Đề tài Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt. Đây cũng là cây trồng có vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong đó có Việt Nam [7], [11]. Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất, do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [4], [5]. Hiện nay, các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém và thường bị nhiễm một số bệnh như: sâu keo, sâu xanh… Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về đậu xanh đã tiếp cận phân tích các đại phân tử protein và DNA như: nghiên cứu tính đa hình protein của các giống đậu xanh địa phương bằng kỹ thuật phân tích thành phần điện di protein dự trữ trong hạt, nghiên cứu hiện tượng đa dạng DNA được nhân bản ngẫu nhiên [6], [10], [17]. Một số nghiên cứu về khả năng chịu hạn đã được tiến hành trên một số loại cây trồng như đậu tương, ngô, lúa… [1], [2], [9]. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính chịu hạn của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong đó có gen LTP (Lipid Transfer Protein). LTP là gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì. Khi gặp stress hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [36]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quan giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen LTP với khả năng chịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo cây đậu xanh chịu hạn. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu thông qua phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của một số giống đậu xanh. Phân lập và nghiên cứu cấu trúc của gen LTP liên quan đến tính chịu hạn. 3. Nội dung nghiên cứu Phân tích một số đặc điểm hình thái như: màu gốc thân mầm, màu vỏ hạt, hình dạng hạt, khối lượng 1000 hạt, chiều dài thân và rễ của các giống đậu xanh thu thập được ở giai đoạn cây non. Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh sau: hàm lượng lipid, protein tan tổng số của các giống đậu xanh thu thập được. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh thu thập được ở giai đoạn cây non. Tách chiết DNA tổng số của 1 số giống đậu xanh. Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Tách dòng gen LTP của giống đậu xanh chịu hạn tốt và chịu hạn kém nhất. Xác định trình tự gen LTP. Phân tích cấu trúc gen LTP. 4. Ý nghĩa khoa học Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo cây đậu xanh mang gen LTP. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), có bộ NST 2n = 22, là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo. Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các nước Đông và Nam Á. Dạng dại của V. radiata cũng được tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [11]. Phân loại khoa học của cây đậu xanh: Giới (regnum): Plantae Ngành (division): Magnolyophita Lớp (class): Magnolyopsida Bộ (order): Fabales Họ (Familia): Fabaceae Chi (genus): Vigna Loài (species): V. radiata Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm khoảng 150 loài thuộc 7 chi phụ là Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron; Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, trong đó đậu xanh là một trong số 16 loài của phân chi Ceratotropis [5]. 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt. Đặc điểm của rễ Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biển đổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây. Tuy nhiên, bộ rễ của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng chịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém. Nếu bộ rễ phát triển tốt thì bộ lá xanh lâu, cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy. Ngược lại, bộ rễ phát triển kém thì cây sẽ chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ bị lép [7], [11]. Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cổ định đạm Rhizobium. Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật và đạt tối đa khi cây ra hoa rộ. Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tập trung chủ yếu ở cổ rễ. Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đường kính dao động từ 4 - 5 mm, so với đậu tương và lạc thì nốt sần của cây đậu xanh ít và nhỏ hơn. Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còn các lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn. Người ta nhận thấy rằng những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnh hơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng. Trung bình mỗi vụ, 1 ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn [8], [9]. Đặc điểm của thân và cành Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40 - 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có màu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc. Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng. Độ dài của các lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác. Các lóng dài khoảng 8 - 10 cm, các lóng ngắn chỉ 3 - 4 cm. Từ các đốt mọc ra các cành, trung bình có 1 - 5 cành. Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triển mạnh gọi là cành cấp I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2 - 3 mắt, từ các mắt này mọc ra các chùm hoa. Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùm hoa. Thời kỳ trước khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm, sau đó mới tăng nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc đã có quả chắc. Đường kính trung bình của thân chỉ từ 8 - 12 mm và tăng trưởng tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [11]. Đặc điểm của lá Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi thân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn. Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên và dưới của lá đều có lông bao phủ. Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên, các lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn. Chỉ số diện tích lá (m2 lá/m2 đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch. Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc vào giống, đất trồng và thời vụ [5], [11]. Đặc điểm của hoa Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to, xếp xen kẽ nhau ở trên cuống. Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt đều có khả năng ra hoa. Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoa hình thành , sau 35 - 40 ngày thì nở hoa. Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày. Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10 cm và có từ 10 - 125 hoa. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu xanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt [11]. Hoa đậu xanh thường nở rải rác, các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn chậm hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây. Trên cùng một cành, các chùm hoa cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10 - 15 ngày. Trong một chùm hoa cũng vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh 10 - 15 ngày. Hoa nở được 24h là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là quả chín. Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây. Công thức hoa là: K5C5A10G1. Thời gian nở hoa có thể chia thành 3 nhóm: - Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài < 16 ngày. - Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp > 30 ngày. - Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày. Đặc điểm của quả Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài 8 - 14 cm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2 gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen... gặp nắng rễ bị tách vỏ. Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có từ 5 - 10 hạt. Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn. Mật độ lông phụ thuộc vào đặc điểm của giống và khả năng chống chịu của cây. Những giống đậu xanh chống chịu bệnh khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lông dày, vào thời kì chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [4], [5]. Các quả của những lứa hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ra lứa sau đó, nhưng quả to và hạt mẩy hơn. Các quả của những đợt hoa ra sau thường ngắn, ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn. Các quả sinh ra từ các chùm hoa trên thân nhiều quả và quả to, dài hơn quả của các chùm hoa ở cành. Quả đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày [8]. Đặc điểm của hạt Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non. Mầm non là nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên. Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và có nhiều màu sắc khác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả. Ruột hạt màu vàng, xanh, xanh nhạt. Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của hạt. Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt. Hạt của những quả trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành. Hạt của các quả lứa đầu cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau. Số lượng hạt trung bình trong một quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh. Trọng lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống, thời vụ và chế độ canh tác. Trọng lượng 1000 hạt từ 50 - 70 gam [4]. 1.1.3. Sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh Sinh trưởng và phát triển của đậu xanh là kết quả thể hiện các đặc điểm của giống trong các mối quan hệ tương tác chặt chẽ với các điều kiện môi trường bên ngoài và với các yếu tố kỹ thuật canh tác. Cần lưu ý, cây đậu xanh có khả năng vừa sinh trưởng sinh dưỡng, vừa sinh trưởng sinh thực đồng thời ở một số giai đoạn phát triển [11]. Có 2 giai đoạn sinh trưởng và phát triển chủ yếu ở đậu xanh: - Các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (SD) - Các giai đoạn sinh trưởng sinh thực (ST) Bảng 1.1. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh Sinh trưởng sinh dưỡng Sinh trưởng sinh thực Ký hiệu Thể hiện bên ngoài Ký hiệu Thể hiện bên ngoài SDm Hạt nảy mầm ST1 Cây bắt đầu ra hoa SDl Lá mầm xuất hiện ST2 Hoa phát triển đầy đủ SD1 Hình thành đốt thứ nhất ST3 Bắt đầu hình thành quả SD2 Hình thành đốt thứ hai ST4 Quả phát triển đầy đủ SD3 Hình thành đốt thứ ba ST5 Bắt đầu hình thành hạt ..... ST6 Hạt phát triển đầy đủ SDn Hình thành đốt thứ n ST7 Hạt bắt đầu chín ST8 Hạt chín hoàn toàn * Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (SD): Được bắt đầu bằng thời kỳ SDm, là lúc hạt đậu giống nảy mầm. Tiếp theo là thời kỳ SDl, lúc này cây bắt đầu xuất hiện lá mầm. Các thời kì tiếp theo là SD2, SD3...tương ứng với thứ tự hình thành các đốt trên cây. Kết thúc giai đoạn SDn tương ứng với số đốt cuối cùng trên cây. Số đốt hình thành trên cây đậu xanh thay đổi tùy thuộc vào đặc điểm của giống. * Giai đoạn sinh trưởng sinh thực của đậu xanh (ST): Được chia thành 8 thời kì bắt đầu từ ST1 đến ST8, tương ứng với các thời kì hình thành hoa, quả, hạt đậu. Cây đậu xanh có đặc điểm sinh trưởng vô hạn hoặc bán vô hạn, nên việc xác định các thời kì sinh trưởng sinh thực thường gặp nhiều khó khăn, vì trên một cây đồng thời vừa có cả nụ, hoa, quả non và quả chín. Vì vậy, thời kì sinh thực của đậu xanh chỉ mang tính chất tương đối. Các thời kỳ sinh dưỡng, có thể gọi là các thời kỳ hình thành đốt trên cây đậu xanh (không kể thời kỳ SDm và SDl), các thời kỳ tiếp theo của sinh dưỡng được tính bằng số đốt đã mang lá hoàn chỉnh. Một đốt được xem là hoàn chỉnh khi đốt phía trên nó có một lá kép đã xòe rộng (không còn cuốn nữa). Đốt lá đơn là đốt đầu tiên có hai lá đơn mọc đối diện hai bên thân và có cuống lá ngắn nhất. Các lá thật trên thân đều có 3 lá chét, mọc cách trên thân chính với cuống lá dài [5], [11]. 1.1.4. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12% nước, các vitamin B1, B2, C… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K … [11]. Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giá chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinh trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm... Trong đó, hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây là protein và lipid. 1.1.4.1. Protein Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn cung cấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi. Trong hạt đậu xanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hai nhóm: nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp. Trong nhóm protein đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loại khác. Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt [11]. Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tính chất chung nhất của protein. Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tính chất riêng biệt như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hoà tan trong nước. Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu và công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh. Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ các amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng với tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra [20]. 1.1.4.2. Lipid Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hoà tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ether, petroleum ether, benzen... Lipid cũng là thành phần cấu tạo quan trọng của màng sinh học, là nguồn dự trữ nhiên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể. Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nẩy mầm của hạt. Tuy hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bình khoảng 1,3%) [11], nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩm chất và khả năng bảo quản hạt. Tóm lại, việc nghiên cứu và xác định hàm lượng protein và lipid có ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá chất lượng hạt đậu xanh. 1.1.5. Tầm quan trọng của cây đậu xanh Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24 - 28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P... cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C... Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, valine... Hạt đậu xanh không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đỗ và một số đồ uống... Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa. Thân, lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [4], [5]. Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học, vỏ hạt đậu xanh có vị ngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [13]. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ hệ rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [11]. 1.1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu xanh 1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới Hiện nay, công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến hành theo một số hướng chính sau: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao chất lượng, tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng kháng sâu, bệnh hại [1], [10]. Để tạo các giống đậu xanh có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, các nhà khoa học đã tập trung vào nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và các gen liên quan đến khả năng chống chịu của cây đậu xanh. Nghiên cứu về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhằm chọn tạo ra các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt. Liu K.H. và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen LTP ở đậu xanh, đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41]. Pandurangam V. và cs (2006) đã nghiên cứu biểu hiện gen Rubisco ở đậu xanh [47]. Chen Y.J. và cs (2004) đã tiến hành phân lập ba gen Hsc70 ở đậu xanh là VrHsc70 - 1, VrHsc70 - 2, VrHsc70 - 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chịu hạn, chịu nóng [28]. Kim Y. J. và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3 với chiều dài của gen là 5213 nucleotide, vùng mã hoá gồm 1776 nucleotide mã hoá cho 591 amino acid, có khối lượng phân tử 67,4 kDa [40]. Kang S. J. và cs (2002) đã phân lập gen cystatin ở đậu xanh với mã số AF454396 trên Ngân hàng gen quốc tế [37]. Gần đây, nhiều nhà khoa học cũng bàn luận về mối liên quan giữa cystatin với hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật, chống côn trùng, vi sinh vật gây bệnh. Malgorzata G. và cs (2004) đã tiến hành phân lập gen mã hoá cystatin ở đậu xanh nhằm nghiên cứu, chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chống chịu tốt [42]. Trong tương lai, với sự phát triển ngày càng mạnh của khoa học kỹ thuật, các loại cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng sẽ còn được nghiên cứu kĩ hơn, sâu hơn để có thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng đậu xanh ngày càng lớn của con người. 1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ở Việt Nam Từ sau cách mạng tháng tám năm 1945, chúng ta đã xây dựng được nhiều trạm nghiên cứu thí nghiệm về đậu đỗ nói chung và về đậu xanh nói riêng ở nhiều nơi khác nhau như ở Định Tường (Thanh Hoá), Mai Nham (Vĩnh Phúc), Pú Nhung (Lai Châu), Thất Khê (Cao Bằng) và đã tiến hành thu thập, chọn tạo ra nhiều giống mới với các đặc tính ưu việt hơn trước. Từ những năm 1980 đến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu về đậu xanh như: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện cây lương thực thực phẩm, các trường Đại học Nông nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khoa học khác. Các Trung tâm này đã tập trung và đi sâu vào hai hướng nghiên cứu cơ bản trong sản xuất đậu đỗ nói chung và đậu xanh nói riêng là: - Chọn tạo giống thích hợp cho từng vùng sinh thái, từng mùa vụ khác nhau, giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi, đặc biệt là các giống có giá trị thương mại cao. - Đưa cây đậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thống trồng độc canh hoá ở các vùng và cải tạo các vùng đất bị thoái hoá [4], [5]. Với những định hướng trên, công tác chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta đã được quan tâm phát triển và đã đạt được một số thành tựu nổi bật sau: Lê Khả Tường và cs (2000), nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, khả năng chống chịu sâu bệnh hại và thử nghiệm giống KP11. Kết quả đã được Hội đồng khoa học công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật năm 2001 áp dụng cho vùng Bắc Trung Bộ [9]. Chu Hoàng Mậu (2001), bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm đã tạo được 2 dòng đậu xanh MX1103 và TX16012 có năng suất cao, ổn định và có khả năng chịu hạn tốt [15]. Chu Hoàng Mậu (2001) đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng protein, thành phần và hàm lượng các amino acid trong hạt các giống đậu xanh đột biến và giống gốc để đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh. Kết quả cho thấy hạt của giống đậu xanh đột biến MX103 có hàm lượng protein là 20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lượng amino acid của các giống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng [16]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) đã nghiên cứu một số chỉ tiêu hoá sinh của 9 giống đậu xanh do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. Kết quả cho thấy hàm lượng protein của các giống này dao động trong khoảng 20,72% - 26,86% [17]. Cùng với việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu đậu xanh của các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước đầu cũng có nhiều ứng dụng và đã thu được những kết quả khá quan trọng. Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập các gen liên quan đến khả năng chống chịu như gen chịu hạn, chịu nóng, chịu muối... và đánh giá quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh. Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 57 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RADP [6]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3 (Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống đậu xanh KP11 và MN93. Gen có chiều dài 4215 nucleotide gồm 8 đoạn intron và 9 đoạn exon, vùng exon gồm 1776 nucleotide mã hoá 591 amino acid [18]. Nguyễn Thị Thu Trang (2008) đã phân lập gen cystatin có khả năng chịu hạn ở 2 giống đậu xanh là DX208 và PAEC3 [21]. 1.1.6.3. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ngày một tăng. Đặc biệt, trong những năm gần đây do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật tăng nhanh đã làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh trên thế giới phát triển mạnh. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á đóng tại Đài Loan đã có một bộ sưu tập giống đậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống, trong đó có những giống cho năng suất cao từ 18 - 25 tạ/ha. Gần đây, một số nước láng giềng của Việt Nam như Thái Lan, Philippin, Trung Quốc... đã chọn ra được những giống đậu xanh cho năng suất từ 10 - 12 tạ/ha trở lên, hạt to, màu hạt đẹp, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, có sức chống chịu tốt với các điều kiện cực đoan của môi trường [11]. Cho đến nay, trên thế giới cây đậu xanh được trồng với diện tích khoảng 928 ngàn ha, sản lượng đạt hơn 6445 triệu tấn (2002 - 2006). Ấn Độ là nước trồng nhiều đậu xanh nhất với diện tích 15000 ha (năm 2008), chiếm trên 70% diện tích đậu xanh toàn cầu, sản lượng đạt 420000 tấn (2008), năng suất đạt 2800 kg/ha (2008). Thái Lan là nước sản xuất lớn thứ hai và là nước đứng đầu về xuất khẩu đậu xanh với sản lượng đạt 92000 tấn (năm 2008), chiếm khoảng 40% sản lượng thế giới. Nước nhập nhiều đậu xanh nhất là Nhật 80 tấn/năm, Hoa Kỳ 50 tấn/năm [33]. Diện tích, năng suất, sản lượng của đậu xanh trên toàn thế giới trong 5 năm gần đây được thể hiện trong bảng sau: Bảng 1.2. Diện tích, sản lượng, năng suất đậu xanh trên thế giới trong 5 năm gần đây Năm 2004 Năm 2005 Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Diện tích (ha) 940188 938893 943149 938112 985679 Sản lượng (tấn) 6551886 6578870 6816377 6752646 6818948 Năng suất (kg/ha) 6968,6 7007 7227,2 7198,1 6918 Nguồn: FAOSTAT, 2008. 1.1.6.4. Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam Ở Việt Nam, cây đậu xanh cũng được trồng từ lâu đời ở các vùng đồng bằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước. Tuy nhiên, nó vẫn chỉ được xem như một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng đất đai, lao động dư thừa... Vì thế, năng suất sản xuất đậu xanh còn chưa cao. Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản xuất đậu xanh bình quân đạt khoảng 5,5 - 12 tạ/ha. Từ 1996 - 2000 năng suất dao động trong khoảng 15 - 20 tạ/ha. Đến năm 2000, Việt Nam có diện tích và sản lượng đậu xanh đứng thứ 6 trên thế giới [9]. Đậu xanh của nước ta sản xuất ra chủ yếu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước như làm rau, làm bánh.... Các sản phẩm làm từ đậu xanh rất phong phú, nhưng hiện nay chỉ có một số ít sản phẩm có chất lượng ổn định và có thương hiệu lâu năm trên thị trường [20]. Đậu xanh phân bố chủ yếu ở các vùng: - Vùng núi phía Bắc: Tập trung ở các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình. Năng suất trung bình đạt 600 kg/ha. - Vùng đồng bằng và trung du Bắc Bộ: Năng suất trung bình dao động 800 - 1000 kg/ha. - Vùng duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên: Là vùng sản suất đậu xanh lớn về diện tích và sản lượng. Nhưng do ảnh hưởng của thời tiết nên cũng thất thu nhiều về năng suất và sản lượng. - Vùng Đông Nam Bộ: Là vùng sản xuất đậu xanh quy mô lớn chiếm 26% diện tích gieo trồng cả nước, năng suất bình quân còn thấp đạt khoảng 500 kg/ha do sử dụng giống đậu xanh cũ, khả năng chống chịu kém [5]. Ngày nay, đậu xanh có xu hướng tăng về diện tích và sản lượng do nhu cầu sử dụng. Để đạt được kết quả tốt cần có các phương pháp lai tạo, chọn ra các giống mới có năng suất cao, chống chịu được với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường ngoại cảnh. 1.2. GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 1.2.1. Hạn và tác động của hạn đối với cây trồng 1.2.1.1. Hạn và các loại hạn đối với cây trồng Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong thực vật. Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, từ đó ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng cây trồng [10]. Có 3 dạng hạn đối với thực vật là: hạn đất, hạn không khí và hạn sinh lý. Hạn đất Hạn đất xảy ra khi lượng nước dự trữ cho cây hấp thu trong đất bị cạn kiệt nên cây không hút đủ nước và mất cân bằng nước. Hạn đất thường xảy ra ở các vùng có lượng mưa trung bình rất thấp và kéo dài nhiều tháng trong năm như các tỉnh miền Trung, Tây nguyên... vào mùa khô. Hạn không khí Hạn không khí xảy ra khi độ ẩm không khí quá thấp làm cho quá trình thoát hơi nước của cây quá mạnh và cũng có thể dẫn đến mất cân bằng nước trong cây. Hạn không khí thường xảy ra ở các vùng có gió khô và nóng như gió Tây Nam của các tỉnh miền Trung, mùa khô ở Tây Nguyên hoặc đôi lúc gió mùa Đông Bắc cũng có độ ẩm không khí thấp. Hạn sinh lý Hạn sinh lý xảy ra khi trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây hút được nước mặc dù trong môi trường không thiếu nước. Rễ cây không lấy được nước trong khi quá trình bay hơi nước vẫn diễn ra nên cây mất cân bằng nước. Hạn sinh lý nếu nghiêm trọng và kéo dài cũng tác hại như hạn đất và hạn không khí. Nếu hạn đất kết hợp với hạn không khí thì mức độ tác hại đối với cây còn tăng lên nhiều. 1.2.1.2. Tác hại của hạn đối với cơ thể thực vật Hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi mạnh: - Thay đổi các tính chất lý hoá của chất nguyên sinh: tăng độ nhớt chất nguyên sinh làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năng thuỷ hoá và tính đàn hồi của keo nguyên sinh chất… - Thay đổi đặc tính hoá keo từ trạng thái sol rất linh động thuận lợi cho các hoạt động sống sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động, cản trở các hoạt động sống. Quá trình trao đổi chất lúc thiếu nước sẽ bị đảo lộn từ hoạt động tổng hợp là chủ yếu khi đủ nước chuyển sang hướng phân giải khi thiếu nước. Quá trình phân giải quan trọng nhất là phân giải protein và axit nucleic, kết quả là giải phóng và tích lũy NH3 gây độc cho cây và có thể làm cây chết. Hoạt động sinh lý bị kìm hãm - Thiếu nước sẽ ức chế hoạt động quang hợp. Do khí khổng đóng nên thiếu CO2, lục lạp có thể bị phân huỷ, ức chế tổng hợp diệp lục, lá bị héo và khô chết, diện tích quang hợp giảm, sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn. - Thiếu nước ban đầu sẽ làm tăng hô hấp, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệu quả sử dụng năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh nhiệt là chính. - Hạn làm mất cân bằng nước trong cây: lượng nước thoát ra lớn hơn lượng nước hấp thu vào cây làm cho cây bị héo. - Dòng vận chuyển vật chất trong cây bị ức chế rất mạnh: sự hút chất khoáng giảm do tốc độ dòng thoát hơi nước giảm. Thiếu nước kìm hãm tốc độ vận chuyển chất đồng hoá về các cơ quan dự trữ và có thể có hiện tượng “chảy ngược dòng” các chất đồng hoá từ các cơ quan dự trữ về các cơ quan dinh dưỡng. Kết quả làm giảm năng suất kinh tế của cây trồng. Quá trình sinh trưởng và phát triển bị kìm hãm - Ức chế sinh trưởng: thiếu nước thì đỉnh sinh trưởng không tiến hành phân chia được, quá trình dãn của tế bào bị ức chế làm cho cây sinh trưởng chậm nên nước được xem là yếu tố nhạy cảm trong sự sinh trưởng của tế bào. - Ức chế ra hoa, kết quả: thiếu nước ảnh hưởng đến quá trình phân hoá hoa và đặc biệt là quá trình thụ tinh. Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm, ống phấn không sinh trưởng được, sự thụ tinh không xảy ra và hạt sẽ bị lép, dẫn đến giảm năng suất cây trồng. 1.2.2. Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn Thực vật có khả năng ngăn ngừa thương tổn khi bị tổn thương gọi là tính chống chịu. Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, sương… Khi các nhân tố này vượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, dẫn đến giảm năng suất. Phản ứng chủ yếu của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng, giảm sự thoát hơi nước, giảm quang hợp, tăng tích lũy ABA, prolin, manitol, sorbitol… Nhờ vậy mà thực vật có thể thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường ngoại cảnh. Một trong những xu hướng để thực vật chống lại hạn là dựa vào khả năng làm tăng áp lực nội tại, tăng tính đàn hồi của màng tế bào cũng như giảm kích thước tế bào. Trên phương diện hóa sinh, thực vật xảy ra nhiều biến đổi nhằm chống lại hạn hán như giảm phức hợp CO2, giảm tổng hợp protein và các axit nucleic, tăng hoạt tính RNase và hàm lượng prolin, tăng nồng độ các chất hòa tan. Ngoài ra, thực vật còn chống lại sự khô hạn bằng cách giữ không để mất nước hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nước thông qua những sự biến đổi về cấu trúc và hình thái như: rễ to, khỏe, dài, có khả năng xuyên sâu; giảm diện tích lá; rút ngắn chu kỳ sống…[18]. Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của đậu xanh nói riêng và tính chống chịu của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý hoá sinh và do nhiều gen quy định. Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease, các gen điều khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA, LTP, PLC...) [10]. Vai trò của bộ rễ: khả năng nhận nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ. Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khoẻ, mập thì có khả năng hút nước ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài sẽ có khả năng lấy được nhiều nước. Ở cây đậu xanh, hình thái rễ rất đa dạng. Các giống đậu xanh địa phương thường có bộ rễ dài hơn các giống khác. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính của tế bào khi bị mất nước do hạn, nóng, lạnh... Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất. Các chất và các gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để cạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K+; các amino acid như prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol và các chất khác như glycine betain, b- alanin betain. Các chất này có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ [19]. Abscisic acid (ABA) là hormone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh sinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với môi trường của thực vật bậc cao. ABA chủ yếu được tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress nhờ gen cis-epoxycarotenoids với sự tham gia của enzyme 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase [46]. ABA đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình của tế bào thực vật như: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nẩy mầm, sinh trưởng phát triển và đáp ứng với stress của môi trường. Đối với stress hạn, ABA có vai trò điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất nước làm cây thích nghi với điều kiện khô hạn. Về cơ chế tác động người ta cho rằng ABA làm biến đổi điện thế hoá qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K+ [38]. Các nhân tố gây ức chế protease: khi stress hạn xảy ra, các protein bị biến tính và bị tổn thương. Cystein protease tham gia loại bỏ các protein biến tính. Quá trình này có thể bị cản trở bởi các chất ức chế cystein protease gọi là cystatin [42]. Các gen điều khển phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển (cis acting element) trên vùng khởi động gen (promotor) và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng. Có nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn đã được quan tâm nghiên cứu như: DREB, ABEB, NAC, MYB, MYC, bZIP, WRKY. Mỗi nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển tính chịu hạn có trật tự cis acting element riêng biệt và promotor trên mỗi gen chức năng chứa một hay nhiều nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã. Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn được biết đến là: protein sốc nhiệt (Heat Shock Protein - HSP), môi giới phân tử (Molecular chaperone), protein LEA (Late embryogenesis abundant), Phospholipase C (PLC), protein vận chuyển lipit (LTP). HSP được tổng hợp trong quá trình sinh trưởng, các giai đoạn biệt hóa các mô, thời kì sinh sản, đặc biệt được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như hạn, nhiệt độ cao, muối cao. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy của stress. Dựa vào khối lượng phân tử người ta chia HSP ở thực vật thành 6 nhóm khác nhau: HSP 8.5, 20, 60, 70, 90, 110kDa. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (MGPT) (HSP70, HSP60) nhưng cũng có những HSP không phải là môi giới phân tử, ví dụ HSP 8,5 kDa (Ubiquitin). Các MGPT là yếu tố chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các điều kiện sinh trưởng cực thuận và đối lập. Chức năng chính của MGPT là tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới được tổng hợp, chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự hủy hoại protein chưa tạo cấu trúc không gian, khởi đầu cho sự phân hủy protein biến tính [10]. MGPT có 5 họ chính là: HSP 70 (Dnak), HSP 60 (Chaperonin), HSP 90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môi giới phân tử được nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70. HSP70 đã được phân lập ở đậu xanh [28]. Protein LEA cũng được chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu nước [32], [50], [58], [59]. Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chính trên cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó: nhóm 1-D19, nhóm 2-D11 (dehydrin), nhóm 3-D7, nhóm 4-D113, nhóm 5-D29 [30]. Protein LEA thực hiện các chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Nó không những chỉ được phát hiện trong hạt mà còn trong các mô tăng trưởng khi cây bị stress do thiếu nước, do mặn, và do lạnh. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự mất nước [57]. Protein LEA được tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi. Gen PLC liên quan đến sự huy động canxi. Canxi hoà tan được xem như chất truyền tín hiệu thứ cấp truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào có phản ứng bảo vệ. Sự truyền tín hiệu canxi trong suốt stress hạn và muối đã được nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao [40]. Gen LTP liên quan đến quá trình sinh tổng hợp biểu bì. Khi bị stress hạn, LTP được kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [27]. Ở đậu xanh, gen LTP cũng đã được phân lập và công bố trên ngân hàng gen quốc tế [34]. 1.2.3. Protein vận chuyển lipid (LTP) và gen LTP (Lipid Transfer Protein) 1.2.3.1. Protein LTP LTP là tên thường gọi của một nhóm protein có khả năng vận chuyển lipid, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật. LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước. LTP được gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như một receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào. Phức hợp LTP - linoleic acid đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo [39]. Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress muối và stress hạn. Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu K.H. và cs (2003) nhận thấy rằng hàm lượng mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress muối, stress hạn hay khi hàm lượng ABA ngoại bào tăng cao [41]. LTP còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật. Nghiên cứu trên cây lúa, Blilou I. và cs (2005) nhận thấy tốc độ tổng hợp LTP tăng nhanh khi có sự xâm nhập của loài nấm Glomus mosseae vào biểu bì rễ và giảm khi nấm tấn công vào khoảng gian bào [24]. Carvalho A.O. và cs (2006) khi nghiên cứu trên cây đậu đũa (Vigna unguiculata (L.) Walp) nhận thấy LTP là peptide kháng khuẩn tham gia vào việc bảo vệ cây chống lại các mầm bệnh [26]. LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử. Dạng thứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại prolin [36]. 1.2.3.2. Gen LTP LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng. Vai trò của LTP là tham gia vào cấu tạo cutin, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và đáp ứng sự thích nghi biến đổi của môi trường [25], [29], [35]. Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng nhằm giúp cho cây tăng khả năng chống chịu stress, chịu bệnh… Những phân tử protein này thường bao gồm nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa và sự có mặt của 8 phân tử cystein làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide [36]. LTP đã được chứng minh trong việc ngăn chặn nguồn gây bệnh như: Pseudomonas solanacearum, Clavibacter michiganasis, Fuarium solani, Rhizoctonia solani, Trichodelmar viride và Cercospora beticola [36], [45]. Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực vật như: Arabidopsis thaniana L. [22], Paphanus sativus L. [53], Zea mays L. [49], [51], Capsicum annuum [55], Vigna radiata L. [41], Triticum L. [44], Daucus carota L. [52], Nicotiana tabacum L. [43], [48], Oryza sativa L. [56], Valencia orange [60], Lycopesium esculentum [54]. LTP có khả năng xúc tác tới sự vận chuyển phospholipid giữa các lớp màng của tế bào. LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường [23], [25]. Hiện nay, LTP ở thực vật được biết có 4 nhóm lớn: Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein đã được cô lập và biểu hiện ở trong quả. Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein được biểu hiện trong hạt. Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein được biểu hiện trong mô lá. Chúng được tạo ra khi có những ảnh hưởng của môi trường như tình trạng khô hạn và các tác nhân có thể gây bệnh. Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi polypeptide được cô lập và biểu hiện trong hoa [36], [45]. Ở cây đậu xanh, Liu K.H. và cs (2003) đã phân lập thành công hai dạng khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41]. Trình tự các amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang tính bảo thủ cao ở thực vật. Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhóm nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dưỡng thì mRNA của cả Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có ở chóp rễ. Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi như stress hạn hay muối hoặc khi hàm lượng ABA ngoại bào quá cao sẽ làm tăng tốc độ phiên mã của mRNA Vrltp1 và Vrltp2. Từ đó đưa ra giả thuyết rằng gen LTP có ảnh hưởng rõ rệt tới sự phát triển các mô non và rất có thể đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Hạt của 13 giống đậu xanh do Viện nghiên cứu Ngô cung cấp và một số giống thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Hà Giang. Danh sách các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Các giống đậu xanh nghiên cứu TT Tên giống Nguồn gốc 1 ĐXVN 4 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống Mungo 113 với ĐX 113 2 ĐXVN 5 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 04 với ĐX 113 3 VN 99-3 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống VN 93-1 với Vigna mungo 4 044/ĐX06 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 044 với ĐX 06 5 TN Đồng Hỷ - Thái Nguyên 6 LS Bắc Sơn - Lạng Sơn 7 HN 1 Ba Vì - Hà Nội 8 HN 2 Mỹ Đức - Hà Nội 9 BG 1 Việt Yên - Bắc Giang 10 BG 2 Yên Dũng - Bắc Giang 11 BG 3 Sơn Động - Bắc Giang 12 HG 1 Bắc Quang - Hà Giang 13 HG 2 Hoàng Su Thùy - Hà Giang VN 99-3 LS 044/ĐX06 BG 1 HG 2 BG 2 22 BG 3 ĐXVN 5 HN 2 HG 1 ĐXVN 4 TN HN 1 Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Các loại hóa chất: các hoá chất phục vụ nghiên cứu phân lập gen do các hãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp. Các loại thiết bị máy móc: các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân tử như máy PCR, máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò vi sóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổn nhiệt, máy xác định trình tự nucleotide tự động, pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máy móc cần thiết khác. Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Phòng thí nghiệm Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Phòng Miễn Dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp sinh lí, hoá sinh 2.3.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs (1998) [1]. Hạt đậu xanh được gieo vào trong các chậu trồng cây chứa cát vàng sạch. Sau khi cây có 3 lá thật, tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước đến khi cây héo, trong quá trình gây hạn cho cây che không cho nước mưa có thể vào chậu thí nghiệm, thời điểm tiến hành thí nghiệm được thực hiện vào mùa khô từ tháng 9 đến tháng 11 âm lịch. Khi cây non 3 lá thật bắt đầu héo, tiến hành theo dõi mức độ héo của cây trong vòng 3, 5, 7, 9, 11 ngày kể từ khi lô thí nghiệm bắt đầu có cây héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày. Các chỉ tiêu phân tích gồm: - Tỷ lệ cây không héo. - Tỷ lệ cây phục hồi. - Chỉ số chịu hạn tương đối. Khả năng chịu hạn tương đối của cây được biểu hiện bằng đồ thị rada, gồm các trục a, b, c, d, e, g, h, i, k, l và mang các trị số tương ứng an, bn, cn, dn, en, gn, hn, in, kn,ln và chỉ số chịu hạn tương đối được tính bằng đồ thị rada theo công thức: Sn = ½ sin α (an bn + bn cn + cn dn + dnen + engn + gnhn + hnin + inkn+knln+lnan) Trong đó: - Góc α được tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau - Sn: chỉ số chịu hạn tương đối. - n: ký hiệu các giống nghiên cứu. - Các chỉ tiêu theo dõi gồm: - a: % cây không héo sau 3 ngày hạn. - b: % cây phục hồi sau 3 ngày hạn. - c: % cây không héo sau 5 ngày hạn. - d: % cây phục hồi sau 5 ngày hạn. - e: % cây không héo sau 7 ngày hạn. - g: % cây phục hồi sau 7 ngày hạn. - h: % cây không héo sau 9 ngày hạn. - i: % cây phục hồi sau 9 ngày hạn. - k: % cây không héo sau 11 ngày hạn. - l: % cây phục hồi sau 11 ngày hạn. Chỉ số chịu hạn càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao. 2.3.1.2. Định lượng lipid tổng số [3]. * Nguyên tắc Dựa vào khả năng hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ để chiết lipid có trong hạt đậu xanh. Dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether. * Tiến hành Hạt đậu xanh được sấy khô ở 700C đến khối lượng không đổi, nghiền mịn, cân 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 1,5 ml petroleum ether, lắc đều trong 10 phút, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ. Sau đó mang đi li tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, loại bỏ dịch. Lặp lại quy trình như trên 3 lần. Hàm lượng lipid tính bằng hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khi chiết phần trăm khối lượng khô. Trong đó: % L - % của lipid a - khối lượng mẫu trước khi chiết b - khối lượng mẫu sau khi chiết 2.3.1.3. Định lượng protein Định lượng protein tan trong hạt đậu xanh theo phương pháp Lowry [3]. * Nguyên tắc Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng, protein khử hỗn hợp phosphomolipdate - phosphovonphramate (thuốc thử Foling - Ciocalteau). Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein. * Lập đồ thị chuẩn định lượng protein Nguyên liệu và hoá chất: Albumin tiêu chuẩn 100%. Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N. Dung dịch B: CuSO4 0,5% trong Natri, kali tactrate 1%. Dung dịch C: 49 ml dung dịch A : 1 ml dung dịch B. Thuốc thử Foling. Pha dung dịch albumin 0,02% từ albumin gốc tinh khiết 100%. Lấy 6 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng như trong bảng 2.2. Sau đó đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 750 nm. Bảng 2.2. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry Các ống nghiệm Hóa chất 1 2 3 4 5 6 Protein 0,02% (ml) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Nước cất (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Lượng protein (mg) 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4 Thuốc thử Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Kết quả đo OD ở 750 nm 0,00 0,11 0,20 0,31 0,39 0,49 Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry được thể hiện như hình 2.2. * Tiến hành định lượng Dùng các dung dịch đệm phosphate citrate (pH = 10), NaCl 1M và nước cất để chiết protein tan có trong hạt. Mẫu sấy khô tuyệt đối ở 1050C, nghiền mịn, cân 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 1,5 ml dung dịch đệm chiết, lắc đều trong 10 phút, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ. Sau đó mang đi li tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu lấy dịch. Lặp lại quy trình như trên 3 lần nhưng lần thứ hai chỉ cần để lạnh trong 8 - 10 giờ, lần ba là 6 - 8 giờ. Sau khi chiết bằng dung dịch đệm phosphate citrate (pH = 10), tiếp tục tiến hành chiết bằng dung dịch NaCl 1M và nước cất. Dịch chiết chứa protein hoà tan đem xác định hàm lượng cùng protein chuẩn là albumin huyết thanh bò theo phương pháp quang phổ hấp thụ bước sóng 750 nm với thuốc thử Foling. Đơn vị tính hàm lượng protein là phần trăm khối lượng khô. Hàm lượng protein được xác định dựa trên đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry (hình 2.2). Cách tính hàm lượng protein: Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ H : hệ số pha loãng G : số mg mẫu phân tích 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử 2.3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [31] như sau: (1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nito lỏng thành bột mịn. (2) Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. (3) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (4) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. (5) Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa. (6) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng. (7) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (8) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ. (9) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn. (10) Làm khô DNA bằng máy speed vac. (11) Hoà tan DNA trong H2O khử ion. 2.3.2.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phương pháp: (1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức: Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng. Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 được coi là đảm bảo chất lượng. (2) Phương pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết. 2.3.2.3. Kỹ thuật PCR Sau khi tách chiết và kiểm tra được độ tinh sạch của DNA tiến hành nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs (1985) với cặp mồi đặc hiệu được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi nhân gen LTP Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Xuôi ATGGCTAGCCTGAAGGTTGC Ngược TTACTTGATGTTAGCGCAGTT Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR được trình bày trong bảng 2.4 và bảng 2.5. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion khử trùng 12,5 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 6 Mồi ngược (10 pM/µl) 2,0 7 Taq-polymerase (5U/1µl) 0,5 8 DNA mẫu 1 Tổng 25 Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 30 3 Gắn mồi 56 1 phút 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Sau đó, sản phẩm được tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas. 2.3.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thước khoảng 350 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml . Bổ sung 1000µl dung dịch Binding esdution. Ủ ở 550C trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt. Bổ sung 5 - 10µl Silica power vào và ủ sản phẩm ở 550C khoảng 5 phút rồi vontex khoảng 2 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng. Bổ sung tiếp khoảng 500µl Buffer wash, vontex 2 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa (bước này lặp lại 3 lần). Làm khô DNA trong box. Hoà tan DNA trong 20µl H2O deion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 550C trong 5 - 10 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa. Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. 2.3.2.5. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT được thể hiện ở bảng 2.6. Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion khử trùng 12,2 2 DNA 4 3 Ligation buffer 10X 2 4 Vector pBT 1 5 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng 20 Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 1h, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Hình 2.3. Sơ đồ vector pBT 2.3.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp vào đá trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút. Sau đó tiếp tục đặt hỗn hợp vào đá 5 phút. Bổ sung 400µl môi trường LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C. Sử dụng que cấy trải, trải 200µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Sau đó, chọn những khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung ampicillin) qua đêm. 2.3.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng clony-PCR. Thành phần của phản ứng clony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR chỉ khác mẫu DNA thay bằng DNA plasmid. Chu trình nhiệt của phản ứng clony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR, chỉ thay đổi nhiệt độ gắn mồi là 540C. Sản phẩm clony-PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. 2.3.2.8. Tách chiết plasmid Sau khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Các bước tách chiết plasmid: Lấy dịch vi khuẩn li tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn. Hòa cặn trong 250 ml Resuspension Buffer for plasmid (Buffer 1), đảo nhẹ. Bổ sung 250 ml Lysis Buffer for plasmid (Buffer 2) vào ống trên, đảo nhẹ. Bổ sung 350 ml Neutralization Buffer for plasmid (Buffer 3), đảo nhẹ để tránh kết tủa cục bộ. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 ml Denaturation Buffer for plasmid (Buffer D), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 700 ml Washing Buffer for plasmid (Buffer 4), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 ml H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid. Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. 2.3.2.9. Phương pháp xác định trình tự nucleotide Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDyeÒ Terminator v3.1 Cycle Sequencing. 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu 2.3.3.1. Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel Xác định giá trị trung bình, phương sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu ... bằng chương trình Excel trên máy vi tính theo Chu Văn Mẫn (2003) [14]. 2.3.3.2. Phương pháp xử lý trình tự gen Sử dụng phần mềm DNAstar và Bioedit để phân tích, so sánh trình tự gen. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu xanh Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Một số đặc điểm hình thái của các giống đậu xanh nghiên cứu TT Tên giống Màu gốc thân mầm Hình dạng hạt Màu vỏ hạt P 1000 hạt (g) 1 ĐXVN 4 Tím Bầu dục Xanh mỡ 51,50±0.20 2 ĐXVN 5 Xanh Trụ Xanh mốc 53,40 ± 0,25 3 VN 99-3 Tím Ô van Xanh mốc 52,36 ± 0,28 4 044/ĐX06 Xanh Trụ Xanh mốc 46,40 ± 0,44 5 TN Tím Ô van Xanh mốc 48,10 ± 0,62 6 LS Tím Ô van Xanh mốc 50,20 ± 0,84 7 HN 1 Xanh Trụ Xanh mốc 51,46 ± 0,18 8 HN 2 Tím Ô van Xanh mốc 53,15 ± 0,24 9 BG 1 Xanh Trụ Xanh mốc 54,30 ± 0,47 10 BG 2 Xanh Bầu dục Xanh mỡ 58,00 ± 0,60 11 BG 3 Xanh Ô van Vàng 47,25 ± 0,55 12 HG 1 Tím Ô van Xanh mốc 52,20 ± 0,55 13 HG 2 Xanh Trụ Xanh mỡ 57,32 ± 0,33 Qua bảng 3.1, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau: * Về màu gốc thân mầm: sau khi hạt đậu xanh nảy mầm khoảng 7 ngày thì màu gốc thân được phân biệt rõ, gồm màu xanh và màu tím. Các giống có màu gốc thân mầm màu xanh là ĐXVN 5, 044/ĐX06, HN 1, BG 1, BG 2, BG 3 và HG 2, còn các giống có màu gốc thân mầm màu tím là ĐXVN 4, VN 99-3, TN, LS, HN 2 và HG 1. Cây càng lớn thì màu sắc gốc thân càng không rõ và có màu nâu gần như nhau. Hiện chưa có nghiên cứu nào tìm thấy mối liên quan giữa màu sắc gốc thân với một tính trạng nào của cây đậu xanh. * Về hình dạng hạt: các giống đậu xanh nghiên cứu có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình trụ, ô van và bầu dục. Trong đó, hạt có hình trụ có các giống ĐXVN 5, 044/ĐX06, HN 1, BG 1 và HG 2. Hạt có hình ô van có các giống VN 99-3, TN, LS, HN 2, BG 3 và HG 1. Còn lại hai giống ĐXVN 4 và BG 2 thì hạt có dạng hình bầu dục. Tuy nhiên, tìm hiểu về mối quan hệ giữa hình dạng hạt với các đặc tính sinh lý, hoá sinh của cây đậu xanh chưa có công trình khoa học nào công bố. * Về màu sắc vỏ hạt: màu vỏ hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu bao gồm xanh bóng, xanh mốc và vàng bóng. Trong đó, màu xanh mốc là màu chủ đạo. Có tới 9 giống trong tổng số 13 giống đậu xanh nghiên cứu là vỏ hạt có màu xanh mốc, bao gồm các giống ĐXVN 5, VN 99-3, 044/ĐX06, TN, LS, HN 1, HN 2, BG 1 và HG 1. Ba giống là ĐXVN 4, BG 2 và HG 2 vỏ hạt có màu xanh mỡ. Còn lại giống BG 3 vỏ hạt có màu vàng bóng. Trong các màu trên, màu xanh mốc là màu được người tiêu dùng ưa chuộng và cho là có vị thơm ngon hơn hai màu còn lại nhưng chưa có nghiên cứu nào khẳng định mối tương quan giữa màu sắc vỏ hạt với chất lượng hạt. * Về khối lượng 1000 hạt: khối lượng 1000 hạt là một trong các yếu tố quan trọng cấu thành năng suất của cây đậu xanh. Khối lượng 1000 hạt của 13 giống đậu xanh nghiên cứu dao động trong khoảng 46,40g (044/ĐX06) đến 58,00g (BG 2). Khối lượng 1000 hạt của các giống xếp theo thứ tự giảm dần như sau: BG 2 > HG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > HN 2 > VN 99-3 > HG 1 > ĐXVN 4 > HN 1 > LS > TN > BG 3 > 044/ĐX06. Khối lượng hạt có thể thay đổi do chế độ chăm sóc, mùa vụ và điều kiện môi trường. 3.1.2. Chiều dài rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non Mối quan hệ giữa rễ và thân là mối quan hệ kích thích: Rễ sinh trưởng tốt sẽ kích thích các bộ phận trên mặt đất, trong đó có thân sinh trưởng và ngược lại. Rễ cung cấp nước và chất khoáng cho thân lá, còn thân lá lại cung cấp cho hệ thống rễ các sản phẩm quang hợp để sinh trưởng. Mối quan hệ hữu cơ này biểu hiện hết sức chặt chẽ trong giai đoạn cây còn non. Vì vậy, nghiên cứu kích thước của rễ và thân ở giai đoạn cây non là cơ sở để đánh giá năng suất và khả năng chống chịu của cây. Kết quả nghiên cứu kích thước rễ và thân của các giống đậu xanh nghiên cứu ở giai đoạn cây non được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Kích thước rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non STT Tên giống Chiều dài thân (cm) Chiều dài rễ (cm) 1 ĐXVN 4 11,22 ± 0,17 9,35 ± 0,21 2 ĐXVN 5 9,50 ± 0,20  8,13 ± 0,14 3 VN 99-3 8,32 ± 0,07  7,15 ± 0,09 4 044/ĐX06 14,12 ± 0,09  11,45 ± 0,16 5 TN 8,7 8 ± 0,12 7,59 ± 0,20 6 LS 11,50 ± 0,13  10,47 ± 0,22 7 HN 1 8,29 ± 0,03 6,80 ± 0,10 8 HN 2 8,05 ± 0,21  6,24 ± 0,12 9 BG 1 10,45 ± 0,15  8,15 ± 0,15 10 BG 2 10,80 ± 0,31  8,29 ± 0,12 11 BG 3 12,14 ± 0,10 10,65 ± 0,15 12 HG 1 11,75 ± 0,05 10,80 ± 0,32 13 HG 2 11,65 ± 0,13  10,50 ± 0,27 Qua bảng 3.2 cho thấy: Chiều dài thân ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu dao động từ 8,05 - 14,12 cm. Giống có chiều dài thân ngắn nhất là HN 2 (8,05 cm), giống có chiều dài thân dài nhất là 044/ĐX06 (14,12 cm). Chiều dài thân của các giống đậu xanh nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > BG 3 > HG 1> HG 2 > LS > ĐXVN 4 > BG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Chiều dài rễ ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu dao động từ 6,24 - 11,45 cm. Giống có chiều dài rễ ngắn nhất là HN 2 (6,24 cm), giống có chiều dài rễ dài nhất là 044/ĐX06 (11,45 cm). Chiều dài rễ của các giống đậu xanh nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > HG 1 > BG 3 > HG 2 > LS > ĐXVN 4 > BG 2> BG 1 > ĐXVN 5 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Những giống đậu xanh 044/ĐX06, HG 1, BG 3, HG 2 có chiều dài thân và rễ dài nhất nên rất có thể đây là những giống có khả năng chịu hạn cao nhất trong các giống mà chúng tôi nghiên cứu. Còn hai giống HN 1 và HN 2 có chiều dài thân và rễ ngắn nhất nên đây cũng rất có thể là những giống có khả năng chịu hạn kém nhất. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh để làm sáng tỏ mối liên quan này. Theo Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), chiều dài thân của các giống đậu xanh tác giả nghiên cứu dao động từ 9,53 - 15,60 cm. Chiều dài rễ của các giống đậu xanh tác giả nghiên cứu dao động từ 8,61 - 13,22 cm [17]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu có chiều dài thân và chiều dài rễ ngắn hơn các giống đậu xanh mà tác giả Nguyễn Vũ Thanh Thanh nghiên cứu. 3.1.3. Đặc điểm hoá sinh hạt của các giống đậu xanh Hạt đậu xanh gồm có lipid, protein, glucid, các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P... cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C… Trong đó, protein và lipid là hai thành phần quan trọng được sử dụng để đánh giá chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh. Kết quả phân tích hàm lượng lipid và protein của 13 giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu Đơn vị: (% khối lượng khô) STT Tên giống Hàm lượng lipid (%) Hàm lượng protein (%) 1 ĐXVN 4 2,68 ± 0,37 26,80 ± 0,18 2 ĐXVN 5 3,78 ± 0,39  24,31 ± 0,16 3 VN 99-3 4,13 ± 0,34  20,93± 0,32 4 044/ĐX06 2,17 ± 0,30  28,78 ± 0,87 5 TN 3,98 ± 0,02 21,89± 0,12 6 LS 2,80 ± 0,18 26,59± 0,42 7 HN 1 4,58± 0,27 20,04± 0,52 8 HN 2 4,78 ± 0,31  18,54± 0,43 9 BG 1 3,88± 0,30  23,42 ± 0,15 10 BG 2 3,92± 0,10  22,16 ± 0,32 11 BG 3 2,50 ± 0,45  27,69 ± 0,40 12 HG 1 3,17 ± 0,24 25,51 ± 0,52 13 HG 2 3,45 ± 0,05  24,36 ± 0,57 Qua bảng 3.3 cho thấy, hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu dao động từ 2,17% đến 4,78%. Giống có hàm lượng lipid thấp nhất là 044/ĐX06 (2,17%), giống có hàm lượng lipid cao nhất là HN 2 (4,78%). Hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: HN 2 > HN 1 > VN 99-3 > TN > BG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > HG 2 > HG 1 > LS > ĐXVN 4 > BG 3 > 044/ĐX06. Theo Trần Đình Long (1991), hàm lượng lipid trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ đạt 1,3% [12]. Theo Chu Hoàng Mậu (2001), hàm lượng lipid của các dòng đậu xanh đột biến và giống gốc tương đối cao (4,15% - 6,53%) [15]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều có hàm lượng lipid cao hơn mức trung bình so với thống kê của Trần Đình Long nhưng lại thấp hơn so với những dòng đậu xanh đột biến của tác giả Chu Hoàng Mậu nghiên cứu. Bảng 3.3 còn cho thấy, hàm lượng protein trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu dao động từ 18,54% - 28,78%. Giống có hàm lượng protein thấp nhất là HN 2 (18,54%), giống có hàm lượng protein cao nhất là 044/ĐX06 (28,78%). Hàm lượng protein trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > BG 3 > ĐXVN 4 > LS > HG 1 > HG 2 > ĐXVN 5 > BG 1 > BG2 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Theo Trần Đình Long (1991), hàm lượng protein trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ đạt 23% - 28% [12]. Theo Chu Hoàng Mậu (2001), hàm lượng protein của các dòng đậu xanh đột biến và giống gốc tương đối cao (15,12% - 20,58%) [15]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều có hàm lượng protein mức trung bình giống như thống kê của Trần Đình Long nhưng lại cao hơn so với những dòng đậu xanh đột biến của tác giả Chu Hoàng Mậu nghiên cứu. Từ số liệu trong bảng 3.3, chúng tôi rút ra nhận xét: các giống có hàm lượng lipid thấp thì có hàm lượng protein cao và ngược lại. Như vậy, hàm lượng lipid và protein trong hạt đậu xanh có mối tương quan nghịch. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Chu Hoàng Mậu (1991) [15] và Trần Thị Phương Liên (1999) [10]. Để xác định mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein, chúng tôi đã xử lý số liệu bằng phần mềm Excel theo Chu Văn Mẫn (2003) [14] để xác định hệ số tương quan R. Kết quả thu được R=0,983 > 0,9 nên đây là mối tương quan chặt. Phương trình biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu là : Y= -3,784X + 37,263. Hình 3.1. Mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON Để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu góp phần định hướng cho việc chọn các giống đậu xanh chịu hạn có hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non theo các chỉ tiêu: tỉ lệ cây không héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày thí nghiệm. Từ đó xác định chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu xanh. Giống nào có chỉ số chịu hạn tương đối càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao và ngược lại. Kết quả đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu Tên giống 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày Chỉ số chịu hạn %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH ĐXVN 4 93,33 46,66 76,66 46,66 56,66 33,33 36,66 16,66 13,33 6,66 5524 ĐXVN 5 93,33 46,66 76,66 33,33 43,33 20,00 30,00 10,00 16,66 6,66 4288 VN 99-3 90,00 40,00 70,00 23,33 30,00 16,66 23,33 10,00 6,66 0,00 2915 044/ĐX06 100,0 73,33 86,66 46,66 66,66 60,00 46,66 26,66 36,66 10,00 9174 TN 93,33 50,00 73,33 30,00 33,33 23,33 23,33 13,33 10,00 6,66 4109 LS 96,66 56,66 73,33 43,33 53,33 30,00 36,66 13,33 10,00 6,66 5626 HN 1 90,00 40,00 70,00 23,33 30,00 10,00 20,00 6,66 6,66 3,33 2859 HN 2 86,66 40,00 66,66 20,00 26,66 6,66 16,66 6,66 0,00 0,00 2467 BG 1 93,33 53,33 76,66 33,33 36,66 23,33 20,00 10,00 6,66 6,66 4435 BG 2 93,33 53,33 76,66 33,33 40,00 26,66 23,33 10,00 6,66 6,66 4585 BG3 100,0 63,33 83,33 50,00 63,33 43,33 46,66 20,00 26,66 10,00 7768 HG 1 96,66 63,33 73,33 43,33 56,66 43,33 36,66 16,66 16,66 6,66 6488 HG 2 96,66 60,00 73,33 40,00 53,33 43,33 33,33 10,00 13,33 6,66 5940 Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh còn được biểu diễn bằng đồ thị rada ở các ngưỡng thời gian hạn là 3, 5, 7, 9, 11 ngày (hình 3.2). Diện tích hình tam giác càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao. Hình 3.2. Đồ thị hình rada biểu diễn khả năng chịu hạn Qua bảng 3.4 và hình 3.2 cho thấy: giống 044/ĐX06 và giống BG 3 là hai giống chịu hạn tốt nhất với chỉ số chịu hạn lần lượt là 9174 và 7768. Còn giống HN 1 và HN 2 là hai giống chịu hạn kém nhất với chỉ số chịu hạn lần lượt là 2859 và 2467. Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > BG 3 > HG 1> HG 2 > LS > ĐXVN 4> BG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Như vậy, những giống có bộ rễ càng dài thì khả năng chịu hạn càng tốt. Còn những giống có bộ rễ càng ngắn thì khả năng chịu hạn càng kém. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây, thực vật có bộ rễ phát triển sẽ giúp cây phát triển tốt và có khả năng chống chịu cao. Để xác định mối tương quan giữa khả năng chịu hạn với chiều dài của rễ, chúng tôi xử lý số liệu bằng phần mềm Excel theo Chu Văn Mẫn (2003) [14] để xác định hệ số tương quan R. Kết quả cho thấy R=0,91 nên đây là mối tương quan chặt. Phương trình biểu diễn mối tương quan giữa chiều dài rễ với chỉ số chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu là : Y=972,57X-3611,7. Hình 3.3. Mối tương quan giữa chỉ số chịu hạn và chiều dài rễ của các giống đậu xanh nghiên cứu Theo Nguyễn Thị Thu Trang (2008), chỉ số chịu hạn của các giống đậu xanh mà tác giả nghiên cứu dao động từ 4610 - 11640 [21]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu có chỉ số chịu hạn thấp hơn các giống đậu xanh mà tác giả Nguyễn Thị Thu Trang nghiên cứu. Điều đó chứng tỏ các giống đậu xanh chúng tôi nghiên cứu có khả năng chịu hạn thấp hơn các giống đậu xanh tác giả Nguyễn Thị Thu Trang nghiên cứu năm 2008. Hình 3.4. Hình ảnh của 4 giống đậu xanh nghiên cứu sau 11 ngày gây hạn HN 1 HN 2 044/ĐX06 BG 3 Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở trên, chúng tôi lựa chọn giống có chỉ số chịu hạn cao nhất là 044/ĐX06 và giống có chỉ số chịu hạn thấp nhất HN 2 để tiếp tục nghiên cứu phân lập gen LTP. 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN LTP 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm. Do đó, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của hai giống đậu xanh là 044/ĐX06 và HN 2 theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991). Sau khi tách DNA tổng số, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng DNA tổng số bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethydium bromide và soi dưới ánh đèn cực tím. Kết quả được thể hiện trong hình 3.5. Hình 3.5. DNA tổng số của giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Ký hiệu : 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 Tiếp theo, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng của DNA tổng số bằng phương pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm của giống đậu xanh 044/ĐX06 và BG 3 Tên giống A260 A280 A260/A280 Hàm lượng DNA (ng/ml) 044/ĐX06 0,318 0,165 1,927 795 HN 2 0,223 0,121 1,843 557,5 Bảng 3.5 cho thấy: tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít lẫn protein có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2. Kết quả nhân gen LTP Dựa trên cơ sở dữ liệu khai thác từ Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY300807, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân và phát hiện sự có mặt của gen LTP ở hai giống đậu xanh là 044/ĐX06 và HN 2. M 1 2 3 4 ¬ 350 bp 500bp ® Hình 3.6. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP Kí hiệu: M. Marker 1 Kb; 1,2. 044/ĐX06; 3,4. HN 2 Đoạn gen LTP được nhân từ DNA tổng số bằng phương pháp PCR. Kết quả nhân gen được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Hình ảnh điện di được thể hiện ở hình 3.6. Qua hình 3.6 cho thấy, đã nhân được một đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 350 bp, hàm lượng của sản phẩm đủ lớn để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo. Độ dài của đoạn DNA vừa nhân được cũng phù hợp với lý thuyết khi chúng tôi thiết kế mồi và chiều dài cũng tương tự như với gen LTP đã đăng ký trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY300807 [34]. 3.3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Vì sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn còn có sản phẩm phụ, các nucleotide dư thừa sau phản ứng, mồi, enzyme… Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm PCR theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas để thu nhận đoạn gen mong muốn trước khi biến nạp. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR được thể hiện ở hình 3.7. ¬ 350 bp M 1 2 500bp ® Hình 3.7. Kết quả điện di DNA thu được từ kỹ thuật thôi gel Kí hiệu: M. Marker 1 Kb; 1. 044/ĐX06; 2. HN 2. p Qua hình 3.7 cho thấy: sản phẩm thôi gel có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.4. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pBT. Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 1h cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có bổ sung kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Kết quả thu được có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng được thể hiện ở hình 3.8. Hình 3.8. Hình ảnh khuẩn lạc Tiến hành chọn 4 khuẩn lạc có màu trắng chuyển sang nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung ampicillin 100mg/l) qua đêm. 3.3.5. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng clony-PCR Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng PCR với cặp mồi pUC 18 để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm clony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Kết quả điện di sản phẩm clony-PCR được thể hiện ở hình 3.9. Vì pUC là mồi thiết kế chung cho các vector tách dòng nên khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR vừa dòng hoá thì kích thước của đoạn gen sẽ cao hơn 124 bp. Điều này có nghĩa là kích thước của đoạn gen vừa nhân khoảng 474 bp. Từ kết quả điện di ở hình 3.9 cho thấy, sản phẩm clony-PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả dương tính. Tất cả hai mẫu đều cho một băng duy nhất đúng kích thước, chứng tỏ kết quả biến nạp và chọn dòng đã được thực hiện tốt, phản ứng PCR đã đạt mức tối ưu. Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm clony-PCR Kí hiệu: M. Marker 1Kb; 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 474 bp 500 bp 3.3.6. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Kí hiệu: 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 Sau khi kết quả biến nạp và chọn dòng đã được thực hiện tốt, phản ứng PCR đã đạt mức tối ưu, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của hai giống đậu xanh nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.10. Kết quả điện di ở hình 3.10 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lượng và số lượng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide. 3.3.7. Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen LTP Để xác định chính xác trình tự nucleotide của gen LTP đã được tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen LTP trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự gen của 2 mẫu nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.11. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 044/ĐX06 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG HN 2 CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 044/ĐX06 ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA HN 2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA . 044/ĐX06 A HN 2 A Hình 3.11. Trình tự nucleotide của gen LTP ở 2 giống đậu xanh nghiên cứu Kết quả hình 3.11 cho thấy, chiều dài gen LTP của hai mẫu nghiên cứu đều có kích thước 351 nucleotide. Khi so sánh 2 trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá LTP của đậu xanh. Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng và đọc trình tự thành công đoạn gen mã hoá LTP của đậu xanh. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của giống đậu xanh chịu hạn tốt 044/ĐX06 với giống đậu xanh chịu hạn kém HN 2 đạt 97,7% (chỉ sai khác 8 nucleotide lần lượt ở các vị trí 107, 108, 109, 113, 276, 302, 313 và 314). Sự sai khác của các nucleotide giữa giống đậu xanh chịu hạn tốt 044/ĐX06 với giống đậu xanh chịu hạn kém HN 2 được thể hiện ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 STT Vị trí 044/ĐX06 HN 2 1 107 C A 2 108 T A 3 109 C T 4 113 G C 5 276 A T 6 302 T A 7 313 T A 8 314 G A Qua bảng 3.6 cho thấy, ở vị trí 107, 108, 109, 113, 276, 302, 313 và 314 nucleotide của giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt là C, T, C, G, A, T, T và G, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng A, A, T, C, T, A, A và A. Các vị trí sai khác này có thể liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu xanh. Từ kết quả xác định trình tự ở trên, chúng tôi tiếp tục so sánh trình tự gen LTP của hai giống đậu xanh nghiên cứu với trình tự của giống đậu xanh trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY300807. Kết quả so sánh trình tự nucleotide được thể hiện ở hình 3.12. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 AY300807 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT 044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT 044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 AY300807 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG 044/ĐX06 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG HN 2 CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 AY300807 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC 044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 AY300807 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT 044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 AY300807 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC 044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 AY300807 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA 044/ĐX06 ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA HN 2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA . AY300807 A 044/ĐX06 A HN 2 A Hình 3.12. So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 với trình tự đã công bố AY300807 Qua hình 3.12 cho thấy, trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 đều có hệ tương đồng với trình tự nucleotide của giống đã công bố với mã số AY300807 là 98,8%. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở 3 giống đậu xanh trên được thể hiện ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 STT Vị trí AY300807 044/ĐX06 HN 2 1 107 C C A 2 108 T T A 3 109 C C T 4 113 G G C 5 276 T A T 6 302 A T A 7 313 A T A 8 314 A G A Qua bảng 3.7 cho thấy, trình tự nucleotide ở vị trí 107, 108, 109 và 113 của giống có mã số AY300807 lần lượt là C, T, C và G, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng A, A, T và C. Trình tự nucleotide ở vị trí 276, 302, 313 và 314 của giống có mã số AY300807 lần lượt là T, A, A và A, còn ở giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt được thay bằng A, T, T và G. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 cho kết quả được thể hiện ở hình 3.13. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV ....|....| ....|. 110 044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK HN 2 NVPYKISTFT NCANIK Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Qua hình 3.13 cho thấy, giữa giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 có độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP đạt 95,6% với 5 vị trí sai khác được thể hiện ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 STT Vị trí 044/ĐX06 HN 2 1 36 A E 2 37 P S 3 38 C S 4 101 I N 5 105 W K Qua bảng 3.8 cho thấy, trình tự amino acid ở vị trí 36, 37, 38, 101 và 105 của giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt là A, P, C, I và W, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng E, S, S, N và K. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 với giống đậu xanh có mã số AY300807 cho kết quả được thể hiện ở hình 3.14. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 AY300807 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA 044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV 044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV ....|....| ....|. 110 AY300807 NVPYKISTFT NCANIK 044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK HN 2 NVPYKISTFT NCANIK Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 Qua hình 3.14 cho thấy, độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh có mã số AY300807 với giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 lần lượt là 98,2% và 97,4%. Các vị trí sai khác được thể hiện ở bảng 3.9. Bảng 3.9. Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 STT Vị trí AY300807 044/ĐX06 HN 2 1 36 A A E 2 37 P P S 3 38 C C S 4 101 N I N 5 105 K W K Qua bảng 3.9 cho thấy, trình tự amino acid ở vị trí 36, 37và 38 của giống đậu xanh có mã số AY300807 lần lượt là A, P và C, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng E, S và S. Trình tự amino acid ở vị trí101 và 105 của giống đậu xanh có mã số AY300807 lần lượt là N và K, còn ở giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt được thay bằng I và W. Sự sai khác về trình tự nucleotide và trình tự amino acid ở trên là cơ sở để chúng tôi có những nghiên cứu tiếp theo trên nhiều giống đậu xanh hơn nữa và so sánh giữa hai nhóm chịu hạn tốt và kém nhằm tìm kiếm sự thay đổi vị trí các nucleotide và amino acid liên quan đến tính trạng chịu hạn của các giống đậu xanh. Đây là tiền đề tạo cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt, phục vụ cho phát triển cây đậu xanh ở vùng trung du và miền núi phía Bắc. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận 13 giống đậu xanh có nguồn gốc khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu có: khối lượng 1000 hạt dao dộng từ 46,40 g (ở giống 044/ĐX06) đến 58,00 g (ở giống BG 2), chiều dài thân ở giai đoạn cây non dao động từ 8,05cm (ở giống HN 2) đến 14,12 cm (ở giống 044/ĐX06), chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 6,24 cm (ở giống HN 2) đến 11,45 cm (ở giống 044/ĐX06). Các giống đậu xanh nghiên cứu có hàm lượng lipid dao động từ 2,17 % (ở giống 044/ĐX06) đến 4,78 % (ở giống HN 2), hàm lượng protein dao động từ 18,54 % (HN 2) đến 28,78 % (ở giống 044/ĐX06). Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu có sự khác biệt. Hai giống có khả năng chịu hạn cao nhất là 044/ĐX06 và BG 3 còn hai giống có khả năng chịu hạn kém nhất là HN 1 và HN 2. Đã nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen LTP của giống chịu hạn tốt (044/ĐX06) và giống chịu hạn kém (HN 2) thành công. Chiều dài gen LTP ở hai giống đậu xanh trên có kích thước 351 nucleotide với độ tương đồng là 97,7 %. Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở hai giống đậu xanh trên đạt 95,6 %. Độ tương đồng giữa trình tự gen LTP của hai giống đậu xanh nghiên cứu với trình tự gen LTP trên đậu xanh đã được công bố trong ngân hàng gen đều là 98,8 %. Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh có mã số AY300807 với giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 lần lượt là 98,2 % và 97,4 %. II. Đề nghị Cần tiếp tục nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen LTP của nhiều giống đậu xanh khác nhau để tìm ra chỉ thị phân tử về tính chịu hạn của cây đậu xanh. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Lê Trần Bình và cs (1998), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành Hoá sinh học, NXB Giáo dục. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr: 3-9. Đường Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện pháp tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, NXB Lao Động - Xã Hội, tr: 5-31. Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005), ‘‘ Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng kỹ thuật RAPD’’, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(1), tr: 57-66. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr: 5-6. Kết quả nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991- 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, tr: 4-188. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), NXB Nông Nghiệp. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, NXB Nông Nghiệp. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1991), Những nghiên cứu mới về chọn tạo giống đậu đỗ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr: 2-20. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội, tr: 20-215. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2001), “Hàm lượng axit amin trong hạt của các dòng đậu tương và đậu xanh đột biến”, Tạp chí Sinh học, 23(4). Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hoá sinh hạt và tính đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006), Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử ở một số giống đậu xanh chịu hạn, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp Bộ. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Phạm văn Thiều (1997), Cây đậu xanh. Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp. Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin của một số giống đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Tài liệu tiếng Anh: Arondel V., Vergnolle C., Cantrel C., Kader J.C. (2000), “Lipid transfer protein are encoded by a small multigen familly in Arabidopsis thaniana”, Plant Science, 157, pp: 1-12. Blein J.P., Coutos P.T., Marion D., Ponchet M. (2002), “From elicitins to lipid-transfer proteins: a new insight in cell signalling involved in plant defence mechanisms”, Trends in Plant Science, 7, pp: 293-296. Blilou I., Ocampo J.A., Garcia - Garrido J.M. (2005), ‘‘ Induction of LTP and Pal gene expression in rice roots clonized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae’’, www.ncbi.nlm.nih.gov. Bourgis F., Kader J.C. (1997), “Lipid-transfer proteins: Tools for manipulating membrane lipids”, Physiologia Plantarum, Volume 100, Number 1, pp: 78-84. Carvalho A.O., Souza-Filho G.A., Ferreira B.S., Branco A.T., Araujo I.S., Fernandes K.V., Retamal C.A., Gomes V.M. (2006), ‘‘Cloning and characterization of a cowpea seed lipid transfer protein cDNA: expression analysis during seed development and under fungal and cold stresses in seedling tissues’’, Plant Physiol Biochem, 44(11-12), pp: 732-742. Carvalho A.O., Tavares O.L.M., Santos I.S., Cunha M., Gomes V.M. (2001), “Antimicrobial peptides and imunolocatization of a LTP in Vigna radiata seeds’’, Plant physiol Biochem, 39, pp: 137-146. Chen Y.J., Wu M.F., Yu Y.H., Tam M.F., Lin T.Y. (2004), “Developmental expression of three mungbean Hsc70s and substrate-binding specificity of the encoded protein”, Plant and Cell Physiology, 45(110), pp: 1603-1614. Douliez J.P., Michon T., Elmorjani K. and Marion D. (2000), “Structure, Biological and Technological Functions of Lipid Transfer Proteins and Indolines, the Major Lipid Binding Proteins from Cereal Kernels”, Journal of Cereal Science, Volume 32, Issue 1, pp: 1-20. Dure L.III., Crouch M., Harada J, T-H Ho, Mundy J, Quatrano R.S., Thomas T., Sung Z.R. (1989), ‘‘Common amino acid sequence domains among the LEA proteins of higher plants’’, Plant Mol Biol, 12, pp: 475-486. Gawel N.J., Jarret R.H. (1991), Genomic DNA isolation. Goyal K., Walton L.J., Tunnacliffe A. (2005), ‘‘LEA proteins prevent protein aggrevation due to water stress’’, Biochem, 388, pp: 151-157. Guerbette F., Grosbois M., Jolliot C.A., Kader J.C. and Zachowski A. (1999), “Lipid-transfer proteins from plants: Structure and binding properties”, Molecular and Cellular Biochemistry, 192, pp: 157-161. Kader J.C. (1996), “Lipid-transfer proteins in plants”, Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology , 47, pp: 627-654. Kang S.J., Kim M.C., Yoo D.W., Park K.S. (2002), Vigna rariata cystatin mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AF454396. Karen S. and John M. (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid and osmotic stress”, The plant cell, 2, pp: 503-512. Kimberly D.C., Mark A.T. and Lawrence B.M. (2005), ‘‘Increased Accumulation of Cuticular Wax and Expresion of Lipid Transfer Protein in Response to Periodic Drying Events in Leaves of Tree Tobacco’’, www.ncbi.nlm.nih.gov. Kim Y.J, Kim J.E, Lee J.H., Lee M.H., Jung H.W., Bahk Y.Y, Hwang B.K., Hwang I., Kim W.T. (2003), ‘‘The Vr - PLC3 gene encodes a pultative plasma membrane - localized phosphoinoside - specific phospholipase C whose expression is induces by abiotic stress in mungbean (Vigna radiata L.)”, Federation of Eropean Biochemical Societies Letters, 556, pp: 127-136. Liu K.H., Lin T.Y. (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate”, DNA sequence - The Journal of sequencing and mapping, 14(6), pp: 420-426. Malgorzata G., Barbara Z. (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases”, Acta Biochimica Polonica, 51(3), pp: 609-624. Masuta C., Furuno M., Tanaka H., Yamada M., Koiwai A. (2005), ‘‘Molecular cloning of a cDNA clone for tobacco lipid transfer protein and expression of the functional protein in Escherichia’’, www.ncbi.nlm.nih.gov. Molina A., Garcia O.F. (1993), “Developmental and pathogen-induced expression of three barley genes encoding lipid transfer proteins”, The Plant Journal, 4, pp: 983-991. Molina A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P., Garcisa O.F. (1996), “Two cold-inducible genes encoding lipid transfer protein LTP4 from barley show differential responses to bacterial pathogens”, Molercular and General Genetics, 252, pp:162-168. Ouvrard O., Cellier F., Ferrare K.,Tousch D., Lamaze T., Dupuis J.M. and Casse D.F. (1996), “Identification and expression of water stress- and abscisic acid-regulated genes in a drought-tolerant sunflower genotype”, Plant Molecular Biology, Volume 31, Number 4, pp: 819-829. Pandurangam V., Sharma - Natu P., Sreekanth B., Ghildiyal M.C. (2006), ‘‘Photosynthetic acclimation to elevated CO2 in relation to Rubisco genee expression in three C3 species’’, Indian Journal of Experimental Biology, 44(5), pp: 408-415. Park C.J., Shin R., Park J.M., Lee G.J., You J.S. and Paek K.H. (2002), “Induction of pepper cDNA encoding a lipid transfer protein during the resistance response to tobacco mosaic virus”, Plant Molecular Biology, Volume 48, Number 3, pp: 243-254 Pe M. E. (1993), “Mapping quantitative trait loci (QTLs) for resistance to gibberella zeae infection in maize”, Molercular Gene Geneet, 241(1-2), pp: 11-16. Raesh S., Manickam A. (2006), ‘‘Prediction of functions for two LEA proteins from mungbean”, Bioinformation, 1(4), pp: 133-138. Sossountzov L., Ruiz A.L., Vignols F., Jolliot A., Arondel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Miginiac E., Delseny M., Puigdomenech P. and Kader J.C. (1991), “Spatial and Temporal Expression of a Maize Lipid Transfer Protein Gene”, The Plant Cell, Vol 3, pp: 923-933. Sterk P., Booij H., Schellekens G.A., Van Kammen A., De Vries S.C. (1991), “Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene”, The Plant Cell, 3, pp: 907-921. Terras F.R., Schoofs H.M., De Bolle M.F. (1992), “Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds”, The Journal of Biological Chemistry, 267, pp:15301-15309. Terres S.S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A. (1992), ‘‘A probable lipid transfer protein is induced by NaCl in stems of tomato plants’’, Plants Molecular Biology, 105, pp: 749-756. Verma D.P.S. (1990), “Genetic engineering for prolin biosynthesis and the role prolin in salt stress and symbiotic nitrogene fixation”, In: Proccedings of the international symposium on molecular and genetic approaches to plant stres, Newdelhi, pp: 14-17. Vignols F. Lund G., Pammi S., Tremousaygue D., Grellet F., Kader J.C., Puigdomenech P., Delseny M. (1994), “ Characterizarion of a rice gene coding for a lipid transfer protein”, Gene, 142, pp: 420-426. Wise (2003), ‘‘Leaping to conclusions a computational reanalysis of latte embryogenesis abundant proteins and their possible roles’’, BMC Bioinformatics, 4, pp: 52-57. Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L. (2007), ‘‘Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions’’, TAG, 115, pp: 35-46. Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T., Wu R. (1996), ‘‘Expression of a late embyogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice’’, Plant Physiol, 110, pp: 249-257. Zhencai W. and Jacqueline K. B. (2003), “Isolation and characterization of a cDNA encoding a lipid transfer protein expressed in Valencia orange during abscission”, Journal of Experimental Botany, 385, pp: 1183-1191. MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục những chữ viết tắt trong luận văn Danh mục các bảng trong luận văn Danh mục các hình trong luận văn