MS các chất điều tiết sinh trưởng BA (4,0 µM) và NAA (0,1 µM) sau 60 ngày nuơi cấy. Nhưng khi bổ sung vào mơi trường nồng độ BA cao hơn 4,0 µM cùng với 0,1 µM NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng khơng tốt và chất lượng chồi xấu, do đĩ tốc độ nhân nhanh cũng giảm. 1.4.2.5 Sự hình thành rễ Sự hình thành rễ của nhiều lồi cây cĩ thể khơng cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998). Rễ của nhiều lồi cây cĩ thể được hình thành dễ dàng khi nồng độ các muối khống giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0.5%. (Webb và Street, 1977). Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình thành rễ của lồi Fragaria x ananasa, cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA với liều lượng thấp (0.1mg/l). Rễ của một số lồi cây cĩ thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường, đơi khi cĩ bổ sung thêm auxin. Than hoạt tính làm nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs., 1999). Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong mơi trường cĩ chất hút các chất ức chế ra rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và cs., 1993; George và Sherrington, 1984). Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuơi cấy in vitro là điều kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng. 11 2. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu họ lan (Orchidaceae) và chi địa lan (Cymbidium sw.) 2.1 Khái quát chung Lan được biết đến đầu tiên ở phương Đơng vào 551-479 trước cơng nguyên bởi Khổng Tử. Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung Quốc là Kiến Lan (tìm ra ở Phúc kiến) là Cymbidium enrifolium. Theo Phrastus được xem là ơng tổ của thực vật học và cũng cĩ thể nĩi là cha đẻ của ngành học về lan. Orchis được ơng dùng để chỉ những cây lan tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải. Thế kỷ thứ nhất sau cơng nguyên, Dioscorides dùng Orchis để mơ tả 2 lồi địa lan trong quyển sách về dược liệu của ơng và được Linnaeus ghi lại trong sách “Các Lồi Cây Cỏ” (Species Plantarum) vào 1753, rồi John Lindley sử dụng đầu tiên để đặt tên cho họ lan là Orchidaceae từ năm 1836 và tồn tại cho đến nay. Ở Việt Nam sự nghiên cứu về lan chưa rõ rệt lắm nhưng cĩ lẽ người đầu tiên tìm hiểu và nuơi trồng lan là vua Trần Anh Tơng, kế đến là Joanis Loureiro, là nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha (1789) trong cuốn “ Thực Vật Chứng Nam Bộ ” (Flora Cochinchinesis) các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần Việt Nam và đã được Bentham và Hoocker ghi lại trong “ Các Giống Cây Cỏ” (Genera Plantarum)(1862 – 1883). F. Gagnepain và A. Guillaumin mơ tả 101 giống gồm 636 lồi lan cho cả 3 nước Đơng Dương trong bộ “ Thực Vật Chí Đơng Dương ” do Hlecomte chủ biên. Đáng kể nhất là quyển II bộ sách “ Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” của giáo sư Phạm Hồng Hộ với 289 lồi lan được mơ tả và vẻ hình. Mới dây giáo sư đã bổ sung thêm 364 lồi lan trong quyển III tập 2 của bộ sách “Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” xuất bản 1993. Trong đĩ chi Cymbidium.sw cĩ 15 lồi: C.aloifolium (Lindl.).sw, C.atropurpureum (Lindl.) Rolfe., C.banaense Gagn, C. bicolor lindl, C.dayanum Reich.b.f, C.devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw, C.erythrostylum Rolfe, C.filay sonianum Lindl., C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum Hookf, C.lowianum Reich.b.f, C.schroederi Rolfe., C.sinense (Jacks)Willd., C.macroshizon Lindl.. Theo Trần Hợp trong cuốn “Phong Lan Việt Nam” tập 1 và 2 xuất bản 1988- 1990 thì họ lan Việt Nam cĩ khoảng 368 lồi, trong đĩ chi Cymbidium cĩ khoảng 10 lồi sau: C.aloifolium (Lindl.).sw, C.dayanum Hookf, C. devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw, C.evrardii Guillaum, C.grandiflorum Griff, C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum Hookf, C.parishii Reich.b., C.poilanei Gagnep. Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến trong cuốn “Phân Loại Học Thực Vật – Thực Vật Bậc Cao” xuất bản 1978 thì họ lan ở Việt Nam cĩ 91 chi 463 lồi, trong đĩ chi Cymbidium cĩ khoảng 12 lồi sau: 12 C.aloifolium Swartz., C.cyperifolium Wallex Lindl, C.dayanum Reich.b.f, C. devonianum Paxt., C.ebarneum Reich.b.f, C.enrifolium Swartz., C.erythrostylum Lindl., C.giganteum Wall., C.inringne Reich.b.f., C.lancifolinum Hookf, C.polanei Gagn., C.munronianum kinget plant. 2.2 Một vài nét về địa lan Đà Lạt. Hiện nay, nhu cầu hoa tươi nĩi chung và hoa lan nĩi riêng trên thế giới và trong nước đang ngày càng tăng. Trong năm 2000 kim ngạch xuất khNu hoa lan cắt cành và giống cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đĩ chỉ riêng hoa lan cắt cành đã chiếm 128 triệu USD. Do đĩ việc trồng lan đã trở thành một hướng phát triển kinh tế của nhiều nước trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở khu vực Đơng Nam Á. Thái Lan trở thành một nước xuất khNu hoa cắt cành và cây giống lan nhiều nhất trên thế giới. từ 1990 đến 1995 số lượng lan cắt cành xuất khNu ở Thái Lan tăng 1.7 lần, từ 15.6 triệu cành lên 26.5 triệu cành. Chính phủ Malaysia đã thấy hiệu quả kinh tế lớn của việc trồng lan nên đã giao 300 ha đất cho hiệp hội hoa lan Malaysia, với mục đích quy hoạch vùng này thành trung tâm sản xuất hoa xuất khNu. Trong những năm gần đây Nhà nước ta cũng định hướng phát triển việc trồng lan khơng chỉ phụ vụ cho xuất khNu mà cịn phục vụ cho ngành du lịch. Các cấp lãnh đạo nhà nước từ Trung ương đến địa phương đã bắt đầu thấy được tầm quan trọng của ngành xuất khNu hoa lan nên đã cĩ những chủ trương khuyến khích phát triển. Năm 1978, ngành xuất khNu thành phố Đà Lạt đã xuất khNu lơ đầu tiên sang các nước Châu âu với 3000 cành lan., cho đến nay thì số lượng này đã tăng lên đáng kể. Hiện nay việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nĩ lại chẳng yêu cầu phải cĩ vốn đầu tư quá cao. Điều kiện tự nhiên của Đà Lạt phù hợp với việc trồng nhiều lồi hoa, đặc bệt là hoa lan. Trong đĩ địa lan Đà lạt vốn nổi tiếng từ lâu về sự phong phú và vẻ đẹp độc đáo mà chỉ cĩ địa lan ở Đà Lạt mới cĩ được. Những năm gần đây, ngành trồng lan Đà Lạt đã cĩ những biến chuyển đáng kể. Diện tích trồng hoa thay thế cho trồng rau ngày càng tăng. Hiện nay Đà Lạt cĩ 400 ha trồng hoa với 300 triệu cành hoa xuất khNu hàng năm. Hướng phát triển đến năm 2010 tăng diện tích trồng lên 450 – 500 ha trong đĩ ưu tiên phát triển trồng lan. Thêm vào đĩ, với sự trợ giúp của cơng nghệ nuơi cấy mơ, việc nhân giống và tạo ra những giống mới do lai tạo cũng dễ dàng hơn, từ đĩ mà thời gian trồng lan được rút ngắn lại. Hiện nay sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là địa lan vẫn chưa đủ cung cấp cho nhu cầu rộng lớn của thị trường. Trong khi đĩ dịch bệnh thối giả hành, và một số bệnh do virus hồnh hành đã làm giảm một lượng lớn số chậu địa lan cĩ ở Đà Lạt. Do vậy ngành trồng lan trong đĩ Cymbidium là chủ đạo sẽ cịn tiếp tục phát triển. Từ một vài dẫn liệu nêu trên, ta cĩ thể mạnh dạn kết luận việc nuơi trồng Cymbidium ở Đà Lạt cĩ một ưu thế tuyệt vời. Và đây là một tiềm năng to lớn mà nếu chúng ra biết cách tác động sẽ đem lại lợi nhuận cao. Họ lan là họ cĩ số lượng lồi lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 lồi. Trong đĩ Cymbidium được mệnh danh là nữ hồng của các lồi hoa, Cymbidium cĩ những 13 đặc điểm nổi bật cả về giá trị thNm mĩ lẫn giá trị khoa học. Vẻ tao nhã, hài hịa của chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hĩa của con người Phương Đơng. 2.3 Hình thái bên ngồi của địa lan. Về hình thái bên ngồi địa lan là những cây thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ. Thân ngầm của địa lan (căn hành) thường ngắn nối những củ với nhau, … các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ cĩ thể phát sinh đoạn căn hành mới, từ đĩ mọc lên những cây con, do đĩ người ta xếp Cymbidium vào nhĩm lan đa thân. Củ lan (giả hành) thường cĩ dạng con quay hay dạng hột xồi. Đường kính của giả hành từ 1cm đến 15cm. Giả hành được bao bọc bởi các bẹ lá xếp xít nhau, do đĩ giả hành của địa lan khơng rõ ràng như một số lồi lan khác như denrobium, catleya. Rễ của một số lồi địa lan bì sinh hay phụ sinh thường mọc bám trên vỏ cây, mặt đất. Một số lồi khác cĩ rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh). Những rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, cịn cây mẹ ít khi hình thành rễ mới mà chỉ thấy những rễ phụ phân nhánh từ rễ củ. Lá địa lan thường cĩ hai dạng, dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành. Lá ở dạng thực đính trên giả hành thường cĩ cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá cĩ một phần phân cách, khi phiến lá rụng vẫn cịn đoạn bẹ ơm lấy giả hành, một số lồi khơng cĩ cuống lá. Tùy theo từng lồi mà hình dáng của phiến lá, gân lá rất khác nhau, gân dọc nổi rõ hay gân chìm trong thịt lá. Một số lồi ít chịu rợp cĩ phiến lá màu vàng xanh, cịn lại thường là màu xanh đậm. Bản lá và độ dày của lá thay đổi tùy theo từng lồi, các lồi sống ở trảng trống cĩ lá hẹp và dày hơn các lồi ưa bĩng rợp. Lá cĩ dạng dải, dạng mũi mác hay dạng phiến. Đầu lá thường là nhọn, hay chia thành hai thùy. Kích thước của lá biến động từ 0.5 cm – 6cm, chiều dài thay đổi từ 10 cm – 150 cm. Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới của giả hành từ các nách lá, tách các bẹ già đâm ra ngồi. Chồi hoa thường xuất hiện cùng với chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuơi cá, nhưng chồi hoa căng trịn hơn, trong khi đĩ chồi thân thì hơi dẹt. Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuơi cá, cịn các lá bao ở chồi hoa thì luơn ơm chặt quanh phát hoa. Cành hoa khơng phân nhánh, cĩ thể dựng đứng hay buơng thõng. Cành hoa cĩ thể mang từ vài hoa đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo hình xoắn ốc. Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cành hoa, xoay nửa vịng trịn để đưa cánh mơi xuống dưới, sau đĩ búp hoa bắt đầu bung cánh. Hoa Cymbidium thoạt nhìn cĩ 6 cánh với 5 cánh gần giống nhau và 1 cánh mơi. Thực ra 3 cánh bên ngồi chính là 3 lá đài, cĩ màu sắc giống 2 cánh hoa ở trong. Cánh hoa cuối cùng biến đổi thành cánh mơi cĩ màu sắc sặc sỡ hơn. Hoa Cymbidium là hoa lưỡng tính, đặc biệt nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trục hợp nhụy (trụ nhị - nhụy). Trên trục hợp nhụy, thì nhị nằm ở trên cùng mang hai khối phấn màu vàng, cĩ gĩt dính như keo. Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà, nắp này dễ mở rời và cách biệt với nuốm nhụy bởi một các mỏ nổi lên. Do hoa cĩ cấu trúc đặc biệt như vậy nên Cymbidium trong tự nhiên quá 14 trình thụ phấn chỉ xảy ra được nhờ cơn trùng. Tận cùng phía bên trong hoa cĩ dĩa mật và đơi khi cịn cĩ tuyến tiết mùi thơm. Sau khi thụ phấn xong, bầu hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu phình lên và tạo thành quả. Quả của lan thuộc dạng quả nang cĩ ba gĩc, bên trong quả chứa hàng trăm ngàn hạt. Hạt lan cĩ kích thước rất nhỏ trơng như bụi phấn, màu vàng lụa. Khi chín, quả mở theo 3 đường gĩc và phát tán hạt theo giĩ, hạt rơi vào nơi cĩ điều kiện thích hợp như Nm độ, ánh sáng,… thì hạt sẽ nảy mầm thành cây con. Trong tự nhiên tỷ lệ hạt lan nảy mầm là rất thấp, do đĩ khi chưa cĩ cơng nghệ nuơi cấy mơ thì việc trồng và nhân giống lan cần thời gian lâu và gặp nhiều khĩ khăn. 2.4 Phân loại địa lan. Trong hệ thống phân loại họ lan là một họ lớn thứ hai với 20.000- 25.000 lồi chỉ sau họ cúc (A.L. Takhtajan). Lồi địa lan thuộc Ngành: Magnoliophyta- Angiospermae Lớp: Liliopsida- monocotyledemes Bộ: Orchidales Họ: Orchidaceae Chi: Cymbidium. Theo các tác giả Võ Văn Chi và một số tác giả khác thì trong tự nhiên cĩ chi Cymbidium cĩ khoảng hơn 50 lồi, và ở Việt Nam cĩ 15 lồi trong đĩ chỉ riêng Đà Lạt cĩ tới 12 lồi. - Cymbidium aloifolium Swartz (Hay Cymbidium aimulans Rolfe; Cymbidum Pubesecens Lindl). - Cymbidium cyperifolium. - Cymbidium dayanum Reichb.F - Cymbidium devoniaum Paxt - Cymbidium eburneum Reichb - Cymbidium ensifolium Swartz (hay Cymbidium sudaicum Schltr) - Cymbidium erythrostylum Lindl (hay Cymbidium longifolium Don; Cymbidium Limodorum Angustiflorum Ham) - Cymbidium gagiteum Wall (hay Cymbidium gradnifolium Griff; Cymbidium hookerianum. R) - Cymbidum insigne Rolfe - Cymbidium Lancifolium Hook. F (hay Cymbidium gibsonii Paxt; Cymbidium javancum Hook. F.) - Cymbidium polanei Gagn. - Cymbidium munronianum King et Plan. 15 Ở Đà Lạt ngồi 12 lồi trên cịn cĩ nhiều biến chủng khác, nhưng hiện nay vẫn chưa xác định rõ lồi, thứ. Từ lâu đồng bào dân tộc ở Đà Lạt đã dùng từ Tịong Plăng cĩ nghĩa là “lan sả” để gọi những lồi lan này. Nhưng cho tới khi người Pháp và người Kinh đến Đà Lạt thì phong trào trồng lan và phát triển lan ở Đà Lạt mới bắt đầu phổ biến và ngày càng phát triển. Cuối những năm 50 của thế kỷ này, một số giống lan lai đã di nhập vào Đà Lạt để thoả mãn về nhu cầu giống mới và thị hiếu của một số người chơi lan giàu cĩ. Trong quá trình nuơi trồng lan lai, giới chơi lan đã tích luỹ dần những kinh nghiệm trong việc xác định các yếu tố giá thể, giàn che, cách tưới nước bĩn phân,… phù hợp với điều kiện khí hậu ở Đà Lạt. Những cây lai đĩ đã phát triển tốt và cho ra hoa đều đặn hàng năm. Từ đĩ phương pháp trồng “lan ngoại” đã được hình thành và được phổ biến nhưng cũng chỉ dừng lại trong phạm vi hẹp của những người trồng lan tiêu khiển. Trong mấy năm gần nay, phong trào trồng lan của người dân Đà Lạt đang cĩ chiều hướng phát triển mạnh các lồi địa lan, đặc biệt là các lồi lan nhập nội như: Tím Hột, Miretta xanh, Xanh Chiểu, Trắng bệt, Trắng Bệt, Hồng Bệt, Miss Kim, Đỏ Bà Mai, Vàng Ba Râu, Miretta xanh,… … Vì các giống lan này cho hoa rất đẹp, màu sắc sặc sỡ, hương thơm và đặc biệt là lâu tàn nên đã làm thu hút các nhà vườn, các nghệ nhân chơi hoa, họ đã chú ý nuơi trồng và nhân giống ngày càng nhiều. 2.5 Virus hại thực vật Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 cĩ rất nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá dưa chuột, virus thối hĩa khoai tây, virus hại cà chua,…Virus thực vật gây nhiều thiệt hại như làm giảm chất lượng nơng sản, giảm năng suất và cĩ khi là mất 100% năng suất. Trên thế giới hàng năm bệnh virus gây thiệt hại khoảng 70 tỉ USD (Nguyễn Văn Tỵ, 2002). Tại nước ta, nhiều bệnh virus được truyền từ năm này qua năm khác gây thiệt hại một vài phần trăm cho đến 80- 90% năng suất cây trồng, đặc biệt virus gây thối hĩa nghiêm trọng các cây trồng nhân giống vơ tính. Hiện nay, các cây đang trồng cũng như cây mơ ở Đà Lạt đều khơng hồn tồn sạch bệnh, và virus là nguyên nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất cản trở sự phát triển của sản xuất trồng trọt hiện đại. Việc nghiên cứu và phịng bệnh virus giúp giảm thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất cần thiết, đặc biệt là những nước cĩ nền kinh tế dựa vào nơng nghiệp là chính như nước ta. Ivanopski là người đầu tiên khám phá ra thế giới virus khi nghiên cứu bệnh trên cây thuốc lá vào năm 1892. Virus được phát hiện đầu tiên đĩ gây những vết khảm trên lá cây thuốc lá là Tobaco Mosaic Virus và đây cũng chính là lồi virus cĩ phổ cây chủ lớn nhất hiện nay. Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, con người đã phát hiện được trên 4 ngàn loại virus, trong đĩ cĩ hơn 100 loại là virus hại thực vật và cĩ tới hơn 25 lồi virus gây hại trên cây lan. Như vậy, virus thực vật là những vi sinh vật cĩ kích thước vơ cùng nhỏ bé và cĩ những đặc điểm sau đây (PGS.TS Vũ Triệu Mẫn và PGS.TS Lê Lương Tề, 2002). 16 Virus là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đĩ phải quan sát chúng trên kính hiển vi điện tử. Virus cĩ cấu tạo rất đơn giản: cĩ hai phần chính là lõi axit nucleic và vỏ protein. Thơng thường virus thực vật cĩ vật chất di truyền là ARN, một số ít cịn lại cĩ vật chất di truyền là ADN. Virus là vi sinh vật kí sinh ở mức độ tế bào. Virus thực vật cĩ thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều lồi cây, và mỗi loại cây cĩ thể nhiễm một hay nhiều lồi virus. Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế bào để tạo thành vơ số virus con mới. Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần, thối hĩa và suy tàn cĩ khi bị chết. Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm đến khi cây thối hĩa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các lồi khác nhau và phụ thuộc vào từng lồi cây cũng như sức chống chịu của từng cây. 2.5.1 Thành phần cấu tạo Thơng thường mỗi virus được tạo từ hai thành phần chính là protein và axit nucleic, một số virus đặc biệt cịn cĩ cả polyanin, lipit, hoặc một số men đặc hiệu. Dựa vào những hiểu biết về đặc điểm cấu tọa của virus mà các nhà khoa học đã tìm ra những chất hĩa học cĩ tác dụng làm giảm sự nhân lên của virus trong tế bào cây chủ. Protein của virus thực vật cĩ tác dụng bảo vệ, bám giữ và cĩ vai trị quan trọng trong việc virus truyền bệnh qua mơi giới. Protein của virus thực vật cũng được tạo thành từ nhiều axit như alanin, acginin, glixin, triptophan, valin,…Các virus (ARN hay ADN) sẽ quyết định bản chất protein của chúng. Ở bên ngồi tế bào cây chủ cĩ những điểm đặc biệt hay những thụ thể để virus nhận biết mà bám vào, từ đĩ mới bơm nucleic vào tế bào. Do đĩ từ kết quả phân tích vỏ protein của virus và biết được trình tự nhận biết đĩ thì sẽ tổng hợp được những chất hĩa học cĩ cấu tạo giống các thụ thể để giảm tốc độ lan truyền virus trong cây chủ. Axit nucleic của virus giữ vai trị chủ yếu quyết định tính di truyền, khả năng truyền nhiễm và gây bệnh. Phần lớn các virus thực vật cĩ vật chất di truyền là ARN, một số ít là ADN. Cả ARN và ADN đều là những đại phân tử chứa hàng trăm ngàn các đơn vị nhỏ được gọi là các nucleotit. Mỗi nucleotit được cấu tạo từ một gốc photphat, bazơ nitơ và đường 5 carbon. Cĩ 2 nhĩm bazơ nitơ là purin và pirimidin với 5 loại là uracil, adenin, guanin, xitozin và timin. Dựa trên cấu tạo của các nucleotit mà con người đã tổng hợp nên những dẫn xuất của chúng hoặc những hĩa chất mà về mặt hĩa học tương tự các nucleotit này. Các hĩa chất này sẽ cạnh tranh với các nucleotit để tham gia tạo thành các axit nucleic, và do đĩ làm sai khác trật tự nucleotit và làm giảm tốc độ tái sản xuất của virus. 2.5.2 Về cách gọi tên: tên virus thường được đặt theo qui tắc sau Tên virus = Tên cây chủ + Đặc điểm bệnh + Virus 17 Ví dụ : Tobaco Mosaic Virus: đây là virus gây hại trên cây thuốc lá, đặc điểm bệnh là gây khảm lá. Odontoglossum Ringspott Virus: virus này gây hại trên cây lan thuộc chi Odontoglossum, lá cây bị bệnh cĩ các vết bệnh hình đốm vịng. Virus là một loại kí sinh phân tử khơng cĩ cấu tạo tế bào, nhưng cũng khơng sinh sản bằng cách phân đơi như vi khuNn, virus sinh sản bằng cách kí sinh vài tế bào sống và “ bắt ” tế bào cung cấp vật chất cần thiết cho virus tổng hợp thành protein và vật chất di truyền của virus, sau đĩ các thành phần này lắp ráp với nhau tạo thành virus con. Phương thức sinh sản này người ta gọi là sinh sản tái tạo (multiplication). Như vậy sự sinh sản của virus hồn tồn dựa vào vật chất của tế bào, làm cho tế bào kiệt quệ và dẫn đến chết. Virus thực vật muốn kí sinh và gây bệnh cho cây chủ thì virus phải bám được vào thành tế bào và xâm nhiễm vào trong tế bào. Bản thân virus khơng chủ động di chuyển và xâm nhập vào bên trong tế bào được. Sự xâm nhiễm của virus thực vật vào cây chủ cĩ thể thơng qua các vectơ truyền bệnh như cơn trùng, bét nhện,… hoặc qua các vết thương cơ giới do con người gây ra trong quá trình cắt tỉa cây trồng. Sau khi xâm nhập được vào bên trong tế bào, sự lây lan của virus từ tế bào này sang tế bào khác cĩ thể qua cầu nguyên sinh giữa các tế bào, hoặc qua dịng vận chuyển vật chất. Người ta cũng phát hiện ra rằng trên tế bào cĩ một số điểm nhận biết đặc biệt mà virus cĩ khả năng bám vào để từ đĩ xâm nhập vào tế bào, gọi là các thụ thể. Sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ, virus sẽ giải phĩng vật chất di truyền (RNA, DNA) quá trình này gọi là sự lột áo (uncoating). Tiếp đĩ là quá trình tái tạo vật chất di truyền và biểu đạt gen. Đối với virus cĩ vật chất di truyền là ARN (ARN virus), quá trình tái tạo ARN gồm tái tạo ARN của virus và mARN protein của virus. “ARN virus ” lợi dụng ribosom của cây chủ phiên dịch ra là enzym ARN- phụ thuộc ARN (ARN- dependent ARN polymerasa, RdRp). Dưới tác dụng của RdRp tế bào sẽ tổng hợp ra hàng loạt ARN con của virus và ARN tổ gen của virus, lúc này ARN tổ gen sẽ tiến hành phiên dịch ra protein vỏ áo. Cuối cùng “ARN con” và “protein vỏ áo” lắp vào nhau tạo thể virus con hồn chỉnh. Vơ số virus con được tạo thành sản sinh ra enzym phân giải màng tế báo ký chủ để phĩng thích virus con ra ngồi, từ đĩ tiếp tục xâm nhiễm sang các tế bào bên cạnh. Đối với virus cĩ vật chất di truyền là ADN, sự tái tạo lại vật chất di truyền cĩ thể xảy ra theo con đường sau: đầu tiên là từ DNA sẽ phiên mã ra RNA , sau đĩ xảy ra quá trình phiên mã ngược từ RNA qua DNA và quá trình tổng hợp protein từ RNA. Cuối cùng là protein và DNA sẽ kết hợp với nhau để tạo thành virus mới hồn chỉnh. Như vậy virus sử dụng vật chất của tế bào để sinh sản. Do đĩ virus cũng gây ra những biến đổi về sinh lí và hình thái bên ngồi của cây bị bệnh. 2.5.3 Virus gây biến đổi về sinh lí cây chủ. Virus thực vật kí sinh bên trong tế bào và sử dụng vật chất của tế bào cây để xây dựng cơ thể virus mới do đĩ gây ra những tác động lên quá trình tổng hợp và trao đổi chất của tế bào cây chủ. Virus cĩ thể kìm hãm sự tổng hợp, trao đổi chất này trong khi đĩ lại kích thích sự tổng hợp và trao đổi chất khác. 18 Virus tác động lên quá trình hoạt động của hệ thống men trong tế bào để kìm hãm enzym phản ứng tạo nên một số chất này hay kích thích tạo ra nhiều chất cĩ lợi cho virus. Trong cây bị bệnh virus, hoạt động một số men oxi hĩa được tăng cường như oxidaza (Woods, 1899), peroxidaza (Kokin, 1937), tirodinaza, xitocromoxidaza (Martin, 1954), polyfenoloxida (Van Kammen và Drouwer, 1964), ngược lại thì hoạt động của một số men khác bị kìm hãm như catalaza (Vager, 1955). Virus gây bệnh cho cây cũng tác động lên quá trình hơ hấp của cây. Những thay đổi này khơng ổn định (cĩ thể cao hay thấp) tùy thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của cây, điều kiện thời tiết hay tình trạng sinh lí của cây trồng. Bệnh virus thường làm giảm số lượng diệp lục trong lục lạp, do vậy làm giảm hiệu quả quang hợp của cây. Cùng với sự giảm số lượng diệp lục thì các sắc tố như antoxianit, carotinoit sẽ tăng lên, làm cho lá cây nhiễm bệnh virus chuyển màu từ màu xanh sang màu vàng hay nâu đỏ. Bên cạnh đĩ, virus thực vật cịn làm thay đổi tốc độ trao đổi gluxit trong cây. Ban đầu cây bị bệnh ở bộ phận hoa, lá cây sẽ tích lũy các chất đường ở vị trí nhiễm bệnh. Nhưng về sau hàm lượng đường ở các lá bị bệnh sẽ thấp hơn so với các lá khỏe. Nguyên nhân là do virus ban đầu làm cản trở quá trình vận chuyển ở các bộ phận bị bệnh đến các bộ phận khác dẫn đến việc tích lũy đường ở các bộ phận này. Sau đĩ, virus sử dụng vật chất của tế bào, thúc đNy quá trình hơ hấp nên hàm lượng đường ở bộ phận bị bệnh sẽ thấp hơn các bộ phận khác trong cây. 2.5.4 Virus gây biến đổi về hình thái. Thơng thường cây chủ chỉ cĩ biểu hiện bệnh ra bên ngồi khi mà đã bị nhiễm bệnh khá nặng. Một số triệu chứng về hình thái do virus gây ra: - Triệu chứng khảm lá: Là triệu chứng rất phổ biến của nhiều bệnh virus mới hại thực vật. Lá cây loang lổ chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng (Mosaic - khảm lá). Khảm lá thường xảy ra ở các bệnh như: Virus khảm thuốc lá, khảm ớt, dưa chuột, khảm lá đậu, khảm lá táo tây. - Đốm chết hình nhẫn: Thương gặp là khảm và tạo ra đốm chết loại hình nhẫn (đốm vịng) như bệnh đốm hình nhẫn ở cây đu đủ, cây mận, cây thuốc lá, cây hoa cNm chướng. - Triệu chứng hại gân lá: Là hiện tượng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân sáng, gân chết, gân biến dạng… như virus Y hại cây thuốc lá tạo gân sáng, virus Y hại một số giống khoai tây (tạo gân biến dạng). - Khảm lá, lùn cây: Là hiện tượng khảm lá kèm theo cây lùn như Maize mosaic dwarf virus hay khảm sĩc lá (Maize strerk trip mosaic virus) ở ngơ, lúa, và các cây đơn tử diệp. - Xoăn, cuốn lá: Biến dạng lá như xoăn lá cà chua, cuốn lá khoai tây, xoăn lá cây ớt, hồ tiêu. - Biến màu và biến vàng: Là những triệu chứng gây biến vàng (ở lúa), gây hố xanh (ở cam, chanh). 19 - Lùn bụi, tàn lụi: Là hiện tượng khá phổ biến như lùn bụi ở cây lạc, cây chuối rụt, cây cam bị bệnh tritera virus. Vết chết ở thân cây, vết lõm thân như hiện tượng sưng cành táo, vết lõm thân cây cam, chanh. - Biến dạng củ, quả: Như ở táo, mận, nho bị nhiễm virus, quả cà chua bị đốm héo, củ khoai tây ở cây bị bệnh vàng lùn. Các triệu chứng bệnh trên cịn phụ thuộc vào giống cây kí chủ, điều kiện mơi trường và chủng loại virus gây bệnh mà cĩ sự biến đổi. Cùng một loại virus mà ở ba nhĩm chủng khác nhau cĩ thể thể hiện thành nhiều nhĩm triệu chứng khác nhau. Bên cạnh đĩ các triệu chứng bệnh này khơng mang tính đặc thù, ví dụ như virus bệnh đốm vịng thì vết bệnh cũng tương tự như bệnh đốm do một số lồi nấm gây nên. Do đĩ bệnh virus khơng chỉ khĩ phát hiện khi mới chớm bị, mà khi bị nặng và cĩ biểu hiện bệnh ra bên ngồi thì cũng rất dễ nhầm với bệnh do bệnh sinh lí, bệnh nấm, hay một số tác nhân khác gây ra. Tĩm lại virus gây bệnh hại ở thực vật cĩ một số đặc điểm sau: Cây bị bệnh virus hiện nay thì khơng thể chữa được mà chỉ cĩ thể làm ức chế sự sinh sản của virus trong cây. Bệnh virus gây thiệt hại lớn cho người trồng. Đối với những cây ngắn ngày virus gây thiệt hại nhanh chĩng. Ví dụ ở nước ta hiện nay, bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá ở cây lúa do virus gây ra và lan truyền nhờ rầy nâu đang bùng phát, gây hậu quả nặng nề cho bà con vùng đồng bằng Sơng Cửu Long. Nhưng thiệt hại nặng nề hơn cả là virus khơng làm cho cây trồng bị chết ngay khi cịn nhỏ mà làm thối hố, giảm sức sống, dần dần dẫn đến tàn lụi sau khi người trồng đã đầu tư rất nhiều vào việc chăm sĩc và nuơi dưỡng cây. Ví dụ ở Đà Lạt, cĩ nhiều gia đình trồng địa lan đã mất 70% đến 100% chậu địa lan đang trong giai đoạn cĩ hoa. Bệnh virus tồn tại lâu, khĩ phát hiện và triệu chứng bên ngồi khơng đặc thù dễ gây nhầm lẫn. Việc chuNn đốn bệnh thì phức tạp, địi hỏi kĩ thuật cao. Biểu hiện bên ngồi của cây bị bệnh virus cĩ chu kì biến đổi theo chu kì phát triển của virus, theo tác động của yếu tố mơi trường, đặc điểm sinh lí của cây chủ. Do đĩ những biểu hiện bệnh bên ngồi của cây cũng thay đổi gây nhầm lẫn cho người trồng. Và đến khi cây chủ khơng cịn khả năng phục hồi theo chu kì bệnh thì cây sẽ hồn tồn tàn lụi. Ví dụ bệnh virus hại địa lan tại Đà Lạt, trong điều kiện mùa khơ, nhiệt độ cao diễn biến bệnh virus chậm chạp, nhưng vào mùa mưa lại bùng phát. 2.6 Virus hại địa lan Những triệu trứng bệnh virus đầu tiên được miêu tả vào năm 1943 trước khi Ivanopski phát hiện ra sự tồn tại của thế giới virus. Virus thực vật gây hại trên rất nhiều loại cây trồng, cĩ thể thấy trong tự nhiên đa số cây đều bị nhiễm virus. Ở nước ta mà đặc biệt ở Đà lạt, trong những năm gần đây cùng với sự gia tăng về nhu cầu và qui mơ trồng lan thì bệnh virus hại lan cũng bùng phát và đã gây ra nhiều thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người trồng lan. Theo ước tính thì đến nay cĩ khoảng 25 lồi virus hại lan. Những triệu chứng biểu hiện bệnh virus gây hại trên lan rất đa dạng và khơng theo qui tắc nào cả. Đa số virus thực vật gây vàng, chết mơ hay hoại mơ (thối nhũn) và biểu hiện ban đầu của 20 virus nhiều khi giống với bệnh sinh lí. Ví dụ: Bệnh trên địa lan do Cymbidium Mosaie Virus gây ra, ban đầu giống với biểu hiện khi bĩn quá nhiều urê cho cây. Trong họ lan thì địa lan là cây đặc thù của xứ lạnh và được trồng khá lâu ở Đà lạt và cĩ giá trị kinh tế cao. Ngày nay, dưới sự phát triển của kĩ thuật nuơi cấy mơ, việc mở rộng qui mơ sản xuất lan đang gặp nhiều thuận lợi, bên cạnh đĩ thì việc lây lan bệnh virus cũng đang là nguy cơ số một cho người trồng lan nếu cây lan khơng sạch bệnh virus. Trong số những lồi virus hại địa lan hiện nay thì tại Đà Lạt cĩ một số lồi gây hại chủ yếu: Cymbidium Mosaic Virus (CyMV), Tobaco Mosaic Virus (TMV), Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), Cybidium Ringspot Virus (CyRV), Odotoglosum (ORSV)... 2.6.1 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Cymbidium Mosaic Virus trên cây địa lan Trên lá cây nhiễm bệnh ban đầu cĩ nhiều chấm đen nhỏ, sau đĩ phát triển thành vệt màu đen. Những vết bệnh lớn liên kết với nhau tạo thành những mảng đen ở cả mặt trước và mặt sau. Khi bệnh nặng thì những chấm đen ban đầu phát triển trên cả phần bẹ lá, tồn bộ lá khơ đi nhanh chĩng và gây ra hiện tượng khơ xám giả hành. Trên những cây lan nhiều năm tuổi, trong cùng một chậu thì tất cả giả hành, chồi non và phát hoa đều bị bệnh. CyMV ngồi tác động làm khơ lá thì cịn gây thối theo đám từ gân lá ra ngồi mép lá. 2.6.2 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tobaco Mosaic Virus orchid trên cây địa lan TMV orchid theo dịng vận chuyển vật chất lây lan khắp hệ thống cây trồng và gây ra hiện tượng khảm lá, lùn cây, cây cịi cọc. Vết bệnh thường xuất hiện ở phần lá, ban đầu trên lá non xuất hiện một vài đốm vàng xanh, sau đĩ các đốm xuất hiện ngày càng nhiều và gây hoại lá. Với các lá bị nhiễm nhẹ, phiến lá nhỏ hẹp và mặt lá sần sùi. Đặc điểm của vết bệnh là các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ hẹp, xếp sít nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn bình thường. 2.6.3 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tomato Spotted Wilt Virus trên cây địa lan Cây nhiễm virus TSWV cĩ biểu hiện bệnh rõ rệt ở phần hoa, trên cả nụ non và hoa đã nở, nhưng chủ yếu là hại ở phần nụ hoa. Các vết bệnh thường to và cĩ màu đen. 21 2.6.4 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Cybidium Ringspot Virus (CyRV) trên cây địa lan Phần lá trên cây bị bệnh do virus CyRV thường cĩ nhiều sọc vàng nhạt phân biệt rõ với cùng xanh của phiến lá. Cây bị bệnh nặng thì các vết bệnh liên kết lại với nhau làm cho cây bị vàng, các lá xếp sít với nhau và dựng thẳng đứng. Bệnh thường xuất hiện ở cây con 6 tháng tuổi với bộ lá dày cĩ màu vàng nhạt. Trên cây lớn thì bệnh khiến cho phát hoa thấp ngắn, tuy cĩ nụ hoa nhưng lại khơng nở được. 2.7 Một số biện pháp đã được áp dụng để cĩ cây sạch bệnh virus Ngày nay, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh để cung cấp cho người trồng là vơ cùng quan trọng và cần thiết. Hiện nay chỉ cĩ hai phương pháp được sử dụng để cĩ cây trồng sạch bệnh là cây gieo từ hạt khơng bị tổn thương và phương pháp phục tráng giống bằng cách nuơi cấy đỉnh sinh trưởng. 2.7.1 Về phương pháp gieo hạt Phương pháp nhân giống bằng hạt hiện nay là phương pháp nhân giống thường được sử dụng cho lan. Đây là phương pháp tạo ra được số lượng lớn các cây con và chủ yếu áp dụng với những cây mà thời gian tạo cây con bằng phương pháp nhân giống vơ tính là rất lâu và khĩ nảy mầm trong điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đĩ để nâng cao tỉ lệ hạt nảy mầm cho những cây cĩ thể nảy mầm trong điều kiện tự nhiên như lan, người ta gieo hạt trong điều kiện phịng thí nghiệm. Vấn đề quan trọng nhất trong phương pháp này là tìm ra mơi trường gieo hạt tối ưu để rút ngắn thời gian và tăng tỉ lệ hạt nảy mầm. 2.7.2 Về phương pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Đây là một trong những phương thức nuơi cấy mơ trong phịng thí nghiệm (nhân giống in- vitro). Nhân giống in- vitro hay nuơi cấy mơ đều là thuật ngữ mơ tả các phương thức nuơi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm cĩ chứa mơi trường xác định ở điều kiện vơ trùng. Mơi trường cĩ chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khống, các hormone tăng trưởng, carbon, và một số chất bổ trợ khác. Kĩ thuật nuơi cấy mơ cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mơ như lá, thân hoặc rễ. 2.7.3 Một số biện pháp bổ trợ khác 2.7.3.1 Phương pháp nhiệt độ Thơng thường, để ức chế sự tái bản của virus thì các mẫu thực vật được xử lí với nhiệt độ ở 30 – 37 oC trong thời gian từ 10 - 14 ngày hay ở 40 – 55 oC trong 5 - 10 phút (Nguyễn Văn Tỵ, 2002). Tuỳ vào loại mẫu cấy, kích thước mẫu cấy mà cĩ thời gian và nhiệt độ xử lí thích hợp. Sau đây là một số thí nghiệm đã tiến hành của nhiều tác giả với mục đích ức chế sự nhân bản của virus bằng nhiệt độ là: Để ức chế virus PVY - Potato Virus Y trên cây khoai tây, năm 1956 Thomson, năm 1998 Leonhardt và cộng sự, tiến hành xử lí mẫu ở 35 – 38 oC trong 30 - 40 ngày. 22 Walkey và Freeman xử lí mẫu với nhiệt độ 40 oC trong 16h cĩ chiếu sáng và 22 oC trong 8 h tối, trên cây Nicotiana Rustica, để ức chế virus CMV - Cucumber Mosaic Virus. 2.7.3.2 Phương pháp hố học Một trong những phương hướng khác trong việc ức chế sự tái bản virus trong tế bào là sử dụng hố chất mà đĩ là những dẫn xuất halogen tiền thân của sự trao đổi chất axit nucleic. Trong giai đầu của quá trình tìm kiếm, các nhà khoa học đã tìm thấy một số hoạt chất như: Iot deoxyuridin, 2 - thiouracil,… Đây là những chất đồng dạng với purin, pirimidin. Những chất này cĩ tác dụng làm rối loạn sự tổng hợp bình thường của các axit nucleic của virus. Bên cạnh đĩ những hoạt chất được tìm thấy trong thời gian này tuy cĩ tác dụng ức chế tác động của virus nhưng đồng thời cũng gây độc cho tế bào. Hợp chất được sử dụng sớm nhất trong là 2 – thiouracil, đựơc tìm ra vào năm 1952 do hai nhà khoa học là Commoner và Mercer. Từ lâu người ta đã biết đa số virus cĩ vật chất di truyền chứa uracil là một phần của acid nucleic. Do đĩ Commoner và Mercer đã ức chế sự tái bản của virus trong cây thuốc lá bằng cách sử dụng 2 - thiouracil. Vào năm 1953, Jeener và Rosseels nhờ việc sử dụng đồng vị của sulfua (S35) của 2 - thiouraci và chứng minh được rằng S35 đã tham gia vào acid nucleic của virus. Sau đĩ hàng loạt những chất hố học khác thuộc nhĩm này được nghiên cứu. Một số chất chất khác như 5- Fluorouracil (Heidelberger và cộng sự, 1957), 5 - Chlorouracil, Azaguanin (Matthews, 1953),… 8 - Azaguanin là một hợp chất khơng cĩ trong tự nhiên và được tổng hợp do Matthews vào năm 1953. Matthews đã sử dụng 8 - Azaguanin trong thí nghiệm ức chế sự nhân bản của virus CMV (Cucumber Mosaic Virus) và virus TMV (Tobaco MosaicVirus). Và thực tế là việc sử dụng 2 - thiouracil và một số chất hố học khác thời kì này đều khơng hiệu quả (Tam, 1959). Những chất này khơng chỉ ức chế sự tái bản của virus mà đồng thời ức chế sự sinh trưởng và thậm chí gây chết đối với tế bào. Nhưng dù sao, 2 - thiouracil khi sử dụng ở nồng độ phù hợp cũng thu được một số thành cơng trong việc ức chế được sự tái bản của virus (Holmes,1955). Ngày nay, ribazole là một hĩa chất do con người tổng hợp được sử dụng rộng rãi trong ức chế virus ở động vật và cả thực vật mà ít gây ảnh hưởng xấu lên tế bào vật chủ nhất. Ribazole là hợp chất thuộc nhĩm kháng chuyển hố nucleotide của virus do đĩ cĩ tác dụng ức chế sự nhân bản của virus trong tế bào. Ribazole cĩ cơng thức hố học là C18H12N4O5 và cấu tạo hố học như sau: 23 Một số chế phNm cĩ chứa ribazole là: Copegus, Rebetol, Ribasphere, Vilona, và Virazole. Ribazole là chất hố học được tổng hợp nhân tạo, hiện chưa tìm thấy trong tự nhiên, và lần đầu tiên được tổng hợp vào năm 1970 do nhà hố học Joseph T. Witkowski (Lau, 2002). Vào năm 1972 Sidwell đã chứng minh rằng ribazole cĩ thể ức chế hoạt động của một số lồi virus động vật mà ít gây độc cho tế bào. Từ đĩ cho đến nay, ribazole đã đựơc chứng minh là khơng chỉ ức chế hoạt động của rất nhiều loại virus động vật mà cịn cĩ tác dụng với cả virus thực vật. Theo Simpkins và cộng sự (1981), theo Vicente De Fazio (1987), Chen và Sherwood (1991) và gần đây là Fletcher cùng cộng sự (1998) đã cho thấy ribazole cĩ tác dụng ức chế virus thực vật nhân bản. Việc ứng dụng ribazole trong nuơi cấy in- vitro để ức chế hoạt động của virus thực vật trong việc làm sạch bệnh virus được bắt đầu từ những năm 1980 và đã được áp dụng cho một số đối tượng thực vật. Đa số virus thực vật cĩ vật chất di truyền là ARN, một số ít cịn lại cĩ vật chất di truyền là ADN. Cả ADN và ARN đều cĩ cấu tạo từ các axit nucleotic. Mỗi nucleotid đều gồm cĩ 3 phần là nhĩm photphat, phân tử đường 5 carbon và Bazơ nitơ. Cĩ 5 loại bazơ nitơ là adenin, guanin, xitozin, timin, uraxin. Trong đĩ ARN cĩ 4 loại là adenin, uraxin, guanin, xitozin. Cịn ADN cĩ 4 loại là adenin, timin, guanin, xitozin. Ribazole cĩ cấu tạo và tính chất hố học tương tự cả adenosin lẫn guanosin. Bên cạnh đĩ ribazole cĩ thể hoạt động độc lập và tuần hồn và đĩ là nguyên nhân mà ribazole tham gia đồng hố vào ARN và ADN của virus. Từ đĩ ribazole cĩ một số tác động chính sau: Ribazole cĩ thể ghép đơi với xitozine và uridine, từ đĩ gây rối loạn biến đổi sự tổng hợp RNA của virus. Thêm vào đĩ, dẫn xuất của ribazole là Ribazole 5’ monophotphat, Ribazole 5’ diphotphat, Ribazole 5’ triphotphat cĩ tác dụng ức chế hoạt động của RNA polymerase phụ thuộc vào ARN của virus. Cuối cùng ribazole cĩ thể cạnh tranh với Guanosin triphotphat, cĩ tác dụng ức chế hoạt động gen của virus thực vật. Ribazole đã được áp dụng với rất nhiều cây trồng như khoai tây, thuốc lá,… và mỗi loại cây trồng thích hợp với những nồng độ ribazole khác nhau. 24 Ví dụ như đối với cây Allium Sativum L. thì nồng độ tối thích của ribazole trong các thí nghiệm này là 205 µm (Hector Loszoya và Saldana; William. O Dowson; T Murashige, 2006) Đối với cây Oxalic Tuberosa Molina, Ullucus Tuberosus Caldas, Arraccia Xanthorrhiza, thì nồng độ ribazole tối ưu là 50 mg/l mơi trường nuơi cấy (Fletcher, 2001). Đối với cây khoai tây, nồng độ ribazole được sử dụng trong khoảng 20- 30 mg/l mơi trường MS cĩ bổ sung kinetin, NAA và GA3. Khi sử dụng ribazole trên cây chuối thì nồng độ ribazole là 50 mg/ l nhưng khi sử dụng cho Nicotiniana Rustica thì nồng độ ribazole lại cao hơn là 100 mg/ l mơi trường nuơi cấy. 3. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung và phân loại về họ cúc 3.1. Tình hình sản xuất hoa cúc 3.1.1. Trên thế giới Trong ngành sản xuất hoa tồn cầu, hoa cúc là lồi quan trọng thứ hai sau hoa hồng. Cúc cịn được xem như là một trong những lồi hoa trang trí được ưa chuộng nhất trên tồn thế giới. Ở Nhật Bản, hoa cúc là quốc hoa từ năm 910 (L.Naeve, và D. Nelson, 2005), nên ngành sản xuất hoa cúc đã mang về lợi nhuận tăng hơn hai lần, chỉ trong vài thập niên gần đây, nhờ áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật, cũng như do nhu cầu thưởng thức cuộc sống của người dân tăng nhanh. Hoa cúc ở Nhật Bản chiếm đến 35% tổng sản phNm hoa cắt cành trong nước (Boase và cs, 1997). Trên thế giới, hàng năm, Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa cúc nhiều nhất, với 2 tỉ cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu; Colombia 600 triệu; Italia: 500 triệu; Hoa Kì:300 triệu (Boase và cs, 1997). Ở nước Anh, hoa cúc là loại hoa cắt cành quan trọng đứng thứ hai trên thị trường (Flowers and Plants Association, 2001). Tại Nhật Bản, hoa cúc cắt cành được sử dụng khá phổ biến: 40% được dùng làm quà tặng; 25% được dùng để trang trí tại các khách sạn hay trong các lễ hội; 25% được dùng để trang trí trong gia đình và cúng theo đạo Phật; và 10% phục vụ trong việc giảng dạy nghiên cứu (Jaime, 2003). Cải cúc (C.coronarium L.) được trồng rất phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc và vùng Đơng Nam Á, như một loại rau ăn hàng ngày khá phổ biến (Oka và cs., 1999). Một số lồi cúc khác cĩ chứa một hàm lượng tinh dầu đáng kể, nên một số lồi được trồng để khai thác tinh dầu (Schwinn và cs., 1994). 3.1.2 Tại Việt Nam Ở nước ta, cĩ nhiều lồi cây dại thuộc họ cúc mọc ở nhiều nơi. Một số lồi được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như bồ cơng anh (Lactuca laciniata L.). Hoa cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng từ thế kỉ XV đến đầu thế kỉ XVI. Lúc đĩ chủ yếu dùng làm cảnh. Mãi đến sau này, cúc mới được trồng như một loại cây thương mại. Ở nước ta, Hà Nội là nơi cĩ diện tích trồng hoa cúc nhiều nhất, với diện tích 450 ha, sau đĩ là Thành Phố Hồ Chí Minh (370 ha). Đà Lạt là vùng 25 cĩ diện tích trồng hoa cúc lớn thứ ba, với diện tích 160 ha ((N.Q. Trạch và Đ.V.Đơng, 2002). 3.1.3 Tại Lâm Đồng Hầu hết diện tích trồng hoa cúc ở Lâm Đồng tập trung ở thành phố Đà Lạt, ở các huyện Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương…diện tích khơng đáng kể. Mặc dù được trồng từ khá lâu, nhưng hoa cúc trở thành một sản phNm thương mại mới từ năm 1995. Diện tích trồng hoa cúc ở Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đây. Diện tích trồng hoa cúc chiếm đến 40-50% diện tích trồng hoa nĩi chung. Trong việc trồng hoa cúc, bà con nơng dân đã áp dụng nhiều biện pháp kĩ thuật, như dùng hệ thống đèn chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kính… Đa số hoa cúc ở Đà Lạt được trồng với mục đích cắt cành. Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường từ 10-15 triệu cành. Tại Đà Lạt, hiện cĩ khoảng 70 giống, được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều con đường khác nhau: chính thức và khơng chính thức. Do đĩ, việc xác định tên thương phNm và chủng loại cho từng chủng loại cúc là rất khĩ khăn. 3.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) : 3.2.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978, họ cúc thuộc: -Giới thực vật -Ngành Magnoliophyta (Angiospermae) - Ngọc Lan (hạt kín) -Lớp Magnoliopsida (Dicotyledonea) - Ngọc Lan (hai lá mầm) -Bộ Asterales (cúc). Bộ cúc cĩ một họ duy nhất là họ cúc (Asteraceae hay Compositae) được xem là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật nĩi chung. Bao gồm gần 1000 chi và hơn 20 000 lồi, cĩ những chi cĩ tới 1000 lồi. Họ cúc phân bố trên khắp nơi trên Trái Đất, sống được trong nhiều điều kiện khí hậu, mơi trường, đất đai khác nhau. Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân gỗ thấp bé. (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986). Trong họ cúc được chia thành hai phân họ: hoa ống (Asteroideae=Tubiliflorae) và thìa lìa (Cichorioideae=Liguliflorae). Phân họ hoa ống cĩ đặc điểm là tất cả hoa trong cụm hoa đầu tiên hình ống (ống phễu, ống sợi, ống hình chuơng…), hoặc hoa hai mơi, hoặc hoa cĩ hoa hình ống ở giữa và hoa thìa lìa giả xung quanh. Trong phân họ hoa ống cĩ gần 740 chi, và rất nhiều lồi với các cây quen thuộc như là: ngãi cứu (Artemisia vulgaris L. var.indica (Willd.) DC.), thanh hao (Artemisia carvifloria Wall.), nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) thược dược (Dahila pinnata Cav.)… Trong đĩ, chi Chrysanthemum được trồng phổ biến như một lồi hoa trồng chậu hay hoa cắt cành. Hoa cúc là một lồi hoa cắt cành phổ biến trên tồn thế giới, nĩ đa dạng về các thứ và cĩ hàng ngàn kiểu dáng khác nhau (Cockshull, 1985). Ngồi ra một số lồi khác trong chi này cịn được dùng làm rau ăn, làm thuốc an thần, thuốc 26 chữa bệnh như là: cải cúc (C.coronarium L.), bạch cúc (C. moriforium Ramat), kim cúc (C. indicum L.). Phân họ thìa lìa cĩ đặc điểm là tất cả hoa trong cụm đầu tiên là hoa thìa lìa. Phân họ này cĩ ít lồi hơn. Một số lồi rất quen thuộc như là rau diếp, rau xà lách (Lactuca sativa L.), rau diếp xoăn (Cichorium endivia L.), bồ cơng anh (Lactuca laciniata L.) (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978). 3.2.2. Đặc điểm thực vật học Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986; N.Q. Trạch và Đ.V.Đơng, 2002 thì cúc cĩ các đặc điểm sau: Rễ - Cúc cĩ hệ rễ chùm, mọc cạn, theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10-20 cm. rễ cúc cĩ kích thước khá đều nhau, với số lượng rễ lớn, nên khả năng hút nước và chất dinh dướng rất mạnh. Do cúc được nhân giống bằng phương pháp vơ tính, nên rễ mọc ngang từ các mấu thân ở gần mặt đất. Thân - Thân hoa cúc là thân thảo nhỏ, nhiều đốt, mọng nước, giịn, dễ gãy. Trên thân non một số lồi cĩ phủ một lớp lơng tơ. Một số lồi cĩ dạng thân bị. Chiều cao thân tuỳ lồi. Nhưng đa số các giống nhập cĩ thân to, thẳng, giịn. Cịn các giống nội địa cĩ thân nhỏ, mảnh, cong. Lá - Lá cúc thuộc loại lá đơn, khơng cĩ lá kèm, mọc so le. Bản lá cĩ xẻ thuỳ hình lơng chim. Phiến lá mỏng, mặt dưới cĩ phủ một lớp lơng tơ, mặt trên nhẵn. Gân lá hình mạng. Mỗi cây cĩ khoảng 30 – 50 lá. Hoa, quả - Hoa cúc về cơ bản là hoa lưỡng tính. Hoa cúc cĩ nhiều màu sắc khác nhau, thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ. Hoa nhỏ, sít nhau và luơn luơn tập hợp thành cụm hoa đầu, để một sâu bọ thụ phấn được cho nhiều hoa cùng một lúc. Đế hoa lồi lên. Hoa ở giữa là hoa hình ống, hoa ở ngồi là hoa thìa lìa giả. Ở cúc, quả là quả bế. Chỉ cĩ một hạt mầm nằm trong khoang của quả và đơi khi dính với vỏ quả. Vỏ hạt rất mỏng, phơi lớn và thẳng khơng cĩ nội nhũ. Quả phát tán nhờ giĩ và động vật. 27 Hình 1.1: Các dạng hoa cúc (Nguồn:RHS A-Z Encyclopedia of Garden Plants (c) DK Images) 3.2.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển Khí hậu - Đa số hoa cúc thích hợp với điều kiện khí hậu ơn hồ, mát mẻ, lượng mưa đầy đủ, nhất là những hoa được nhập từ vùng ơn đới. Với nhiệt độ trên 250C, cúc sinh trưởng và phát triển kém (L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Đất đai - Cúc ít địi hỏi về điều kiện đất đai. Thích hợp với đất acid nhẹ, pH khoảng 6.0 - 6.5. Nhìn chung, cúc sẽ phát triển tốt trên đất cĩ độ Nm tốt, thống khí, giàu chất hữu cơ, đặc biệt là cĩ phân chuồng. Trước khi trồng, cần làm đất tốt, cày sâu 20-40 cm để đảm bảo độ thống khí và bĩn lĩt đầy đủ phân hữu cơ (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996; M.Top và B. Tatura, 2002; L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Phân bĩn - Cúc là cây địi hỏi một lượng phân bĩn khá lớn, vì vậy, cần bĩn 2 lần NPK, với tỷ lệ 10:10:10. Mỗi lần bĩn khoảng 25 kg/ 100m2. Tốt hơn là bĩn lĩt trong giai đoạn chuNn bị đất một lượng phân hữu cơ (M.N. Dana và B.R.Lerner, 1996; M.Top và B. Tatura, 2002). Cần chú ý khơng bĩn phân để cây bước vào giai đoạn ra hoa (L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Nước tưới - Cúc chỉ cĩ thể sống sĩt trong thời gian khơ hạn ngắn, nếu khơ hạn kéo dài sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây. Vì vậy, tưới nước rất quan trọng đối với cúc, nhất là trong mùa khơ (L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Cần tưới một cách đều đặn và kỹ lưỡng, đảm bảo nước phải thấm sâu xuống đất ít nhất 12-15cm. Cần chú ý tránh làm tổn thương cây do những tia nước mạnh quá. Những tổn thương này là nguyên nhân để các virus xâm nhập, các vi khuNn và nấm phát triển (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996). Sâu bệnh hại - Một số cơn trùng gây hại trên cúc thường xuyên là rệp muội, sâu vẽ bùa, nhện…Các bệnh thường gặp là: đốm lá, thối thân rễ, mốc sương…(M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996; L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Trong trường hợp sâu hại khơng nhiều lắm thì khơng cần thiết phải sử dụng thuốc hố học. Nên áp dụng biện pháp phịng ngừa tổng hợp, bằng thiên địch, bằng bẫy cơn trùng… (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996) 28 4. Virus và phương pháp ELISA Virus rất nhỏ bé, chỉ cĩ thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Chúng chưa cĩ cấu trúc tế bào nên bắt buộc phải kí sinh nội bào trên cơ thể một sinh vật khác (vi khuNn, nấm, động vật, thực vật). Chúng chỉ cĩ cấu tạo bởi một vỏ protein bao bọc bên ngồi một lõi acid nucleic. Chúng cĩ đầy đủ các hoạt động sống như di truyền, biến dị, tăng trưởng, sinh sản truyền nhiễm… mặc dù các hoạt động này đều phải gắn liền với tế bào vật chủ. Virus thực vật đã được phát hiện cách đây trên một thế kỷ và thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà sinh học. Ngành nơng nghiệp hết sức lúng túng trước các bệnh nghiêm trọng do virus gây nên vì cho đến nay vẫn chưa cĩ thuốc phịng trừ đặc hiệu (bệnh khảm thuốc lá, bệnh xoăn lá cà chua, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá ở lúa…). Cây bị bệnh virus cĩ thể tàn lụi, chết. Một số bộ phận của cây như thân, hoa, củ, quả, lá bị hủy hoại, cây phát triển kém dẫn tới năng suất giảm, chất lượng nơng sản về dinh dưỡng, cảm quan kém. Một số trường hợp bệnh hại cây cĩ thể sinh ra những độc tố gây ảnh hưởng xấu, trực tiếp đến sức khoẻ và đời sống của con người và động vật. Do tác hại của virus vơ cùng to lớn nên cần cĩ những biện pháp chuNn đốn và phát hiện sớm để cĩ biện pháp sử lý cho thích hợp. Hiện nay cĩ nhiều phương pháp chuNn đốn bệnh virus thực vật như phương pháp huyết thanh (trong đĩ phương pháp DAS-ELISA là phương pháp huyết thanh hiện đại nhất), phương pháp cây chỉ thị, phương pháp chuNn đốn bằng hiển vi điện tử, chuNn đốn phân tử (RT-PCR). Phương pháp ELISA tới nay vẫn là phương pháp phát hiện virus hiệu quả, nhanh chĩng được sử dụng rộng rãi. Để thực hiện được phương pháp này cần phải tách được protein của virus thực vật, bằng cách nghiền mẫu thực vật cĩ chứa virus trong dung dịch đệm nhằm giữ pH khơng đổi ở dịch chiết và thực hiện quy trình làm tinh khiết virus. ELISA là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để xác định kháng thể đặc hiệu chống virus ở thời điểm xuất hiện triệu chứng hoặc ngay sau khi xuất hiện triệu chứng. Kỹ thuật cho phép xác định kháng thể ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 µg/ ml). Nguyên lý phương pháp này là kháng thể được đánh dấu bằng cách gắn với enzym. Khi cơ chất thích hợp enzym sẽ phân giải, cơ chất cho sản phNm cĩ màu. Đo cường độ màu để biết mức độ phản ứng xảy ra. Kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật “bánh kẹp”(sandwich), theo đĩ kháng nguyên của cây bệnh (virus) được phản ứng với kháng thể sơ cấp đã biết, được xác định khi cho thêm kháng thể thứ cấp cĩ gắn enzym. Các bước thực hiện như sau: - Cố định kháng thể sơ cấp (đã được biết) lên thành giếng - Nạp dịch virus (kháng nguyên) vào giếng rồi ủ. Nếu kháng nguyên phù hợp sẽ tạo phản ứng với kháng thể sơ cấp. Rửa nhẹ để loại bỏ kháng nguyên thừa. - Thêm kháng thể thứ cấp cĩ gắn enzym. Rửa nhẹ để loại bỏ kháng thể thừa. 29 - Thêm cơ chất thích hợp với enzym. Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên trong dịch chiết virus. 4.1. Bệnh khảm thuốc lá TMV (tobacco mosaic virus) TMV là bệnh virus phổ biến ở các vùng trồng thuốc lá trên thế giới. Ở Việt Nam bệnh gây hại nặng trên vùng trồng thuốc lá các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc bộ. Cây bị nhiễm bệnh cĩ thể giảm năng suất 35%, chất lượng thuốc lá cũng giảm mạnh do hàm lượng nicotine giảm, lá dễ bị gãy nát. Virus cĩ khả năng truyền bệnh cao. Bệnh truyền chủ yếu qua con đường tiếp xúc cơ học, các vết thương do xây xát. Virus vận chuyển trong cây theo hệ thống mạch dẫn. Bệnh Khảm thuốc lá cĩ khả năng gây hại cho nhiều cây khác ngồi thuốc lá như cây ớt, cà chua, địa lan, hoa cúc... 4.2. Bệnh khảm thuốc lá trên địa lan Cây bệnh nhiễm hệ thống, gây hiện tượng khảm lún cây, cây cịi cọc, xuất hiện các vết chết hoại ở phần lá, trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng phiến lá nhỏ hẹp, ,mặt lá sầm sùi. Các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ hẹp, xếp sít nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn. 4.3. Bệnh khảm thuốc lá trên cúc Trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng xen kẽ nhau, gân lá nhợt nhạt, lá nỏ hẹp, cây chỉ bằng ½ cây khỏe, cây mất triệu chứng khi nhiệt độ giảm xuống 110C. Cây nhiễm bệnh hệ thống. Gây bệnh cho Cúc, Lan bao gồm nhiều yếu tố và nhiều nhĩm vi sinh vật khác nhau. Trong báo cáo này chúng tơi chỉ tiến hành test và đánh giá tác hại của virus TMV. Bởi vì, TMV là một virus phổ rộng, đồng thới khơng phải là virus gây hại chính cho các đối tượng trên. Do đĩ nếu các đối tượng trên nhiễm TMV thì xác suất nhiễm các bệnh virus khác rất cao. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 2.2.1 Vật liệu ban đầu Đặc thù của đề tài là nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống cúc và hoa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt là sự đa dạng về giống, riêng giống cúc nhập vào Đà lạt đã cĩ hơn 70 giống. Chính vì vậy, trong phương pháp thực hiện nghiên cứu chúng tơi chỉ nêu những phương pháp chung và trên một số giống làm chuNn, các giống cịn lại đều tuân thủ theo các bước sau đây: a. Thu thập mẫu b. Tách và nuơi cấy mơ phân sinh. c. Nhân nhanh protocorm (đối với địa lan), nhanh nhanh cây cúc in vitro d. Chuyển protocorm và cây con sang mơi trường xử lý virus e. Tách lại mơ phân sinh f. Nhân nhanh và test virus 2.2 Phương pháp nghiên cứu A. Phương pháp áp dụng trên đối tượng lan Cymbidium Các thí nghiệm đã tiến hành sử dụng protocorm của ba giống địa lan sẵn cĩ trong phịng thí nghiệm. Ba giống đĩ là Trắng bệch, Tím hột, và Miretta xanh. Cả ba gjống này đều cho hoa rất đẹp và các giống mà được trồng rộng rãi ở Đà Lạt. 1. Mơi trường nuơi cấy Trong các thí nghiệm đã thực hiện với mơi trường khống Knudson C, MS và 1/2MS cĩ bổ sung thêm các chất khác là: Vitamin: các vitamin là myo - inositol, acid nicotinic, pyridoxine HCl, Thiamin HCl. Đây là các vitamin được sử dụng trong mơi trường MS. Peptone được bổ sung với hàm lượng 2g/l. Agar được bổ sung 8g/ l. Chất điều hịa sinh trưởng bổ sung là BA: 0.5 mg/ l. Đường saccharose với hàm lượng 30g/l. 2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.1. Nghiên cứu mơi trường dinh dưỡng thích hợp và sử dụng ribazole hổ trợ việc loại bỏ virus kết hợp với việc tách mơ phân sinh đỉnh 31 Các protocorme hình thành sau khi qua bước nuơi cấy đỉnh dinh trưởng, chúng tơi tiếp tục bố trí nuơi cây trong các mơi trường cĩ hàm lượng khống MS, 1/2MS và mơi trường Knudson C. Các thí nghiệm về tác động của của than hoạt tính, cytokinin (chọn BA), cytokinin/auxin (chọn BA và NAA) đều sử dụng mơi trường khống cơ bản là MS. Cách bố trí thí nghiệm như sau: - Thí nghiệm ảnh hưởng của BA: Chúng tơi bố trí 5 nồng độ khác nhau: 0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2 mg/l. - Thí nghiệm ảnh hưởng phối hợp giửa BA và NAA: này được thực hiện bởi các protocorme nuơi cấy trong mơi trường MS, cĩ than hoạt tính là 1g/l, nồng độ BA là 1ml/l và cĩ bổ sung thêm các nồng độ NAA từ 0 – 2mg/l. Chọn mơi trường thích hợp từ các thí nghiệm trên để tiếp tục nghiên cứu tác động của ribazole lên sinh trưởng của cây con. Chúng tơi sử dụng ribazole trong các thí nghiệm với các nồng độ 0 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l và 150 mg/l. Dạng ribazole đã sử dụng là chế phNm của Getz Pharma. Các protocorm tái sinh trên mơi trường đã xử lý ribazole, tiếp tục được cấy chuyền để theo dõi khả năng phục hồi và test virus. Cây sạch bệnh tiếp tục được nhân lên để giữ giống cũng như chuyển ra khảo nghiệm ở vườn ươm. Các mẫu thí nghiệm trên được nuơi trong điều kiện phịng nuơi in- vitro với: Thời gian chiếu sáng: 10h/ ngày. Cường độ chiếu sáng: 45 micro mol m-2 s-1 Độ Nm trung bình: 75- 80 % Nhiệt độ: 25- 27oC Chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu được theo dõi là số mẫu cấy sống sĩt, số lượng protocorm mới phát sinh sau 60 ngày nuơi cấy. Bên cạnh đĩ một số chỉ tiêu khác thường xuyên được theo dõi là thời gian bắt đầu phát sinh protocorm mới, màu sắc mẫu cấy. Sau giai đoạn xử lý, theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con (chiều cao, số lá, số rễ, trọng lượng tươi sau ba tháng cấy chuyền…) 2.2. Nghiên cứu giá thể thích hợp cho cây lan con khi ra vườn ươm Cây con sau khi rút khỏi mơi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ, nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể. Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm Với thí nghiệm giá thể: chúng tơi bố trí một số nghiệm thức sau: Ký hiệu loại giá thể Loại giá thể I II Dớn mút 3T 32 III IV V VI VII VIII 3T/dớn xay (1:1) Xơ dừa Dớn xay/Xơ dừa (3/1) Dớn xay/Xơ dừa (2/1) Dớn xay/Xơ dừa (1/1) Dớn xay Số lượng cây con/ khay: 100 cây Độ Nm giá thể: 70 – 80% Độ Nm khơng khí: 90 – 95% Nhiệt độ nuơi trồng: 20-25oC Ánh sáng: Độ che sáng > 70% Số lần tưới/ngày: 3-5 lần Bĩn phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha lỗng cĩ EC 1.0 ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ tuần đầu tiên sau khi mới ra cây) 2.3. Nghiên cứu chế độ phân bĩn cho cây con giai đoạn ra vườn ươm Cây con sau khi rút khỏi mơi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ, nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể. Giá thể được chọn ra từ những kết quả nghiên cứu giá thể để bố trí thí nghiệm. Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm Số lượng cây con/ khay: 100 cây Độ Nm giá thể: 70 – 80% Độ Nm khơng khí: 90 – 95% Nhiệt độ nuơi trồng: 20-25oC Ánh sáng: Độ che sáng > 70% Số lần tưới/ngày: 3-5 lần Bĩn phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha lỗng cĩ EC thay đổi từ 0; 0.5; 1.0 và 1.5ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ tuần đầu tiên sau khi mới ra cây) B. Phương pháp áp dụng trên đối tượng hoa cúc Với các giống cúc chúng tơi chọn các giống hoa cúc được trồng khá phổ biến ở Đà Lạt farm hồng, pingpong vàng, nút vàng, nút tìm, tia muỗng vàng. Các giống thu thập cịn lại đều theo một qui trình mẫu tương tự các giống nêu ra ở đây. Trong đề tài chúng tơi sử dụng vật liệu ban đầu là các đế hoa, được lấy từ các vườn sản xuất của bà con nơng dân trong địa bàn thành phố Đà Lạt. Quy trình xử lý mẫu như sau: 33 - Chọn đế hoa từ cây trồng trên vườn. - Rửa bằng xà phịng và rửa lại bằng nước cất nhiều lần, đảm bảo sạch hết xà phịng. - Khử trùng mẫu bằng TTCA với nồng độ 15g/l, trong 10 phút. Trong quá trình khử mẫu luơn lắc đều đặn, nhẹ nhàng để đảm bảo các mẫu được khử trùng đều. - Đưa vào điều kiện vơ trùng để rửa lại nhiều lần bằng nước cất (4-5 lần) , trước khi đưa vào nuơi cấy trong mơi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA đã chuNn bị sẵn. Đế hoa sau khi nuơi cấy 30 ngày, cĩ thể tiếp tục cấy chuyền trong mơi trường nhân nhanh (MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA) để đảm bảo số lượng đỉnh chồi cần thiết cho thí nghiệm. 34 Mơi trường nuơi cấy Mơi trường để nuơi cấy là mơi trường MS (Murashige – Skooge, 1962), bổ sung 30g/l đường, 8g/l agar, chất điều hồ sinh trưởng gồm cĩ: 0.2mg/l IBA, 0.5mg/l BA; và được bổ sung Ribazole ở các nồng độ khác nhau. Mơi trường nuơi cấy được điều chỉnh về pH =5.8 bằng KOH (1N), hoặc HCL (1N). Mơi trường nuơi cấy được đun cho hồ tan các thành phần trước khi khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 30 phút. Sau khi khử trùng, mơi trường được đổ vào bao nilon 500ml, chứa 100ml mơi trường. Bao nilon cũng đã được hấp vơ trùng trong autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 30 phút. Quá trình đổ mơi trường vào bao nilon được tiến hành trong tủ cấy ở điều kiện vơ trùng. Bảng 2.1 :Thành phần cơ bản của mơi trường MS Thành phần Nồng độ (mg/l) Muối khống đa lượng CaCl2.2H2O 440 KH2PO4 170 KNO3 1900 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 1650 Muối khống vi lượng MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 FeSO4.7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 Cu SO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Vitamin và các thành phần hữu cơ Glyxin 2 Myo-inositol 100 Acid nicotinic (Niaxin) 0.5 Thiamin HCl (vitamin B1) 0.1 Pyridoxine HCl (vitamim B6) 0.5 35 Bảng 2.2 :Thành phần cơ bản của mơi trường Knudson C (1946) Ca(NO3)2 * 4 H2O 1000 mg KH2PO4 250 mg MgSO4 * 7 H2O 250 mg (NH4)2SO4 500 mg FeSO4 * 7 H2O 25 mg MnSO4 * 4 H2O 7.5 mg Sucrose 20 g Agar 12-15 g Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hồn tồn. Chọn mẫu cấy ban đầu (đế hoa) cĩ kích thước tương đối đồng đều. Mỗi bao nilon được cấy 9 mẫu, lặp lại 3 lần. Sau khi cấy, các mẫu cấy được bố trí nuơi trong phịng cây, đảm bảo ánh sáng đồng đều với thời gian chiếu sáng 16 giờ. Nhiệt độ trong khoảng 18-250C. Phương pháp lấy chỉ tiêu và xử lý số liệu: Sau thời gian nuơi cấy 30 ngày, chúng tơi tiến hành lấy số liệu gồm các chỉ tiêu về số chồi/cụm chồi; chiều cao chồi (tính từ gốc đến ngọn) để nhận xét về mức độ sinh trưởng và phát triển của cây dưới ảnh hưởng của Ribazole. Số liệu được tính tốn trên phần mềm EXCEL phiên bản 2003, của Microsoft. Gồm cĩ tính các số liệu trung bình trong mỗi nghiệm thức và dùng cơng cụ data analysis để phân tích số liệu bằng bảng ANOVA. Các thí nghiệm - Ảnh hưởng của Ribazole lên sự sinh trưởng phát triển in vitro Các cây in-vitro được nuơi cấy từ đế ban đầu, được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm. Từ các đỉnh chồi tách ra từ cây in-vitro, theo từng giống, sẽ được cấy vào các lơ nghiệm thức khác nhau. Trên mỗi giống, các lơ thí nghiệm bao gồm: Lơ nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4 Nồng độ (mg/l) 0 50 75 100 150 Sau 30 ngày nuơi cấy, các cây sẽ được đo đạc các chỉ tiêu: số chồi/cụm, chiều cao chồi và tỷ lệ sống. Sự phục hồi của cây sau khi xử lý ribazole Các cây sau khi đã xử lý ribazole, chúng tơi tiến hành tách đỉnh chồi, cấy chuyền lại trong mơi trường nhân nhanh bình thường, để kiểm tra sự phục hồi của cúc sau khi xử lý ribazole. 36 Do một số điều kiện khách quan, chúng tơi tiến hành kiểm tra sự phục hồi sau của cây cịn sống ở tất cả các nồng độ đối với ba giống (tia muỗng vàng, farm hồng và pingpong vàng); đối với hai giống cịn lại (nút vàng và nút tím) chúng tơi kiểm tra ở lơ nghiệm thức R2 để so sánh với lơ đối chứng. Các chỉ tiêu quan sát cũng bao gồm: số chồi/cụm, chiều cao chồi và tỷ lệ sống của mẫu cấy. Phương pháp test virus - Đối tượng là các cây hoa địa lan, hoa cúc cĩ triệu chứng nhiễm bệnh virus TMV điển hình theo mơ tả trên và các mẫu cây trong ống nghiệm được sử lý loại virus. - Thời gian: Đợt 1: 5//2006 – 6/2006 Đợt 2: 9/2007 - Địa điểm: + Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thuộc khoa Sinh học- Đại học Đà Lạt + Mẫu vật lấy tại một số vườn trồng Cúc và lan trên địa bàn Phường 8 – Tp Đà Lạt và mẫu ở PNCM khoa Nơng Lâm Bộ kít và máy ELISA - Mondel 680 Microplate Reader S/N/14172 - Kit. name : Full kit 1000 Tests (Bio – rad) Quá trình tiến hành b. Xử lý mẫu Bước 1: Làm sạch mẫu - Rửa mẫu sạch bằng nước
lau qua bằng cồn 700C
ngâm Javen (4%) khoảng 5 phút (chú ý tránh để mẫu bị xây sát nhiều)
Rửa bằng nước cất vơ trùng 3 lần. Dùng giấy thấm vơ trùng thấm khơ. - Cối sứ: ngâm Javen (4%) trong 5 phút
Rửa lại bằng nước cất vơ trùng 3 lần. Bước 2: Tách chiết - Mẫu thực vật: Cân 2 g mẫu lá cho mỗi giống trước khi đem xử lý. - Nghiền mẫu trong cối sứ cĩ chứa dung dịch đệm chiết (lượng đệm chiết tuỳ thuộc vào lượng mẫu). * Cách pha đệm chiết : 1g mẫu : 0,5 ml dịch đệm chiết : 9,5 ml nước cất vơ trùng - Chiết lấy dịch nổi, bảo quản vào ở 2 -80C để dịch chiết lắng cặn. Sau đĩ hút ra 2 ống eppendorf (1ml/ống) - Votext
Ly tâm 4500vịng /phút trong 5’ ở nhiệt độ 60C 37 c. Test ELISA Bước 1: Phủ kháng thể sơ cấp - Đệm phủ (màu xanh) pha trong nước cất với tỷ lệ 1/5 - Kháng thể sơ cấp (Ab1) hịa trong đệm phủ với tỷ lệ 1/100. Vortex trước khi sử dụng. - Nạp vào mỗi giếng 100µl. - Đậy Microplate bằng màng film, tiến hành ủ hỗn hợp trên trong 2 giờ ở 370C. - Rửa 3 lần bằng PBS – Tween được pha sẵn. Quá trình rửa sẽ giúp loại bỏ kháng thể thừa và thấm khơ giếng bằng giấy thấm. Bước 2: Nạp mẫu - Mẫu: + Mẫu dịch chiết (M) được chuNn bị ở phần tách chiết virus. + Chứng dương (+), chứng âm (-) được pha bằng nước cất vơ trùng. + Chứng trắng (0): Nước cất vơ trùng + Đệm cơ chất (khơng màu): pha lỗng theo tỷ lệ 1:19
Vortex trước khi sử dụng - Tiến hành nạp mẫu vào các giếng trong Micrplates - Ủ mẫu ở 2 –80C trong 12 h (giếng được đậy bằng màng film) - Rửa mẫu: sau khi ủ đổ và rảy khơ giếng. Rửa 3 lần bằng PBS- Tween, 2 lần đầu đổ rửa đổ ngay, lần 3 sau 3 phút mới đổ. Sau mỗi lần đổ thấm khơ bằng giấy thấm. Bước 3: Phủ kháng thể thứ cấp - Đệm cộng hợp (màu đỏ) được pha lỗng trong nước cất với tỷ lệ 1/5. - Kháng thể thứ cấp (Ab2) pha lỗng trong đệm cộng hợp với tỷ lệ 1/100. Vortex trước khi sử dụng - Nạp vào mỗi giếng 100µl dung dich trên. - Đậy màng film và ủ trong 2h ở 370C. - Rửa 3 lần bằng PBS – Tween được pha sẵn. Quá trình rửa sẽ giúp loại bỏ kháng thể thừa và thấm khơ giếng bằng giấy thấm Bước 4: Nạp cơ chất - Pha lỗng 2ml đệm cơ chất trong 8ml nước cất tiệt trùng (tỷ lệ 1/5). - Dùng 2 viên cơ chất pha vào dung dịch đệm trên. - Nạp vào mỗi giếng 100µl hỗn hợp trên. - Đậy giếng bằng màng film và ủ ở 370C trong 30’ Bước 5: Đọc kết quả 38 - Sau khi ủ, đưa mẫu vào máy ELISA, đọc kết quả lần thứ nhất. - Đọc kết quả 3 lần, mỗi lần cách nhau 30’. Lần 3 cách lần 2 là 3h. d. Phân tích kết quả từ máy đọc ELISA - Kết quả thí nghiệm ELISA là sạch (âm tính) khi giá trị thu được của mẫu bệnh ≤0.5 giá trị đối chứng sạch bệnh (chứng trắng hoặc nước) - Kết quả ELISA là bị bệnh (dương tính) khi giá trị thu được của mẫu kiểm tra ≥1.5 lần giá trị đối chứng sạch bệnh. - Kết quả thí nghiệm ELISA là nghi ngờ bị bệnh khi giá trị thu được của mẫu kiểm tra lớn hơn giá trị đối chứng sạch bệnh từ 0.5 – 1 lần. * Chú ý: trong báo cáo này, mẫu ghi ngờ bị nhiễm bệnh sẽ bị coi là cĩ bệnh Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel 2003 để phân tích và tổng hợp các số liệu thơ thu thập được từ các thí nghiệm. Dùng phần mềm MSTATC phân tích thống kê các số liệu bằng ANOVA với mức sai số cĩ ý nghĩa là 0.01. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÁC GIỐNG ĐNA LAN CẮT CÀNH 3.1 Kết quả điều tra các lồi địa lan hiện cĩ tại Đà lạt Bảng 3.1. Danh mục các lồi địa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt STT TÊN THƯƠNG MAI STT TÊN THƯƠNG MAI 1 Hồng bệch 20 Tím họng vàng 2 Trắng Balkis 21 Hồng cánh sen 3 Trắng vằn 22 Hồng phấn 4 Trắng lá lúa 23 Tím hột 5 Trắng tím hoa cà 24 Hồng năm nghĩa 6 Trắng bảo trọng 25 Đỏ bà mai 7 Bạch hồng hồng 26 Tím việt quang 8 Trắng neon 27 Đỏ toản 9 Liễu rũ 28 Xanh oliu 10 Vàng da beo 29 Cam lửa 11 BGH 30 Trắng bệt 12 Vàng chùm 31 Xanh lưỡi chấm 13 Vàng Ba Râu 32 Xanh lưỡi đỏ 14 Vàng lụa 33 Xanh ngọc 15 Vàng hải 34 Xanh cánh nhọn 16 Xanh chiểu 35 Vàng rút 17 Miretta xanh 36 Vàng chiêm 18 Vầng trăng 37 Hồng úc 19 Xanh olive 38 Hồng nhật 3.2 Khảo sát mơi trường nhân giống Kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào thực vật hiện nay đã xuất hiện và phát triển ở nhiều phịng thí nghiệm trên khắp thế giới. Nhiều phương pháp nuơi cấy đã được áp dụng nhằm mục đích nhân giống cây trồng, bảo tồn nguồn gen quý, lai tạo, đa dạng hố các kiểu di truyền thực vật. Phương pháp nhân giống vơ tính in vitro được sử dụng trong đề tài để nghiên cứu ảnh hưởng của khống, vitamin, và chất điều hồ sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng của ba giống địa lan: Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh. Nhu cầu dinh dưỡng, điều kiện lý hố với mỗi đối tượng thực vật khác nhau là khơng giống nhau. Do đĩ khơng thể áp dụng quy trình nhân giống của đối tượng này lên đối tượng khác. Khi nghiên cứu trên ba giống địa lan nĩi trên, việc tìm ra phương pháp vơ trùng mẫu cấy, mơi trường nuơi cấy thuận lợi cho sự tái sinh chồi, sự tăng trưởng về kích thước, trọng lượng, chiều cao cũng như sự phân hố của các cơ quan gĩp phần xây dựng quy trính nhân ba giống địa lan nĩi trên. 40 Thơng qua việc bố trí 4 thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của mơi trường nhân giống in vitro lên sự phát triển của địa lan, chúng tơi thu được kết quả sau. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của mơi trường lên quá trình phát sinh chồi Để khảo sát các protocorme được nuơi cấy trong các mơi trường cĩ hàm lượng khống khác nhau, mơi trường MS, 1/2MS và mơi trường Knudson C, kết quả sau 2 tháng nuơi cấy chúng tơi ghi nhận kết quả trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mơi trường lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh Đối tượng Mơi trường Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt MS 20 1/2MS 12 Knudson C 16 Tím hột MS 19 1/2MS 12 Knudson C 16 Miretta xanh MS 20 1/2MS 10 Knudson C 11 Trong thí nghiệm này chúng tơi khảo sát từng loại mơi trường cĩ ảnh hưởng như thế nào để số lượng chồi trên từng loại giống. Theo kết quả ở bảng 1, biểu đồ 1 và biểu đồ 2 chúng tơi thấy rằng: Với loại mơi trường ½ MS thì cả ba giống đều cho số lượng chồi khơng cao, chúng rất hạn chế trong sự phát sinh protocorme nhưng cịn đối với loại mơi trường Knudson C thì số lượng chồi cĩ phát triển nhiều hơn so với mơi trường ½ MS số lượng protocom phát sinh đáng kể nhưng protocom cĩ nhiều lơng hút. Cịn loại mơi trường MS thì lại là khả thi nhất loại mơi trường này cho số lượng protocom nhiều nhất, ít lơng hút và protocom phát triển đều hơn, sinh trưởng mạnh hơn. Do vậy, chúng tơi sử dụng mơi trường MS làm mơi trường cơ bản trong quá trình nhân nhanh Cymbidium. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình phát sinh chồi của Lan Cymbidium Than hoạt tính khơng phải là chất kích thích sinh trưởng nhưng khi bổ sung vào mơi trường nuơi cấy sẽ cĩ lợi ích và tác dụng khử độc trong mơi trường, đặc biệt là với các cây họ lan đặc biệt là nĩ cĩ vai trị quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Việc hấp thu các chất ức chế trong mơi trường nuơi cấy hoặc từ mơ cấy tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của Cymbidium sp.. Ngồi ra những nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng quá trình thúc đNy cơ quan biệt hĩa tạo rễ cũng chịu ảnh hưởng của than hoạt tính. Kết quả nghiên cứu trên ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh sau 60 ngày cấy được thể hiện ở bảng 3.3. 41 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh. Đối tượng Hàm lượng than (g/l) Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt 0 11 0.5 13 1 21 1.5 22 2 19 Tím hột 0 11 0.5 12 1 18 1.5 15 2 2 Miretta xanh 0 8 0.5 8 1 18 1.5 10 2 11 Ở thí nghiệm này chúng tơi quan sát sự ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình phát sinh chồi cho thấy: Với mơi trường MS khơng bổ sung than hoạt tính thì số lượng chồi khơng nhiều, hình thái cây sinh trưởng rất kém: cây, rễ cĩ phát triển nhưng lại cịn rất nhỏ nên chúng sẽ bị ảnh hưởng trong quá trình sinh trưởng và phát triển ở giai đoạn ex-vitro. Mơi truờng MS cĩ bổ sung 0.5 g/l than hoạt tính thì cũng như mơi trường MS khơng bổ sung than hoạt tính số lượng protocorme cịn rất thấp, nhưng hình thái cĩ thay đổi hơn là cây cĩ phát triển, rễ cũng phát triển rất mạnh. Như vậy thì với nghiệm thức này thì chủ yếu là rễ phát triển chứ chưa cĩ sự phân chia mạnh để tạo lượng protocorme thích hợp. Cịn mơi trường MS cĩ bổ sung 1.5 g/l than hoạt tính và 2g/l than hoạt tính thì lượng protocorme tạo ra nhiều hơn 2 nghiệm thức vừa nĩi trên nhưng cây tạo ra cũng chưa nhiều lắm và protocorme cũng khơng đơng đều. Với mơi trường MS cĩ bổ sung 1 g/l than hoạt tính thì lượng protocorme tạo ra nhiều và vượt trội hẳn các nghiệm thức trên, cây, rễ phát triển mạnh và rất đều. Qua thí nghiệm này chúng tơi thấy than hoạt tính cũng gĩp phần vào sự phân chia tế bào để tạo ra số lượng protocorme thích hợp, để gĩp phần nhân nhanh Cymbidium ứng với một lượng nhất định. 42 Thí nghiệm 3: Sự ảnh hưởng của các nồng độ BA đến quá trình phát sinh chồi BA là một chất điều tiết sinh trưởng nhân tạo thuộc nhĩm Cytokinin, là nhĩm được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật nuơi cấy mơ hiện nay. Tác dụng chủ yếu của nĩ là kích thích sự phân chia tế bào, thúc đNy sự hoạt động của chồi bên. Nồng độ sử dụng khác nhau tuỳ đối tượng thực vật nuơi cấy, chẳng hạn ở nồng độ 22µM thích hợp với sự phát triển chồi ở Cymbidium aloifolium, nhưng đối với Dendrobium aphyllum và Dendrobium moschatum nồng độ thích hợp nhất cho sự phát triến của chồi là 44µM (N.R.Nayak và cộng sự, 1997). Để tìm nồng độ phù hợp của BA lên sự tạo protocorm của các giống Cymbidium sp. trong thí nghiệm này chúng tơi bố trí 5 nồng độ khác nhau: 0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2 mg/l. Sau 12 tuần nuơi cấy, chúng tơi quan sát và ghi nhận được kết quả ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh Đối tượng Hàm lượng than (g/l) Nồng độ BA (ml/l) Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt 1 0 8 1 0.5 10 1 1 20 1 1.5 14 1 2 12 Tím hột 1 0 10 1 0.5 13 1 1 28 1 1.5 16 1 2 16 Miretta xanh 1 0 6 1 0.5 7 1 1 20 1 1.5 14 1 2 9 Với thí nghiệm này thì giống Tím hột là lồi thích hợp nhất cho sự tạo chồi, đạt tới 41,5% nhưng số cây hồn chỉnh thì lại rất ít, cịn Trắng bệt và Miretta xanh thì cả 2 lồi này chiếm tỉ lệ ít hơn nhưng lại vừa tạo protocorm vừa tạo cây, Trắng bệt chiếm 31,7% cịn Miretta xanh chiếm khoảng 26,8%. Với MS + 1g/l than hoạt tính và khơng bổ sung BA và mơi trường MS + 1 g/l tan hoạt tính + 0,5ml/l, với 2 nghiệm thức này thì sự thích nghi của các protocorme cịn rất kém, chứng tỏ đây khơng phải là nồng thích hợp chĩ các protocorme của Địa Lan phát triển. Tại mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 2ml/l BA thí các protocorm phát triển cũng khơng nhiều, tạo cây và rễ lại cịn phát triển rất mạnh. Ở mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1,5ml/l BA thì số lượng protocorm cĩ phát triển hơn nhưng cũng 43 chủ yếu là tạo cây và rễ. Nen đây cũng chưa là mơi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh ở cây Địa Lan. Mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1ml/l BA lại cho số lượng protocorm là nhiều nhất, một số tạo cây, rễ và một số khác tạo protocorme cũng mạnh , đều. Do đĩ mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1ml/l BA là mơi trường thích hợp để tiếp tục phục vụ cho quá trình nhân nhanh ở cây Địa Lan. Thí nghiệm 4: Sự ảnh hưởng BA + NAA đến quá trình hình thành chồi Thí nghiệm này được thực hiện bởi các protocorme nuơi cấy trong mơi trường MS, cĩ than hoạt tính là 1g/l, nồng độ BA là 1ml/l và cĩ bổ sung thêm các nồng độ NAA khác nhau. Sau 2 tháng nuơi cấy, quan sát, ghi nhận được kết quả như ở bảng 3.5 sau: Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA + NAA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh Ngược lại với thí nghiệm 3: Miretta xanh nhường như khơng thích hợp với các nồng độ của BA nhưng khi phối hợp với NAA thí các protocorme của Miretta xanh lại phát triển rất tốt, tốt hơn cả Trắng bệt và Tím hột, chiếm tới 41,5% so với tỉ lệ chồi. Với sự nghiên cứu của các chất điều hịa sinh trưởng thì Trắng bệt là lồi ổn định nhất , với thí nghiệm ảnh hưởng của BA thì Trắng bệt chiếm 31,7% cịn ở thí nghiệm ản hưởng của sự phối hợp của BA + NAA cũng chiếm với tỉ lệ tương đương là 32,7%. Điều này cho ta thấy được đối với chất điều hịa sinh trưởng như BA hay NAA thì các protocorme của Trắng bệt đều phát triển. Tím hột với thí nghiệm này chỉ chiếm 26,8%. Qua thí nghiệm này ta thấy được sự thích hợp của các lồi khác nhau ứng với từng chất điều hịa sinh trưởng là khác nhau. Đối tượng BA (mg/l) NAA (mg/l) Tỉ lệ chồi hình thành (%) Trắng bệt 1 0 11 1 0.5 15 1 1 22 1 1.5 16 1 2 17 Tím hột 1 0 9 1 0.5 11 1 1 17 1 1.5 12 1 2 12 Miretta xanh 1 0 12 1 0.5 21 1 1 27 1 1.5 23 1 2 24 44 Nồng độ BA + NAA 1: 0ml/l ở mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính thì lượng protocorm tạo ra là kém, ở nồng độ BA + NAA 1: 0,5ml/l protocorme cĩ phát triển hơn BA + NAA 1: 0ml/l nhưng cũng khơng đáng kể, cũng cĩn hạn chế về lượng protocorme. Ở nồng độ BA + NAA 1:1,5ml/l và nồng độ BA + NAA 1: 2ml/l thì vừa tạo protocorm lại vừa tạo cây. Ở 2 nồng độ này lượng protocorm tạo ra khơng hơn kém nhau bao nhiêu. Cịn ở nồng độ BA + NAA 1:1ml/l hầu hết các lồi là thích hợp, số lượng protocorme là cao nhất, một số tạo cây, rễ. 3.3. Khảo sát tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của protocorm Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm mới của ba giống địa lan tím hột, Trắng bệt và Mire