Đề tài Đánh giá khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học do các chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tàu và ảnh hưởng của chúng lên khả năng phân huỷ dầu

MỞ ĐẦU Công nghiệp dầu khí là một trong những ngành công nghiệp quan trọng, đem lại lợi ích vô cùng lớn cho nền kinh tế quốc dân. Nguồn nguyên liệu dầu khí tạo ra rất nhiều sản phẩm phục vụ cho hầu hết các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, đời sống xã hội, an ninh quốc phòng… Bất kì một nước nào sở hữu nguồn tài nguyên quý giá này đều có tiềm năng phát triển kinh tế vượt trội, vì vậy nó không ngừng được tìm kiếm, khai thác và với quy mô ngày càng tăng. Đặc biệt với một nước đang phát triển như nước ta thì vai trò của nó lại càng quan trọng. Hiện Việt Nam là nước khai thác dầu đứng thứ 3 Đông Nam Á, tấn dầu đầu tiên được khai thác vào năm 1986 tại Vũng Tàu, tính đến năm 2004 đã khai thác được tấn dầu thứ 140 triệu tấn, hàng năm đem lại một phần ba nguồn ngân sách quốc gia. Hoạt động thăm dò khai thác dầu khí diễn ra hết sức sôi nổi ở thềm lục địa phía Nam và đang có xu hướng chuyển sang miền Bắc như ở Thái Bình, Hải Phòng. Bên cạnh những mặt tích cực đó, hoạt động khai thác càng mạnh mẽ cũng đồng nghĩa với việc thải ra môi trường càng nhiều phế thải và tình trạng ô nhiễm lại trầm trọng thêm. Trong ngành công nghiệp dầu khí, mùn khoan là một nguồn chất thải vô cùng lớn và có nguy cơ gây ô nhiễm rất cao, đặc biệt là khi sử dụng các dung dịch khoan gốc dầu. Nó được tạo ra khi tiến hành khoan thăm dò và phát triển mỏ, gồm hỗn hợp đất đá cùng với các hoá chất trong dung dịch khoan lẫn vào. Khi quá trình khoan sử dụng dung dịch gốc dầu thì tình trạng ô nhiễm càng lớn. Về nguyên tắc nguồn phế thải này phải được đem vào bờ xử lí, tuy nhiên việc xử lí chúng rất khó khăn và tốn kém nên các nhà thầu thường sao lãng. Hiện tại trong ngành công nghiệp dầu khí nước ta chỉ mới áp dụng các biện pháp hoá lí thông thường để làm giảm tác hại, mà không xử lí triệt để rồi thải vào môi trường. Vấn đề đặt ra cho các nhà môi trường là phải xử lí chúng, phương án giải quyết phải đảm bảo sao cho vừa hiệu quả, đơn giản mà lại kinh tế. Do đó mà phương pháp sinh học đang được chú ý bởi các ưu điểm vượt trội của nó so với các phương pháp hoá lí như: an toàn với môi trường, đơn giản, xử lí triệt để mà giá thành lại rẻ. Một trong các phương pháp xử lí sinh học đem lại hiệu quả cao đó là sử dụng các chất hoạt hoá bề mặt do các vi sinh vật tạo ra. Chất hoạt hoá bề mặt sinh học là một hợp chất lưỡng cực cho phép hoà tan các chất không tan vào trong nước, chúng dễ bị phân huỷ sinh học lại không độc thêm vào đó nó có thể sản xuất từ các nguồn cơ chất phế thải của các ngành công nghiệp khác giá thành hạ lại giải quyết được tình trạng ô nhiễm do các nguồn phế thải này sinh ra. Để xử lí mùn khoan, CHHBM tỏ ra rất có triển vọng. Ở Việt Nam, mới chỉ có một số ít các công trình nghiên cứu vế chất hoạt hoá bề mặt sinh học, hướng nghiên cứu và ứng dụng chúng còn rất mới mẻ. Xuất phát từ những yêu cầu thực tế đặt ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá khả năng tạo CHHBMSH do các chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tàu và ảnh hưởng của chúng lên khả năng phân huỷ dầu”. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG DUNG DỊCH KHOAN VÀ VẤN ĐỀ XỬ LÍ MÙN KHOAN DẦU KHÍ HIỆN NAY 1.1. Tình hình sử dụng dung dịch khoan Trong ngành công nghiệp khai thác dầu khí, khi tiến hành khoan mỏ để bôi trơn mũi khoan, vận chuyển mùn khoan từ đáy giếng lên trên bề mặt, giữ áp suất vỉa ổn định để ngăn hiện tượng phun trào, bảo vệ thành giếng khỏi sạt lở, bôi trơn chòng khoan, cần khoan người ta luôn phải sử dụng dung dịch khoan (DDK). DDK là một hệ dung dịch bao gồm hỗn hợp các chất điều chỉnh độ nhớt, chất tạo nhũ, chất phân tán, chất diệt khuẩn, chất phụ gia, NaCl, CaCl2, vôi, sét, BaSO4, chất chống mất nước... nhằm tạo các đặc tính mong muốn cho DDK. Khi chúng được pha với nước gọi là DDK gốc nước, hoặc pha với dầu gọi là DDK gốc dầu. Hàm lượng dầu gốc trong DDK thường chứa trên 70%. So với DDK gốc nước thì DDK gốc dầu đắt và độc hại hơn, nhưng chúng có những đặc tính hơn hẳn như: ổn định được nhiệt độ cao, chống sạt lở tốt, khả năng giữ dung dịch tốt... Khi tiến hành khoan sâu, khoan nghiêng để đảm bảo thành công người ta luôn sử dung dịch khoan gốc dầu. Dầu gốc của các dung dịch khoan đầu tiên thường là dầu diezen hay dầu thô. Do gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường mà hiện nay xu hướng sử dụng các loại dầu gốc có độ độc thấp như dầu khoáng, dầu thực vật hay dầu tổng hợp có độ độc thấp. Dầu khoáng được sản xuất từ dầu thô đã được loại bỏ các hợp chất độc hại như các hợp chất thơm, dị vòng nên độ độc thấp hơn dầu thô. Dầu thực vật có độ nhớt cao nên thường sử dụng các dẫn xuất của nó có độ nhớt thấp hơn, ưu điểm của nó là có khả năng phân huỷ sinh học tốt hơn dầu thô nên ít ảnh hưởng tới môi trường hơn. Dầu tổng hợp có độ độc thấp, dễ phân huỷ sinh học, giá thành lại rẻ hơn dầu thực vật nên được sử dụng rộng dãi [5]. Hiện nay ở trên thế giới và ở Việt Nam, một số nhà thầu đã sử dụng DDK gốc dầu tổng hợp saraline có độ độc thấp. Saraline được sản xuất từ dầu khoáng loại bỏ các hợp chất thơm dị vòng độc hại, nó không chứa các hợp chất thơm đa vòng vốn là một hợp chất rất độc hại cho môi trường, thành phần chính của nó là các ankan mạch thẳng từ C12 đếnC25. Tuy các dầu gốc đã được xử lí loại bỏ các thành phần độc hại, chúng vẫn gây tác động lớn tới môi trường sinh thái và sức khoẻ con người. Các dầu gốc chứa các thành phần hydrocacbon, các thành phần này nếu tích tụ ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của sinh vật. Trong môi trường nước nó tạo lớp váng trên bề mặt ngăn cản sự hoà tan oxy vào trong nước, sự trao đổi nhiệt giữa khí quyển và thuỷ quyển, không cho ánh sáng đi vào nước từ đó ảnh hưởng tới nguồn thức ăn, dinh dưỡng, hô hấp của sinh vật, tới các loại ấu trùng... Đối với môi trường đất, dầu đẩy nước và không khí ra ngoài làm cho đất mất khả năng hấp thụ và trao đổi, ngăn cản quá trình trao đổi chất của hệ vi sinh vật trong đất. Đối với con người, nó ảnh hưởng thông qua môi trường nước, không khí, nó đi vào trong lưới thức ăn, gây tác động tới hệ tiêu hoá, hệ bài tiết, hệ hô hấp, hệ thần kinh. Cụ thể như dầu saraline, đã có những công bố về tác hại gây bệnh viêm phổi của loại dầu này [21]. 1.2. Vấn đề xử lí mùn khoan dầu khí hiện nay 1.2.1. Mùn khoan Mùn khoan là sản phẩm phế thải của ngành công nghiệp dầu khí, gồm hỗn hợp của các loại đất đá bị vỡ vụn ra khi tiếp xúc với mũi khoan và được vận chuyển lên trên mặt đất thông qua quá trình tuần hoàn của dung dịch khoan. Hệ dung dịch khoan được bơm vào bên trong ống khoan, độ nhớt và vận tốc tuần hoàn duy trì mùn khoan ở trạng thái huyền phù, thông qua không gian giữa thành ống khoan và thành lỗ khoan nó vận chuyển mùn khoan lên trên mặt, tại đó nó tách khỏi mùn khoan và lại tuần hoàn trở lại giếng khoan. Do đó, ngoài đất đá, mùn khoan còn lẫn các hoá chất trong DDK. Đối với quá trình sử dụng DDK gốc dầu thì mùn khoan thấm đầy dầu. Mùn khoan được tạo ra từ hoạt động khoan thăm dò và phát triển mỏ. Khối lượng mùn khoan phụ thuộc vào đường kính giếng, tốc độ khoan và chiều dài của mỗi công đoạn khoan. Trong quá trình khoan thăm dò, lượng mùn khoan tạo ra ít, khi đưa lên mặt đất, mùn khoan được rửa sạch, một phần giữ lại nghiên cứu, theo quy chế mùn khoan loại bỏ phải đưa vào bờ chôn, nước rửa mùn khoan phải được xử lí sạch. Tuy nhiên, các quy định này rất khó thực hiện đồng thời gây tốn kém nên các nhà thầu thường trốn tránh trách nhiệm. Giai đoạn khoan phát triển mỏ, số lượng giếng khoan nhiều cộng với lượng mùn khoan ở mỗi giếng rất lớn, khoan khai thác thường không lấy mẫu nên lượng mùn lại vô cùng lớn. Chỉ tính riêng ở mỏ Bạch Hổ, trung bình khoan một giếng sâu 4000m tạo ra khoảng 350 m3 (900 tấn) mùn khoan. Nếu duy trì tỉ lệ dầu 70% trong DDK gốc dầu thì mùn khoan thải ra có hàm lượng dầu vô cùng lớn. 1.2.2. Tác hại của mùn khoan nhiễm dầu Với đặc thù là một sản phẩm phế thải nhiễm dầu, có số lượng rất lớn, mùn khoan đã và đang gây những tác hại không nhỏ. Khi thải ra ngoài biển mùn khoan nhiễm dầu làm thay đổi môi trường sống của các sinh vật đáy, riêng các chất độc hại trong mùn khoan sẽ xâm nhập vào trong thức ăn, tác động tới quá trình trao đổi chất, có thể giết chết hoặc gây biến dạng giống loài, làm thay đổi hệ sinh thái biển, ảnh hưởng ô nhiễm dễ lan rộng đặc biệt là ở khu vực có dòng hải lưu. Tại đất liền việc chất đống mùn khoan hay làm vật liệu chôn lấp hố, ao hồ chiếm diện tích lớn, làm thay đổi địa hình và sau đó khi cần dùng diện tích thì phải tốn kém chi phí bốc dỡ, không những thế nó còn làm ô nhiễm nguồn nước, không khí qua đó ảnh hưởng tới sức khoẻ của con người [5]. 1.2.3. Tình hình xử lí mùn khoan nhiễm dầu Hiện nay ở nước ta và nhiều nước trên thế giới, việc xử lí mùn khoan chỉ mới áp dụng các biện pháp hoá lí nhằm giảm thiểu lượng dầu bám dính trên mùn khoan trước khi thải xuống biển, hoặc vận chuyển vào bờ để lấp các địa điểm tạo bề mặt xây dung hay xử lí thành các nguyên vật liệu xây dựng như ở Thái Lan, Malayxia, Tây Âu. Các nước phát triển ở trình độ thấp thì chưa quan tâm tới môi trường thường chấp nhận một khoản phí bồi thường rồi cho phép đổ tuỳ tiện các chất thải [5]. Nước ta hiện này cũng áp dụng một số các biện pháp để giảm tác động của mùn khoan đối với nguồn lợi thuỷ hải sản và môi trường biển: - Sử dụng sàng rung lưới và các thiết bị li tâm hiệu quả cao trên giàn khoan để giảm thiểu tối đa hàm lượng dầu bám dính trên mùn khoan đến dưới 10%. - Thực hiện chương trình giám sát môi trường tại các khu vực lân cận của giếng khoan để đánh giá tình trạng thay đổi môi trường. - Nghiên cứu độ độc của các loại dầu tổng hợp đối với sinh vật. Tuy nhiên, các biện pháp trên không giải quyết được vấn đề triệt để, môi trường sinh thái vẫn bị tác động lớn. 2. PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC TRONG XỬ LÍ Ô NHIỄM DẦU 2.1. Vai trò của vi sinh vật trong xử lí ô nhiễm dầu 2.1.1. Hệ vi sinh vật trong mùn khoan dầu khí Như đã nói ở trên, mùn khoan là hỗn hợp các loại đất đá ở trong lòng đất chuyển lên. Mùn khoan chứa một phần các phụ gia trong dung dịch khoan, phần dầu (đối với DDK gốc dầu), nước trong lòng đất và khu hệ vi sinh vật ở trong giếng khoan. Các chất thường sử dụng trong dung dịch khoan là: tinh bột, cacbonoxymetylcellulo, lignosulfonat, các loại gum tự nhiên, dầu nhũ hoá, dầu gốc...[23]. Các chất này đã được nhiều nhà khoa học chứng minh là có khả năng bị phân huỷ bởi các vi sinh vật: Bacillus subtilis, Pseudomonas sp., các vi khuẩn khử sunphat như Desulfovibrio desulfuricans [15]... Mặc dù trong mùn khoan thường bổ sung các chất diệt khuẩn nhưng khả năng bị tấn công bởi vi sinh vật của các chất kể trên vẫn rất cao. Việc có mặt nước ở trong mùn khoan càng làm tăng khả năng phân huỷ dầu của vi sinh vật. Smirnova đã chứng minh có nhiều loại vi khuẩn bao gồm cả các loại oxy hoá hydrocacbon có mặt trong DDK [15]. Do mỗi vùng địa lí có khu hệ vi sinh vật khác nhau nên các mẫu mùn khoan lấy ở các địa điểm khác nhau có khu hệ vi sinh vật đặc trưng cũng khác nhau. Hệ vi sinh vật trong mùn khoan là cơ sở cho các biện pháp xử lí dầu bằng biện pháp sinh học. 2.1.2. Cơ chế phân huỷ các hydrocacbon Cơ chế phân huỷ các hydrocacbon của vi sinh vật đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu. Vi sinh vật sử dụng hydrocacbon làm nguồn dinh dưỡng và năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển. Việc sử dụng các hydrocacbon của vi sinh vật có thể xảy ra theo hai hướng: - Đối với một số các hydrocacbon tan trong nước, vi sinh vật có thể hấp thụ trực tiếp. - Với các hydrocacbon khó tan mà có thể tan dưới dạng nhũ tương dầu -nước thì quá trình phân huỷ vi sinh theo trình tự các bước: đầu tiên là hoà tan các hydrocacbon dưới dạng nhũ tương dầu nước bằng cách tiết ra các chất hoạt hoá bề mặt sinh học, sau đó vi sinh vật tiếp xúc với dầu, cuối cùng nó tiết ra các enzyme để chuyển hoá các hydrocacbon thành các chất mà nó có thể sử dụng được. Nhìn chung các hydrocacbon khác nhau bị phân huỷ bởi nhiều loại vi khuẩn và bằng nhiều con đường khác nhau. 2.1.2.1. Cơ chế phân huỷ các ankan Khả năng phân huỷ của các ankan phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của chúng. Thông thường các hydrocacbon bậc 1 và bậc 2 dễ phân huỷ hơn các hydrocacbon bậc 3 và 4. a. Cơ chế phân huỷ các n-ankan: Quá trình phân huỷ ankan được khơi mào nhờ enzym mono-oxygenaza và di-oxygenaza. Quá trình này đòi hỏi có sự tham gia của một phân tử oxy và chất cho điện tử NADPH2. Các giai đoạn oxy hoá ankan: * Giai đoạn 1: Tạo thành rượu, xảy ra qua 2 bước Tạo thành hợp chất peoxyt R- CH2- CH3 + O2 —> R- CH2- CH2- OOH Hợp chất peoxyt không bền dưới tác dụng của NADPH2 tạo thành rượu và nước: R- CH2- CH2- OOH + NADPH2 —> RCH2- CH2- OH + H2O + NADP (2) Từ ankan chuyển thành rượu có hai khả năng xảy ra: Tạo thành rượu bậc 1: xảy ra khi nhóm OH gắn vào C bậc 1 (2) Tạo thành rượu bậc hai: khi nhóm OH gắn với C bậc 2: R-CH2-CH2 - OOH + O2 + NADPH2 —> R- CH- CH2 + H2O + NADP | OH * Giai đoạn 2: Rượu bậc 1 tạo thành andehit R- CH2 - CH2 - OH +1/2 O2 —> R- CH2 - CHO + H2O Rượu bậc 2 tạo thành xeton: R - CH - CH3 + 1/2 O2 —> R – CH - CH3 +H2O | || OH O * Giai đoạn 3: tạo thành axit béo: - Các xeton bị oxy hoá tạo thành este, liên kết este bị phá vỡ tạo ra một axit và rượu bậc một, rượu bậc 1 lại bị oxy hoá thành andehit rồi axit béo: R- CH2- C- CH3 —>R- CH2-O- C - CH3 —>R- CH2 - OH + CH3 - COOH || || O O - Các andehit bị oxy hoá thành axit béo: R - CH 2- CHO +1/2 O2 —>R - CH2 - COOH Có trường hợp sự oxy hoá xảy ra ở cả hai đầu của ankan tạo thành các diol, các dicacbonxylic. * Giai đoạn 4: các axit béo bị oxy hoá tiếp nhờ tru trình õ - oxy hoá. Axit béo mạch dài dưới tác dụng của một loại enzym chuyển sang dạng acetyl coenzym A và chuyển hoá tiếp dưới tác dụng của nhiều enzym khác. Kết quả là sau mỗi chu kì chuyển hoá, một nhóm acetyl CoA bị cắt ra và phân tử axit béo bị cắt đi hai nguyên tử cacbon. Sản phẩm cuối cùng của chu trình õ – oxy hoá là CO2 và nước. b. Cơ chế phân huỷ các alkan mạch nhánh: Do cản trở về mặt không gian nên khả năng phân huỷ của chúng kém hơn n-ankan. Theo Atlas, các vi sinh vật phân huỷ ưu tiên C bậc1 và bậc 2, còn C bậc 3 và 4 thì khó phân huỷ hơn. Ankan có nhóm metyl ở dầu mạch khó phân huỷ hơn ở giữa mạch. Ankan có mạch nhánh dài dễ bị phân huỷ hơn ankan có mạch nhánh ngắn. Trong quá trình nghiên cứu sự phân huỷ các ankan mạch nhánh, người ta đề xuất biến dạng của chu trình TCA là chu trình Metylcitrat, thay vào vị trí của axit citric là metylcitrat. c. Cơ chế phân huỷ các cycloankan: Cycloankan là cấu tử chính của dầu thô. Khơi mào cho sự phân huỷ cycloankan cũng là các enzym monooxygenaza và oxygenaza. Dưới tác dụng của các enzym này, các cycloankan bị phân huỷ thành các cycloankanol. Theo các tác giả, khả năng phân huỷ của cyclohexan là mạnh nhất trong dãy đồng đẳng cycloankan. Cùng vòng cycloankan chất nào có mạch nhánh dài hơn thì sẽ dễ phân huỷ hơn. Khi phân huỷ cyclohexan, quá trình hydroxyl hoá được xúc tác bởi enzym oxydaza chức năng tạo ra một rượu mạch vòng. Rượu mạch vòng sẽ bị dehydro hoá để tạo ra xeton, xeton bị oxy hoá tiếp thành lacton. Lacton sẽ bị thuỷ phân, nhóm hydroxyl bị oxy hoá thành một nhóm andehit và một nhóm cacboxyl. Kết quả là axit dicacboxylic bị biến đổi tiếp nhờ chu trình õ - oxy hoá. Các vi sinh vật có khả năng phát triển trên cyclohexan phải thực hiện tất cả các phản ứng trên. Tuy nhiên ta thường gặp hơn các vi sinh vật có khả năng chuyển cyclohexan thành rượu mạch vòng nhưng không có khả năng lacton hoá và mỏ mạch vòng. Do vậy cơ chế cộng sinh và cùng trao đổi chất (co- metabolism) đóng một vai trò rất quan trọng trong phân huỷ sinh học các hợp chất hydrocacbon mạch vòng. 2.1.2.2. Cơ chế phân huỷ hydrocacbon thơm a. Benzen Xúc tác ban đầu cho quá trình oxy hoá benzen là enzym dioxygenaza, tức là phân tử oxy sẽ gắn trực tiếp vào cacbon của vòng thơm. b. Naphtalen Xúc tác đầu tiên là enzym oxygenaza, gắn phân tử oxy vào phân tử naphtalen để tạo thành cis-1,2 dihydroxyl 1,2 dihydro naphtalen, sau đó tách nước để thành 1,2-dihydroxynaphtalen. Tại đây, vòng bị cắt để tạo thành cis-o-hdroxyl benzan pyruvic axit, sau đó tiếp tục bị oxy hoá tạo thành salicyandehyd, salicylic axít và catechol, tiếp đó cắt các vòng khác theo hướng -octhor hay -metha phụ thuộc vào chủng vi khuẩn. Cũng có trường hợp xúc tác để oxy hoá naphtanen là enzym monooxygenaza, tức là một nguyên tử của phân tử oxy sẽ gẵn vào vòng naphthalen và cuối cùng cho ta cis-1,2-dihydroxyl 1,2 -dihydronaphtalen. Nấm mốc là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế về chủng loại có khả năng phân huỷ naphtalen. Như vậy, naphtalen dần dần sẽ bị chuyển hoá thành phân tử có khối lượng bé hơn nhờ vi sinh vật, làm cho dầu nặng trở thành dầu nhẹ hơn, và độ nhớt của dầu sẽ giảm đi. 2.2. Cỏc yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phõn huỷ dầu của vi sinh vật Sự phỏt triển của vi sinh vật phõn huỷ dầu phụ thuộc rất lớn vào cỏc nguồn cơ chất và cỏc điều kiện của mụi trường sống: nhiệt độ, pH, ỏp suất. Trong tự nhiờn, sự tồn tại của cỏc vi sinh vật cú khả năng sử dụng hydrocacbon rất đa dạng. Chỳng cú thể sống được ở những nơi cú điều kiện rất khắc nghiệt như trong giếng khoan cú độ sõu hàng nghỡn một với ỏp suất từ 200 – 400 atm và nhiệt độ lớn hơn 1000C. Mặt khỏc chỳng cú thể sống ở cỏc vựng ven biển, nơi mà hàng giờ cú sự thay đổi lớn về độ muối và nhiệt độ do tỏc động của súng và thuỷ triều. Do đú sự tồn tại và phỏt triển của vi sinh vật cú khả năng sử dụng hydrocacbon trong dải nhiệt độ và ỏp suất khỏ lớn. Đa số cỏc vi sinh vật phự hợp với nhiệt độ từ 25 – 300C và ỏp suất 1 atm [4]. Một nhõn tố mụi trường nữa tỏc động tới sự phõn bố và phỏt triển của vi sinh vật là pH. Đa số cỏc vi sinh vật sống ở mụi trường cú pH trung tớnh hoặc kiềm yếu. Khớ hậu cũng ảnh hưởng lớn đến sự phỏt triển của vi sinh vật. Nước ta cú khớ hậu nhiệt đới giú mựa. Mựa hố, nhiệt độ cao và độ ẩm lớn tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phỏt triển. Mựa đụng, nhiệt độ và độ ẩm giảm thỡ khả năng phỏt triển của vi sinh vật cũng yếu đi. Bờn cạnh đú, sự phỏt triển của vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào thành phần muối khoỏng trong mụi trường. Sự phỏt triển của vi sinh vật sử dụng dầu ở vựng thềm lục địa phong phỳ và đa dạng hơn ở đại dương. Trong cỏc nguyờn tố dinh dưỡng khoỏng N và P là hai nguyờn tố chớnh ảnh hưởng tới khả năng sử dụng hydrocacbon của vi sinh vật. Tại nhiều vựng ụ nhiễm dầu, người ta đó dựng nhiều phõn vụ cơ tổng hợp N, P, K rải xuống nơi ụ nhiễm nhằm kớch thớch sự phỏt triển của vi sinh vật [4]. Cỏc vi sinh vật khỏc nhau sử dụng các hyrocacbon khác nhau. Trong cỏc hydrocacbon, hydrocacbon no và hydrocacbon thơm bị phân huỷ nhiều nhất tốt nhất. Các đặc tính của mùn khoan có ảnh hưởng tới khả năng phân huỷ của vi sinh vật. Mùn khoan là một chất thấm đậm DDK - là một dung dịch kiềm tính cao, cho nên mùn khoan thường rất kiềm. Mùn khoan là một hỗn hợp rắn, chứa các chất kìm hãm vi sinh cho nên lượng O2 trong mùn khoan rất ít và khả năng sinh sống của vi sinh vật trong đó không thuận lợi. Điều này đã gây nên những khó khăn nhất định trong việc xử lí chúng. Vì vậy hướng sử dụng chính vi sinh vật phân lập từ mùn khoan và việc dùng CHHBMSH để kích hoạt quá trình phân huỷ của chính tập đoàn vi sinh vật trong mùn khoan đảm bảo khả năng thành công. 2.3. Các phương thức xử lí sinh học * Đánh giá mức độ ô nhiễm dầu: trong tự nhiên ô nhiễm dầu được giảm đi bằng nhiều cách như sự bay hơi của các phân đoạn nhẹ hay sự tự oxy hoá và quang hoá nhưng cơ chế chủ yếu của sự phân huỷ dầu là nhờ vi sinh vật. Điều này là cơ sở cho các nhà vi sinh vật dùng các chế phẩm sinh để hỗ trợ các kỹ thuật làm sạch hoá lí khác [12]. * Các phương thức xử lí ô nhiễm dầu bằng biện pháp phân huỷ sinh học: Khái niệm phân huỷ sinh học hay còn gọi là cứu chữa sinh học (bioremediation) đưa ra để mô tả quá trình sử dụng các vi sinh vật sống xử lí các hệ thống bị ô nhiễm. Trong các vi sinh vật thì vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất, tuy nhiên nấm và các thực vật bậc cao cũng góp phần xử lí ô nhiễm. Bản chất của quá trình phục hồi sinh học là cố gắng thúc đẩy sự phân huỷ sinh học trong tự nhiên. Khi trong môi trường bị ô nhiễm dầu, các vi sinh vật có khả năng sử dụng dầu làm thức ăn lập tức phát triển. Tuy nhiên sự thành công của việc ứng dụng chúng để xử lí ô nhiễm dầu phụ thuộc vào khả năng tối ưu hoá các điều kiện khác nhau về sinh học, hoá học, địa chất… giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ nhất có thể, với thời gian nhanh nhất. Có hai phương thức xử lí ô nhiễm dầu trong đất: 1. Bioaugmentation là phương thức xử lí mà trong đó ngoài việc tối ưu hoá các điều kiện dinh dưỡng, người ta đưa vào một số vi sinh vật chọn lọc có khả năng phân huỷ cao, bổ sung cùng với quần xã sinh vật bản địa trong môi trường bị ô nhiễm để tăng cường khả năng phân huỷ dầu. 2. Biostimulation là phương thức xử lí lấy quần xã sinh vật bản địa làm trung tâm, các đặc điểm sinh học, sinh thái của quần xã vi sinh vật được nghiên cứu kỹ qua đó đưa các chất dinh dưỡng hữu cơ, vô cơ, cùng các chế phẩm sinh học với một tỉ lệ thích hợp nhằm kích hoạt tập đoàn vi sinh vật có khả năng phân huỷ dầu bản địa làm sạch môi trường. Trên thế giới cả hai phương thức này cũng đã được đem ra áp dụng nhưng theo các tài liệu thì phương thức thứ nhất dường như ít hiệu quả hơn khi xử lí dầu trong môi trường mở. Trong các thử nghiệm thực tế, việc cho thêm các vi vinh vật cho thấy không có gì hiệu quả hơn so với chỉ thêm các chất dinh dưỡng. Nguyên nhân có thể là do khi đưa một lượng vi sinh vật mới vào môi trường, chúng phải mất thời gian để thích nghi với môi trường sinh thái mới, và thường mất đi khả năng phân huỷ mạnh như vốn có do có các tác nhân kìm hãm nào đó trong môi trường ô nhiễm, nhiều khi chúng chuyển sang sử dụng nguồn cơ chất mới không phải là dầu. Điều này thật bất lợi, thậm chí cản trở quá trình phân huỷ tự nhiên do chúng lấn át hệ vi sinh bản địa, sử dụng hết nguồn oxy vốn là một nhân tố giới hạn cực kì nhạy cảm của quá trình phân huỷ. Kết quả là vừa tốn kém mà hiệu quả lại không cao. Tuy nhiên các nhà khoa học cho rằng phương thức Bioaugmentation có tiềm năng trong việc xử lí các hợp chất dầu đặc biệt hoặc là ở những vùng mà vi sinh vật bản địa làm việc không hiệu quả như các vùng đất đá sỏi, đất cát. Ở Nga đã sử dụng chế phẩm Devoroie gồm hỗn hợp các vi khuẩn Rhodoccocus và Candida làm sạch ô nhiễm dầu ở vùng đất cát. Biostimulation đã được chứng minh là một công cụ hứu hẹn để xử lí triệt để các bờ biển bị ô nhiễm dầu theo phương pháp hiếu khí. Một nhân tố chủ chốt tạo nên sự thành công của phương thức này là duy trì mức độ dinh dưỡng tối ưu. Các yếu tố kìm hãm phải được khảo sát kỹ làm cơ sở cho quyết định hàm lượng dinh dưỡng được đưa vào. Trong trường hợp hàm lượng dầu cao thì chúng ta có thể bổ sung vi khuẩn và một số chế phẩm khác như chất hoạt hóa bề mặt để tăng tốc độ phân huỷ sinh học… Các chủng vi khuẩn được bổ sung ở đây phải là các chủng được phân lập từ chính môi trường bị ô nhiễm được nhân giống và bổ sung dưới dạng chế phẩm. Các chế phẩm khác nhau khi đưa vào xử lí ô nhiễm đã cho các kết quả khác nhau phụ thuộc vào đặc tính của dầu, hàm lượng dinh dưỡng tự nhiên sẵn có của vùng bị ô nhiễm, đặc điểm của môi trường bị ô nhiễm. Dựa trên các thí nghiệm thất bại trong thực tế nói chung các chế phẩm thương mại có hiệu quả hơn các loại phân bón nông nghiệp trong việc thúc đẩy sự phân huỷ dầu. Hiện nay nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, sự phát triển của phân loại học, các nhà khoa học có thể giám sát quá trình phân huỷ sinh học thông qua sự biến động số lượng của quần thể vi sinh vật chiếm ưu thế trong môi trường bị ô nhiễm, nhờ đó phương án phục hồi sinh học môi trường bị ô nhiễm dầu trở nên hấp dẫn các nhà quản lí nhờ giá rẻ, an toàn, độ tin cậy cao. 3. VAI TRÒ CỦA CHẤT HOẠT HOÁ BỀ MẶT SINH HỌC (BIO-SURFACTANT HAY MICROBIAL SURFACE ACTIVE AGENT) 3.1. Bản chất của chất hoạt hoá bề mặt sinh học Chất hoạt hoá bề mặt sinh học (CHHBMSH) được tạo ra từ con đường lên men vi sinh vật. Nó là một hợp chất lưỡng tính gồm hai phần phần kị nước (hydrophobic moiety) và phần ưa nước (hydrophilic moiety), có khả năng làm giảm sức căng bề mặtgiữa các phân tử. Phần ưa nước thường là các nhóm: axit amin, peptit, sacarit đơn, đôi, polysacarit. Phần kị nước là các axit béo, axit no, không no [30]. Các CHHBMSH có cấu tạo rất khác nhau về cấu trúc hoá học lẫn kích thước phân tử từ rất đơn giản như các axit béo đến phức tạp như các hợp chất polymer. Các CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào (extracellular) như các chất glucolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic-lipoprotein, hay chính bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật [30]. Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có đặc tính kháng sinh như chất gramicidin S hay polymicin [30]. Các CHHBMSH được tạo ra cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn tan trong nước [16,30]. Nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với môi trường không thuận lợi, độc hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không hoà tan trong nước [16]. Các CHHBMSH do các gen trên nhiễm sắc thể lẫn các gen ở plasmid tổng hợp và điều khiển. Các gen này dễ mất đi chức năng qua một thời gian dài do bị đột biến và chọn lọc nếu gặp môi trường không thuận lợi cho chúng biểu hiện [16]. Điều này giải thích vì sao chúng ta bắt gặp các loài có khả năng sử dụng dầu ở cả những nơi không bị ô nhiễm dầu và khi đó hoạt tính tạo CHHBM rất thấp. Các CHHBMSH tạo ra trong suốt quá trình phát triển của vi sinh vật, sản lượng và hoạt tính về sau có thể bị giảm do môi trường hết nguồn cơ chất dinh dưỡng, vi vinh vật sử dụng chúng làm nguồn thức ăn hay các vi sinh vật chết đi. 3.2. Các loại CHHBMSH CHHBMSH là một nhóm rất đa dạng, dựa vào cấu trúc hoá học có thể chia chúng thành các nhóm sau: 3.2.1. Glucolipid: là một nhóm được nghiên cứu, ứng dụng nhiều nhất và có hoạt tính mạnh, chúng gồm 3 loại: * Rhamnolipid: do một hoặc hai phân tử rhamnoza liên kết với một hoặc hai phân tử axit hydroxydecacnoic, gồm có 4 loại: 2 phân tử đường liên kết với 2 phân tử axit, 2 phân tử rhamnose liên kết với 1 phân tử axit, 1 phân tử đường liên kiết 2 phân tử axit, và 1 phân tử đường liên kết với 1 phân tử axit. Vi sinh vật sản suất là Pseudomonas aeruginosa Công thức cấu tạo: * Trehaloselipid: do một phân tử đường đôi trehalose liên kết ở vị trí C6 và C6’ với các phân tử axit mycolic. Axit mycolic là một axit béo mạch dài có phân nhánh. Các loài vi sinh vật khác nhau tạo ra các chất có mạch hydrocacbon có chiều dài và số liên kết đôi cũng khác nhau [30]. Các vi sinh vật như nhiều thành viên của chi Mycobacterium tạo ra các este trehalose trên bề mặt tế bào [7]. Các loài thuộc các chi Mycobacteria, Nocardia, Brevibacteria tạo ra các trehaloselipid khác nhau về cấu trúc và kích cỡ. [9] * Sophorolipid Do 1 phân tử đường sophorose liên kết với một axit béo mạch dài. Phân tử đường do hai phân tử glucose liên kết với nhau, nhóm OH ở vị trí C6 và C6’ bị acetyl hoá. Chúng do nhiều chủng nấm men thuộc chi Torulopsis sản xuất: T. bombicola, T. petrophilum, T. apicola và loài Candida bogoriensis. Sophorolipid có khả năng làm giảm sức căng bề mặt nhưng nó không phải là chất nhũ hoá hiệu quả [9,24]. 3.2.2. Các axit béo: được tạo ra do các vi sinh vật oxy hoá ankan, gồm có các axit béo mạch thẳng và các axit béo phức hợp chứa nhóm OH và nhánh ankyl. Cân bằng dầu và nước (hydrophilic-lipophilic balance) phụ thuộc vào chiều dài của mạch cacbon. [36] Chúng do một số vi khuẩn và một số nấm men sản xuất. 3.2.3. Phospholipid Do một số vi khuẩn và nấm men sản xuất, nó là thành phần chính của màng vi sinh, khi vi sinh vật được nuôi trên các cơ chất là ankan thì hàm lượng phospholipid tăng mạnh. Chủng Acinetobater sp., Thiobacillus thioxydans, Athrobacter AK-19, Pseudomonas, Aeruginosa 44T1, Aspergillus spp. có khả năng sản xuất phospholipid. 3.2.4. Các lipid trung tính 3.2.5. Các lipopetid và các lipoprotein Các chất vừa có đặc tính kháng sinh vừa có hoạt tính bề mặt như gramicidin S do Bacillus brevis, polimicin do Brevibacterium polymixa tổnghợp.[28] Các lipid chứa ornithine do Peudomonas rubescen, Thiobacillus thioxydans, các lipid chứa lysin do Agrobacterium tumefaciens IFO tạo ra. Loài Seratia marcescens sản xuất ra một loại aminolipid có hoạt tính bề mặt. Chủng Bacllus subtilis ATCC21332 đã xác định có khả năng tạo ra một loại lipopeptid có hoạt tính cao. 3.2.6. Polymer Hầu hết các CHHBMSH thuộc nhóm polymer là hỗn hợp của polysacarit với protein, chúng là những chất có hoạt tính bề mặt có khối lượng rất lớn và cấu trúc phức tạp. Các chất tốt nhất là emulsan, liposan, manoprotein và một số phức hợp của polysacarit-protein khác. Emulsan do Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 tạo ra, đơn phân của nó chứa một trisacarit liên kết với hai axit béo, nó có khả năng nhũ hoá cao các hydrocacbon trong nước thậm chí với nồng độ rất thấp [10]. Liposan tạo ra từ Candida lipolytica, là một chất nhũ hoá ngoại bào, hoà tan trong nước, trong cấu trúc của nó chứa 17% protein và 73% hydrocacbon, các hydrocacbon trong liposan gồm có glucose, galactose, galactosamin, axit galactorunic [12]. Manoprotein do Sacharomyces cerevisiae tạo ra chứa 44% manose và 17% protein. Candida tropicalis đã sản xuất ra một loại phức hợp manan-axit béo trên môi trường chứa ankan [25]. P. aeruginosa P-20 tạo ra một peptidoglycolipid chứa 52 axit amin, 11 axit béo, 1 đường [16]. Cyanobacterium phormidium J-1 tạo các chất CHHBM là biofloculan và emulcyan [16]. 3.2.7. Các CHHBMSH đặc biệt Một số loài tạo ra các túi ngoại bào có tác dụng cắt hydrocacbon thành từng phần nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các hydrocacbon vào trong tế bào. Các túi do chủng Acinetobacter HO1-N có đường kính 20-50 nm chứa protein, phospholipid và lipopolysaccharid, chứa 5 phần phopholipid, khoảng 350 phần polysaccharid [26]. Hầu hết các vi khuẩn phân huỷ hydrocacbon và gây độc có chứa các CHHBMSH là các thành trên bề mặt tế bào, chúng bao gồm các cấu trúc như là M protein. 3.3. Khái quát quá trình tạo CHHBMSH của vi sinh vật Để có thể biết rõ được cơ chế rõ ràng quá trình tạo chất hoạt động bề mặt sinh học ta phải theo dõi được sản phẩm của từng giai đoạn trao đổi chất của vi sinh vật. Nhưng trong phạm vi của bản khoá luận này chỉ xin được mô tả một cách sơ lược về quá trình tạo ra chất hoạt động bề mặt sinh học của vi sinh vật. Nhìn chung, mỗi một loài vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học lại có một cơ chế chuyển hoá riêng. Bởi vậy nếu nói một cách cụ thể thì phạm vi sẽ là quá rộng. Ta sẽ xét cơ chế của quá trình tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của vi khuẩn hiếu khí. Với loại vi khuẩn hiếu khí, con đường chung là trình tự oxy hoá các hydrocacbon thành rượu, sau đó đến andehit, các axit béo, rồi đến axetyl-CoA hoặc axit pyruvic. Từ đây tiếp tục con đường chuyển hoá trong chuỗi hô hấp của vi sinh vật (chu trình TCA), tạo ra các axit sản phẩm có nhóm chức ưa nước (nhóm OH hoặc C=O). Các sản phẩm của chu trình TCA sau đó kết hợp với các thành phần của dầu thô tạo lên sản phẩm là các axit amin hoặc các lipid chung tính gồm có một đầu ưa nước (OH hoặc C=O) và một đầu ưa dầu (-CH2). Chính các cấu tử này là các chất hoạt động bề mặt sinh học. 3.4. Cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH Trong tự nhiờn cú rất nhiều cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH. Sự tạo thành CHHBMSH và chức năng của cỏc chất này thường cú liờn quan tới sự phõn huỷ cỏc hydrocacbon. Vỡ vậy, cỏc chất này chủ yếu là do cỏc vi sinh vật cú khả năng sử dụng hydrocacbon sinh ra. Tuy nhiờn, một số vi sinh vật khỏc lại sử dụng cỏc nguồn cơ chất là cỏc hợp chất hữu cơ tan trong nước (glucoz, glycerol, etanol…) cũng cú khả năng sinh ra CHHBMSH. Một số vi sinh vật dường như tạo ra chất này nhằm thớch nghi với cỏc điều kiện mụi trường sống đặc biệt của chỳng, chẳng hạn như: trong cỏc bể chứa dầu, trong đất, trong đại dương… Người ta đó phõn lập được chủng Pseudomonas aeruginosa trong nước bơm ộp vào giếng khoan dầu thụ ở Venuezuela [19]. Chủng này cú khả năng thớch nghi với cỏc điều kiện khắc nghiệt trong bể chứa dầu và hơn nữa, cỏc CHHBMSH (rhamnolipit) do chủng này sinh ra lại khụng bị cỏc điều kiện đặc biệt trong giếng khoan (pH, nhiệt độ, độ mặn, Ca2+ và Mg2+) làm mất hoạt tớnh. Chủng Bacillus SP018 cú khả năng tạo CHHBMSH ngay trong điều kiện kị khớ ở 500C và chịu được nồng độ NaCl đến 10%. Chủng Bacillus AB-2 và Y12-B được phõn lập từ cỏt nhiễm dầu cú khả năng sinh trưởng trong mụi trường cú chứa hydrocacbon ở nhiệt độ 500C. Từ cỏc mẫu đất nhiễm dầu đó phõn lập được một số chủng vi sinh vật khỏc như Rhodococcus, Bacillus pumilus [27], Arthrobacter sp. MIS 38 [33]. Từ cỏc vựng ụ nhiễm nhiờn liệu đó phõn lập được cỏc chủng như Ochrobacchum anthropii, hay từ cỏc vựng biển bị tràn dầu phõn lập được Pseudomonas aeruginosa. Cỏc chủng này khụng những cú khả năng phõn huỷ dầu mà cũn cú khả năng tạo CHHBMSH cao. Jeneman và cộng sự đó phõn lập được chủng Bacillus licheniformis JF-2 trong một giếng khoan dầu ở vựng Carter, Oklahoma. Chủng này cú khả năng phỏt triển trong mụi trường kị khớ và làm giảm sức căng bề mặt của mụi trường cũn 30mN/m. Chủng này cũng cú thể sinh trưởng trong mụi trường cú nồng độ NaCl lờn tới 10%, nhiệt độ nuụi cấy là 500C và pH dao động trong khoảng từ 4,6 đến 9,0. Hơn thế nữa, chỳng khụng bị ức chế bởi sự cú mặt của dầu thụ. Vỡ vậy, chủng này cú tiềm năng để sử dụng trong phương phỏp tăng cường thu hồi dầu nhờ vi sinh vật. Người ta ước tớnh, trong cỏc giếng dầu ở Mỹ, khoảng 50-70% cỏc vi sinh vật cú thể sinh trưởng được ở pH từ 4-8, nhiệt độ dưới 750C, nồng độ NaCl khoảng 10% và cú thể sinh trưởng được cả trong điều kiện kị khớ hoặc vi hiếu khớ [19]. CHHBMSH do vi sinh vật sinh ra cú thể là chất ngoại bào hay chớnh bản thõn tế bào, trong một số trường hợp cỏc chất này cú tớnh khỏng sinh, do đú chỳng cú thể phõn huỷ màng tế bào của một số vi sinh vật cạnh tranh nguồn cacbon với chỳng. Cooper phỏt hiện chủng Clostridium pasteurianum sinh một loại mỡ chung tớnh ngoại bào, chất này cú thể làm giảm sức căng bề mặt của mụi trường từ 72mN/m xuống cũn 55mN/m. Yakimov và cộng sự [38] đó phõn lập được chủng Bacillus licheniformis BAS50, chủng này cú thể sinh trưởng kị khớ trờn mụi trường cú bổ sung đường glucoz và 0.1% NaCl và sinh CHHBMSH cú tờn là lichenysin. Kinsinger và cộng sự [21] đó phỏt hiện một chủng Bacillus subtilis cú khả năng sinh CHHBMSH ngoại bào cú bản chất là surfactin, chất này cú khả năng khỏng vi nấm. Cỏc loài vi sinh vật khỏc nhau cú thể tạo ra cỏc loại CHHBMSH cú bản chất hoỏ học và trọng lượng phõn tử khỏc nhau. Người ta đó tỏch chiết và mụ tả được bản chất hoỏ học của một số CHHBMSH do một số chủng vi sinh vật tạo ra. Banat đó tổng kết được một số vi sinh vật cú khả năng sinh CHHBMSH và bản chất hoỏ học của từng chất do từng chủng sinh ra trong bảng sau: Tên vi sinh vật Tên CHHBMSH được tạo thành Arthrobacter RAG-1 Heteropolysaccarit Arthrobacter MIS38 Lipopeptit Arthrobacter Trechaloz, xaccaroz, fructoz Bacillus licheniformis JF-2 Lipopeptit Bacillus subtilis Surfactin Bacillus pumilus A1 Surfactin Bacillus sp. AB-2 Rhamnolipit Bacillus sp. C-14 Hiđrocacbon-lipit - protein Candida antarctica Mannosylethritol lipit Candida bombicola Sophoroz lipit Candida tropicalis Mannan Candida lipolytica Y-917 Sophoroz lipit Clostridium pasteuriannum Lipit chung tính Corynebacterium hiđrocarbolastus Protein-lipit-cacbohiđrat Corynebacterium insidiosum Photpholipit Corynebacterium lepus Axit béo Chủng MM1 Glucoz, lipit, và axit hiđroxidecanoic Nocardia erythropolis Mỡ chung tính Ochrobacchum anthropii Protein Penicillum spiculisporum Axit spiculosporic Pseudomonas aeruginosa Rhamnolipit Pseudomonas fluorescens Lipopeptit Phaffia rhodozyma Cacbohiđrat-lipit 3.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sản xuất CHHBMSH a. Nguồn cacbon Chất HHBMSH được sản xuất bởi nhiều các sinh vật khác nhau và chúng cũng có những cấu trúc rất khác nhau, tuy nhiên có một số các hiện tượng chung liên quan tới việc tổng hợp chúng: Thứ nhất là việc sản xuất CHHBMSH có thể do các hydrocacbon hoặc các cơ chất không tan trong nước. Hiện tượng này được nhắc đến bởi nhiều tác giả với nhiều CHBMSH [30,16]. Hiện tượng dễ thấy khác là sự kìm hãm tổng hợp CHHBMSM bởi gluco và một số các chất trao đổi khác [16]. Trong trường hợp của Athrobacter paraffineus I, CHHBMSH không được tạo ra khi thay thế hexan bằng gluco [22]. Một chủng thuộc loài Pseudomonas aeruginosa đã sản xuất ra một chất giống protein trên nguồn hydrocacbon nhưng không tạo ra trên gluco, glycerol, axit palmitic [22]. Loài Torulopsis petrophilum không tạo ra bất cứ một glucolipid nào khi nuôi trên môi trường đồng pha chứa bất cứ nguồn cacbon hoà tan trong nước nào. Đối với chủng P. aeruginosa khác khi nuôi trên môi trường chứa glycerol nếu thêm gluco, acetat, succinat, citrat thì sản lượng rhamnolipid giảm mạnh. Nhiều loài vi sinh vật đã được biết là sẽ tổng hợp nhiều loại CHHBM khác nhau khi nuôi trên vài nguồn cacbon [32]. Có nhiều ví dụ về việc sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như ở Pseudomonas sp. đã sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như glycerol, gluco, manitol, ethanol [30]. Nhiều tác giả đã chứng minh rằng sản lượng CHHBMSH tạo ra ít khi nuôi vi sinh vật trên các nguồn cacbon nào đó trong môi trường, chỉ khi nào nguồn cacbon này hết, khi đưa vào nguồn cacbon không hoà tan trong nước sẽ thúc đẩy tạo CHHBMSH [8]. Việc tạo glucolipid bởi Torulospos bombiloca được kích thích khi thêm dầu ăn vào trong môi trường nuôi cấy chứa 10% D – gluco [16]. Davis cùng các cộng sự đã chứng minh khi thêm ethyl este của một loại axit béo vào môi trường chứa gluco thì sản lượng sopholipid ở chủng C. bombicola CBS6009 tăng. Khi sản xuất glucolipid ở chủng T. apicola TMET73747, Stuwer cùng các cộng sự đã thu được sản lượng lên tới 90g/l trên môi trường chứa gluco và dầu hướng dương [16]. b. Nguồn nitơ Nguồn nitơ là một yếu tố quan trọng điều khiển sinh tổng hợp CHHBMSH. Nguồn nitơ NH4 thích hợp hơn nguồn NO3 cho việc tạo CHHBMSH ở chủng Athrobacter paraffineus ATCC 19558, nguồn ure cũng làm tăng sản lượng CHHBMSH. Nguồn NO3 tạo ra sản lượng lớn CHHBMSH ở P. aeruginosa và Rhodoccocus sp. [16]. Sản lượng CHHBM tăng ở A. paraffineus khi thêm các axit amin như: axit glutaric, axit asparagin, hay glycin vào môi trường. Cấu trúc của surfactin cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ L- aa tạo ra surfactin Val-7 hay Leu-7 [16]. Với chủng B. lichenniformis BAS50 sản lượng lichennysin A tăng gấp hai đến bốn lần khi thêm L-glutaric và L-asparagin vào môi trường. Robert cùng các cộng sự đã chứng minh rằng NO3 là nguồn nitơ tốt nhất cho việc sản xuất CHHBMSH ở chủng Pseudomonas 44TL và Rhodococus ST-5 sinh trưởng trên dầu ôliu và paraffin. Sản lượng CHHBM cũng tăng bằng việc giới hạn nguồn nitơ; P. aeruginosa, Norcardia, C. tropicalis đã tăng sản lượng CHHBM cùng với hoạt động tổng hợp glutamic khi chuyển sang giai đoạn sinh trưởng chậm lại, lúc mà môi trường hết nguồn nitơ. Syldatle cùng các cộng sự đã chứng minh rằng việc giới hạn nguồn nitơ không chỉ làm tăng sản lượng CHHBMSH mà còn làm thay đổi thành phần của CHHBMSH. Guerra-Santos cùng các cộng sự chỉ ra rằng việc tạo rhamnolipit là cực đại khi tỉ lệ C: N là 16:1 đến 18:1, không tạo ra khi tỉ lệ này là 11:1. [20] c. Các yếu tố khác Một sự thay đổi trong môi trường nuôi cấy cũng làm tăng sản lượng CHHBMSH. Kiểu loại, sản lượng và hoạt tính CHHBMSH cũng bị ảnh hưởng không chỉ bởi các nguồn cacbon khác nhau mà còn bởi nồng độ, nguồn nitơ, photpho, các ion Mg, Fe trong môi trường, điều kiện nuôi cấy, pH, nhiệt độ, tốc độ lắc và tỉ lệ pha loãng các chất trong môi trường [21]. Trong một số trường hợp, khi thêm các ion đa hoá trị vào môi trường ảnh hưởng dương tính tới sản lượng CHHBM. Một số các chất như etabutol, penicillin, cloramphenicol, EDTA cũng ảnh hưởng tới việc tạo thành CHHBM. Đó là do các yếu tố này ảnh hưởng tới độ hoà tan của các nguồn cacbon. [35] Một số trường hợp quá trình tổng hợp CHHBM lại bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, pH thông qua sự tác động của các yếu tố này tới hoạt động sinh trưởng của tế bào. pH đóng vai trò quan trọng trong việc tạo rhamnolipit ở Pseudomonas sp., CHHBMSH tạo ra cực đại ở pH = 6 đến 6,5 và giảm mạnh khi pH =7 [19]. Khả năng tạo cellobioselipit ở Ustilago maydis [18] và tạo sophorolipit ở Torulospos bombicola bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi yếu tố pH [13]. Trong trường hợp chủng Athrobacter paraffineus ATCC19558, Rhodotorula erythropolis, Pseudomonas sp. DSM2874 nhiệt độ lại đóng vai trò quan trọng. Loài Bacillus chịu nhiệt cao chỉ tạo CHHBM khi nhiệt độ trên 40oC. Tốc độ lắc cũng ảnh hưởng tới sản lượng CHHBM, ở chủng Norcardia erythropolis, sản lượng CHHBM giảm khi tăng tốc độ lắc do nó tác động tới hoạt động phân chia tế bào, còn ở nấm men sản lượng lại tăng khi tốc độ lắc và mức độ kị khí tăng [29]. Nồng độ muối cũng ảnh hưởng nhiều tới quá trình sản xuất CHHBM do ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào. Đa số các trường hợp khi nồng độ muối tăng thì khả năng tạo CHHBM giảm. Tuy nhiên trong một số trường hợp sản lượng CHHHBM không bị ảnh hưởng khi nồng độ muối lên tới 10% mặc dù nồng độ mixen tối thiểu giảm nhẹ [6]. 3.6. Một số ứng dụng của CHHBMSH * Ưu điểm của CHHBMSH so với CHHBMHH CHHBMSH tạo ra từ con đường lên men sinh học, cấu tạo của chúng rất khác so với các CHHBMHH, tuy nhiên chúng cũng gồm hai đầu kị nước và ưa nước và hoạt tính của chúng cũng không kém CHHBMHH. Nhưng CHHBMSH lại có những ưu điểm mà CHHBMHH không thể sánh kịp, quyết định khả năng ứng dụng của nó trong rất nhiều ngành công nghiệp, và đang có xu hướng thay thế dần các CHHBMHH. Đó là các đặc điểm: - Dễ phân huỷ sinh học: CHHBMHH khi bổ sung vào trong mỏ khó bị phân huỷ trong điều kiện vỉa, gây ô nhiễm môi trường dầu khí do lẫn các cấu tử không mong muốn làm giảm chất lượng dầu. CHHBMSH tạo ra từ nguồn vi sinh vật nên độ tinh khiết cao, hoạt tính của chúng lại không kém các CHHBMHH. Ví dụ điển hình cho trường hợp này là ảnh hưởng của CHHBMSH và CHHBMHH lên sự phân huỷ các hợp chất hydrocacbon thơm mạch vòng được nghiên cứu bởi Marar và Rockne: khi thêm một số CHHBMHH vào có thể kìm hãm sự phân huỷ các hợp chất thơm do có ảnh hưởng gây độc, kích thích vi sinh vật phân huỷ CHHBMHH hay cô lập các hydrocacbon trong mạch micxen CHHBM, còn CHHBMSH cho thấy có những ảnh hưởng tốt như CHHBMHH nhưng chúng có thể bị phân huỷ, không độc và nhiều CHHBMSH không tạo cấu trúc micxen do đó rất thuận lợi cho việc kết hợp các hợp chất thơm với vi khuẩn [34]. - Các chất HHBMSH có thể sản xuất từ các nguồn vật liệu rẻ tiền, sẵn có, với số lượng lớn. Nguồn cacbon có thể là các hydrocacbon, lipit, các nguồn cơ chất phế thải của các ngành công nghiệp khác như rỉ đường, dầu cặn... do đó nó mang lại hiệu quả kinh tế cao mà lại xử lí được ô nhiễm do các phế thải này gây ra với môi trường [31]. - Việc sản xuất CHHBMSH đơn giản hơn nhiều CHHBMHH. Chúng được tạo ra bằng con đường lên men nhờ vi sinh vật cho nên thiết bị đơn giản, đỡ tốn kém mà lại không sử dụng các hoá chất độc hại như sản xuất CHHBMHH. Do không độc, dễ dàng bị phân huỷ, giá thành sản xuất rẻ nên chúng được ứng dụng trong xử lí môi trường mà CHHBMHH không thể xử lí triệt để: xử lí dầu tràn, tăng cường khả năng phân huỷ các hợp chất độc hại cho môi trường, chuyển chúng thành các yếu tố tích cực cho môi trường như sản xuất phân bón từ mùn khoan phế thải, các hợp chất thơm. Với những đặc tính không độc hại, dễ bị phân huỷ, dễ tiêu hoá mà CHHBMSH được sử dụng trong các ngành công nghiệp đặc biệt khác như mĩ phẩm, dược phẩm, thực phẩm mà CHHBMHH khó có thể bì kịp. * Một số ứng dụng của CHHBMSH CHHBMSH là một nhóm đa cấu trúc, chúng có những đặc tính hơn hẳn các CHHBMHH như đã nói ở trên cho nên chúng được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Công nghiệp dầu mỏ là một ngành ứng dụng rộng rãi các chất hoạt hoá bề mặt trong khai thác cũng như là xử lí môi trường, CHHBMSH đã tỏ ra có ưu thế và tiềm năng trong ngành công nghiệp này. Sau đây chúng tôi xin trình bày một số các ứng dụng quan trọng của nó. a. Nâng cao hiệu suất khai thác dầu (MEOR) Đây là một ứng dụng quan trọng nhất của nó trong ngành công nghiệp dầu mỏ. Cơ chế của phương pháp MEOR bao gồm: Tạo axit hoà tan phần đá bao bọc dầu, tăng độ rỗng và tính thấm của vỉa, tạo khí, do đó làm giảm độ nhớt của dầu và tăng áp suất vỉa. Tạo các axit hữu cơ hay các chất HHBM, biopolyme làm giảm sức căng bề mặt giữa dầu và nước dẫn đến làm tăng độ linh động của dầu. CHHBMSH có thể được sản xuất từ ngoài (ex situ) rồi bổ sung vào trong mỏ hay tạo ra ngay trong mỏ (in situ). Trong cả hai trường hợp, CHHBMSH đều làm tăng lượng dầu khai thác từ mỏ lên tới 60 đến 70% mà bằng phương pháp bơm ép thông thường chỉ khai thác được khoảng 30% nguồn dầu trong mỏ. Sự có mặt của CHHBM làm giảm sức căng bề mặt giữa vùng dầu nước do đó kích thích dòng dầu chảy. Để sản xuất CHHBM từ ngoài, CHHBM được tiến hành lên men, thu CHHBM hay đơn giản là cô đặc dịch nuôi cấy và sau đó là bơm xuống giếng. Quá trình sản xuất ex situ phải được tiến hành với số lượng lớn, dưới điều kiện tối ưu, cung cấp đầy đủ không khí cho quá trình lên men. Quá trình này có thể sử dụng các cơ chất rẻ tiền như các phế thải của các ngành công nghiệp nên vừa hạ giá thành sản phẩm vừa giảm ô nhiễm cho môi trường [31]. Một áp dụng hợp lí và hấp dẫn hơn là sản xuất CHHBMSH ngay trong mỏ (in situ) bằng cách cung cấp chất dinh dưỡng cho quần thể vi sinh vật nội tại trong mỏ hay nuôi giống từ bên ngoài trộn cùng với môi trường dinh dưỡng rồi bơm vào trong giếng. Tuy nhiên khi sản xuất theo cách thức này thường gặp những khó khăn nhất định ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi sinh vật thậm chí kìm hãm sinh trưởng và sinh tổng hợp CHHBM như: nhiệt độ mỏ quá cao, áp suất lớn, pH, độ mặn và kim loại nặng, khó khăn lớn nhất là thiếu oxy và việc luân chuyển chất dinh dưỡng trong mỏ. Do đó, để phương pháp MEOR này thành công thì phải lựa chọn được các chủng có khả năng chịu đựng được các điều kiện khó khăn trong mỏ. Phương pháp MEOR đã được nhiều nước áp dụng thành công. Clark cùng các cộng sự đã xác định có khoảng 27% mỏ dầu ở Mĩ thích hợp cho vi sinh vật phát triển và ứng dụng phương pháp MEOR. Phương pháp MEOR cũng đã được thông báo thành công trong nhiều nghiên cứu ở Nga, Cộng hoà Séc, Rumani, Mĩ, Hungary, Balan, Hà Lan, Nam Tư. Nước ta hiện đã ứng dụng phương pháp này, năm 1998 Lại Thuý Hiền cùng các cộng sự đã thử nghiệm phương pháp MEOR trên hiện trường khu vực mỏ dầu Bạch Hổ- Vũng Tàu và thu được kết quả tốt, số lượng vi khuẩn khử sunphat giảm đi, năng suất khai thác dầu tăng lên có giếng tăng tới 200%. b. Phân huỷ các hydrocacbon Một ứng dụng quan trọng khác của CHHBMSH đó là trong xử lí môi trường ô nhiễm hydrocacbon. - Phân huỷ các hydrocacbon trong đất: Các nghiên cứu về quá trình phân huỷ hydrocacbon trong đất đã được thông báo rộng dãi. Khả năng phân huỷ phụ thuộc vào sự có mặt của các vi sinh vật phân huỷ, thành phần hydrocacbon, O2, nhiệt độ, pH, nước, các chất dinh dưỡng và trạng thái vật lí của các hydrocacbon. Khi thêm CHHBM sinh học hay tổng hợp vào trong môi trường sẽ làm tăng tính lưu biến và độ hoà tan của các hydrocacbon, điều này rất cần cho quá trình phân huỷ. Các thử nghiệm khi bổ sung CHHBMSH để phân huỷ các hydrocacbon đã đem lại nhiều thành công: Lindley và Heydeman nuôi nấm Cladosporium resinae trên hỗn hợp ankan, chủng này có khả năng sản xuất ra một loại CHHBM gồm các axit béo, phospholipid, nhưng chủ yếu là axit dodecacnoic và phosphatidylcloline. Khi bổ sung phosphatidylcloline vào môi trường nuôi cấy chứa hỗn hợp các ankan này đã làm tăng tốc độ phân huỷ ankan lên 30%. Foght cùng các cộng sự đã chứng minh chất emulsan kích thích quá trình phân huỷ của dịch chứa đơn chủng vi khuẩn nhưng lại kìm hãm khi môi trường chứa hỗn hợp các chủng vi khuẩn. Oberbremer và Muller-Harting sử dụng quần thể vi sinh đất để đánh giá khả năng phân huỷ dầu thô, trong đó naphthalen bị phân huỷ đầu tiên, các thành phần khác chỉ bị phân huỷ khi các CHHBM được tạo ra làm giảm sức căng bề mặt giữa dầu và nước. Khi thêm CHHBM như một số sophorolipit vào môi trường chứa hỗn hợp các hydrocacbon thì sẽ làm tăng phân huỷ cả số loại lẫn số lượng các hydrocacbon. Một vài chủng vi khuẩn kị khí cũng sản xuất CHHBMSH nhưng khả năng làm giảm sức căng bề mặt không bằng các vi khuẩn hiếu khí. Bergetal đã sử dụng CHHBMSH do chủng P. aeruginosa UG2 làm tăng độ hoà tan của hexachlorobiphenyl lên 31% gấp 3 lần khi sử dụng CHHBM hoá học là 9,3%. Khi cả hai chất này cùng sử dụng thì hiệu quả hoà tan tăng lên 41,5%. Chủng Pseudomonas cepacia AC1100 tạo ra một loại chất nhũ hoá có khả năng tạo thể huyền phù với 2,4,5-T và cũng nhũ hoá một số các clorophenol, do đó CHHBM này được sử dụng để tăng cường khả năng phân huỷ của các chất hữu cơ chứa clo [30]. - Phân huỷ các hydrocacbon trong môi trường nước: Khi dầu bị tràn ở môi trường nước, các thành phần HRCB nhẹ bay hơi còn các HRCB không phân cực thì không hoà tan trong nước. Do có độ hoà tan thấp (<1ppm) và tỉ trọng nhỏ hơn nước nên hầu hết các thành phần HRCB tồn tại trên bề mặt nước. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ HRCB đã được phân lập trong môi trường nước, các vi sinh vật này bị kích thích hoạt động nhũ hoá khi môi trường nhiễm dầu. Chakrabartu đã thông báo rằng chất nhũ hoá do P. aeruginosa SB30 làm tăng khả năng thu gom dầu, rất có ích để xử lí các bờ biển bị nhiễm dầu. CHHBM từ vi khuẩn còn được ứng dụng để làm sạch các thùng, kho chứa dầu và nhiều ứng dụng khác. CHHBM emulsan do chủng Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 sinh ra sử dụng trong công nghiệp dầu khí làm giảm cặn dầu trong thùng chứa, giảm độ nhớt của dầu nặng, tạo chất nhũ hoá phục vụ nhiều lĩnh vực khác [30]. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. VẬT LIỆU 1.1. Nguyên liệu Mùn khoan lấy từ mỏ Bạch Hổ –Vũng Tàu. Các chủng vi khuẩn nhận từ phòng vi sinh vật dầu mỏ. 1.2. Hoá chất và môi trường nuôi cấy 1.2.1. Môi trường hiếu khí tổng số 1% (g/l) Thạch KH2PO4 NaCl KCl MgCl2 NH4 NO3 Glucoza Pepton Cao thịt Cao men Nước máy pH 20 1 10 0,25 1,2 2 1 5 3 0,2 1 lít 7-7,2 Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Nga Đức Đức 1.2.2. Môi trường khoáng Gost cho vi khuẩn (g/l): Na2HPO4 KH2 PO4 KNO3 MgSO4 Nước máy 0,7 0,3 3 0,4 1 lít pH và nồng độ NaCl chỉnh theo từng thí nghiệm. Các loại dầu: DO, saralin, dầu thô, parafin, dầu oliu. Các môi trường được khử trùng riêng với các loại dầu ở 1 atm trong thời gian 30 phút. 1.3. Thiết bị và máy móc Kính hiển vi quang học Laborval 4 (Đức) Cân phân tích Sartorius (Đức) Máy bay hơi chân không SpeedVac (Đức) Máy li tâm Sorwal (Đức) Máy lắc Beckman (Đức) Tủ sấy (Việt Nam) Bốc cấy (Việt Nam) Các vật dụng khác của phòng vi sinh vật dầu mỏ. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Giữ giống và nhân giống * Giữ giống: các chủng sau khi lựa chọn được giữ giống trên môi trường khoáng Gost bổ sung dầu DO, giữ trong glycerin với tỉ lệ 1:1, và trên môi trường hiếu khí thạch nghiêng. Nhân giống: chủng được nhân giống trên môi trường hiếu khí thạch nghiêng, rồi từ đó được cấy sang môi trường Gost có bổ xung 5% dầu DO để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.2. Tuyển chọn các chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh Các chủng sau khi phân lập từ mùn khoan dầu khí được nhân giống và và cấy chuyền ra các ống thạch nghiêng. Tiến hành nuôi lắc từng chủng trên môi trường Gost 1% NaCl chứa 5% dầu DO, pH =7,5; tốc độ lắc v =200vòng/phút với tỉ lệ 1% giống, theo dõi trong một tuần. Quan sát sự thay đổi độ đục, trạng thái của dầu trong môi trường, kết luận chủng có khả năng sử dụng dầu hay không. Nếu môi trường có độ đục cao, dầu bị nhũ hoá thì chứng tỏ chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh. 2.3. Quan sát hình thái 2.3.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc: cấy ria các chủng trên môi trường hiếu khí, ủ ở điều kiện 30o C sau 24h đem quan sát. 2.3.2. Quan sát hình thái tế bào: sau24h nuôi cấy, tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi quang học. * Xác định Gram: nhuộm Gram và thử lại bằng phương pháp KOH để làm tăng độ chính xác: lấy một ít sinh khối tế bào lên phiến kính, nhỏ một giọt dung dịch KOH 3% lên sinh khối tế bào, dùng que cấy đánh tan tế bào. Nếu dịch tạo nhớt thì kết luận vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, nếu không tạo nhớt chứng tỏ vi khuẩn là Gram dương * Xác định khả năng chuyển động: làm tiêu bản giọt ép và soi kính hiển vi. 2.4. Xác định các đặc điểm sinh hoá bằng các phép thử hoá sinh: nhằm mục đích xác định khả năng sử dụng một số các cơ chất của chủng nghiên cứu. 2.5. Xác định số lượng tế bào trên môi trường thạch (phương pháp Koch) Pha loãng dịch theo dãy thập phân: Chuẩn bị một loạt các lọ penicilin chứa 4,5 ml muối sinh lí vô trùng, hút 0,5 ml dịch cần pha loãng vào lọ penicilin thứ nhất và lắc đều, từ lọ thứ nhất chuyển 0,5 ml sang lọ penicilin thứ hai, cứ thực hiện liên tiếp như vậy cho đến độ pha loãng thích hợp. Sau khi pha loãng hút 0,1ml dịch ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa chứa môi trường hiếu khí, dùng que trang gạt đều. Trong quá trình pha loãng tiến hành với hai độ pha loãng chẵn hoặc lẻ liên tiếp thích hợp, ở mỗi độ pha loãng hút vào hai đĩa peptri để giảm sai số, nuôi ở nhiệt độ 300C sau 1-2 ngày đem xác định số lượng tế bào. Công thức tính số lượng tế bào: X = n * 10 (x+1) Trong đó: X là số lượng tế bào trong 1ml dịch cần xác định. n là số lượng tế bào trung bình các đĩa x là sốthứ tự của lọ pha loãng 2.6. Đánh giá khả năng sinh CHHBM theo phương pháp Pruthi Khả năng sinh CHHBM được đánh giá thông qua chỉ só nhũ hoá E24 Chỉ số nhũ hoá E24 đặc trưng cho khả năng nhũ hoá của các sản phẩm trao đổi chất do vi sinh vật sinh ra trong dung môi xylen sau 24h trong 4oC. Cách tiến hành: Lấy 1ml dịch nuôi cấy đã ly tâm loại bỏ tế bào thêm 1 ml xylen vào ống nghiệm đem voltex trong 1 phút với vận tốc 2000 vòng/phút. Mẫu được giữ ở 4oC trong 24h rồi đem đo. Công thức xác định chỉ số E24: Chiều cao cột nhũ hoá E24 = x100% Chiều cao tổng số E24 càng cao thì khả năng nhũ hoá của sản phẩm càng lớn. 2.7. Tối ưu hoá một số các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo CHHBM theo phương pháp Gause- Zenden Phương pháp Gause-Zenden là phương pháp tối ưu đơn giản, được tiến hành bằng cách chỉ thay đổi một yếu tố tác động, cố định các yếu tố tác động còn lại. Quá trình A chịu ảnh hưởng của n yếu tố, chỉ số cần tối ưu là y. Cố định (n- 1) yếu tố và cho một yếu tố thay đổi trong khoảng xác định công nghệ của nó, ứng với mỗi một thí nghiệm ta xác định được một số liệu y. Trong dãy số liệu thu được ta xác định được một giá trị y tối ưu. Ta thu được loạt thí nghiệm thứ nhất. Loạt thí nghiệm thứ 2 ta cũng cố định (n-1) yếu tố tác động ở một giá trị nào đó, cho yếu tố thứ n thay đổi trong khoảng xác định công nghệ. Trong dãy thí nghiện thu được ta được một giá trị tối ưu của yếu tố thứ 2. Thực hiện n loạt thí nghiệm như vậy ta xác định đựoc các giá trị tối ưu của các yếu tố tác động mà tại đó y tối ưu. Phương pháp này chỉ tiệm cận tới vùng tối ưu. Trong phạm vi khoá luận này, chỉ số cần tối ưu là sản lượng CHHBM, các yếu tố tác động là nhiệt độ, pH, nồng độ muối và nguồn cacbon. 2.8. Phân tích sản phẩm bằng phổ hồng ngoại Cấu trúc phân tử của chất hoạt hoá bề mặt được nghiên cứu bằng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại nhờ sự giúp đỡ của phòng phổ hồng ngoại –Viện Công nghệ hoá học để dự đoán cấu trúc hoá học của sản phẩm. 2.9. Xác định trọng lượng khô của CHHBM Phương pháp tách chiết chất hoạt hoá bề mặt được tiến hành theo phương pháp Pruthi có cải tiến. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 120 giờ nuôi lắc được dùng để tách chiết chất hoạt hoá bề mặt sinh học. Dịch nuôi cấy Li tâm 8.000 v/ph 10’ Dịch huyền phù Cặn Bổ sung axeton tỉ lệ 1:4 giữ ở 4oC trong 24h Li tâm Chất kết tủa Dịch nuôi cấy và axeton Làm khô chân không Chất hoạt hoá bề mặt Trọng lượng của CHHBMSH được đo bằng cân phân tích. 2.10. Xác định độ bền hoạt tính của CHHBM Dịch nuôi cấy được li tâm 20.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để loại bỏ toàn bộ tế bào, thu phần dịch chứa CHHBM. Phần dịch thu được đặt ở các nhiêt độ 30oC, 55oC trong thời gian 3 ngày, 10 ngày, 15 ngày và ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút, 60 phút; rồi đem đo hoạt tính để đánh giá độ bền của CHHBMSH. 2.11. Đánh giá ảnh hưởng của CHHBMSH lên mùn khoan * Làm giàu vi khuẩn phân huỷ saralin trong mùn khoan: Cân 10 gam mùn khoan cho vào bình 250ml chứa môi trường Gost có bổ sung 5% dầu saralin, tiến hành lắc trong 3 ngày. Sau đó cấy chuyển 2ml dịch nuôi lắc sang bình khoáng Gost thứ hai cũng bổ sung 5% dầu saralin, lắc trong 5 ngày. Hỗn hợp vi khuẩn phân huỷ dầu được dùng làm giống. * Bổ sung CHHBMSH để làm tăng khả năng phân huỷ dầu: Nuôi cấy chủng M150 để thu được lượng CHHBM cực đại. Thu CHHBM bằng cách li tâm loại bỏ tế bào, thu dịch nuôi cấy. Chuẩn bị 4 bình khoáng Gost chứa 5% saralin, bổ sung vào các bình 0,5ml dịch hỗn hợp vi khuẩn phân huỷ dầu. Bổ sung CHHBMSH vào một bình 1ml, bình 2ml, bình 3ml và một bình không bổ sung CHHBM. Đếm số lượng vi sinh vật lúc mới bổ sung và sau khi lắc 4 ngày. Sự ảnh hưởng của CHHBM lên vi sinh vật trong mùn khoan thông qua sự biến động số lượng vi sinh vật. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN SINH CHHBMSH 1.1. Tuyển chọn chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh Từ bộ sưu tập gồm 16 chủng vi khuẩn phân lập được trong mùn khoan dầu khí mỏ Bạch Hổ –Vũng Tàu, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sử dụng dầu của chúng. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường khoáng Gost có bổ sung 5% dầu DO, lắc ở nhiệt độ 30o C trong 7 ngày. Khả năng sử dụng dầu được đánh giá định tính thông qua độ đục của môi trường và sự thay đổi trạng thái vật lí của các giọt dầu. Từ đó, chúng tôi tìm được 3 chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh là M150, MT3 và MX. Các chủng này lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.2. Đặc điểm hình thái của một số chủng phân huỷ dầu Các chủng vi khuẩn ria trên đĩa chứa môi trường hiếu khí tổng số 1% NaCl, để trong tủ ấm 30o C. Sau 24 giờ nuôi cấy đem ra quan sát hình thái khuẩn lạc, đồng thời cũng tiến hành nhuộm Gram để xác định hình thái tế bào, làm tiêu bản giọt ép để quan sát khả năng chuyển động. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1. Bảng 1. Đặc diểm hình thái của một số chủng vi khuẩn phân lập có khả năng phân huỷ dầu Kí hiệu chủng Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào MT3 Tròn dẹt, mép không đều, màu vàng nâu, hơi dẹt, khuẩn lạc to 2,5 -3 cm. Que ngắn, Gram âm, không có khả năng chuyển động MX Tròn đều, mầu xanh lá cây, bóng, lồi, khuẩn lạc nhỏ 1cm. Que ngắn, Gram dương, không có khả năng chuyển động. M150 Tròn đều, bóng lồi, mầu vàng, nhỏ 1 cm. Que ngắn, hơi cong, Gram dương, không có khả năng chuyển động. Hình1. Hình thái khuẩn lạc chủng M150 trên môi trường hiếu khí tổng số 1% NaCl 1.3. Khả năng sinh CHHBMSH của các chủng vi khuẩn phân huỷ dầu Để lựa chọn tiếp chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ khả năng tạo CHHBM của các chủng này. Khả năng tạo CHHBMSH được xác định bằng phương pháp Pruthi - xác định chỉ số nhũ hoá E24. Các chủng được nuôi lắc trên môi trường khoáng Gost chứa 5% (v/v) dầu DO. Theo dõi liên tục và đo chỉ số nhũ hoá E24 sau 5 ngày nuôi lắc, kết quả cho thấy chủng M150 có chỉ số nhũ hoá cao nhất là 69,8%, chủng MT3 là 59%, chủng MX là 63%, đặc biệt chủng M150 có tốc độ tạo CHHBM nhanh nhất chỉ sau 3 ngày nuôi lắc. Bảng 2. Khả năng sinh CHHBM của các chủng vi khuẩn Chủng E24 (%) M150 69,8 MT3 59,0 MX 63,0 Chủng M150 được lựa chọn nghiên cứu sâu hơn. Theo kết quả phân tích trình tự 16S rARN đã xác định chủng M150 thuộc loài Brevibacterium celere. Loài này mới được phát hiện vào năm 2004 [17], do đó, các nghiên cứu về chúng còn rất hạn chế. Do vậy để phục vụ cho các bước tiếp theo chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số các đặc điểm sinh lí sinh hoá của chủng này. 2. MỘT SỐ CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH LÍ SINH HOÁ CỦA CHỦNG M150 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa Để phục vụ cho các mục đích xây dựng môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng cũng như sự tạo CHHBM của chủng M150 trong các giai đoạn sau này chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ khả năng sử dụng một số nguồn cơ chất bằng các phép thử hoá sinh. Khả năng sử dụng một số cơ chất của chủng M150 được thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3. Khả năng sử dụng một số các nguồn cơ chất của chủng M150 STT Nguồn cơ chất Khả năng 1 NO3 + + 2 Tryptophan - 3 Gluco (kị khí) - 4 Arginin + + 5 Ure + + 6 Esculin - 7 Gelatin - 8 Gluco + + + 9 Gluconat + 10 Caprat - 11 Adipat + 12 Malat + 13 Citrat - 14 Phenylacetat - Trong đó: +++ là có khả năng sử dụng mạnh; + là sử dụng yếu ++ là sử dụng trung bình; - là không có khả năng sử dụng Vậy chủng M150 có khả năng khử nitrat thành nitrit, sử dụng arginin, ure, gluco ở điều kiện hiếu khí; sử dụng yếu gluconat, adipat, malat; chủng không có khả năng, gelatin, trytophan, escunin, caprat, ciprat và phenylacetat, gluco trong điều kiện kị khí 2.2. Động thái sinh tổng hợp CHHBM của chủng M150 CHHBMSH là một sản phẩm của quá trình trao đổi chất chúng được tạo ra trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Theo các tác giả thì lúc đầu chất hoạt hoá bề mặt tăng dần, đến một thời điểm nào đó nó giảm dần do một số các vi sinh vật sử dụng chúng làm nguồn thức ăn, hay vi sinh vật bị chết đi (đối với CHHBMSH là chính các tế bào vi sinh vật). Để có thể thu được lượng CHHBM cao nhất chúng tôi tiến hành xác định động thái sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng nghiên cứu. Chủng được nuôi lắc trên môi trường khoáng Gost, pH = 8, ở 30oC, bổ sung 5% dầu DO, theo dõi và đo liên tục chỉ số nhũ hoá E24. Động thái sinh tổng hợp CHHBM của chủng được thể hiện ở Hình 2. Hình 2. Động thái sinh tổng hợp CHHBM của chủng M150 Kết quả từ đồ thị cho thấy chủng bắt đầu tạo CHHBM từ 48 giờ và tăng dần lên, từ 96 giờ đến 120 giờ cao nhất đạt chỉ số nhũ hoá72.7% và không tăng nữa, đến 168 giờ giảm dần. Như vậy sau 4 ngày chủng cho lượng CHHBM cao nhất. Khoảng thời gian để sinh CHHBM cao nhất là tương đối ngắn so với các vi khuẩn Gram dương. 3. TỐI ƯU HOÁ ĐIỀU KIỆN TẠO CHHBM Sự tạo thành CHHBM của vi khuẩn chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường và dinh dưỡng. Trong phạm vi khoá luận này, chúng tôi khảo sát một số các yếu tố quan trọng như pH, nhiệt độ, độ mặn và nguồn cacbon. Các yếu tố này tác động tới quá trình phát triển và tạo CHHBMSH. Do đó chúng tôi tiến hành đo số lượng tế bào và chỉ số nhũ hoá E24 qua các thời điểm để lựa chọn được những thông số phù hợp cho sự phát triển và tạo CHHBM của chủng M150. 3.1. Khảo sát sự thay đổi của pH môi trường pH là yếu tố quan trọng và có ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của các loài nên nó được chọn để nghiên cứu đầu tiên. Theo các tác giả đã thông báo thì vi khuẩn thường có khả năng phát triển tốt nhất ở pH trung tính, thêm vào đó chủng này được phân lập từ mùn khoan là một nguồn chất có tính kiềm nên chúng tôi lựa chọn dải pH khá rộng từ 6 đến 9, ngoài mục đích xác định pH phù hợp, chúng tôi còn muốn đánh giá phạm vi chịu pH của chủng để tạo điều kiện thuận lợi cho các bước nghiên cứu về sau. Chúng tôi tiến hành chuẩn bị các bình chứa môi trường với các pH 6; 7; 7,5; 8,5; 9 có bổ sung 5% (v/v) dầu DO lắc với vận tốc 200 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Kết quả được thể hiện ở Bảng 4 và Hình 3. Bảng 4. Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và tạo CHHBM Thời gian (giờ) Log số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24(%) 6 7 7,5 8,5 9 6 7 7,5 8,5 9 0 4,8 4,8 4,8 4,8 4,8 0 0 0 0 0 48 6,1 6,7 7,2 6,1 5,3 0 0 4,4 0 0 72 6,6 - 8,6 6,2 5,4 0 22,2 26,6 9,0 2,2 80 7,0 7,9 9,1 7,5 6,9 0 54,4 59,0 13,2 4,4 96 7,6 8,2 9,7 8,3 7,2 4,4 63,5 59,0 54,4 31,1 104 7,7 - 9,0 - 7,7 9,0 68,1 72,7 68,1 59,0 168 - - - - - - 50,0 59,0 54,4 - Hình 3. Ảnh hưởng pH lên sự sinh trưởng và tạo CHHBM của M150 Kết quả cho từ Bảng 4 và Hình 3 cho thấy ở pH =7,5 thì cho chỉ số nhũ hoá cao nhất E24 =72,7% (ở 104 giờ) đồng thời với số lượng tế bào cao nhất lên tới hơn 10 9 CFU/ml. pH =6 thì cho chỉ số nhũ hoá cao thấp nhất E24 = 4,4%, ở pH = 7 cũng cho chỉ số nhũ hoá khá cao E24 = 68,1% vào 104 giờ. Như vậy ở pH = 7,5 là phù hợp nhất cho sự phát triển và tạo CHHBM của chủng vi khuẩn. pH = 7,5 được sử dụng tiếp cho các thí nghiệm về sau. 3.2. Khảo sát sự thay đổi nồng độ muối NaCl môi trường Do chủng phân lập từ mùn khoan dầu khí mỏ Bạch Hổ ngoài khơi Vũng Tàu nên việc kiểm tra độ mặn có ảnh hưởng như thế nào tới sự phát triển của vi khuẩn là rất quan trọng cho việc ứng dụng về sau. Chúng tôi chọn các thí nghiệm với dải nồng độ NaCl là 0%; 0,5%; 1%; 2%; 3% với nguồn cacbon là DO, pH =7,5, ở điều kiện nhiệt độ phòng. Ảnh hưởng của việc thay đổi nồng độ muối được biểu hiện ở Hình 4 và Bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng và tạo CHHBMSH Thời gian (giờ) Log của số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24 (%) C-0 C-0,5 C-1 C -2 C-3 E-0,5 E-0,5 E-1 E-2 E-3 0 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 0 0 0 0 0 24 5,4 6,3 5,8 5,2 4,8 0 0 0 0 0 48 6,3 6,8 7,0 5,4 5,0 0 0 0 0 0 72 7,0 7,9 7,3 6,0 5,4 0 26,6 0 0 0 80 7,3 8,6 7,8 7,2 6,1 0 36,5 4,4 0 0 96 8,2 8,9 8,4 7,8 6,7 4,4 59,0 13,2 0 0 Các số liệu cho thấy ở nồng độ muối C=0,5% thì số lượng tế bào là cao nhất và cũng ở chính nồng độ NaCl cho chỉ số nhũ hoá cao nhất E24= 59%. Các nồng độ muối 0%, 3% cho chỉ số nhũ hoá và lượng tế bào thấp nhất là 4,4% và 9%, nồng độ muối 1% và 2% cũng thấp hơn nhiều so vời ở nồng độ muối 0,5%. Vậy nồng độ muối 0,5% là thích hợp nhất cho sự phát triển cũng như là sự tạo CHHBM của M150. Nồng độ muối 0,5% dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự sinh trưởng và tạo CHHBM của chủng M150 3.3. Khảo sát sự thay đổi nhiệt độ môi trường Thí nghiệm được tiến hành ở nồng độ muối 0,5%; pH = 7,5; nguồn cacbon là dầu DO với các nhiệt độ là 22oC, 30oC, 37oC; kết quả được thể hiện ở Bảng 6 và Hình 5. Bảng 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng vào tạo CHHBM Thời gian (giờ) Log của số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24 (%) T-22 T-30 T-37 E-22 E-30 E-37 0 4,3 4,3 4,3 0 0 0 48 6,3 7,0 5,8 0 0 0 72 7,1 7,6 6,3 0 0 0 80 7,7 8,4 6,8 0 31,1 0 96 7,5 8,4 7,5 4,4 59,0 2,2 104 7,6 8,6 7,9 13,2 72,7 4,4 168 7,7 8,3 6,6 35,5 63,4 13,2 Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và tạo CHHBM của chủng M150 Từ số liệu thu được ở Bảng 6 và Hình 5 cho thấy, nhiệt độ thích hợp nhất cho việc tổng hợp CHHBM là 30o C. Nhiệt độ cao hay thấp hơn cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và tạo CHHBM của chủng thể hiện rõ ràng ở nhiệt độ 22oC và 37oC vi khuẩn tạo sinh khối ít và chỉ số nhũ hoá thấp. Vậy nhiệt độ 30o C là phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và tạo CHHBM trong số các nhiệt độ nghiên cứu. Nhiệt độ này đã được nhiều nhà khoa học thông báo là phù hợp cho sự phát triển của đa số các loài vi khuẩn. Nhiệt độ 30o C được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4. Khảo sát sự thay đổi nguồn cacbon Để thu được CHHBM cao nhất, nguồn cacbon cũng là một yếu tố quan trọng. Chúng tôi lựa chọn các nguồn cacbon là DO, paraffin, dầu oliu là các nguồn cacbon được thông báo là rất phù hợp cho sự tạo CHHBMSH và dầu saralin là nguồn cacbon trong mùn khoan cần xử lí. Tiến hành thí nghiệm với các nguồn cacbon DO, dầu saralin, paraffin, dầu oliu ở điều kiện nồng độ muối 0,5%; pH=7,5; điều kiện nhiệt độ phòng. Kết quả được thể hiện ở Bảng 7 và Hình 6. Bảng 7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự phát triển và tạo CHHBM Thời gian (giờ) Log số lượng tế bào (CFU/ml) Chỉ số nhũ hoá E24(%) DO Saralin Parafin Oliu DO Saralin Paraffin Oliu 0 4,9 4,9 4,9 4,9 0 0 0 0 48 6,8 7,1 5,9 6,3 0 0 0 0 72 8,2 8,7 7,3 7,1 17,7 9 0 0 96 9,6 9,5 8,5 7,1 54,4 41 13,2 0 168 8,3 4,2 8,4 7,2 50,0 35,5 31,2 0 Hình 6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CHHBM của chủng M150 Các số liệu cho thấy dầu DO là nguồn cacbon thích hợp nhất trong số các nguồn cacbon khảo sát cho sự tạo CHHBM của chủng M150 đồng thời cho sự phát triển của chủng chỉ số nhũ hoá đạt E24= 54,4 %. Như vậy ở điều kiện pH =7,5; nồng độ muối 0,5%; nhiệt độ 30oC và dầu DO là thích hợp cho chủng sinh trưởng và tạo CHHBMSH. Sự tạo thành CHHBMSH cũng song song với quá trình phát triển của chủng khi E24 tăng thì số lượng tế bào cũng tăng theo. Kết quả thu được cũng hợp lí vì CHHBM tạo ra nhằm mục đích giúp vi sinh vật sử dụng dễ dàng các nguồn cacbon không tan trong nước như các nguồn cacbon khảo sát. 4. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHHBMSH TẠO RA TỪ CHỦNG M150 4.1. Cấu trúc CHHBMSH Cấu trúc phân tử của chất hoạt hoá bề mặt do chủng M150 được nghiên cứu bằng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại. Kết quả thu được biểu diễn trên Hình 7 cho thấy trong cấu trúc phân tử của chất hoạt hoá bề mặt có chứa các nhóm chức -OH, CH2, CH. Nhóm – OH với các vị trí tương ứng với tần số giao động v = 1653/cm, v = 1079,09/cm, v = 3377,49/cm. Nhóm CH tương ứng với các vị trí có tần số giao động là v = 1379,29/cm Tại các vị trí có tần số giao động là v = 1735,42/cm là gốc dầu. Các nhóm chức này đều có mặt trong thành phần của chất hoạt hoá bề mặt sinh học đã được cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ công bố. Trong các nhóm chức nói trên thì nhóm -OH và đóng vai trò là tác nhân ưa nước. Nhóm CH, gốc dầu đóng vai trò là tác nhân kị nước. Tuy nhiên để có thể kết luận chính xác CHHBM do chủng tạo ra có thuộc nhóm trehalolipit như nhiều loài thuộc chi Brevibacterium hay không thì cần phải phân tích tiếp khối phổ. Hình 7. Phổ hồng ngoại của CHHBMSH do chủng M150 tạo ra 4.2. Hàm lượng CHHBMSH Sau khi đã xác định được điều kiện môi trường thích hợp và thời điểm sinh CHHBMSH cao nhất, chúng tôi tiến hành thu CHHBMSH để đánh giá hàm lượng cao nhất của nó trong 1ml dịch nuôi cấy. Sau khi lắc120h ở điều kiện pH =7,5; nồng độ muối 0,5%; nguồn cacbon là dầu DO; ở nhiệt độ 30oC, tiến hành thu CHHBMSH bằng cách kết tủa với acetone, sấy khô chân không rồi đem cân bằng cân phân tích được trọng lượng khô của CHHBMSH là 11,6 g/l. 4.3. Độ bền của CHHBM Do điều kiện thực tế xử lí ô nhiễm ở nhiệt độ rất cao, để có thể ứng dụng được, việc xác định khả năng chịu nhiệt của CHHBM là rất cần thiết. Độ bền của CHHBM được đánh giá thông qua nhiệt độ và thời gian lưu giữ nó. Khi tiến hành giữ ở nhiệt độ 100oC chỉ số nhũ hoá còn 92,8% sau 30 phút đun và 78% sau 1h. Độ bền còn được đánh giá ở 30oC và 55oC trong thời gian 3 ngày, 10 ngày, 15 ngày. Kết quả thể hiện ở Bảng 8. Bảng 8. Độ bền của CHHBM do chủng M150 sinh ra (%) Thời gian Nhiệt độ 3 ngày 10 ngày 15 ngày 30oC 100 100 92,8 55oC 100 89 80 Như vậy CHHBMSH tương đối bền với nhiệt: ở 30o C hoạt tính không mấy thay đổi sau 15 ngày, còn ở 55o C hoạt tính biến động hơn, ở 100oC hoạt tính còn đáng kể sau 30 phút. 5. ẢNH HƯỞNG CỦA CHHBMSH ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ DẦU CỦA QUẦN THỂ VI SINH VẬT TRONG MÙN KHOAN Sau khi đã có những kết quả về đặc tính của CHHBMSH do chủng M150 tạo ra. Chúng tôi tiến hành thu CHHBM, bổ sung vào trong môi trường chứa dầu saralin cùng với các vi sinh vật sử dụng dầu trong mùn khoan để đáng giá khả năng kích hoạt các vi sinh vật này phân huỷ dầu saralin và lượng CHHBM bổ sung có ý nghĩa ảnh hưởng. Kết quả thu được sẽ định hướng cho chúng tôi trong quá trình xử lí với quy mô lớn hơn. Ảnh hưởng của CHHBM được đánh giá thông qua tác động làm thay đổi số lượng vi sinh vật trong mùn khoan. Khi số lượng vi sinh vật tăng lên có nghĩa là các chủng này đã sử dụng dầu làm nguồn dinh dưỡng và lượng dầu giảm. Đây là cách thức để xử lí ô nhiễm dầu theo phương pháp biostimulation – lấy quần xã sinh vật bản địa làm trung tâm của quá trình xử lí ô nhiễm. Sự biến động số lượng vi sinh vật được thể hiện ở Bảng 9 Bảng 9. Ảnh hưởng của CHHBMSH lên số lượng vi sinh vật mùn khoan CHHBM bổ sung (ml) Số lượng vi sinh vật (CFU/ml) Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm 0 4,27.103 6,2.102 1 1,7.106 2 7,8.108 3 1,1.109 Kết quả cho thấy khi bổ sung CHHBM do chủng M150 vào trong môi trường chứa dầu làm tăng số lượng vi sinh vật trong mùn khoan nhiễm dầu. Số lượng vi sinh vật tăng lên rất cao tới 1 triệu lần so với ban đầu chỉ sau 4 ngày. Trong khi đó thí nghiệm không bổ sung CHHBM thì số lượng vi sinh vật giảm đi tới gần 10 lần. Khi bổ sung từ 2 đến 3ml CHHBMSH thì có ảnh hưởng làm tăng rõ rệt. Ở 2ml số lượng tế bào cũng tăng lên rất lớn bằng 70,9% so với khi bổ sung 3 ml. Lượng CHHBM bổ sung 3ml làm tăng số lượng vi sinh vật rõ nhất. Số lượng vi sinh vật tăng lên tới 109 CFU/ml. Vậy có thể kết luận CHHBM do chủng M150 sinh ra có tác động kích thích các vi sinh vật trong mùn khoan sử dụng dầu saralin. Lượng chất bổ sung là 3ml làm tăng rõ nhấtvà có ý nghĩa ứng dụng. KẾT LUẬN Từ 16 chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tầu đã lựa chọn được 3 chủng có khả năng sử dụng dầu cao là MT3, M150, MX. Trong đó chủng M150 có khả năng sử dụng dầu mạnh nhất có chỉ số nhũ hoá cao 72,7%. Chủng này đã được xác định là Brevibacterium celere và được lựa chọn để nghiên cứu tiếp Xác định được một số các đặc điểm sinh hoá của chủng M150: có khả năng khử NO3 thành NO2, sử dụng arginin, ure, gluco ở điều kiện hiếu khí, sử dụng yếu gluconat, adipat, malat, không có khả năng sử dụng, gelatin, trytophan, escunin, caprat, ciprat và phenylacetat, gluco trong điều kiện kị khí. Xác định được động thái sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng nghiên cứu mạnh nhất từ 96 giờ đến 144 giờ với chỉ số nhũ hoá E24 đạt 72,8%, hoạt tính bắt đầu giảm đi ở 168 giờ chỉ còn 50%. Xác định được điều kiện tạo CHHBM cao nhất ở pH =7,5; nhiệt độ phù hợp là 30o C; nồng độ NaCl thích hợp là 0,5 %, nguồn cacbon tạo CHHBM mạnh nhất trong các nguồn cacbon nghiên cứu là dầu DO. Khả năng tạo CHHBM cao nhất ở chủng M150 là 11,6 g/l. Xác định được độ bền của CHHBM theo nhiệt độ và thời gian: sau khi xử lí nhiệt độ ở 1000 C hoạt tính còn lại 92,8% sau 30 phút và 78% sau 1 giờ, còn 100% hoạt tính sau 10 ngày giữ ở 30oC chỉ giảm còn 92,8% sau15 ngày giữ, ở 55oC thì hoạt tính giảm mạnh hơn sau 10 ngày còn 89%. Kết quả thí nghiệm cho thấy CHHBM do chủng M150 sinh ra có tác dụng tăng cường khả năng phân huỷ dầu. Tác động mạnh khi bổ sung 2 đến 3 ml. Kết luận CHHBMSH do chủng này sinh ra có khả năng ứng dụng để xử lí mùn khoan. PHỤ LỤC Hình 8. Khả năng nhũ hoá của chủng M150 với các nguồn cacbon khác nhau Hình 9. Khả năng nhũ hoá của CHHBMSH ở các nhiệt độ khác nhau Hình 10. Ảnh hưởng của pH tới khả năng phát triển và nhũ hoá dầu của chủng M150 Hình 11. Khả năng nhũ hoá của chủng M150 với các nồng độ muối khác nhau Hình 12. Hình thái tế bào của chủng M150 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Đinh Thị Ngọ,(2001), Hoá học dầu mỏ và khí, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật. Doãn Thái Hoà, Phan Văn Lập, Trần Đình Mấn, Nguyễn Đình Việt, Lại Thuý Hiền, (2003), “Nghiên cứu ảnh hưởng của CHHBMSH tạo ra từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ASB lên tính lưu biến của dầu thô Bạch Hổ”. Lại Thuý Hiền, (1997), Giáo trình cao học vi sinh học dầu mỏ, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, chung tâm khoa học tự nhiên và tài nguyên quốc gia. Lại Thuý Hiền, Đỗ Thu Phương, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng, Lê Phi Nga, Lê Thị Nhi Công, Kiều Hữu Ảnh, (2003), “Chọn chủng vi sinh vật tạo CHHBMSH cao ứng dụng trong công nghiệp dầu khí và xử lí môi trường”. Tạp chí thông tin dầu khí thế giới số 7/ 2005. Tài liệu tiếng Anh Abu-Ruwaida A. S., I. M. Banat., S. Haditirto., S. Salem., and M. Kadri., (1991), “Isolation of biosurfactant production bacteria – product characterization and evaluation”. Acta. Biotechnol, pp. 315- 324. Asselineau C., Asselineau J. P., (1978), Chem. Fats Lipid, 16, pp. 59 -99. Banat I.M., (1995), “Characterrization of biosurfactant and their use in pollution removal”, Acta. Biotechnol, pp. 251-267. Barksdate L. and Kim K. S., (1977), Bacteriol. Rev., pp .217 -230. Belsky J., Gutnick D. L., Rosenberg E., (1979), “Emulsifier of Athrobacter RAG- 1: Determination and emulsifier bound fat acid”. REFBS Letts., pp. 175 -178. Borraccino R., Kharoune M., Giot R., Agathos S.N., Nyns E.J., Naveau H.P., Pauss A., (2001), “Abiotic transformation of catechol and 1 – naphthol in aqueous solution – influence of environmental factors”. Water research, 35, pp. 3729 -3737. Cameron D.R., Cooper D. G., Neufeld R. J., (1988), “The manoprotein of Sacharomyces cerevisiae is an effective bioemulsifier”. Environ. Microbiol, pp. 1420-1425. Cooper D. G., Pillon D. W., Mulligan C. N., Sheppard J. D., (1986), “Biological additives for improved mechanical dewatering for fuel- grade peal”, Fuel, pp. 255-259. Cooper D.G., Zajic J.E., Denis C., (1981), Oil Chem. Soc., pp.77-80. Davis J.B., (1967), “Petroleum microbialogy”, Amsterdam Elvevier. Publ. Co Elvervier. Desai J.D., Banat I.M. (1997), “Microbial production of surfactants and their commercial potential”, Microbiol. Biol. Rev., 61, pp. 47 -64. Elenap I., Richard C., Yulia A., (2006), “Brevibacterium celere sp. Nov., isolated from degraded thalluses of the brown algae”. Fautz B., Wagner F., (1986), Biotech. Lett, pp. 757-760. Fogt J.M., Westlake D.W., Johnson W.M., Ridgway H.F., (1996), “Environmental gasoline-utilizing isolates and clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are taxonomically indistinguishable by chemotaxonomic and molercular techniques”, Microbiol., 142, pp. 2333-2340. Guerra-Santos L. H., Kappeli O., Feichter A., (1984), “Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose carbon sources”. Appl. Environ. Microbiol, pp. 301-305. Guerra-Santos L., Kappeli O., Feichter A., (1986), Appl. Microbiol. Bioltechnol, pp. 443-448. Hauser G., Karnovsky M. L. J., (1954), Bacteriol., pp. 645-654. Health and safety laboratory, (2000), “Drilling fluid composition and use within the UK offshore drilling industry”. Ito S., Inoue S., (1982), Biotechnol. Microbiol., pp. 173 -176. Kappeli O., Fiechter A., (1977), “Chemical and structural alterations at the cell surface of Candida tropicalis, induced by hydrocacbon substrate”. J. Bacteriol., pp. 952-958. Kappeli O., Finerty W. R., (1979), “Partition of ankane by an extracellular vesile derived from hexandecane grown Acinetobacter”. J. Bacteriol, pp. 707-712. Leahy J.G., Colwell R.R., (1999), “Microbial degradation of hydrocarbon in the environment”. Microbiol. Rev., 54, pp. 305-315. Marahiel M., Danders W., Kcause M., Kleikauf H., (1979), Biochem., pp. 59 – 52. Margaritis A., ZaZic. J. E., (1979), “Production and surface active properties of microbial surfactant”. Biotechnol. Bioeng., pp. 1151-1162. Karanth N. G. K., Deo P. G., Veenadig N. K., (2000), “Microbiol production of biosurfactants and their importance”. Kosaric N., (1992), “Biosurfactant in industry”. Parkinson M., (1985), Biotechnol. Adv, pp. 65-83. Peypox F., Bonmatin J. M., (1999), “Recent trends in the biochemistry of surfactant”, Appl. Microbiol. Biotechnol, 51, pp. 553-563. Randhirs M., Karl J. R., (2003), “Comparison of synthetic surfactants and biosurfactants in enhancing biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbon”. Rubino W. C., Gutnick D. L., Appl. Environ. Microbiol., (1979), pp. 402-408. Ruhn H. J., Reiff I., (1981), Biochem. Eng., pp. 175 -216. Saferty date sheet – saralin 200, (2003). Yakimov M. M., Timmis K. N., Wray V., Fredrickson H. J., (1995), “Characterization of new lipopedtide surfactant produced by thermotolerant and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis ABS50”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 61, pp.1706-1713.