Đề tài Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam và Cypermethrine đối với sâu xanh (Heliothis armigera)

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nông nghiệp đóng vai trò rất quan trọng trong nền kinh tế nước ta. Trong sản xuất nông nghiệp, người nông dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là phòng trừ và tiêu diệt các loại sâu hại cây trồng. Theo thống kê của tổ chức lương nông thế giới (FAO) cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với hơn 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Hằng năm có khoảng 20% sản lượng lương thực thực phẩm trên thế giới bị mất trắng (Trần thị Thanh, 2003). Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại, nhiều biện pháp khác nhau đã được sử dụng, trong đó có biện pháp sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, chúng đóng một vai trò quan trọng trong hệ thống canh tác nông nghiệp trong một thời gian dài và mang lại hiệu quả cao ở phạm vi sử dụng rộng lớn. Có thể nói, không một biện pháp bảo vệ mùa màng nào hiệu quả hơn biện pháp hóa học về mặt qui mô và hiệu quả. Nhưng các biện pháp hóa học đã bộc lộ ngày càng nhiều những khuyết điểm của nó, sau khi dùng chất diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu hóa học, môi trường bị ô nhiễm, con người bị ngộ độc và cả khu hệ sinh vật đi kèm cũng bị ảnh hưởng làm mất cân bằng sinh thái. Điều nghiêm trọng hơn là tình trạng gia tăng liều lượng và thời gian phun thuốc hóa học chống sâu bệnh đã tạo nên dư lượng thuốc không cho phép trên rau màu và lương thực, là nguyên nhân gây nhiễm độc cho khoảng 1,5 triệu người mỗi năm trên toàn thế giới, trong đó có khoảng 25 nghìn người bị tử vong (WHO, 1998). Trước thực trạng này, các nhà khoa học nông nghiệp đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu hại cây trồng. Một trong những phương pháp đó là kiểm soát sinh học: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, virus, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thảo mộc…có khả năng phòng trừ, tiêu diệt sâu hại cây trồng hiệu quả và an toàn. Do đó, các chế phẩm phòng trừ sâu hại cây trồng có nguồn gốc sinh học rất được quan tâm, bởi chúng ít ảnh hưởng đến sinh vật sống, dễ phân hủy, không làm 2 độc nông phẩm và tiện sử dụng. Trong đó, có các chế phẩm từ cây neem (cây xoan chịu hạn). Cây xoan chịu hạn (Azadirachta Indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bệnh đang được nghiên cứu và sử dụng ngày càng nhiều ở nước ta và một số nước trên thế giới do chúng có khả năng phòng trừ hơn 400 loại dịch hại. Cây xoan chịu hạn có nguồn gốc từ Ấn Độ, du nhập vào nước ta cách đây gần 30 năm và được trồng nhiều ở các tỉnh miền trung. Hiện nay rừng neem tại Ninh Thuận và Bình Thuận vẫn không ngừng phát triển với diện tích hơn 1.000 ha, đây là nguồn nguyên liệu quan trọng, bước đầu tạo ra các sản phẩm phòng trừ sâu hại cây trồng. Với mục đích bước đầu thăm dò khả năng phòng trị côn trùng của cây xoan chịu hạn trồng tại Việt nam, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam và Cypermethrine đối với sâu xanh (Heliothis armigera)”. 1.2 Mục đích, yêu cầu - Khảo sát các chỉ tiêu sinh hóa của nhân hạt xoan chịu hạn trồng tại Việt Nam. - Chiết xuất hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn và định lượng một số hoạt chất trong sản phẩm chiết xuất thô từ nhân hạt xoan chịu hạn bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). - Khảo sát hiệu quả gây chết của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrine đối với sâu xanh (Heliothis armigera). - Xác định LC50 của chế phẩm đối với sâu xanh. 1.3 Giới hạn đề tài Azadirachtin - hợp chất phòng trị côn trùng chính của cây xoan chịu hạn, tập trung nhiều trong nhân hạt (Dennis, 1992), và sâu xanh (Heliothis armigera) là một trong những loài sâu hại phổ biến, khó phòng trừ nhất hiện nay, nên đề tài chỉ đánh giá hiệu quả gây chết của chế phẩm phối trộn từ dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn đối với sâu xanh, và xác định LC50 của chế phẩm đối với sâu xanh. Đề tài được thực hiện tại Phòng Các chất có Hoạt tính sinh học; Tổ Công nghệ sinh học Động vật, Viện Sinh học Nhiệt đới. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây xoan chịu hạn 2.1.1 Phân loại [29; 4; 12] - Nghành : Angiospermatophyta (nghành thực vật hạt kín) - Lớp : Dicotyledoneae (lớp hai lá nầm) - Lớp phụ : Archichlamydeae (lớp phụ nguyên hoa bì) - Nhóm : Dialypetalae (nhóm cánh phân) - Bộ : Rutales (bộ cam) - Bộ phụ : Rutinae - Họ : Meliaceae (họ xoan) - Họ phụ : Melioideae - Tộc (chi): Melieae - Giống : Azadirachta - Loài : indica A. Juss 2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây xoan chịu hạn [36] Xoan chịu hạn là loại cây thường xanh, tán lá rộng, chiều cao trung bình từ 13 đến 20 m, cây trưởng thành có thể cao 30 mét, chu vi 2,5 m. Nhánh cây trải rộng có thể vươn dài đến 10 m. Vào những mùa khô hạn, lá cây vẫn xanh tươi ngoại trừ bị rụng vào mùa thu. - Đặc điểm của lá: Lá có dạng xẻ, lá kép lông chim lẻ, dài 20 – 38 cm, mọc nhiều phía đầu nhánh, so le, dạng mác, xẻ răng cưa sâu và sắc cạnh, nhẵn cả trên hai bề mặt, cân đối hai bên, nhọn, cuống rất ngắn. Lá thường xanh tốt quanh năm, không có thời kỳ rụng lá. - Kiểu phát hoa: Hoa mọc ở nách lá, thường mọc thành cụm, hoa có 5 cánh, cuống hoa ngắn, có màu trắng và mùi dễ chịu. Hoa lưỡng tính, có dạng mác nhỏ, lá bắc rụng sớm. Đài hoa có phủ lớp lông mịn bên ngoài, có 5 thùy ở phần nửa thấp, các thùy xếp lớp dạng trứng hoặc tròn, có lông mịn nhỏ. Hoa có 5 cánh tràng, mọc xếp lớp, có dạng trứng ngược hoặc dạng thuôn, có lớp lông mịn phủ bên ngoài. Ở nước ta, cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 5. 4 - Vỏ cây: Cây có vỏ dày trung bình, có các mấu nhỏ phân tán giữa các rãnh dọc và các rãnh nghiêng nhăn nheo, vỏ có màu xám đậm bên ngoài và màu đỏ lợt bên trong. Vỏ cây thay đổi về hình dạng và độ dày tùy theo tuổi của cây cũng như theo điều kiện môi trường và khí hậu. Vỏ của các nhánh nhỏ có màu xanh lợt, mềm và trơn, đôi khi có các vân dọc màu xanh. Độ dày của vỏ từ 1,25 đến 2,5 cm. Vỏ ngoài nhám, có nhiều vết nứt. Khi cắt ngang thân cây, quan sát thấy vỏ có ba vùng: vùng ngoại biên hẹp, có màu tía; vùng giữa có màu trắng; vùng trong cùng khá dày, chứa các sợi libe thứ cấp, có màu trắng vàng. Vỏ cây có mùi giống mùi tỏi và hơi đắng. - Rễ và gỗ cây: Hệ thống rễ gồm rễ cọc ngắn và nhiều rễ bên mọc ngang khá dài. Cấu trúc bên trong và hình dạng bên ngoài của rễ thường giống nhau ở tất cả các loại rễ. Tuy nhiên, độ dày và mức độ cứng của phần vỏ bên ngoài cũng như kết cấu của gỗ thay đổi tương ứng theo tuổi của rễ và thành phần của đất. Bề mặt rễ phủ nhiều bì khổng dạng thuôn hẹp, sắp xếp gần nhau theo chiều dọc và ngang. Gỗ cây có màu vàng hoặc vàng xám. Lõi gỗ có màu nâu đỏ. Gỗ bóng, cứng, thường nặng, có nhiều vân gỗ xen nhau. - Quả và hạt: Cây bắt đầu ra quả sau khi trồng từ 3 đến 5 năm, cho năng suất cao và ổn định sau 5 đến 10 năm, trung bình một cây trưởng thành cho từ 30 đến 50 kg quả/ năm. Quả có hình bầu dục, da trơn láng, dài từ 1 – 2 cm, khi chín có màu vàng hay vàng xanh, thịt quả ngọt. Quả phát triển và chín trong vòng 1 đến 2 tháng, quả được thu hoạch tốt nhất vào lúc quả chuyển sang màu vàng nhạt hay vàng xanh, tốt nhất nên thu hái trực tiếp từ cây vì hạt thường giảm chất lượng khi quả rụng xuống đất. Hạt gồm vỏ và nhân hạt, một hạt có từ 1 đến 3 nhân. Nhân hạt chứa nhiều hợp chất có khả năng phòng trị nhiều loài dịch hại, đặc biệt là azadirachtin. Theo Siddiqui và ctc (1993), thì thành phần dầu chiếm từ 35 – 45% trọng lượng nhân hạt. Ở nước ta, thông thường quả chín từ tháng 6 đến tháng 8. Mỗi hecta có thể trồng từ 50 – 200 cây, cho sản lượng từ 5.000 – 10.000 kg/ năm. 2.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố của cây xoan chịu hạn Xoan chịu hạn được xem là có nguồn gốc ở vùng Assam và Burma. Tuy nhiên, nguồn gốc chính xác của nó vẫn chưa được biết, một số người cho rằng xoan chịu hạn sống tự nhiên ở vùng tiểu lục địa Ấn Độ; những người khác lại cho rằng nó thuộc vùng khô hạn trên toàn khu vực Nam Á, Đông Nam Á bao gồm Sri Lanka, Thái Lan, Malaysia và Indonesia [33; 36]. 5 Xoan chịu hạn được di thực vào Châu Phi từ những năm đầu của thế kỷ 20. Ngày nay, nó được trồng rộng rãi ở ít nhất 30 quốc gia, đặc biệt ở vùng dọc theo khu vực vành đai phía nam sa mạc Sahara. Trong thế kỷ 20, xoan chịu hạn cũng đã được di thực đến Fiji, Mauritius và nhiều quốc gia thuộc Trung, Nam Mỹ [33; 36]. Xoan chịu hạn được di thực vào Việt Nam năm 1981 do GS. Lâm Công Định, một nhà lâm học Việt Nam. Nhân dịp tham dự hội thảo quốc tế lâm nghiệp về “Vai trò của rừng trong sự phát triển của cộng đồng nông thôn” tại Senegal, Châu Phi, ông đã đem hạt giống xoan chịu hạn về trồng tại vùng đất Phan Thiết, sau đó cho nhân rộng ra và trồng tại Ninh Thuận, Bình Thuận. Ông cũng là người đặt tên cho loài cây này là cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) để phân biệt với xoan địa phương (Melia azedarach) được trồng phổ biến ở nước ta [5]. 2.1.4 Điều kiện thích nghi và tăng trƣởng [18] Xoan chịu hạn là loài thực vật có phổ thích nghi rộng và chịu được điều kiện khắc nghiệt tốt hơn nhiều loài cây khác. Cây vẫn có thể phát triển mạnh trên những vùng đất khô hạn, nghèo chất dinh dưỡng, đất có độ mặn trung bình hoặc kiềm nặng. Cây cũng có thể sống sót trên đất có pH thấp, do trong lá xoan chịu hạn có hàm lượng chất khoáng khá cao, có tác dụng giảm độ acid trong đất. Cây xoan chịu hạn thích nghi tốt ở những vùng nhiệt đới khô nóng với nhiệt độ có thể cao hơn 450C và lượng mưa trung bình khoảng 400 – 1500 mm/ năm. Mức độ tăng trưởng của cây cũng tùy thuộc vào chất lượng đất, cây thường phát triển nhanh trong 5 năm đầu, có thể đạt chiều cao 4 m sau 5 năm và 10 m sau 25 năm trồng. 2.1.5 Nhân giống [33; 36] Xoan chịu hạn dễ được nhân giống bằng cả sinh sản hữu tính lẫn vô tính. Cây có thể được trồng từ hạt, từ cây giống con, cây non, từ chồi rễ mút hoặc nuôi cấy mô. Tuy nhiên, hiện nay cây thường được trồng từ hạt. Do tỷ lệ nảy mầm của hạt rất biến động (15% đối với hạt dự trử và 85% đối với hạt tươi), nên nhiều chuyên gia khuyến cáo gieo hạt sớm trong vườn ươm. Hạt cần ngâm trong nước lạnh 24 giờ và cắt đầu vỏ hạt để tăng khả năng nảy mầm. Gieo hạt trên những luống cát mịn ở độ sâu 2,5 cm và cách nhau 2 – 5 cm. Hạt thường nảy mầm từ 1 – 2 tuần. Nhiều tác giả cho rằng hạt không tồn tại được lâu, chỉ sau 2 – 6 tháng bảo quản hạt sẽ không thể nảy nầm được. Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây ở Pháp cho 6 thấy, hạt được bảo quản mà không bị hư vỏ quả trong (nội quả bì) có khả năng nảy mầm đến 45% sau 5 năm bảo quản. 2.1.6 Công dụng [18; 33; 36; 50] Xoan chịu hạn có rất nhiều công dụng trong nông nghiệp và công nghiệp. Tại nhiều nước trên thế giới, cây xoan chịu hạn không những mang lại hiệu quả đáng kể về kinh tế với nhiều sản phẩm đa dạng mà nó còn giải quyết được một số vấn đề về môi sinh. Tại Ấn Độ, cây xoan chịu hạn từ lâu đã được xem là một tài sản qúi giá do tính đa dụng và khả năng thích nghi rộng của nó. Đây là một trong số ít những loài thực vật mà tất cả các bộ phận của nó đều mang lại những lợi ích thiết thực cho con người. Lá: xoan chịu hạn là loại cây có tán lá rộng, xum xuê, lá có lượng đạm, khoáng, caroten tương đối cao nên có thể được sử dụng làm thức ăn cho gia súc.Tại một số vùng Andhra Pradesh, nông dân thường cho gia súc ăn lá xoan chịu hạn sau khi sinh con để gia tăng sự tiết sữa, ngoài ra, lá còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gian súc và kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh khác. Nhiều nơi còn dùng lá non làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa có thể phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột. Ở Ấn Độ, dân gian thường lấy lá xoan chịu hạn để gần trẻ em giúp ngăn ngừa bệnh ho gà. Lá xoan chịu hạn cũng được sử dụng trong bảo quản nông sản với liều lượng 2 – 5 kg lá xoan chịu hạn/100 kg nông sản (Srivastav và cộng sự, 1998). Thân: thân cây xoan chịu hạn thường được dùng làm gỗ, rất được ưa chuận trong xây dựng hoặc trang trí nội thất do có đặc tính kháng mối mọt, màu sắc đẹp và dễ gia công. Ngoài ra, do có tán lá rộng và luôn xanh tốt nên cây xoan chịu hạn còn được xem là một loại cây che mát có giá trị, góp phần phục hồi và ngăn ngừa tình trạng sa mạc hóa đất đai. Quần thể xoan chịu hạn lớn có thể tạo một bầu không khí trong lành bởi tán cây rộng và hiệu suất quang hợp cao. Do vậy, rừng xoan chịu hạn có thể làm dịu đi một số vấn đề về môi trường, đặc biệt là sự ấm lên của trái đất. Tuy nhiên, ở nhiều nước tiềm năng của nó chưa được sử dụng một cách triệt để. Rễ: dịch chiết từ rễ cây xoan chịu hạn được dùng làm thuốc cổ truyền trị bệnh ngoài da, suy nhược cơ thể do có chứa nhiều đường, nhựa, protein, tryptophan. Bộ rễ phát triển khỏe, giúp hạn chế xói mòn đất và góp phần cùng với lá rụng phục hồi dinh dưỡng cho tầng đất canh tác. Vỏ cây: chất nhựa trong, có màu hổ phách trích từ vỏ cây xoan chịu hạn có thể dùng làm thuốc bổ hoặc thuốc trị bệnh vàng da khi phối hợp với một số thảo 7 dược khác. Dịch chiết từ vỏ cây có thể chữa đau răng, bệng sốt rét, bệnh da liễu hoặc dùng để nhuộm lụa. Do vỏ và rễ cây đều có chứa nimbin và nimbidin nên dịch chiết từ hai bộ phận này cũng có hoạt tính kháng nấm, kháng dị ứng hoặc trị bệnh ngoài da. Quả: thịt quả giàu carbohydrat, khi chín có vị ngọt, có thể ăn được hoặc sử dụng trong công nghệ lên men. Thịt quả cũng là cơ chất triển vọng để tạo khí methane. Thịt quả cũng được dùng làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau, thuốc bổ. Quả khô ngâm nước có thể trị được một số bệnh ngoài da. Nước thịt quả khô khi phun lên cây có thể xua đuổi nhiều loài côn trùng, đặc biệt hữu hiệu đối với châu chấu. Hạt: hạt xoan chịu hạn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như azadirachtin, meliantriol, salanin,...trong đó quan trọng nhất là azadirachtin. Azadirachtin là hoạt chất chính có tác dụng phòng trị nhiều loại côn trùng thuộc các bộ, họ khác nhau. Dịch chiết từ hạt được dùng để sản xuất thuốc trừ sâu, thuốc giảm đau, thuốc sát trùng và cả thuốc ngừa thai. Ngoài ra, dầu hạt xoan chịu hạn còn được dùng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng và nhiều lĩnh vực khác. Bánh dầu neem: là sản phẩm phụ có giá trị của công nghiệp ép dầu. Bánh dầu chứa khoảng 1,07 – 1,36 % lưu huỳnh, 2 – 3 % nitơ. Với 2 – 3% đạm; 1% lân; 1,4 % kali trong thành phần, bánh dầu neem là nguồn nguyên liệu tốt sản xuất phân hữu cơ nhằm cung cấp dinh dưỡng cho cây, duy trì và cải thiện độ phì của đất, giải quyết được vấn đề chất thải của ngành công nghiệp ép dầu (Lâm Công Định, 1985; 1991; 1998 và Lim, 1994). Khi nói về giá trị của xoan chịu hạn, Dennis (1992) đã khẳng định: “neem là loài cây có thể giải quyết nhiều vấn đề của toàn cầu”. 2.2 Tình hình nghiên cứu về cây xoan chịu hạn 2.2.1 Trên thế giới Cây xoan chịu hạn đã được trồng phổ biến ở Ấn Độ và Burma như một loại cây thuốc có giá trị và cho đến nay, Ấn Độ vẫn là nước trồng xoan chịu hạn lớn nhất thế giới. Tại đây, cây xoan chịu hạn được trồng khắp nơi và được xem như là loài cây tiêu biểu của quốc gia. Hơn 14 triệu cây xoan chịu hạn cho 418.633 tấn hạt/ năm đã đem lại nguồn lợi hàng năm khoảng 1 vạn tấn dầu và 4 vạn tấn bánh dầu (Gupta và Sharma, 1998). Cuối những năm 1920, các nhà khoa học Ấn Độ đã có những nghiên cứu đầu tiên về cây xoan chịu hạn nhưng kết quả của họ chưa được đánh giá cao [33]. 8 Năm 1959, nhà côn trùng học người Đức Heinrich Schmutterer chứng kiến nạn dịch châu chấu ở Sudan, ông quan sát thấy xoan chịu hạn là cây duy nhất không bị châu chấu tấn công. Từ đó ông bắt đầu quan tâm nghiên cứu các hoạt chất trong cây xoan chịu hạn [33]. Năm 1962, Heinrich Schmutterer và các nhà khoa học Ấn Độ đã chứng minh rằng dịch chiết từ xoan chịu hạn có khả năng xua đuổi được châu chấu và dịch chiết từ hạt có hiệu lực hơn so với dịch chiếc từ lá xoan chịu hạn [33]. Năm 1971, lần đầu tiên Morgan và cộng sự đã cô lập và xác định được hợp chất azadirachtin, hợp chất gây ngán ăn mạnh nhất đối với côn trùng từ hạt xoan chịu hạn [30]. Từ năm 1971 đến 1992, đã có nhiều công trình nghiên cứu về hóa học của xoan chịu hạn; về đặc điểm sinh thái của xoan chịu hạn; về vấn đề chiết xuất hoạt chất sinh học từ xoan chịu hạn; về phương thức hoạt động của azadirachtin lên côn trùng; về tính gây ngán ăn của dịch chiết từ xoan chịu hạn đối với côn trùng; về ảnh hưởng của dịch chiết từ xoan chịu hạn lên nhện, tuyến trùng, giun tròn và lên nấm, .v.v. Các nghiên cứu này được báo cáo và trình bày trong 3 cuộc hội thảo quốc tế về xoan chịu hạn tổ chức ở Đức và Kenya; 2 hội thảo ở Mỹ; tạp chí “Neem Newletter” ở Ấn Độ, .v. v. Cụ thể là: - Năm 1980, hội thảo quốc tế về cây xoan chịu hạn được tổ chức tại Rottach – Egern, Đức. - Năm 1983, hội thỏa quốc tế về cây xoan chịu hạn được tổ chức tại Rauischholzhausen, Đức. - Năm 1984, các nhà khoa học Ấn Độ cho ra đời tập chí “Neem Newletter”, cung cấp các ấn phẩm miễn phí về việc nghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu hạn. - Năm 1986, hội thảo quốc tế về cây xoan chịu hạn được tổ chức tại Nairobi, Kenya. - Năm 1989, Bộ Nông nghiệp Mỹ xuất bản một thư mục với chủ đề “Cây Neem: Tác nhân ức chế sự sinh trưởng và gây ngán ăn ở côn trùng”. - Năm 1990, Mỹ tổ chức hội thảo quốc gia về xoan chịu hạn lần thứ nhất và năm 1991, Mỹ tổ chưc hội thảo quốc gia về xoan chịu hạn lần thứ hai [33]. Giai đoạn từ 1992 đến nay, các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục tổ chức những hội thảo quốc tế về cây xoan chịu hạn (lần thứ 4 ở Ấn Độ vào năm 1993, và lần 9 thứ 5 ở trường Đại học Queensland Gatton College, Úc) và nhiều công trình nghiên cứu tổng thể cũng như các nghiên cứu có tính chuyên sâu về cây xoan chịu hạn như: Nghiên cứu về quá trình ra hoa, ra hạt của cây; nghiên cứu những biện pháp cải tiến di truyền ở xoan chịu hạn, kỹ thuật tạo dòng và các kỹ thuật công nghệ sinh học để thu hiệu suất cao về xoan chịu hạn; chuẩn hóa kỹ thuật nhân giống; nghiên cứu về những ứng dụng của xoan chịu hạn trong Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Y - Dược; nghiên cứu chiến lược sản xuất và quản lý cây xoan chịu hạn .v.v. [31; 32; 33; 36; 37]. 2.2.2 Ở Việt Nam Năm 1981 GS. Lâm Công Định đã tiến hành những khảo nghiệm trồng thử cây xoan chịu hạn giống Senegal ở Bình Thuận. Bước đầu cho thấy cây xoan chịu hạn thích nghi tốt đối với vùng đất khô cằn này [5]. Bên cạnh đó, vịêc nghiên cứu hoạt chất tách chiết từ cây xoan chịu hạn và cây xoan ta cũng đã được nghiên cứu tại một số cơ sở nghiên cứu ở Hà Nội (công trình nghiên cứu của PGS. TS Nguyễn Đăng Diệp, PGS. TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn, Đại học quốc gia Hà nội, và TS. Nguyễn Trường Thành, Viện bảo vệ thực vật Hà Nội). Theo đánh giá chung, thuốc trừ sâu thảo mộc từ xoan chịu hạn tuy không mạnh bằng thuốc trừ sâu hóa học, nhưng có phổ tác động rộng, thời gian tác động chậm đặc trưng cho thuốc trừ sâu sinh học. Các nghiên cứu này còn bị hạn chế do nguồn nguyên liệu ít, không đáng kể về mặt số lượng, hơn nữa cây xoan chịu hạn tỏ ra không thích hợp đối với các tỉnh phía Bắc (không ra hoa, phát triển chậm …) [24]. Từ đầu những năm 1990, việc trồng xoan chịu hạn đã được đẩy mạnh ở 2 tỉnh khô hạn nhất của nước ta là Bình Thuận và đặc biệt là Ninh Thuận. Tỉnh Ninh Thuận tiến hành trồng thử xoan chịu hạn giống Senegal và Ấn Độ trên vùng đất cát hoang, chạy dọc theo biển có khí hậu rất khắc nghiệt, lượng mưa trung bình hằng năm nhỏ và chỉ tập trung trong 2 – 3 tháng. Hiện đã trồng được 380 ha trong đó có 70 ha xoan chịu hạn thuần loại. Một số diện tích trồng từ năm 1996 (7 ha) đã cho hoa và trái. Điều này chứng tỏ cây xoan chịu hạn thích hợp với vùng đất khô cằn này và việc trông xoan chịu hạn trước mắt là phục vụ cho mục đích phủ xanh đất trống, cải tạo môi trường sống và đồng thời tạo nguồn nghiên liệu có giá trị phục vụ cho nhiều mục đích sử dụng [24]. Năm 1991, Giáo sư Lâm Công Định đã viết một cuốn sách nói về loài cây xoan chịu hạn (Azadirachtin indica A.Juss) được nhập nội vào Việt Nam và công bố những 10 nghiên cứu về điều kiện khí hậu, canh tác để phát triển loài cây này trên vùng đất cát nóng Tuy Phong thuộc tỉnh Bình Thuận [5]. Năm 1999 – 2000, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành thử nghiệm dầu xoan Ấn Độ lên sự phát triển bọ hà khoai lang và nghiên cứu ảnh hưởng của dầu xoan chịu hạn lên sự ký sinh của bọ hà khoai lang, kết quả cho thấy dầu xoan chịu hạn có hiệu lực phòng trừ bọ hà khoai lang [18], có tác dụng làm giảm sự ký sinh, sự sinh sản của bọ hà đối với khoai lang ngay từ tuần đầu tiên và có tác dụng xua đuổi bọ hà đến ký sinh [19]. Bên cạnh đó, Viện cũng đã hoàn thành qui trình nhân giống cây xoan chịu hạn bằng nuôi cấy mô [19]. Năm 2001, Dương Anh Tuấn và cộng sự bước đầu nghiên cứu thành công việc chiết tách và tinh sạch Azadirachtin từ nhân hạt xoan chịu hạn trồng tại Việt Nam và thử nghiệm hoạt tính gây ngán ăn trên sâu khoang [26]. Năm 2001, Nguyễn Thị Minh Hà đã khảo sát thành phần hóa học của hạt và lá xoan chịu hạn thu hái từ các cây xoan chịu hạn trồng tại Việt Nam; chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn và thử tác dụng kháng nấm Fusarium oxysporum, Alternaria sp. của sản phẩm chiết xuất thô này [9]. Năm 2001, Nguyễn Thị Thủy đã khảo sát hoạt tính ức chế sinh trưởng rầy nâu và ngài gạo của sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu hạn [25]. Năm 2003, Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng đã chiết xuất, tinh sạch và xác định được hàm lượng azadirachtin và salanin trong nhân hạt xoan chịu hạn. Năm 2003, Trần Thị Hồng Anh đã khảo sát hoạt tính ức chế sâu hại của sản phẩm chiếc xuất từ xoan chịu hạn [1]. Năm 2003, Vũ Đăng Khánh đã khảo sát hoạt tính kháng một số loài nấm gây bệnh và nấm Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin của sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn trồng tại Việt Nam [12]. Năm 2004, Lê Thị Thanh Phượng đã chiết xuất được các hoạt chất sinh học từ nhân hạt Neem (Azadirachta indica A.Juss) và khoả sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra cephadonica St.) [18]. Năm 2005, Vũ Văn Độ, Vũ Đănh Khánh và Nguyễn Tiến Thắng đã đánh giá được độ độc của chế phẩm phối trộn giữa dầu neem và Bt (Baccillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis armigara ), sâu tơ (Plutella xylostella) [6 ]. 11 Năm 2001, Viện Sinh học Nhiệt đới được Nhà nước giao thực hiện đề tài cấp nhà nước theo Nghị định thư giữa Việt Nam và Ấn Độ về “Nghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu hạn (Azadirachtin indica A.Juss) trồng tại Việt Nam”. Kết quả: Đã xây dựng được bản đồ trồng xoan chịu hạn tại Ninh Thuận, nghiên cứu và hoàn thiện qui trình nhân giống cây xoan chịu hạn và đã tiến hành trồng thử nghiệm xoan chịu hạn cấy mô tại Ninh Phước, Ninh Thuận; xây dựng qui trình chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt, qui trình chiết tách và tinh sạch azadirachtin, salanin; xác định hàm lượng azdirachtin, salanin và mimbin bằng kỹ thuật HPLC, khảo sát ảnh hưởng của sản phẩm chiết xuất lên sự sinh trưởng của một số loại nấm gây bệnh và rầy nâu hại lúa [22; 24]. 2.3 Các hoạt chất phòng trị côn trùng trích từ cây xoan chịu hạn 2.3.1 Các hoạt chất có trong xoan chịu hạn Trong cây xoan chịu hạn, trên 300 hợp chất tự nhiên đã được phân lập và mô tả. Tanin có nhiều trong vỏ cây (14%), lá cây ngoài các limonoid còn chứa tinh dầu và alkaloid. Theo Mitra (1963), lá cây chứa alkaloid “Parisian”, xoan chịu hạn tự bảo vệ nó khỏi nhiều loại côn trùng gây hại do nó chứa nhiều thành phần có hoạt tính kháng côn trùng. Xoan chịu hạn chứa hỗn hợp của 3 đến 4 hợp chất chính và khoảng hơn 20 các hợp chất phụ khác, các hợp chất phụ này có tác động theo phương cách này hay phương cách khác. Các hợp chất chính thuộc về nhóm các hợp chất tự nhiên triterpenoid; chuyên biêt hơn, đó là các limonoid (tetranotriterpenoid) [33]. Cho đến nay, 9 limonoid trong xoan chịu hạn đã được chứng minh là có khả năng ngăn cản sự phát triển của côn trùng, đặc biệt là những côn trùng gây dịch bệnh cho nông nghiệp và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Nhiều limonoid mới vẫn đang tiếp tục được phát hiện trong cây, các limonoid như azadirachtin, salannin, meliantriol, nimbin, nimbidin được xem là thành phần hoạt chất chính trong xoan chịu hạn. [33; 36] 2.3.2 Dầu xoan chịu hạn Theo Tewari (1992), nhân hạt xoan chịu hạn có chứa khoảng 40,0 – 48,9% dầu, dầu xoan chịu hạn có màu vàng nâu, mùi tỏi. Theo Ketkar (1976), nhân hạt xoan chịu hạn khi được chiết xuất bằng phương pháp ép thu được từ 30 – 40% dầu. Cặn dầu có thể được chiết xuất bằng một số dung môi khác. Theo Anon (1985), dầu xoan chịu hạn có thể được tách chiết bằng cách đun sôi nhân hạt xoan chịu hạn đã được xay nhỏ trong nước. 12 Một số đặc tính lý hoá của dầu xoan chịu hạn được trình bày ở Bảng 2.1 Bảng 2.1: Một số đặc tính lý hóa của dầu xoan chịu hạn [36] Chỉ số khúc xạ ở 40o 1,4617 – 1,4627 Tỷ trọng ở 30o 0,9087 – 0,9189 Độ chuẩn 35,8 Chỉ số iod 68,0 – 75,8 Chỉ số xà phòng hóa 193 – 204 % chất khô không bị xà phòng hóa 0,8 – 2,4 Thành phần chính Acid oleic 2.3.3 Azadirachtin và các limonoid khác 2.3.3.1 Azadirachtin Azadirachtin là hợp chất chính trong xoan chịu hạn, có công thức phân tử là C35H44O16, nhiệt độ nóng chảy 154 – 158 oC, có hoạt tính kháng côn trùng mạnh nhất, đặc biệt là tác động xua đuổi và ức chế sinh trưởng mạnh. Azadirachtin có cấu trúc tương tự như hormone “ecdysone”, hormone này có tác dụng kiểm soát tiến trình biến đổi nội hóa học của côn trùng khi côn trùng chuyển từ dạng ấu trùng sang dạng nhộng để sang dạng trưởng thành. Azadirachtin được xem như chất ngăn cản sự tổng hợp các hormone cần thiết cho cở thể côn trùng, do đó phá vỡ chu kỳ sống của côn trùng. Azadirachtin tập trung nhiếu nhất trong nhân hạt xoan chịu hạn. Trung bình 1 gram nhân hạt chứa từ 2 đến 4 mg azadirachtin, đặc biệt ở Senegal, 1g nhân hạt có thể chứa đến 9 mg azadirachtin [33]. Hàm lượng azadirachtin trong nhân hạt xoan chịu hạn cũng biến động tùy thuộc vào nguồn gốc, xuất xứ, điều kiện khí hậu ở nhiều vùng khác nhau, trong mỗi cây cũng có sự biến động về hàm lượng azadirachtin (Bảng 2.2), (Ermel và cộng sự, 1987; Singh, 1987) [36]. 13 Bảng 2.2: Sự biến động hàm lƣợng azadirachtin trong mẫu hạt từ nhiều nơi khác nhau [36; 37]. Xuất xứ Hàm lượng azadirachtin ( % trọng lượng khô) Theo tác giả Sri Lanka 0,2 – 0,65 Eeswara (1996) Ấn Độ 0,2 – 0,75 Anon (1985) Nicaragoa và Indonesia 0,48 Tewari (1992) Togo, Burma, Mauritius 0,3 – 0,39 Anon (1985) Sudan 0,19 Tewari (1992) Senegal 0,33 Ermel (1995) Kenya, Nigeria, Ghana 0,10 – 0,35 Morgan (1982) Hàm lượng azadirachtin cũng phụ thuộc vào tời điểm thu hái, quả xoan chịu hạn thu hoạch tốt nhất khi nó chuyển sang màu vàng hay vàng xanh, lúc này hàm lượng azadirachtin cao nhất. không nên để quả quá chín và rụng vì hạt thường bị giảm chất lượng khi bị rơi xuống đất [33; 36]. O O H OH H3CO O O H O OH3C O H3C O CH3 O H H H3CO O OH CH3 HO O CH3 Hình 2.1: Công thức cấu tạo của Azadirachtin [36] 2.3.3.2 Meliantriol Meliantriol là một hợp chất thuộc triterpenoid alcohol, là tác nhân gây ngán ăn mạnh đối với côn trùng ngay cả khi xử lý với nồng độ rất thấp. Nhiều loại côn trùng đã không dám ăn trong khoảng 2 – 6 tuần sau khi tiếp xúc với chế phẩm từ xoan chịu hạn (hình 2.4) [36]. 14 Hình 2.2: Công thức cấu tạo của meliantriol [42] 2.3.3.3 Salannin Salannin cũng có hoạt tính gây ngán ăn mạnh và là chất chống lại sự lột xác của côn trùng. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất này tác động mạnh lên sự lột xác của con bọ cánh cứng trên dưa chuột – Acalymma vitta và bọ cánh cứng Nhật Bản – Popillia japonica. Trong hạt, hàm lượng salannin thường từ 15 – 1247 g/ g nhân hạt xoan chịu hạn (Eeswara và cộng sự, 1996), (hình 2.5) [36]. Hình 2.3: Công thức cấu tạo của Salannin [42] 2.3.3.4 Nimbin và Nimbidin Hai chất này được xem là có hoạt tính kháng virus mạnh. Chúng tỏ ra có hiệu quả đối với virus gây bệnh trên cây cà chua, bệnh đậu mùa và bệnh trên gia cầm. Eeswara và cộng sự (1996) báo cáo rằng nimbidin có trong hạt xoan chịu hạn từ 9 đến 619 g/ g nhân hạt (hình 2.6) [36]. 15 Nimbidin là thành phần chủ yếu gây ra vị đắng của dịch chiết từ hạt xoan chịu hạn với cồn. Nimbidin chiếm khoảng 2% trong nhân hạt xoan chịu hạn [33]. Hình 2.4: (a) Công thức cấu tạo của Nimbin [36] (b) Công thức cấu tạo của Nimbidin [42] 2.3.3.5 Các chất khác Những chất có bản chất limonoid mới được tìm thấy sau này: Diacetylazadirachtin được chiết từ quả tươi, hiệu lực tương tự azadirachtin. Hai chất tương tự salannin là 3 – diacetylsalannin và salannol gây ra sự ngán ăn ở côn trùng. 2.4 Phƣơng thức tác động và phổ tác động của các hoạt chất trong xoan chịu hạn 2.4.1 Đối với côn trùng 2.4.1.1 Phƣơng thức tác động [23] Azadirachtin và các hoạt chất sinh học khác ở cây xoan chịu hạn có hình dạng và cấu trúc tương tự nhiều loại hormone quan trọng trong cơ thể côn trùng, nên chúng dễ dàng xâm nhập và dần dần ức chế hệ nội tiết, gây ra những rối loạn về hormone ở côn trùng (Parma, 1987; Murray và ctv, 1997). Các hoạt chất này thường tác động lên côn trùng theo các phương thức chủ yếu sau đây: Gây ngán ăn: Là một trong những phương thức tác động đặc trưng của các hoạt chất trong cây xoan chịu hạn đối với côn trùng, trong đó azadirachtin là hoạt chất gây ngán ăn mạnh nhất đối với nhiều loại côn trùng. Salannin và meliantriol cũng có khả năng này. Dịch chiết từ hạt xoan chịu hạn chiết xuất trong nước ở nồng độ 0,5 – 1,0% gây ngán ăn hiệu quả đối với Spodoptera litura F. trên đồng ruộng thuốc lá mà không ảnh hưởng xấu lên chất lượng thuốc lá (Johshi và ctv, 1984). (a) (b) 16 Xua đuổi: Các chất xua đuổi dễ bay hơi nên có khả năng tác động đến côn trùng từ xa thông qua cơ quan thụ cảm hóa học khứu giác, gây bất lợi trong đời sống sinh học của côn trùng, khiến chúng di chuyển ra xa vùng gây nhiễm. (Lê Trường và Nguyễn Trần Oánh, 1975) Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều loại côn trùng dễ dàng bị xua đuổi bởi các hoạt chất trích từ cây xoan chịu hạn, nhất là châu chấu và các loại bọ rầy. Năm 1980, ngoài việc chứng minh hoạt chất gây ngán ăn, Saxena và ctv cũng đã theo dõi tác động xua đuổi của dầu xoan chịu hạn đối với rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.). Khả năng diệt côn trùng: Các hoạt chất từ xoan chịu hạn ở nồng độ thích hợp có khả năng diệt côn trùng (đặc biệt là ấu trùng muỗi, ruồi đục quả, bọ rầy) ở các tỷ lệ khác nhau, tuy nhiên hiệu lực cần có thời gian nhất định chứ không nhanh và mạnh như thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp. Ảnh hưởng đến phát triển và biến thái: Theo Koul (1984), tác động của xoan chịu hạn đối sự phát triển và biến thái của côn trùng thường biểu hiện qua các biến đổi như: giảm kích thước, giảm trọng lượng, kéo dài thời gian phát triển, tạo ra những trưởng thành dị dạng như cụt râu, cụt cánh hoặc râu, cánh, chân bị biến dạng. Làm giảm sức sinh sản và gây vô sinh: Các hoạt chất sinh học từ cây xoan chịu hạn có khả năng ức chế sinh sản của nhiều loại côn trùng như ngăn chặn sự đẻ trứng và làm trứng không nở. Ngoài ra, các hoạt chất từ cây xoan chịu hạn còn tác động lên côn trùng theo phương thức khác như làm giảm khả năng nuốt thức ăn, hoặc ức chế sự hình thành kitin (polyacetyl glycoamine), thành phần cơ bản nhất của vỏ côn trùng, làm côn trùng không lột xác được. 2.4.1.2 Phổ tác động [23] Có khoảng 200 loài côn trùng thuộc nhiều bộ khác nhau chịu tác động của hoạt chất chiết xuất từ xoan chịu hạn, chủ yếu ở các bộ sau: - Bộ cánh thẳng (Orthoptera): phương thức tác động chủ yếu là gây ngán ăn. - Bộ cánh cứng (Coleoptera): ngoài hiệu quả gây ngán ăn, còn có thể giết chết ấu trùng khi tiếp xúc với nguồn thuốc. - Bộ cánh đều (Homoptera) và bộ cánh vảy (Lepidoptera): Hiệu quả gây ngán ăn, ức chế tăng trưởng, quá trình lột xác; biến thái và sinh sản của chúng bị rối loạn. - Bộ hai cánh (Diptera): tác động lên nhiều loài ruồi quả, ruồi nhà, muỗi,… 17 - Bộ cánh nửa (Heteroptera): bị tác động bởi cơ chế ngán ăn, ức chế phát triển và biến thái làm cho quần thể côn trùng dần dần bị suy thoái. - Bộ cánh tơ (Thysanoptera): phương thức tác động chủ yếu là ức chế phát triển và sinh sản của đối tượng. 2.4.2 Đối với vi nấm [23] Dầu xoan chịu hạn có thể ức chế hoàn toàn Aspergillus niger, Fusarium monoliforme, Macrophomina phaseolina và Drechslera rostrata (Anon, 1986). Dịch chiết từ lá xoan chịu hạn cũng có khả năng ức chế phát triển và sự nảy mầm bào tử của nấm Fusarium equiseti, Fusarium semitectum và giảm mức độ bệnh ở củ khoai tây gây ra bởi hai loại nấm Aspergillus flavus và Aspergillus niger. Dịch chiết từ lá xoan chịu hạn cũng có hiệu quả ức chế đối với nấm gây bệnh cháy lá ở lúa (Pyricularia oryzae), (Rajeswari và Mariappan, 1993). Dịch chiết từ lá xoan chịu hạn có tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp độc tố của hai loại nấm A. flavus và A. parasiticus (Hampden và ctv, 1993). 2.4.3 Đối với tuyến trùng [23] Dịch chiết từ lá, hoa, quả và vỏ cây xoan chịu hạn có độc tính cao đối với nhiều loại tuyến trùng như: Helicotylenchus indicus Siddiqui, Hoplolaimus indicus Sher và Tylenchus filiformis, Tylenchorchynchus brasscae Siddiqui, Rotylenchus reniformis và Meloidogyne incognita Chitwood (Siddiqui và Alam, 1985). Nimbin và một số hợp chất thuộc nhóm limonoid khác có khả năng ức chế giai đoạn trưởng thành, làm rối loạn chu kỳ sống và có thể gây chết cho đối tượng (Vijayalakshmi và ctv, 1985). 2.5 Một số công trình nghiên cứu về tác động của dịch chiết từ xoan chịu hạn lên sâu bọ Phần này trình bày một số kết quả nghiên cứu đã công bố liên quan đến tính kháng sâu hại của các sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn, làm cơ sở cho việc thực hiện đề tài này. Nhóm tác giả Dương Anh Tuấn và cộng sự thuộc Viện Hóa Học – Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã phân lập hoạt chất azadirachtin từ hạt cây xoan chịu hạn trồng tại Ninh Thuận. Kết quả cho thấy hoạt chất azadirachtin phân lập có độ sạch 92%, hiệu suất chiết tách là 0,054%. Thử nghiệm trên sâu khoang hại rau Spodoptera litura cho thấy azadirachtin có hoạt tính gây ngán ăn khá cao, chỉ số 18 gây ngán ăn trung bình đạt 71,54% ở liều lượng 7,89 mg/cm2 và chỉ số ngán ăn trung bình đạt 87 ở liều lượng 15,6 mg/cm2 [8]. Những thí nghiệm ở phòng thí nghiệm và nhà kính cho thấy dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (NSKE’s) làm giảm đáng kể khả năng đẻ của Leptinotarsa decemlineata trong suốt thời kỳ sinh sản (khoảng 3 tháng). Sau khi phun lên lá khoai tây bằng dịch chiết AZT – VR – K (Feulrhake, 1984) 2,5ml/l nước hoặc dịch chiết từ nước, con cái ăn lá đã xử lý thuốc đẻ rất ít trứng, một số con hoàn toàn không đẻ. Trong khi đó, 20 con đối chứng (không ăn lá đã xử lý thuốc) thì sinh sản bình thường. Vậy ta có thể điển khiển bằng cách phun NSKE’s vào ruộng khoai tây tại thời điểm bắt đầu của thời kỳ đẻ trứng, vào mùa xuân [46]. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Tiến Thắng và Akiko Hirano bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của dầu neem lên sự ký sinh của Bọ Hà (Cylas formicarius F.) trưởng thành trong củ khoai lang (Ipomoea batatas L.) đã kết luận: dầu neem bắt đầu tác dụng với Bọ Hà ở tuần thứ 2 sau xử lý và hiệu quả càng rỏ rệt ở tuần thứ 3 và tuần thứ 4 sau xử lý. Ở nồng độ 200 ppm, tác dụng của dầu neem đối với Bọ Hà là rỏ rệt nhất. Dầu neem làm giảm sự ký sinh, sự sinh sản của Bọ Hà đối với khoai lang ngay từ tuần đầu tiên và có tác dụng xua đuổi Bọ Hà đến ký sinh [21]. Nhóm tác giả Vũ Văn Độ, Vũ Đăng Khánh và Nguyễn Tiến Thắng thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã đánh giá được hiệu quả gây chết của chế phẩm phối trộn giữa dầu neem và Bt (Bacillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis armigera) và sâu tơ (Plutella xylostella). Kết quả nghiên cứu cho thấy: chế phẩm phối trộn giữa dầu neem và Bt gây chết sâu xanh và sâu tơ mạnh hơn so với chế phẩm chỉ chứa dầu neem hoặc chỉ chứa Bt. Hiệu quả gây chết mạnh nhất và rõ ràng nhất ở nồng độ 32% dầu neem và 10% hoặc 15% Bt [6]. Theo S. Singh và R. P. Singh, dịch chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu hạn và Azadirachtin làm cản trở khả năng đẻ trứng của Bactrocera cucurbitae và Bactrocera dorsalis. Azadirachtin và năm loại dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn gồm: dịch chiết trong nước, dịch chiết trong ethanol, dịch chiết trong hexane, dịch chiết trong ethanol được loại dầu bằng n – hexane, và dịch chiết trong acetone của bột nhân hạt neem đã loại dầu được dùng để thử nghiệm sự tác động của chúng lên sự đẻ trứng. Dưới điều kiện thử nghiệm có chọn lọc, tất cả dịch chiết trừ dịch chiết trong nước đều 19 ngăn cản đáng kể sự đẻ trứng của Bactrocera cucurbitae tại nồng độ 1,25% trở lên. Dịch chiết từ nước chỉ tác động ở nồng độ 5% trở lên. Đối với Bactrocera dorsalis, dịch chiết trong ethanol và trong acetone tác động ở nồng độ 1,25% trở lên, dịch chiết trong nước và trong ethanol được loại dầu bằng n – hexane chỉ tác động từ 5% trở lên và dịch chiết trong n- hexane chỉ tác động từ tại nồng độ 20% [47]. 2.6 Chiết xuất, phối chế và sử dụng các sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn 2.6.1 Chiết xuất hoạt chất từ xoan chịu hạn Mặc dù các hoạt chất sinh học được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận cây xoan chịu hạn nhưng các hoạt chất sinh học trong nhân hạt chiếm đa số và dễ thu nhận nhất. Người ta có thể thu nhận hoạt chất sinh học bằng cách chiết xuất với các loại dung môi khác nhau. Các chất có hoạt tính sinh học hòa tan kém trong nước nhưng lại hòa tan gần như hoàn toàn trong dung môi hữu cơ: alcohol, ketone hoặc ether. Việc chiết xuất khá đơn giản, người ta có thể áp dụng phương pháp truyền thống như ngâm, ngấm kiệt và khuấy trộn hoặc phương pháp hiện nay nhờ sử dụng máy ép lạnh. Phương pháp ngâm: Ngâm là phương pháp cho nguyên liệu đã nghiền nhỏ đến độ mịn thích hợp, sau đó cho tiếp xúc với dung môi trong một một thời gian nhất định. sau một thời gian ngâm, gạn lấy dịch chiết và dịch ép, sau đó để lắng, lọc lấy dịch trong [8]. Phương pháp ngấm kiệt: Ngấm kiệt là phương pháp chiết xuất hoạt chất bằng cách cho dung môi chảy qua rất chậm khối nguyên liệu đựng trong một dụng cụ đặc biệt gọi là bình ngấm kiệt, trong quá trình chiết xuất không cần khuấy trộn, có nhiều cách ngấm kiệt khác nhau như: ngấm kiệt phân đoạn (tái ngấm kiệt), ngấm kiệt ngược dòng (gián đoạn và liên tục), ngấm kiệt dưới tác dụng của áp suất, …[9] Ép dầu: Ấn Độ và một số nước thường dùng công nghệ ép dầu từ nhân hạt xoan chịu hạn, dầu ép có màu nâu sẩm, vị đắng và có mùi tỏi do có các hợp chất lưu huỳnh có trong hạt. Phần bã sau khi ép có thể được chiết tiếp bằng các dung môi khác nhau để tận thu hoạt chất hoặc sử dụng làm phân bón. Các dịch chiết thường được pha chế thành các chế phẩm dạng hạt, bột phun, bột hòa nước hoặc dạng nhũ, có bổ sung các chất phụ gia để hạn chế sự phân hủy hoạt chất do điều kiện ngoại cảnh nhằm tăng hoạt lực và dễ dàng đáp ứng cho nhiều đối tượng dịch hại, cây trồng khác nhau. Hiệu quả phòng trị côn trùng có thể tăng lên từ 10 – 20 lần nếu phối hợp dịch 20 chiết hạt xoan chịu hạn với pyrethrin. Dầu hạt neem hòa với acid humic sẽ tăng tác dụng lưu dẫn khi phun lên lá hoặc tưới gốc [8]. Các dung môi chiết xuất phổ biến nhất là: 2.6.1.1 Chiết xuất bằng nƣớc Kỹ thuật đơn giản và được sử dụng phổ biến nhất là xay, nghiền nguyên liệu đến độ mịn thích hợp và chiết xuất hoạt chất sinh học trong nước. Thông thường người ta cho nguyên liệu đã xay mịn vào trong một túi vải và ngâm chìm trong một chậu nước. Ngâm có thể được tiến hành một lần với toàn bộ dung môi hoặc ngâm phân đoạn, ngâm phân đoạn nghĩa là chia quá trình ngâm ra nhiều lần, mỗi lần ngâm dùng một phần của toàn lượng dung môi, người ta có thể tiến hành ngâm phân đoạn một lần hoặc nhiều lần [8]. Dịch chiết thu được có thể sử dụng trực tiếp trên đồng ruộng mà không cần bổ sung thêm phụ gia. Tuy nhiên, có thể lọc dịch chiết và phối chế nó dưới dạng nhũ tương để dễ sử dụng hơn. Cách chiết xuất này thích hợp ở các vùng đồng quê hoặc ở các nước nông nghiệp chưa phát triển. Người ta thường chiết xuất bằng nước khoảng 20 – 30 kg hạt xoan chịu hạn để phun trên một hécta [33]. Theo GS. Govindachari và cộng sự (1999) thì dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn trong nước chứa các chất có hoạt tính sinh học tương tự như các dịch chiết trong alcohol, nhưng hàm lượng ít hơn [35]. 2.6.1.2 Chiết xuất bằng hexane Bột nguyên liệu được ngâm trong dung môi hexane, thu được dầu xoan chịu hạn. Dầu xoan chịu hạn không được xem là thuốc diệt sâu hại mạnh. Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu cho thấy trong một số trường hợp dầu xoan chịu hạn vẫn được sử dụng để diệt trứng của nhiều loại côn trùng, ấu trùng của muỗi và một số sâu hại trong đó có rầy xanh đuôi đen, .v.v. là những đối tượng khó kiểm soát bằng các biện pháp khác. Cặn còn lại sau khi chiết xuất bằng hexane chứa nhiều thành phần limonoid chính và việc chiết xuất tiếp cặn chiết đó bằng nước hoặc cồn sẽ cho sản phẩm chiết chứa hàm lượng limonoid cao, sạch, không chứa dầu [33]. 2.6.1.3 Chiết xuất bằng pentane Dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn trong pentane có tác dụng phòng trừ ve, rệp và nhện. Thành phần có hoạt tính sinh học trong dịch chiết này không phải là azadirachtin. 21 2.6.1.4 Chiết xuất bằng cồn Chiết xuất nhân hạt xoan chịu hạn trong cồn là biện pháp thu nhận các sản phẩm dùng làm thuốc trừ sâu hại ở dạng cô đặc. Các hợp chất limonoid hòa tan tốt trong dung môi cồn. Bột nhân hạt xoan chịu hạn đem ngâm trong trong ethanol hoặc methanol, thu được dịch chiết xuất chứa hàm lượng hoạt chất sinh học từ 0,2 – 6,2 %. Dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn trong nước có tác dụng diệt sâu hại không cao là do các hoạt chất sinh học của xoan chịu hạn không tan tốt trong nước. Còn dịch chiết của nhân hạt xoan chịu hạn trong cồn chứa các chất có hoạt tính sinh học cao hơn khoảng 50 lần so với dịch chiết trong nước [33]. 2.6.2 Phối chế sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn Dạng thuốc trừ sâu hại từ xoan chịu hạn đơn giản nhất là dạng dịch chiết thô nhưng để gia tăng hoạt lực người ta thường phối chế sản phẩm chiết xuất thô với một số hoạt chất khác. Phối chế là việc chuyển dịch chiết xuất thô của xoan chịu hạn thành các dạng hạt, cám, dạng bột ẩm hoặc dạng cô đặc nhũ hóa (emulsifiable concentrate) để tăng hiệu quả sử dụng. Trong thực tế, dịch chiết của nhân hạt xoan chịu hạn trong nước có thể phối chế với xà bông để dễ sử dụng với các bệnh ngoài da [31]. Phối chế liên quan đến việc bổ sung phụ gia vào dịch chiết xoan chịu hạn và đôi khi làm thay đổi cấu trúc hóa học của hoạt chất sinh học từ xoan chịu hạn. Phối chế nhằm làm gia tăng sự ổn định của chế phẩm, làm cho nó dễ sử dụng, dễ bảo quản hoặc thích hợp cho qui mô sản xuất lớn. Việc phối chế cũng nhằm làm giảm độc tính của chế phẩm đối với thực vật (đối với những loài mẫn cảm). Nhóm các chất phụ gia thường được sử dụng là những chất ức chế sự phân hủy do tia UV như dầu mè, leucithin và para – aminobenzoic acid và chất chống oxi hóa [33]. Việc phối chế dịch chiết từ xoan chịu hạn với phụ gia có thể làm tăng khả năng tác dụng của nó lên từ 10 đến 20 lần. Người ta còn sử dụng dịch chiết từ xoan chịu hạn kết hợp với các thuốc diệt côn trùng tổng hợp nhằm làm gia tăng hoạt lực của nó, đặc biệt là để ức chế sự phục hồi quần thể sâu hại. Thí dụ, hiệu quả của dịch chiết từ xoan chịu hạn được tăng cường bằng việc phối chế với vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis (Bt) tạo ra một loại thuốc diệt sâu hại đa tác dụng. [33]. Đối với nấm gây bệnh cây, việc phối chế dầu xoan chịu hạn với chất nhủ hóa như acetic acid, citric acid làm tăng hiệu quả ức chế Sarocladium oryzea gây bệnh thối 22 vỏ lúa và nấm Helminthosporium oryzea, Pyricularia oryzea gây bệnh mất màu ở lúa trong điều kiện in vitro và làm tăng năng suất lúa ở các lô thí nghiệm trên đồng ruộng. Hiệu quả này được duy trì sau 9 tháng bảo quản [41; 44]. 2.6.3 Sử dụng sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn Có thể sử dụng sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn bằng nhiều hình thức khác nhau: ở dạng dịch phun, dạng bột, dạng tẩm hoặc pha loãng với nước tưới cây. Ngoài ra, có thể sử dụng sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn thông qua việc tiêm trực tiếp vào cây hoặc sử dụng cục bộ chế phẩm dạng bụi mịn hoặc dạng phun. Hoặc có thể cho chế phẩm vào mồi để thu hút côn trùng [33]. 2.6.4 Ƣu điểm của các dịch chiết từ xoan chịu hạn So với thuốc trừ sâu tổng hợp, ưu điểm của thuốc trừ sâu gốc thảo mộc là khả năng làm chậm sự phát triển tính kháng ở tác nhân gây dịch hại. Trong số các thuốc gốc thảo mộc đã phổ biến, dịch chiết từ cây xoan chịu hạn phong phú hơn cả về thành phần hoạt chất. Pyrethrin (sản phẩm chiết xuất từ cây hoa cúc Chrysanthemum cinerariaefolium) chỉ chứa 4 loại este và Rotenone (sản phẩm chiết xuất từ cây thuốc lá Derris spp. và Lonchocarpus spp.) chỉ chứa khoảng 6 loại isoflavonoid có hoạt tính diệt côn trùng. Còn ở cây xoan chịu hạn, riêng nhóm azadirachtin đã gồm khoảng 9 loại đồng dạng khác nhau, trong đó nhóm azadarachtin được cho là có hoạt tính kháng côn trùng mạng nhất. Ngoài ra, chưa kể các loại limonoid khác cũng có hoạt tính cao như salanin, meliantriol có mặt trong vỏ và lá xoan chịu hạn. Hoạt lực của các dịch chiết từ xoan chịu hạn được tạo thành từ sự phối hợp tương tác phức tạp của nhiều thành phần hoạt tính, nhờ đó làm giảm tính kháng của các loài dịch hại và sự nhạy cảm về tập tính (Isman, 1997). Thí nghiệm chọn lọc trong điều kiện phòng thí nghiệm trên loài rệp Myzus persicae nhận thấy rằng: khi xử lý azadirachtin tinh sạch lên cây thì tính kháng của loài rệp này tăng lên 9 lần sau 40 thế hệ, nhưng xử lý bằng dịch chiết hạt xoan chịu hạn (chứa hàm lượng azadirachtin tương đương) thì không làm xuất hiện tính kháng của M. persicae sau chừng ấy thế hệ. Có thể chính sự đa dạng về thành phần hoạt chất của dịch chiết hạt xoan chịu hạn đã làm phân tán tiến trình chọn lọc thích nghi của đối tượng dịch hại, nhờ đó làm chậm sự phát triển tính kháng của chúng. Tuy nhiên, cũng như bao nhiêu thuốc thảo mộc khác, các sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn dễ bị phân hủy về mặt sinh học, không bền 23 vững trong môi trường tự nhiên do dễ bị oxy hóa, không làm hại thiên địch và không gây độc hại đối với người [18]. 2.6.5 Một số sản phẩm thƣơng mại của xoan chịu hạn Trên thị trường hiện nay có bán một số sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ xoan chịu hạn, được dùng để kiểm soát côn trùng gây hại. Một số sản phẩm của Mỹ (Margosan-O) [40]; của Đức (NeemAzal – F, NeemAzal T/S) [34; 38] đã được thử nghiệm nghiêm ngặt, được chuẩn hóa và khảo sát độc tính. Một số sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ xoan chịu hạn được trình bày trong Bảng 2.3 Bảng 2.3: Một số sản phẩm thƣơng mại có nguồn gốc từ xoan chịu hạn [36] Quốc gia Tên thương mại Thành phần Việt Nam TP – Kim Thiên Dịch thảo mộc neem (Azadirachtins) và chất hữu cơ Etofenprox Ấn Độ Repelin Wellgro Neemguard Neemmark Neem 2100 Neemrich I Neemrich II, III Xoan chịu hạn, karanja, quả na và dầu caster Dạng chế phẩm rắn Sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn Azadirachtin EC Dịch huyền phù nhân hạt xoan chịu hạn trong nước Dạng cô đặc nhủ hóa Dạng cô đặc nhủ hoá Mỹ Margosan – O Sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn trong ethanol chứa 3000 ppm azadirachtin Thái Lan Instar Neemix Jarvan Advantage Xoan chịu hạn Thái Lan, cây sả chanh, cây riềng nếp Xoan chịu hạn Thái Lan, và các thực vật khác dùng trong y học Dầu xoan chịu hạn Thái Lan Xoan chịu hạn Thái Lan Đức NeemAzal – F NeemAzal T/S Dạng cô đặc hòa tan trong nước, chứa 50.000 ppm azadirachtin Dạng cô đặc hòa tan trong nước, chứa 10.000 ppm azadirachtin 24 Hình 2.5: Cây Neem Hình 2.6: Rừng Neem Ninh Thuận Hình 2.7: Nuôi cấy mô cây Neem Hình 2.8: Hạt và nhân hạt neem 25 2.7 Giới thiệu về Cypermethrin [2; 11] Cypermethrin là một trong hơn 30 hợp chất pyrethroit được sử dụng để phòng trừ côn trùng và nhện hại thực vật. 2.7.1 Pyrethroit [11] Từ xa xưa con người đã dùng bột của hai loài hoa cúc để trừ khử côn trùng và nhện hại hoa màu. Đó là hoa cúc Chrysanthemum cinerariaefolium và C. roseum, hai loài cúc này có chứa 6 este của acid xiclopropan – cacboxylic rất độc đối với côn trùng và nhện hại là pyrethrin I, cinerin I, jasmolin I (có tên chung là chrysanthemat) và pyrethrin II, cinerin II, jasmolin II (có tên chung là pyrethrat). Trong hoa cúc trừ sâu (khô), các este pyrethrin chiếm tới 73 % và được chế biến thành dạng bột 45 – 55 % (Mỹ) hoặc 25 % (Châu Âu) có trộn lẫn với chất tăng hiệu lực PBO (piperonyl butoxit) và được sử dụng để phòng trừ côn trùng trong y tế, thú y, trừ sâu mọt hại kho và phun trừ sâu cho cây trồng . Dưới tác dụng của ánh sáng, các este pyrethrin bị phân giải và mất hiệu lực rất nhanh chóng. Pyrethrin thuộc nhóm độc III, LD50 qua miệng từ 273 – 2370 mg/kg, LD50 qua da là 1500 mg/kg, thuốc rất độc đối với cá, độc nhưng có tác dụng xua đuổi đối với ong mật. Dựa trên những nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc của các este xiclopropan – cacboxylic tự nhiên, đặc biệt là cấu trúc hóa học của pyrethrin, các nhà hóa học đã tổng hợp bằng con đường hóa học ra nhiều dẫn xuất pyrethrin có ưu điểm hơn các este pyrethrin tự nhiên. Những dẫn xuất đó gọi chung là pyrethroit. Hiện nay có trên 30 hợp chất pyrethroit được sử dụng để trừ côn trùng và nhện hại thực vật, nhiều nhất là Acrinathrin, Alphamethrin, Cyfluthrin, Cyhalothrin, Cypermethrin, Fenvalerat, … Nhóm thuốc pyrethroit có những đặc điểm sau: - Lượng hoạt chất sử dụng trên đơn vị diện tích thấp, có khi chỉ từ 8 – 10 g/ha nên làm giảm đáng kể lượng chất độc rải trên môi trường sinh thái. - Có tác dụng chọn lọc cao, ít độc hại hơn đối với thiên địch có ích, trừ được chủng sâu kháng thuốc lân, clo và cacbomat, tuy nhiên hiện tượng sâu chống pyrethroit cũng xảy ra. - Pyrethroit hòa tan nhanh chóng trong lipid và lipoprotein nên tác dụng tiếp xúc mạnh, nhưng cho đến nay chưa có loại thuốc pyrethroit nội hấp và gây tác dụng 26 xông hơi mạnh. Thuốc gây hiện tượng choáng độc nhanh, kích thích cây phát triển và có tác dụng xua đuổi một số côn trùng. - Độ độc cấp tính đối với người và động vật máu nóng thấp hơn so với nhiều hợp chất lân hữu cơ, chóng phân hủy trong cơ thể sống và trong môi trường, nhưng thuốc rất độc đối với cá và các loài động vật thủy sinh, có hiệu quả thấp đối với sâu đục thân lúa. - Các hợp chất pyrethroit có cấu trúc hóa học lập thể rất phức tạp, có nhiều cấu hình khác nhau tạo thành nhiều đồng phân lập thể và hiệu lực diệt sâu của mỗi đồng phân lập thể có khác nhau. Căn cứ vào hiệu lực trừ sâu và sự tác động phối hợp giữa các đồng phân lập thể mà người ta sử dụng đơn hoặc hổn hợp các đồng phân. 2.7.2 Cypermethrin [2; 11] Tên gọi khác: Polytrin, Sherpa, Cymerin, … Tên hóa học: (RS)- - Cyano- 3 - phenoxybenzyl (1RS, 3RS; 1RS, 3SR) – 3 - (2,2--dichlorovinyl) - 2,2 - dimethylcyclopropanecarboxylate (IUPAC). Công thức hóa học: C22H19Cl12NO3 Phân tử lượng: 416,3 Nhóm hóa học: Pyrethroit Công thức cấu tạo: Hình 2.9: Công thức cấu tạo của Cypermethrin 2.7.2.1 Đặc tính của Cypermethrin [2; 11] Thuốc kỹ thuật ở dạng đặc sệt, chứa hơn 90% hoạt chất (active ingredient), điểm nóng chảy từ 60 – 800C, điểm cháy 115,60C. Hầu như không tan trong nước, tan trong nhiều dung môi hữu cơ như: methanol, acetone, xylene, methylene dicloride. Tương đối bền trong môi trường trung tính và acid nhẹ, thủy phân trong môi trường kiềm. Không ăn mòn kim loại. Cypermethrin thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng là 250 mg/kg, LD50 qua da là 1600 mg/kg. Độc đối với cá (LC50 = 2,0 – 2,8 g/l). Cl Cl C = CH CH3 CH3 COOCH CN O 27 Cypermethrin tác động tiếp xúc và vị độc, ngoài ra còn có tác động xua đuổi và làm sâu ngán ăn. Phổ tác động rộng. 2.7.2.2 Sử dụng Cypermethrin Cypermethrin được sử dụng để phòng trừ nhiều loại sâu ăn lá, chích hút và nhện cho nhiều loại cây trồng như sâu tơ, sâu xanh, rệp hại rau, sâu xanh da láng, sâu khoang hại đậu, thuốc lá, bọ xít, rệp, nhện đỏ hại bông, muỗi, rầy xanh, bọ cánh tơ hại chè, sâu vẽ bùa, sâu đục quả, bọ xít hại cây ăn quả, ngoài ra còn dùng để trừ ve, bét, cháy rận cho gia súc và vật nuôi, dùng để trừ ruồi, muỗi trong nhà [11]. Liều lượng sử dụng từ 50 – 100g a.i./ha. Chế phẩm 25 EC (250 g a.i./l) dùng 0,2 – 0,4 l/ha pha với 300 – 400 lít nước phun cho rau, màu, pha nước với nồng độ 0,05 – 0,1% phun ước đều lên lá cây ăn quả. Chế phẩm 10 EC dùng liều lượng và nồng độ tăng gấp 2,5 lần, chế phẩm 5 EC tăng gấp 5 lần so với chế phẩm 25 EC. Khi sử dụng cypermethrin có thể pha chung với nhiều loại thuốc trừ sâu khác. 2.8 Giới thiệu về sâu xanh Heliothis spp. 2.8.1 Định danh và phân loại Sâu xanh thuộc: Bộ : Lepidoptera (Cánh vảy) Họ : Noctuidae (Ngài đêm) Giống: Heliothis Loài : Heliothis spp. Giống Heliothis được định danh lần đầu tiên vào năm 1806 do nhà bác học người Đức Jacobo Hubner, ông đặc tên cho chúng là Tentament. Ở Châu Âu chúng phổ biến với tên Heliothis và có tên là Helicoverpa (Hardrich, 1965). Cuối cùng, ủy ban quốc tế về định danh động vật đã thống nhất gọi giống này là Heliothis spp [43]. Heliothis có các loài sau (Burges, 1981): Heliothis zea Boddic phổ biến ở Châu Mỹ. Heliothis phloxiphaga tìm thấy ở Liên Xô cũ. Heliothis virescens F. ở Châu Mỹ Heliothis punctigera WLLGS ở Châu Úc. Heliothis armigera Hubner ở Châu Á và Châu Phi [43]. 28 2.8.2 Hình thái của sâu xanh 2.8.2.1 Trứng Trứng của sâu xanh có hình cầu, đường kính từ 0,4 – 0,55 mm; có 20 – 30 vân dọc nổi lên chạy tập trung vào đỉnh trứng (xem hình 2.10). Lúc đầu trứng mới đẻ có màu sáng đến vàng óng ánh, sau chuyển dần sang màu nâu đậm trước khi nở. Hình 2.10: Trứng sâu xanh 2.8.2.2 Ấu trùng (Sâu non) Thường có 6 tuổi, sâu non đẩy sức dài 40 – 45 mm, trên cơ thể sâu thường xuất hiện những đường sọc đứt quãng chạy dọc theo mỗi bên cơ thể và một đường kẻ dọc trên lưng. Đầu của sâu thường có màu nâu đỏ; khắp cơ thể có nhiều lông ngắn, chân có màu nâu, cặp chân thứ 4 xuất hiện những gai móc đối xứng nhau giúp sự bám chặt lên ký chủ (xem hình 2.11). Sâu non thường có màu xanh nhạt nhưng màu sắc biến đổi rất nhiều, chủ yếu có 4 loại hình như sau: màu hồng nhạt, màu trắng vàng, màu xanh nhạc và màu xanh [3; 43]. Hình 2.11: Sâu xanh tuổi 2 29 2.8.2.3 Nhộng Nhộng dài từ 17 – 20 mm, màu nâu vàng. Mép trước các đốt bụng 5, 6, 7 có nhiều chấm nhỏ, nốt cuối bụng có 2 gai mông [3 ]. 2.8.2.4 Sâu trƣởng thành Sâu xanh trưởng thành có thân dài từ 15 – 17 mm, sải cánh rộng từ 27 – 38 mm, màu nâu vàng, vàng tươi hoặc nâu tro. Cánh trước có màu vàng sẫm hoặc vàng tro, có các vân không rõ rệt, vân ngoài cùng hình gợn sóng. Con đực có vân ngang, gần mép ngoài hình gợn sóng, giữa hai vân là màu tro, mép ngoài có 7 điểm đen xếp thành hàng ứng với mạch cánh. Cánh sau có màu vàng tro nhạt, ở gần mép trên, phía buồng cánh có một vân ngắn màu nâu đen. Từ mép ngoài trở vào có một khu nâu, cánh trong có một vệt hình trăng non màu tro. Đốt bụng cuối của con cái có lỗ đẻ trứng, còn ở con đực xuát hiện một chùm lông [3; 43]. 2.8.3 Vùng phân bố Sâu xanh (Heliothis armigera) phân bố rất rộng trên thế giới trong phạm vi từ 50 0 vĩ Bắc đến 500 vĩ Nam, từ Châu Phi cho đến các quần đảo ở Thái Bình Dương. Trên núi cao 1821 m vẫn có sâu xanh. Ở nước ta, chúng có mặt ở hầu hết các tỉnh từ tháng 1 đến tháng 12, đặc biệt sâu xanh phát sinh mạnh ở những vùng trồng bông, đay, cà chua, đậu đỗ, …[27]. 2.8.4 Phạm vi ký chủ Sâu xanh là loài sâu ăn tạp, chúng phá hoại trên 200 loại cây ký chủ khác nhau nhưng chủ yếu vẫn là cây bông, ngô, lúa mì, cà chua, thuốc lá, hướng dương, nhiều loại đậu và các ký chủ dại khác. Ở cà chua, mật độ sâu xanh cao hơn ở ngô nhưng thấp hơn ở bông. Tuy mật độ sâu xanh trên ngô thấp nhưng do diện tích trồng ngô nhiều và trồng nhiều vụ trong năm nên quần thể ngô là nơi đóng vai trò bảo tồn giống sâu xanh. Cây chủ thích hợp nhất cho sự đẻ trứng của Heliothis armigera theo thứ tự giảm dần như sau: Đậu Bồ câu (Figeonpea – Cajanus cajan L.), đậu Xanh mỏ két (Chickpea – Cicer arretinum L.), đậu Xanh (Mungbean – Phaseolus aureus) và cà chua (Lycopersicum esculentum) [43]. 2.8.5 Thiên địch của sâu xanh Theo Maxumov A. và Narziculov M., trên đồng bông có 227 loài côn trùng và nhện ký sinh ăn thịt sâu xanh. Theo tài liệu của Trung Quốc và Liên Xô thì bọ xít (Triphlex) ăn trứng và sâu non, ong mắt đỏ (Trichogramma) ký sinh trứng sâu. Ong 30 vàng (Habrobraconhebetor Say.) ký sinh sâu non. Ong đen kén trứng (Apanteles kazak Tel.) ký sinh sâu non đến 64%. 2.8.6 Tập quán sinh sống và qui luật phát sinh gây hại [43] Tập quán sinh sống Sâu xanh thường vũ hóa vào ban đêm. Ban ngày ở ngoài đồng ruộng, ngài ẩn trong các bụi cỏ, lá cây và không hoạt động. Mặc dù bướm đêm của Heliothis armigera bắt đầu hoạt động vào buổi chiều sau 16 giờ nhưng chúng thường hoạt động mạnh nhất từ 20 – 22 giờ. Thời gian giao phối thường từ chập tối đến sáng hôm sau. Sau khi giao phối thì ngài bắt đầu đẻ trứng. Thời gian đẻ trứng có thể kéo dài từ 7 – 13 ngày tùy thuộc vào thời điểm trong năm. Mỗi ngài cái có thể đẻ từ 200 – 300 trứng. Trứng được đẻ riêng lẻ từng quả. Thời gian đẻ trứng của ngài tập trung từ 21 giờ đến nửa đêm. Thời gian đẻ trứng của sâu xanh thường trùng với thời gian kết nụ của cây bông. Sau khi đẻ trứng ngài sẽ chết, sau khi chết trong bụng ngài cái thường vẫn còn trứng. Thời gian sống của ngài cái thường từ 10 – 18 ngày và của ngài đực là 6 – 11 ngày. Thời gian phát dục của trứng phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian này thường kéo dài ở vùng có nhiệt độ thấp và rút ngắn ở vùng có nhiệt độ cao. Ở nước ta, thời gian phát dục của trứng là từ 2 – 12 ngày. Nhiệt độ khởi điểm cho sự phát dục của trứng là 12 0C. Tỷ lệ nở của trứng thường rất cao, từ 80 – 100%. Sau khi nở, sâu non ăn một phần hoặc tất cả vỏ trứng rồi mới ăn sang cây ký chủ. Chúng hoạt động rất mạnh, vừa di chuyển vừa cắn phá các bộ phận của cây để tìm chọn nụ hoặc quả. Khi gặp nụ hoặc quả thích hợp, chùng thường đục vào, ăn phần bên trong làm quả bị rỗng, mỗi sâu non có thể hại từ 5 – 10 quả. Sâu non của Heliothis armigera thích di động và thường ăn thịt lẫn nhau, nhất là ở tuổi 1 sang tuổi 2. Sâu non khỏe mạnh, đẫy sức thường chui xuống đất ở độ sâu từ 2,5 – 17 cm tùy vùng đất cát hay đất thịt để hóa nhộng. Những nghiên cứu của Haren (1979) cho thấy độ ẩm tương đối ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của nhộng, và nhiệt độ có ảnh hưởng rỏ đến sự vũ hóa. Tỷ lệ vũ hóa của nhộng đạt từ 65,5% - 93,1% trung bình đạt 79,6 %. 31 Hình 2.12: Vòng đời của sâu xanh (Heliothis armigera) [43] Qui luật phát sinh gây hại Trên đồng ruộng, mật độ sâu cao nhất thường vào tháng 5. Ở nước ta, tại miền Bắc, sâu xanh có thể phát sinh 4 lứa, mỗi lứa kéo dài 40 – 80 ngày. - Lứa 1: Từ tháng 11 đến tháng 1 - Lứa 2: Từ cuối tháng 1 đến tháng 3 - Lứa 3: Từ cuối tháng 3 đến cuối tháng 5 - Lứa 4: Từ giữa tháng 5 đến cuối tháng 6 [28]. Theo kết quả nghiên cứu của Trung tâm nghiên cứu bông Nha Hố, trong một vụ bông có thể có từ 2 – 6 lứa sâu xanh. Thời gian trung bình của mỗi lứa sâu xanh là 32 ngày [7]. 2 – 3 ngày (Bắt cặp - đẻ trứng) Nhộng Bướm Trứng Sâu non 7 – 10 ngày 2 – 3 ngày 20 – 40 ngày (5 lần lột xác) 32 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 3.1.1 Vật liệu Lá xoan chịu hạn tươi thu nhận từ các cây xoan chịu hạn 4 tuổi ở rừng xoan chịu hạn Ninh Thuận, rửa sạch trong nước cất vô trùng và sấy ở nhiệt độ 500C, xay nhỏ, thu bột lá xoan chịu hạn khô. Hạt xoan chịu hạn thu hái từ các cây xoan chịu hạn 4 tuổi trồng ở Ninh Thuận, phơi khô rồi rửa lại bằng cồn, sau đó đem sấy nhẹ trong 2 giờ ở 600C. Tách vỏ, thu nhân hạt. Cypermethrin 93% do Công Ty Thuốc Sát Trùng Việt Nam (VIPESCO) cung cấp. 3.1.2 Hóa chất H2SO4 đậm đặc, NaOH 35%, H3BO3 2%, hỗn hợp K2SO4/CuSO4 (9:1), thuốc thử methyl red (xác định nitơ tổng); Trilon B 0,02 N, chất chỉ thị murexit (pH = 12), HCl 10%, HNO3, KCN 3%, amonium Molybdate (xác định hàm lượng canxi, phospho); Ether dầu hỏa, KOH 40%, KMnO4 4% (xác định chỉ số lipid), cồn 80 0, cồn 96 0, phenol 5% (định lượng đường tổng số); H2SO4 1,25%, KOH 1,25%, acetone, 6,4n – Octanol (xácđịnh hàm lượng xơ thô)… Azadirachtin chuẩn (Sigma), methanol HPLC (định lượng azadirachtin). Tween 80 (nhũ hóa). 3.1.3 Dụng cụ và thiết bị Cân phân tích có độ chính xác ± 0,001 g. Chén nung bằng sứ chịu nhiệt, có dung tích 30 – 35 ml. Ống nghiệm, pipetman 1000 l. Lò nung, tủ sấy. Bình hút ẩm. Máy cất đạm bán tự động của hãng PROLABO, Pháp. Máy quang phổ tử ngoại khả kiến. 33 Hệ thống Soxhlet. Hệ thống phân tích xơ. Máy cô quay chân không. Máy ép dầu Komet (Model D85 – 1G, Đức). Máy sắc ký HPLC của hãng Hewlett Packard 1090, series 1 – lipid chromatography. 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của lá, bánh dầu và nhân hạt xoan chịu hạn. 3.2.1.1 Xác định trọng lƣợng khô tuyệt đối [10] Cân chính xác 5g mẫu (lặp lại 3 lần đối với mỗi mẫu) trong hộp đựng mẫu sạch, khô đã được cân chính xác. Đem sấy khô ở nhiệt độ 1050C trong tủ sấy cho đến trọng lượng không đổi (từ 2 -5 giờ tùy theo mẫu), ở các thời điểm 2, 3, 4,…giờ sau khi sấy, lấy hộp mẫu ra ngoài tủ sấy, cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội (khoảng 30 – 45 phút), đem cân chính xác. Sai số giữa hai lần phân tích tối đa là 5 mg, trọng lượng khô tuyệt đối được tính theo công thức: Trọng lượng khô tuyệt đối (%) = (trọng lượng mẫu khô * 100)/ trọng lượng mẫu tươi 3.2.1.2 Xác định khoáng tổng số Theo TCVN 4327 – 93; TCVN 4327 – 86 Tham khảo phương pháp TCVN 1538 – 74; AOAC Nguyên tắc Dùng sức nóng (550 – 6000C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong nguyên liệu. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị, dụng cụ - Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002g - Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ (± 100C) - Chén nung bằng sứ chịu nhiệt có dung tích 30 – 50 ml. + Hóa chất - HNO3 đậm đặc - H2O2 30% 34 Cách tiến hành Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung tới 550 – 6000C đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân (G). Cho vào chén nung khoảng 5 g mẫu (G1). Cân trọng lượng chén có mẫu thử, thêm vào chén 5 giọt HNO3 đậm đặc và 1 – 2 giọt H2O2 30%. Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 6000C. Nung cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc (thường trong khoảng 5 – 6 giờ). Sau đó lấy chén sứ ra cho ngay vào bình hút ẩm, để nguôi sau đó đem cân. Lặp lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng không đổi. Sai số giữa hai lần phân tích liên tiếp không được quá 0,0005 g cho 1g mẫu thử. Xác định trọng lượng chén chứa nguyên liệu đã biến thành tro trắng sau khi nung đến trọng lượng không đổi (G2). Tính kết quả Hàm lượng khoáng tổng số đượctính theo công thức: % Khoáng tổng số = (G2 – G) x 100/ (G1 – G) Trong đó: G: Trọng lượng của chén nung (g) G1: Trọng lượng mẫu và chén trước khi nung (g) G2: Trọng lượng mẫu và chén sau khi nung (g) 3.2.1.3 Xác định hàm lƣợng lipid Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet, theo tiêu chuẩn TCVN 4331 – 86. Nguyên tắc Dùng ether nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do trong nguyên liệu, sau đó để bay hơi hết ether, cân chính xác mẫu còn lại và tính ra hàm lượng lipid. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Hệ thống Soxhlet - Máy xay hạt - Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002 mg - Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ± 10C - Giấy gói, lam kính và bình hút ẩm 35 + Hóa chất: Ether petrolium Cách tiến hành Cắt giấy lọc có kích thước 8 x 9 cm, đem sấy ở nhiệt độ 1050C trong 3 giờ, sau đó cho vào bình hút ẩm và mang đi cân trọng lượng bì (Gb). Cân 1 g bột mẫu khô tuyệt đối, chuyển sang bao giấy đã chuẩn bị sẵn như trên, gấp miệng bao để tránh cho mẫu bị rơi vãi, sấy lại bao đã đựng mẫu ở nhiệt độ 1050C đến trọng lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm, đem cân, xác định được khối lượng bao và mẫu (Gm). Cho gói mẫu vào bình trích ly của hệ thống Soxhlet. Lắp các ống dẫn dung môi theo nguyên tắc bình thông nhau, khởi động hệ thống sinh hàn. Rót dung môi (Ether petrolium) vào bình trích ly cho đến miệng ống xiphông để dung môi trào xuống bình hứng, rót thêm cho đến 2/3 bình hứng thì dừng lại. Bình hứng được đặt trên bếp điện điều chỉnh được nhiệt độ. Bật bếp điện ở nhiệt độ 45 – 500C để đun sôi dung môi, khởi động hệ thống Soxhlet. Quá trình trích ly kết thúc sau 10 – 12 giờ. Kiểm tra xem đã trích ly hết lipid bằng cách: nhấc ống làm lạnh ra, lấy vài giọt dung môi trong bình trích ly nhỏ lên lam kính và để cho dung môi bay hết, nếu thấy không còn vết mờ do lipid bám trên lam kính thì việc trích ly xem như kết thúc. Sau cùng, lấy gói mẫu ra để cho bay hơi hết dung môi, đem sấy khô gói mẫu ở nhiệt độ 1050C đến trọng lượng không đổi (khoảng 2 – 3 giờ), để nguội gói mẫu trong bình hút ẩm khoảng 30 phút, sau đó cân gói mẫu trên cân phân tích và xác định được khối lượng gói mẫu đã chiết rút mở ở độ khô tuyệt đối (Gc). Tính kết quả Hàm lượng lipid được tính theo công thức: X = (Gm – Gc)*100/ G Trong đó: X: Hàm lượng lipid trong nguyên liệu ở độ khô tuyệt đối (%) Gm: Khối lượng gói mẫu ở độ khô tuyệt đối Gc: Khối lượng gói mẫu đã chiết rút mở ở độ khô tuyệt đối G: Khối lượng mẫu đem phân tích 36 3.2.1.4 Xác định hàm lƣợng canxi [4] Nguyên tắc Dùng Trilon B xác định canxi trong dung dịch mẫu với chất chỉ thị là Murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH = 12. Ký hiệu của chất chỉ thị Murexid là H3I - trong môi trường pH = 12, H3I - có màu tím và khi kết hợp với canxi tạo thành chất phức tạp có màu hồng: H3I - + Ca 2+ CaH3I + Tím Hồng Phức chất của Ca với Murexid không bền bằng phức chất tạo bởi Ca và Trilon B. Vì vậy Trilon B đẩy chất chỉ thị Murexid ra khỏi phức chất dưới dạng tự do có màu tím: CaH3I + + H2Y 2- CaY 2- + H3I - + 2H + Hồng Tím Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Bình tam giác 100 ml - Bình chuẩn độ bán tự động. - Pipet + Hóa chất - Dung dịch NaOH 10% - Dung dịch KCN 3% - Dung dịch Trilon B 0,02N - Chỉ thị Murexid: cân 0,1 g Murexid + 50 g NaCl tinh khiêt. Nghiền nhuyễn bằng cối, cho vào chai thủy tinh có đậy nút kín. Cách tiến hành Hút 20 ml dung dịch mẫu, cho vào bình tam giác 100 ml. Cho thêm 2 ml dung dịch NaOH 10%, 5 giọt KCN 3% (để ngăn chặn một số ion như Fe3+, Fe2+, Cu2+,…tác dụng với Trilon B) và thêm vào một ít chất chỉ thị Murexid. Chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0,02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một mẫu thử không. 37 Tính kết quả Lượng Calcium (mg) trong 100 g mẫu khô được tính theo công thức: m = (V x C x 20,04 x 100)/ a Trong đó: m: Lượng canxi có trong 100 g mẫu khô (mg). V: Thể tích Trilon B 0,02N dùng để chuẩn độ. C: Độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B. 20,04: Đương lượng của canxi. a: Trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu đã chuẩn độ. 3.2.1.5 Xác định hàm lƣợng phốt - pho Phương pháp Quang phổ kế (AOAC 965.17 – 1990). Xác định hàm lượng phốt - pho trong giới hạn nồng độ từ 1 – 20 mg/ cm3. Nguyên tắc Phương pháp dựa vào khả năng của ion Orthophosphate phản ứng với Ammonium Molybdate tạo thành Phosphormolybdate, phức chất có màu xanh lơ. 2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 + 4 H2O (MoO2.4MoO3)2 H3PO4.4 H2O Hàm lượng phốt - pho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu, đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 650 nm với cuvet có chiều dày 10 mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến có bước sóng 650 nm - Cuvet có chiều dày 10 mm - Bình định mức - Ống nghiệm + Hóa chất - Acid chlohydric đậm đặc (HCl) - Acid nitric đậm đặc (HNO3) - Hydroquinone [C6H4(OH)2] pha khi sử dụng. - Amoni Molybdate - Kali dihydrophosphate (KH2PO4) - Sodium sulphite (NaSO3) 38 Cách tiến hành Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4325 – 86 + Chuẩn bị dung dịch thuốc thử: - Dung dịch 1: là dung dịch chuẩn gốc (có chứa 100 g Phosphor/ml): Hòa tan 0,4394g KH2PO4 trong bình định mức 1000 ml bằng nước cất và định mức đúng 1000 ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (có chứa 25 g Phosphor/ml): Lấy 25 ml dung dịch 1 vào trong bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến đúng 100 ml, ta có dung dịch 1A. - Dung dịch 2: là dung dịch Sodium sulphite (Na2SO3) 20%: Hòa tan 20g Na2SO3 trong ít nước, thêm tiếp nước cho đủ 100 ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. - Dung dịch 3: là dung dịch Hydroquinone [C6H4(OH)2] 0,5%: Hòa tan 0,5g hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO4, thêm tiếp nước cho đủ 100 ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. - Dung dịch 4: là thuốc thử Briggs (hay dung dịch Amoni Molybdate 5%): Hòa tan 50g amoni molybdate trong 600 ml nước. Cho 150 ml H2SO4 đậm đặc vào trong 400 ml nước, để nguội, thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị và hỗn hợp, để nguội, thêm nước cho đủ 1000 ml. - Dung dịch acid chlohydric (HCl) 10% (pha loãng theo tỷ lệ 1:3): 250 ml acid HCl đậm đặc thêm 750 ml nước cất. - Hỗn hợp thuốc thử chuẩn bị khi sử dụng: Trôn lẫn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1 : 1 : 1 + Chuẩn bị dung dịch tro phân tích (Theo TCVN 4327 – 93) - Cân chính xác 1 – 5g mẫu (tùy theo loại mẫu có phosphor nhiều hay ít). - Vô cơ mẫu ở 5500C trong 4 giờ, để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất, thêm vào 10 ml dung dịch HCl 10% và 0,5 ml HNO3 đậm đặc. - Đun nhẹ trong 5 phút (đến bay hơi). Để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250 ml. + Phản ứng lên màu - Lấy 10 ml dung dịch tro cho vào bình nón dung tích 100 ml, định mức bằng nước đến 100 ml được dung dịch thứ 2. 39 - Lấy 1 ml dung dịch thứ 2 cho vào ống nghiệm. - Thêm 3 ml hỗn hợp thuốc thử, cho nước đủ 10 ml. Trộn đều, để 30 phút. Đo ở bước sóng 650 nm. + Chuẩn bị thang dung dịch P chuẩn Thành phần dd O1 O2 O3 O4 O5 O6 O7 O8 O9 O10 O11 Dd 1A (ml) 0 0,3 0,5 0,8 1,0 1,3 1,5 1,8 2,0 2,3 2,5 Nước (ml) 5 4,7 4,5 4,2 4,0 3,7 3,5 3,2 3,0 2,7 2,5 Hỗn hợp thử (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Nước (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Nồng độ Dd (mg/l) 0 15 25 40 50 65 75 90 100 115 125 Độ hấp thu (650nm) 0 0,158 0,279 0,432 0,555 0,735 0,817 0,982 1,096 1,243 1,365 + Tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn Nồng độ phốt - pho của dịch thử được ước tính theo phương trình: X ( g P) = (y * 0,0057)/ 0,0109 y: Mật độ quang của dịch thử đo ở bước sóng 650 nm. Tính kết quả Hàm lượng phốt - pho được tính theo công thức: %P = X x Vdd tro x 100 x Hệ số pha loãng/ 10 6 x m x Vthử Trong đó: %P: Hàm lượng phốt - pho có trong mẫu 40 X: Nồng độ phốt - pho của dịch thử ( g P). m: Khối lượng mẫu thử tính bằng gram. 10 6: Hệ số chuyển đổi từ g ra g. 100: Hệ số phần trăm Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy P = 0,95 không vượt quá d = 28 (0,05 + 0,031X)%. 3.2.1.6 Xác định hàm lƣợng xơ thô Hàm lượng xơ thô được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 4329 – 1993 Nguyên tắc Phương pháp định lượng xơ thô dựa vào tính chất bền của xơ đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Cân phân tích với đọ chính xác ± 0,002g - Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ 5500C ± 100C - Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ± 20C - Bình định mức 1000 ml - Cốc thủy tinh 500 ml, Cốc lọc + Hóa chất - Dung dịch H2SO4 1,25% - Dung dịch KOH 1,25% - Rượu etylic - Ete etylic Cách thực hiện Cân chính xác 1 g mẫu đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi) cho vào bình nón dung tích 250 ml. Hòa tan hết các chất tan trong dung dịch H2SO4 1,25%. Sau đó đem hòa tan tiếp các chất tan trong dung dịch KOH 1,25%.Rửa sạch chất béo, lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng. Rửa kết tủa nhiều lần bằng nước cất nóng (mỗi lần 10 – 15 ml). Rửa lại bằng cồn 960 từ 1 – 2 lần Rửa tiếp với ete etylic tỷ lệ 1:1 41 Sau đó, sấy giấy lọc có chứa cặn ở 1050C đến khối lượng không đổi rồi đốt cháy, Để nguội trong bình hút ẩm, đem cân và tính kết quả. Tính kết quả Hàm lượng xơ thô trong nguyên liệu được tính theo công thức: % xơ thô = (m1 – m2) x 100/ m Trong đó: m1: Khối lượng mẫu và bì trước khi nung (g) m2: Khối lượng mẫu và bì sau khi nung (g) m : Khối lượng mẫu (g) 3.2.1.7 Định lƣợng đạm tổng số [10] Định lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl. Nguyên tắc Nitơ có trong thành phần của chất hữu cơ, dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao sẽ biến đổi thành amoniac (NH3), định lượng NH3 bằng dung dịch acid có nồng độ xác định. Phương pháp Kjeldahl dựa trên nguyên lý chuyển toàn bộ nitơ trong hợp chất hữu cơ thành muối amon bằng cách công phá với H2SO4 đậm đặc. Xác định hàm lượng NH4 + bằng máy Kjeldahl khi cho muối amon tác dụng với kiềm. Thu NH3 bằng dung dịch acid Boric và chuẩn độ muối amon borat bằng dung dịch HCl 0,25 N Quá trình được thực hiện theo các bước sau Bước 1: Vô cơ hóa mẫu Bước 2: Cất đạm Phản ứng xảy ra trong máy cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng NH3 + HBO2 NH4 + + BO2 - Bước 3: Chuẩn độ lượng BO2 - sinh ra trong bình hứng bằng HCl 0,25 N. R – CH - COOH NH2 H2SO4 + Chất xúc tác t 0 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 42 Acid Boric là một acid yếu (Ka = 5,8 x 10-20). Khi chuẩn độ bằng HCl loãng tại điểm đổi màu pH từ 4,4 đến 6,2 thì dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ. Sử dụng hỗn hợp chất chỉ thị Methyl đỏ với Bromocresol xanh. Hàm lượng đạm tổng số của nguyên liệu có thể được tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lượng nitơ tổng số, sau đó nhân với hệ số 6,25. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống Micro - Kjeldahl bán tự động. - Burrette bán tự động - Bộ vô cơ hóa mẫu - Tủ hốt - Pipet, giấy lọc, phiểu lọc, giấy quì tím - Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002g - Bình tam giác + Hóa chất - Hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (9:1) - H3BO3 4% - NaOH N/100 - Thuốc thử Methyl đỏ và Bromocresol xanh. Cách thực hiện + Vô cơ hóa mẫu Cân chính xác 100 mg bột mẫu đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, cho vào bình tam giác. Sau đó thêm 1g chất xúc tác + 5 ml acid H2SO4 đậm đặc vào mỗi bình, lắc nhẹ, để yên 30 phút. sau đó đem vô cơ hóa mẫu. Vô cơ hóa mẫu được tiến hành trong tủ hốt để tránh khí độc SO2, CO2. Trong quá trình đun, dung dịch chuyển từ nâu sẫm đến nâu, đến vàng nhạt cho đến khi dung dịch trắng trong thì quá trình vô cơ hóa mẫu kế thúc. + Tiến hành cất đạm Cất đạm được tiến hành trên máy Micro – Kjeldahl Sử dụng hệ chuẩn HCl 0,25 N để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và tránh những sai số về sự thay đổi nồng độ đượng lượng của kiềm trong không khí. 43 Cho vào bình hứng khoảng 2 ml acid H3BO3 4%, thêm một ít nước cất sao cho dung dịch acid ngập đầu mút sinh hàn. Trong bình hứng dung dịch H3BO3 tự phân ly theo phản ứng: H3BO3 HBO2 + H2O Khi cất đạm, NH3 bị kiềm đẩy khỏi (NH)2SO4 theo hệ thống ống sinh hàn vào bình hứng. Trong bình hứng, NH3 phản ứng với HBO2 như sau: NH4OH + HBO2 NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - là một bazơ mạnh, nên dung dịch của bình hứng chuyển từ màu xanh sang vàng. Quá trình kết thúc khi dịch hứng ở đầu ra có pH = 7,0. Lượng BO2 - được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2 - bằng chuẩn độ ngược với HCl 0,25 N. Tính kết quả Thông qua chỉ số HCl 0,25 N, người ta biết được lượng acid Boric kết hợp với NH3 và từ đó biết lượng NH3 giải phóng ra từ mẫu. 1ml HCl tương ứng với 0,0035g nitơ hữu cơ. Hàm lượng nitơ tổng số được tính theo công thức: % Nitơ tổng số = (VHCl x 0,0035 x 100%)/ m Trong đó: VHCl: Thể tích HCl 0,25 N dùng để chuẩn độ 0,0035: Khối lượng N hữu cơ tương ứng với 1 ml HCl 0,25 N. m: Trọng lượng mẫu (g) Hàm lƣợng đạm tổng số = % Nitơ tổng số x 6,25 3.2.1.8 Định lƣợng đƣờng tổng số [10] Định lượng đường tổng số bằng phương pháp so màu. Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng màu đặc trưng của đường với sụ hiện diện của H2SO4. Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào: - Độ sạch của dụng cụ - Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H2SO4 - Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun Để tạo phản ứng màu, có thể dùng nhiều loại thuốc thử khác nhau như: Phenol, antron hay orcinol. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng thuốc thử là Phenol. 44 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Bình định mức 50 ml, 100 ml, 500 ml - Cốc hay bình tam giác 50 ml, 100 ml - Pipet, giấy lọc, phiểu lọc - Ống nghiệm - Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – Vis). + Hóa chất - Cồn 800, 960 - H2SO4 đậm đặc - Thuốc thử phenol 60%: 6 thể tích H2SO4 đậm đặc và 4 thể tích nước cất. - Các dung dịch đường chuẩn gồm: saccharose 0,1%; glucose 0,01%. Cách thực hiện Gồm 2 bước + Bước 1: Ly trích đường Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau đó cân chính xác 1 – 2 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn có chứa khoảng 5 – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 960 vào. Đun cốc trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần (mỗi lần sôi, lấy cốc ra cho nguội bớt rồi đặt trở lại). Khuấy đều bằng que thủy tinh, để nguội, lọc qua giấy lọc (giữ cặn, không đổ cặn lên giấy lọc) Sau đó thêm 10 ml cồn 800 vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi hai lần trên nồi cách thủy. Để nguội, lọc. Tiếp tục làm như vậy khoảng hai lần. Sau đó đưa cặn lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 800 nóng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để còn bay hơi hết. Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml. Để lắng, dung dịch này được dùng để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch 5 – 10 lần tùy theo nồng độ đường có trong dung dịch nhiều hay ít. + Bước 2: Thực hiện phản ứng màu bằng cách sử dụng thuốc thử là phenol Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi cho thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml acid H2SO4 đậm đặc vào 45 ống nghiệm (không để dính acid vào thành ống nghiệm). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 300C để hiện màu. + Xây dựng đồ thị chuẩn Lấy 7 bình định mức 100 ml cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0,1%, cho thêm nước đến vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml đã pha loãng cho vào ống nghiệm rồi nhuộm màu bằng phenol và H2SO4 như đã nói ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 g saccharose. Phải làm ống thử không với 1 ml nước cất thay thế dung dịch đường. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ màu bằng máy so màu ở bước sóng 490 nm. Tính kết quả Trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không. Từ đó ta xây dựng một đường cong chuẩn. Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không rồi dựa vào đường cong chuẩn để suy ra nồng độ x, từ đó tính ra % lượng đường trong mẫu. 3.2.2 Phƣơng pháp chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn Nguyên liệu Quả xoan chịu hạn được thu hái từ cây 4 – 5 tuổi trồng tại Ninh Thuận, làm sạch vỏ và thịt hạt, sau đó phơi khô hạt trong bóng râm hoặc sấy khô ở nhiệt độ 50 0C. Hạt được tách vỏ lấy nhân hạt để ép dầu. Thiết bị và hoá chất Máy ép dầu thực vật chuyên dụng KOMET Model D 85 – 1G (Đức). Máy cô quay chân không. Dung môi Êtanol. Cách tiến hành [9; 24] Nhân hạt xoan chịu hạn được ép lạnh trên máy ép dầu chuyên dụng Komet (Đức) ở nhiệt độ được khống chế từ 350C đến 450C, thu được dầu và bánh dầu. Bánh dầu (bã còn lại sau khi ép dầu) được cho ngấm kiệt và chiết xuất với ethanol nhằm tận thu các hoạt chất còn lại trong bánh dầu, đặc biệt là azadirachtin. Dịch chiết bánh dầu 46 được loại hết ethanol bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 500C và trộn với dầu, thu được dầu xoan chịu hạn đã làm giàu azadirachtin. (Hình 3.1) Hình 3.1: Qui trình chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn Hạt xoan chịu hạn Nhân hạt Tách vỏ Ép lạnh Bánh dầu Dầu Chiết bánh dầu với êtanol Dịch chiết Bỏ bã Cao chiết Cô quay chân không o Định lượng azadirachtin bằng HPLC o Tạo chế phẩm thử nghiệm trên sâu xanh Dầu xoan chịu hạn đã làm giàu azadirachtin 47 Hình 3.2: Máy Micro – Kjeldahl Hình 3.3: Máy cô quay chân không Hình 3.4: Lọc chân không Hình 3.5: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hình 3.6: Hệ thống Soxhlet Hình 3.7: Máy ép dầu chuyên dụng KOMET (Đức) 48 3.2.3 Phƣơng pháp định lƣợng azadirachtin bằng sắc ký lỏng cao áp (Hight Performance Lipuid Chromatography - HPLC) [24; 39; 45] Xử lý mẫu Cân 20 g hạt xoan chịu hạn, nghiền nhỏ thành bột mịn và chiết rút với 200 ml êtanol từ 1,5 – 2,0 giờ, lặp lại qui trình này 5 lần. Các dịch chiết được gom lại, cô trên máy cô quay chân không ở 500C còn 10 ml và được loại mở bằng n – hexan. Dịch sau khi loại mở được lọc qua màng lọc 0,45 m và xác định hàm lượng các hoạt chất trong dịch lọc trên HPLC. Cách tiến hành + Dựng đường chuẩn azadirachtin: Dựng đường chuẩn 5 điểm với chất chuẩn azadirachtin của hãng Sigma (loại 0,5 mg/ lọ). Xác định hệ số tương quan R. + Phân tích HPLC: Xác định hàm lượng azadirachtin, salanin và mimbin trong dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hewlett Packard 1090, series 1 – liquid chromatography với các thông số sau (Hình 3.5): o Cột phân tích: Bondapak C18, 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 300 mm. o Cột bảo vệ: Bondapak TM C18, 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 20 mm o Detector DAD: = 220 nm o Lượng mẫu bơm vào cột: 5 l o Tốc độ rửa cột: 0,5 ml/ phút o Dung môi rửa cột: Axêtonitril / H2O, (tỷ lệ 55 / 45) o Chất chuẩn: mimbin, salanin của hãng Trifolio – GmbH (Đức) và azadirachtin của hãng Sigma 3.2.4 Phƣơng pháp nuôi sâu xanh (H. armigera) trong phòng thí nghiệm Sâu xanh (Heliothis armigera) được nuôi trên môi trường nhân tạo ở điều kiện nhiệt độ phòng và độ ẩm là 75 – 85%. Bướm sâu xanh được nuôi trong lồng để kiểm tra khả năng đẻ trứng. Nắp lồng được bịt bằng một lớp vải màn để cho bướm sâu xanh đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và thay thức ăn cho bướm. Một hoặc hai ngày sau khi đẻ, trứng đổi thành màu nâu sẫm. Lúc này vải màn chứa trứng được cắt và xếp vào đĩa petri có sẵn thức ăn cho sâu non. Sâu tuổi 1 và đầu tuổi 2 được nuôi tập thể trong đĩa petri. Ở tuổi 2 sâu được tách ra nuôi cá thể. Thức ăn cần thay thường xuyên để đảm bảo sâu đủ khả năng vào nhộng [1]. 49 3.2.5 Phƣơng pháp đánh giá sự ảnh hƣởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin đối với sâu xanh (H. armigera) 3.2.5.1 Chế phẩm thử nghiệm Chế phẩm thử nghiệm được phối trộn giữa hai nguồn gốc là dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (Hình 3.2) và dung dịch Cypermethrin 20% (được pha loãng từ dung dịch 93% do công ty VIPESCO cung cấp). Bao gồm 16 chế phẩm được chuẩn bị (ở dạng tươi để dùng ngay) tại Viện Sinh học Nhiệt Đới như Bảng 3.1 Bảng 3.1 Công thức phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt neem và cypermethrin STT Công thức phối chế (Thể tích cuối: 100 ml) Thành phần chính (%, m/v) Cypermethrin (%, m/v) Dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn (%, m/v) 1 C0D0 0 (0 ml)* 0 (0 ml)* 2 C0D1 0 (0 ml) 10 (10 ml) 3 C0D2 0 (0 ml) 20 (20 ml) 4 C0D3 0 (0 ml) 30 (30 ml) 5 C1D0 0,03 (0,15 ml) 0 (0 ml) 6 C1D1 0,03 (0,15 ml) 10 (10 ml) 7 C1D2 0,03 (0,15 ml) 20 (20 ml) 8 C1D3 0,03 (0,15 ml) 30 (30 ml) 9 C2D0 0,06 (0,30 ml) 0 (0 ml) 10 C2D1 0,06 (0,30 ml) 10 (10 ml) 11 C2D2 0,06 (0,30 ml) 20 (20 ml) 12 C2D3 0,06 (0,30 ml) 30 (30 ml) 13 C3D0 0,09 (0,45 ml) 0 (0 ml) 14 C3D1 0,09 (0,45 ml) 10 (10 ml) 15 C3D2 0,09 (0,45 ml) 20 (20 ml) 16 C 3D3 0,09 (0,45 ml) 30 (30 ml) (*) Lượng thể tích ml tương đương với trọng lượng g. 50 Trong đó: + C: Là cypermethrin (các chữ số 0, 1, 2, 3 theo sau tương ứng với hàm lượng cypermethrin trong chế phẩm lần lược là 0,00; 0,03; 0,06 và 0,09%). + D: Là dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn (các chữ số 0, 1, 2, 3 theo sau tương ứng với hàm lượng dịch chiết nhân hạt neem trong chế phẩm lần lược là 0, 10, 20 và 30%). 3.2.4.2 Đối tƣợng thử nghiệm Sâu xanh (Heliothis armigera) được nuôi bằng thức ăn nhân tạo ở lứa tuổi 2, được cung cấp bởi Tổ Công nghệ Sinh học Động vật - Viện Sinh học Nhiệt đới. 3.2.4.3 Phƣơng pháp thử nghiệm Cách tiến hành Vì sâu xanh có tập tính ăn lẫn nhau khi ở tuổi 2, nên phải bố trí mỗi con ở mỗi lọ riêng biệt.Thức ăn nhân tạo được quét lên thành các lọ nhựa đựng sâu, sau đó quét đều các dung dịch thí nghiệm lên bề mặt thức ăn, đợi cho thức ăn hơi khô ráo thì cho sâu tuổi 2 vào, đậy nắp lại. Ghi nhận số lượng sâu chết sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các nghiệm thức bao gồm 16 chế phẩm được bố trí 5 nồng độ: 5%, 10%, 15%, 20%, 25% và đối chứng không xử lý. Phƣơng pháp xử lý số liệu [14; 15; 16]. Tính tỷ lệ chết của sâu sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày Đánh giá xếp hạng các nhóm chế phẩm và tìm hiểu tương tác giữa 2 yếu tố dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin thông qua phân tích biến lượng (ANOVA) và trắc nghiệm Duncan, thao tác trên phần mềm Statgraphics 7.0 Tính giá trị độ độc trung bình (LC50 – 50% Lethal Concentration) của chế phẩm đối với sâu xanh theo phương pháp phân tích Probit, thao tác trên phần mềm Excell . 51 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu sinh hóa trong lá, bánh dầu và nhân hạt xoan chịu hạn Chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số chỉ tiêu sinh hoá của lá, bánh dầu và nhân hạt xoan chịu hạn như: trọng lượng khô tuyệt đối, hàm lượng khoáng tổng số, hàm lượng lipid, hàm lượng đạm tổng số, hàm lượng đường, hàm lượng xơ thô, hàm lượng canxi, hàm lượng phốt – pho theo các phương pháp được trình bày ở mục 3.2.1 và thu được kết quả như sau: 4.1.1 Các chỉ tiêu sinh hóa của lá xoan chịu hạn Bảng 4.1: Các chỉ tiêu sinh hoá của lá xoan chịu hạn Stt Các chỉ tiêu Lần lặplại Trung bình I II III 1 Trọng lượng khô tuyệt đối (%) 50,00 49,60 49,00 49,53 2 Hàm lượng khoáng tổng số (%) 9,27 9,51 9,16 9,31 3 Hàm lượng lipid (%) 5,10 4,90 4,70 4,90 4 Hàm lượng đạm tổng số (%) 25,63 23,44 23,75 24,27 5 Hàm lượng đường tổng số (%) 7,55 7,20 7,15 7,30 6 Hàm lượng xơ thô (%) 10,95 10,88 10,69 10,84 7 Hàm lượng canxi (%) 0,02 0,03 0,02 0,02 8 Hàm lượng phốt – pho (%) 0,14 0,16 0,16 0,15 Nhận xét: Lá xoan chịu hạn có hàm lượng khoáng và vật chất khô khá cao. Ở nhiều nơi, xoan chịu hạn góp phần cải thiện đất đai bằng con đường tuần hoàn sinh học. Lá xoan chịu hạn khi rụng xuống sẽ cung cấp mùn và khoáng chất cho đất, cải thiện pH ở những vùng đất phèn. Ngoài ra, lá xoan chịu hạn cũng có hàm lượng canxi, phốt – pho và đạm tương đối cao nên có thể là nguồn cung cấp các chất vi lượng cần thiết cho gia súc, là nguồn cung cấp thức ăn hiệu quả trong chăn nuôi. Nếu tận dụng làm phân bón, lá cây là nguồn bổ sung các chất khoáng dồi dào cho cây. Trong lá xoan chịu hạn cũng chứa các hoạt chất sinh học có khả năng phòng trừ sâu hại, do đó lá còn 52 được dùng để sản xuất thuốc trừ sâu. Trong y học, lá cũng có nhiều ứng dụng như sản xuất các loại thuốc bôi da, thuốc sát trùng, thuốc giảm đau,... [23] 4.1.2 Các chỉ tiêu sinh hoá của bánh dầu Bảng 4.2: Các chỉ tiêu sinh hoá của bánh dầu xoan chịu hạn Stt Các chỉ tiêu Lần lặplại Trung bình I II III 1 Trọng lượng khô tuyệt đối (%) 12,20 13,50 11,50 12,40 2 Hàm lượng khoáng tổng số (%) 10,50 9,85 10,80 10,38 3 Hàm lượng lipid (%) 6,90 6,45 6,15 6,50 4 Hàm lượng đạm tổng số (%) 43,13 45,31 44,31 44,25 5 Hàm lượng đường tổng số (%) 8,60 8,25 9,05 8,63 6 Hàm lượng xơ thô (%) 10,25 9,85 10,05 10,05 7 Hàm lượng canxi (%) 0,00 0,02 0,013 0,01 8 Hàm lượng phốt – pho (%) 0,39 0,45 0,52 0,45 Nhận xét: Với hàm lượng phốt – pho 0,45%, hàm lượng đạm tổng số 44,25% và hàm lượng các chất khoáng, đường tổng số khá cao, bánh dầu xoan chịu hạn là một trong những nguồn phân hữu cơ lý tưởng, vừa góp phần cung cấp dinh dưỡng cho cây, duy trì và cải thiện độ phì của đất vừa giải quyết được vấn đề chất thải cho ngành công nghiệp ép dầu. Ngoài ra, bánh dầu xoan chịu hạn còn là nguồn thức ăn lý tưởng cho gia súc. 4.1.3 Các chỉ tiêu sinh hóa của nhân hạt xoan chịu hạn Bảng 4.3: Các chỉ tiêu sinh hóa của nhân hạt xoan chịu hạn Stt Các chỉ tiêu Lần lặplại Trung bình I II III 1 Trọng lượng khô tuyệt đối (%) 4,50 4,50 4,02 4,34 2 Hàm lượng khoáng tổng số (%) 9,05 8,86 9,53 9,15 3 Hàm lượng lipid (%) 33,75 31,20 31,80 32,25 4 Hàm lượng đạm tổng số (%) 32,81 31,88 30,63 31,77 5 Hàm lượng đường tổng số (%) 7,25 7,45 7,06 7,25 6 Hàm lượng xơ thô (%) 9,35 8,40 8,60 8,78 7 Hàm lượng canxi (%) 0,025 0,012 0,01 0,02 8 Hàm lượng phốt – pho (%) 0,41 0,38 0,43 0,41 53 Nhận xét: So với lá thì nhân hạt xoan chịu hạn chứa hàm lượng lipid khá cao (32,25%), nên xoan chịu hạn có thể là một trong những cây cung cấp dầu béo cho các ngành công nghiệp khi được trồng với số lượng lớn và cho năng suất ổn định. Ngày nay, người ta thường sử dụng dầu xoan chịu hạn để sản xuất dầu bôi trơn, thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, sản xuất mỹ phẩm và nhiếu ứng dụng khác trong y học. Bên cạnh đó, dầu xoan chịu hạn chứa nhiều azadirchtin, salanin và nimbin là những hoạt chất có tác dụng phòng trị nhiều loại côn trùng khác nhau nên nhân hạt xoan chịu hạn có thể được dùng để sản xuất thuốc trừ sâu, nấm hại cây trồng. Ở một số nơi, người nông dân còn sử dụng nhân hạt xoan chịu hạn đã được xay nhỏ, ngâm với nước, sau đó đem phun trực tiếp lên rau xanh hoặc hoa màu, vừa phòng trừ sâu hại vừa cung cấp khoáng chất và thức ăn cho cây. Nhân hạt xoan chịu hạn cũng được xay nhỏ để làm thức ăn cho gia súc, vì có hàm lượng đạm tổng số khá cao (trung bình 31,77%). Kết quả thu được phù hợp với những nghiên cứu đã được công bố trước đây [23]. 4.2 Kết quả ép dầu xoan chịu hạn bằng máy KOMET Bảng 4.4: Kết quả ép dầu xoan chịu hạn bằng máy Komet Lần ép Lượng nhân hạt ép (kg) Lượng dầu thu được (kg) Lượng bánh dầu (kg) Nhiệt độ ép Lần ép I 7,1 2,8 (39,44%) 4,3 (60,54%) 400C Lần ép II 8,0 2,7 (33,75%) 5,3 (66,25%) 400C Lần ép III 1,5 0,45 (31,0%) 1,0 (69,00%) 400C Tổng cộng 16,6 5,95 (34,73%) 10,6 (65,27%) 400C Nhận xét: Qua ba lần ép nhân hạt xoan chịu hạn bằng máy ép dầu KOMET (Đức), với mỗi đợt ép từ 1,5 đến 8,0 kg nhân, chúng tôi nhận được kết quả sau: tỷ lệ ép dầu đạt từ 31,0% đến 39,44% (trung bình: 34,73%); bánh dầu từ 60,54% đến 69% (trung bình: 65,27%). Tỷ lệ dầu ép trung bình 34,73% và lượng bánh dầu trung bình thu được 65,27% là phù hợp với các số liệu đã được thông báo [22]. Sự dao động của tỷ lệ dầu và bánh dầu qua các lần ép là do ảnh hưởng của chất lượng hạt (hạt mới hoặc hạt cũ) và ẩm độ của hạt. Tỷ lệ hao hụt qua ba lần ép là không đáng kể. 4.3 Kết quả định lƣợng azadirachtin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tiến hành định lượng azadirachtin trong dịch chiết nhân bánh dầu bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) theo phương pháp và vật liệu tiến hành đã được trình bày ở phần 3.3.2, thu được kết quả sau (xem phụ lục 1): 54 (a) (b) Hình 4.1: Kết quả định lƣợng Azadirachtin trên sắc ký HPLC (a) Sắc ký đồ của dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn. (b) Sắc ký đồ của chất chuẩn Từ kết quả phân tích HPLC, tính được hàm lượng các hoạt chất có trong 1 kg nhân hạt xoan chịu hạn như sau: trong 1 kg nhân hạt xoan chịu hạn chứa 2221 ppm (mg) azadirachtin; 74 ppm (mg) salannin và 26 ppm (mg) nimbin. Kết quả này phù hợp với các số liệu nghiên cứu đã được công bố trước đây [24]. Trên cơ sở các kết quả thu được, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng azadirachtin và cypermethrin trong từng chế phẩm thử nghiệm, kết quả được trình bày trong bảng 4.5: Bảng 4.5: Hàm lƣợng azadirachtin và cypermethrin trong chế phẩm Stt Chế phẩm Thành phần Stt Chế phẩm Thành phần Azadirachtin (%, m/v) Cypermethrin (%, m/v) Azadirrachtin (%, m/v) Cypermethrin (%, m/v) 1 C0D0 0 0 9 C0D2 3,34 0 2 C1D0 0 0,03 10 C1D2 3,34 0,03 3 C2D0 0 0,06 11 C2D2 3,34 0,06 4 C3D0 0 0,09 12 C3D2 3,34 0,09 5 C0D1 1,67 0 13 C0D3 5,00 0 6 C1D1 1,67 0,03 14 C1D3 5,00 0,03 7 C2D1 1,67 0,06 15 C2D3 5,00 0,06 8 C3D1 1,67 0,09 16 C3D3 5,00 0,09 55 4.4 Kết quả đánh giá sự ảnh hƣởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin trên sâu xanh. Sau khi tiến hành thử nghiệm 16 chế phẩm được phối trộn từ dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin (Bảng 3.1) lên sâu xanh (Heliothis armigera) tuổi 2. Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ chết của sâu sau 6 ngày, thu được kết quả sau (Bảng 4.6): Bảng 4.6: Tỷ lệ chết (%) sâu xanh (H. armigera) sau 6 ngày thử nghiệm chế phẩm Stt Chế phẩm Nồng độ thử nghiệm của các chế phẩm (%) 5% 10% 15% 20% 25% 1 C0D0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 C1D0 30,00 33,33 46,67 50,00 53,33 3 C2D0 40,00 50,00 53,33 56,67 63,33 4 C3D0 43,33 46,67 53,33 56,67 66,67 5 C0D1 40,00 46,67 53,33 56,67 63,33 6 C1D1 43,33 53,33 60,00 66,67 73,33 7 C2D1 50,00 53,33 56,67 66,67 70,00 8 C3D1 60,00 63,33 66,67 76,67 83,33 9 C0D2 53,33 60,00 66,67 73,33 76,67 10 C1D2 66,67 70,00 76,67 83,33 86,67 11 C2D2 70,00 80,00 83,33 86,67 93,33 12 C3D2 86,67 90,00 93,33 96,67 100 13 C0D3 66,67 70,00 76,67 83,33 90,00 14 C1D3 73,33 80,00 83,33 86,67 90,00 15 C2D3 80,00 83,33 86,67 90,00 93,33 16 C3D3 86,67 93,33 93,33 96,67 96,67 Trên cơ sở tỷ lệ chết (%) sâu thu được sau 6 ngày theo dõi, chúng tôi tiến hành phân tích Probit bằng phần mềm Excel để xác định LC50 và độ độc tương đối của các chế phẩm thử nghiệm, thu được kết quả sau (Bảng 4.7 và phụ lục 2 ): 56 Bảng 4.7: Kết quả phân tích Probit và LC50 của các chế phẩm thử nghiệm Stt Chế phẩm Phương trình tương quan Hệ số tương quan (R) Mức ý nghĩa (F) LC50 (%) Độ độc tương đối(*) 1 C1D0 y = 0,9376x + 3,7623 0,9590 0,0099 20,8978 0,54 2 C2D0 y = 0,7807x + 4,1965 0,9840 0,0024 10,6955 1,06 3 C3D0 y = 0,7484x + 4,2496 0,9586 0,0101 10,0624 1,12 4 C0D1 y = 0,8123x + 4,1447 0,9818 0,0029 11,2954 1 5 C1D1 y = 1,0914x + 4,0262 0,9847 0,0023 7,8019 1,45 6 C2D1 y = 0,7521x + 4,4022 0,9181 0,2780 6,2345 1,81 7 C3D1 y = 0,9552x + 4,4780 0,8903 0,0429 3,5197 3,21 8 C0D2 y = 0,9349x + 4,3805 0,9789 0,0034 4,5983 2,46 9 C1D2 y = 0,9823x + 4,6564 0,9441 0,0157 2,2331 5,06 10 C2D2 y = 1,2339x + 4,6116 0,9511 0,0129 2,0644 5,47 11 C3D2 y = 1,817x + 4,6336 0,8671 0,049 1,5911 7,1 12 C0D3 y = 1,1405x + 4,5138 0,9135 0,0301 2,6687 4,23 13 C1D3 y = 0,8983x + 4,9623 0,9829 0,0027 1,1015 10,25 14 C2D3 y = 0,8864x + 5,151 0,9441 0,0157 0,6755 16,72 15 C3D3 y = 1,0476x + 5,3881 0,9609 0,0092 0,4261 26,51 (*) Độc tính tương đối được tính trên nghiệm thức C0D1 (chỉ sử dụng dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 10%). Nhận xét: Ngoài nghiệm thức C0D0 (đối chứng trắng) không gây chết sâu xanh tuổi 2 ở tất cả các ngày theo dõi, các nghiệm thức còn lại sau 1 đến 3 ngày thử nghiệm đã có tác dụng gây chết sâu xanh, tuy nhiên hiệu quả không cao. Sau 4 – 5 ngày, hiệu lực gây chết của các chế phẩm tăng dần và đạt mức cao nhất vào ngày thứ 6. Do đó, chúng tôi 57 tập trung đánh giá hiệu quả gây chết sâu xanh sau 6 ngày thử ngiệm chế phẩm. Các kết quả cho thấy: Trong dãy nồng dộ thử nghiệm (5, 10, 15, 20 và 25%), hiệu lực gây chết sâu xanh (H. armigera) của mỗi chế phẩm tăng dần theo sự gia tăng nồng độ của chế phẩm trong dung dịch thử nghiệm. Khi tăng nồng độ thử nghiệm từ 5% lên 25%, tỷ lệ chết của sâu xanh tăng nhiều nhất ở nghiệm thức C2D1 (tăng 30%), các nghiệm thức còn lại tăng từ 13,33% đến 23,33%. Riêng nghiệm thức C3D3 có tỷ lệ chết tăng ít nhất (10%) và nghiện thức C0D0 (đối chứng trắng) không gây chết sâu ở cả 5 nồng độ thử nghiệm (tỷ lệ chết sau 6 ngày là 0%) (Bảng 4.6). Qua kết quả phân tích Probit (Bảng 4.7) cho thấy, độ độc của các chế phẩm đối với sâu xanh (H. armigera) tăng dần theo sự gia tăng nồng độ của dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin trong các chế phẩm. Các giá trị LC50 thấp nhất: 0,4261; 0,6755; 1,1015 và 1,5911% biểu hiện độc tính mạnh nhất của 4 chế phẩm tương ứng là C3D3 > C2D3 > C1D3 > C3D2 (có sự phối trộn giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 20 – 30% và cypermethrin ở nồng độ 0,03 – 0,09%). Độc tính của các chế phẩm này mạnh hơn so với chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 10% (nghiệm thức C0D1) tương ứng 26,5; 16,72; 10,25 và 7,1 lần. Kết quả phân tích cũng cho thấy cypermethrin ở các nồng độ 0,03; 0,06 và 0,09% tương ứng với các nghiệm thức C1D0, C2D0, và C3D0, có độ độc chỉ bằng 0,54; 1,06 và 1,12 lần so với nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 10%. Các nghiệm thức phối hợp giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 10% và cypermethrin ở nồng độ 0,03 – 0,06% (tương ứng với các nghiệm thức C1D1, C2D1) có độ độc chỉ bằng 1,45 và 1,81 lần so với nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 10%. Các nghiệm thức phối hợp còn lại có độ độc tương đối mạnh hơn so với nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn (nồng độ 10%) từ 2,46 đến 5,47 lần. Mạnh nhất là các nghiệm thức có sự phối hợp giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 20 - 30% và cypermethrin ở nồng độ 0,09% (các nghiệm thức C3D2 và C3D3), độ độc tương đối của các chế phẩm này so với chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 10% lần lược là 26,5 và 16,72 lần. Vì việc phân tích Probit bằng phần mềm Excel và phân tích biến lượng (ANOVA) trên phần mềm Statgraphics cho kết quả tương tự nhau, nên bên cạnh việc 58 phân tích Probit để xác định LC50 của các chế phẩm, chúng tôi tiến hành bắt cặp một số nghiệm thức để phân tích trên phần mềm Statgraphit 7.0 nhằm so sánh hiệu quả gây chết sâu xanh giữa các chế phẩm có sự phối trộn dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin với các chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn hoặc cypermethrin, từ đó đưa ra công thức phối trộn tối ưu nhất, kết quả được trình bày ở các Bảng 4.8 và Bảng 4.9 (xem phần phụ lục 3, 4 và 5): Đầu tiên, chúng tôi tiến hành bắt cặp các nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở các nồng độ khác nhau (C0D0, C0D1, C0D2, C0D3), sau đó tiếp tục bắt cặp các nghiệm thức chỉ chứa cypermethrin ở các nồng độ khác nhau (C0D0, C1D0, C2D0, C3D0). Ở cả hai trường hợp, tỷ lệ chết sâu được tính sau 5 ngày theo dõi và ở nồng độ thử nghiệm 25% (ở nồng độ 25%, khả năng gây chết sâu xanh của các chế phẩm trong cùng một nhóm có sự khác biệt rõ ràng nhất), sau khi phân tích trên phần mềm Statgraphics 7.0, thu được kết quả sau (Bảng 4.8): Bảng 4.8: Tỷ lệ