Đề tài Công nghệ thực phẩm collagen

CHÖÔNG 1: COLLAGEN 1.1 GIÔÙI THIEÄU CHUNG VEÀ COLLAGEN 1.1.1 Khaùi quaùt veà Collagen [2] Collagen laø moät protein coù caáu truùc baäc 4 ñieån hình, do caùc ñôn vò tropocollagen caáu truùc baäc 3 toå hôïp theo caùc höôùng doïc vaø ngang laøm collagen coù nhieàu möùc caáu truùc. Collagen laø loaïi protein caáu truùc chính yeáu, chieám khoaûng 25% - 35% toång löôïng protein trong cô theå ôû caùc ñoäng vaät coù xöông soáng. Collagen ñöôïc phaân boá trong caùc boä phaän nhö da, cô, gaân, suïn, raêng, heä thoáng maïch maùu cuûa ñoäng vaät vaø coù maët trong caùc lôùp maøng lieân keát bao quanh caùc cô vaø laø thaønh phaàn chính cuûa daây chaèng vaø gaân,... Khoaûng 10% protein trong cô ôû ñoäng vaät coù vuù laø collagen, caùc protein ngoaïi baøo (hôn 90% trong gaân, xöông vaø khoaûng 50% trong da) coù chöùa collagen. Trong thaønh phaàn cuûa da, collagen chieám khoaûng 70% caáu truùc da vaø ñöôïc phaân boá chuû yeáu ôû lôùp haï bì cuûa da, taïo ra moät heä thoáng naâng ñôõ, hoã trôï caùc ñaëc tính cô hoïc cuûa da nhö : söùc caêng, ñoä ñaøn hoài, duy trì ñoä aåm,... Noù ñoùng vai troø keát noái teá baøo, kích thích quaù trình trao ñoåi chaát, taïo ñoä ñaøn hoài cho da. Söï suy giaûm veà soá löôïng vaø chaát löôïng collagen seõ daãn ñeán haäu quaû laõo hoùa cuûa cô theå maø söï thay ñoåi treân laøn da, khuoân maët laø daáu hieäu deã nhaän bieát nhaát: laøn da bò khoâ, nhaên nheo baét ñaàu töø caùc ñöôøng nhaên maûnh treân khoùe maét, khoùe mieäng, laâu daàn thaønh neáp nhaên saâu, caùc ñöôøng neùt khuoân maët bò chuøng nhaõo vaø chaûy xeä. Tuøy theo töøng ñoä tuoåi, ñieàu kieän soáng vaø taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng, da coù theå bò laõo hoùa hoaëc toån thöông , khi ñoù sôïi collagen seõ maát daàn tính ñaøn hoài vaø saên chaéc do caáu truùc collagen bò phaù huûy. Chính vì vaäy maø collagen ñoùng vai troø laø moät trong nhöõng chaát quan troïng haøng ñaàu cuûa ngaønh thaåm myõ, ñaëc bieät laø chaêm soùc da, phaãu thuaät thaåm myõ, phaãu thuaät boûng... Collagen cuõng ñöôïc phaân boá ôû giaùc maïc, vaø toàn taïi döôùi daïng tinh theå. Trong moâ cô, collagen chieám khoaûng töø 1% ñeán 2%. Trong cô theå ngöôøi, collagen chieám töø 20 – 25% protein cuûa cô theå. Collagen laø thaønh phaàn chính cuûa moâ lieân keát, coù chöùc naêng taïo ñoä vöõng chaéc vaø ñaøn hoài. Collagen coù taùc duïng gioáng nhö moät chaát keo lieân keát caùc teá baøo laïi vôùi nhau ñeå hình thaønh caùc moâ vaø cô quan neàn taûng trong cô theå. Collagen cung caáp cho caùc moâ lieân keát nhöõng ñaëc tính noåi troäi nhôø vaøo söï hieän dieän roäng khaép vaø söï saép xeáp mang tính caáu truùc cuûa noù. Theo quan ñieåm y sinh, collagen ñoùng vai troø quan troïng trong söï phaùt trieån, haøn gaén veát thöông, laø thaønh phaàn hoaït hoaù caùc tieåu caàu trong maùu vaø söï hình thaønh maïch. Theâm vaøo ñoù söï phaùt trieån cuûa moät soá beänh di truyeàn ñöôïc xaùc ñònh laø do söï ñoät bieán trong caáu truùc gen cuûa collagen. Nhöõng roái loaïn trong quaù trình toång hôïp hoaëc phaân giaûi collagen ñeàu ñöôïc ghi laïi nhö laø nguyeân nhaân cuûa nhieàu caên beänh phöùc taïp nhö chöùng vieâm khôùp, xô gan, beänh ñaùi ñöôøng vaø ung thö cuõng nhö nhöõng beänh coù lieân quan ñeán söï laõo hoaù. Collagen phaân boá khaép nôi trong cô theå, töø choã gaân noái baép chaân vôùi goùt chaân cho tôùi giaùc maïc. Trong gaân vaø daây chaèng, collagen coù taùc duïng truyeàn löïc töø cô sang xöông vaø tích tröõ naêng löôïng ñaøn hoài. Chính nhôø tính chaát naøy maø cô theå coù theå di chuyeån, vaän ñoäng moät caùch nhòp nhaøng vaø uyeån chuyeån. Collagen coøn laø chaát neàn höõu cô coù trong xöông vaø men raêng giuùp chuùng choáng laïi söï raïn nöùt. Noù laø thaønh phaàn chính trong da, maïch maùu, caùc cô. Beân caïnh caùc chöùc naêng cô hoïc, ôû giaùc maïc, thuûy tinh theå, traät töï caáu truùc cuûa caùc sôïi collagen taïo neân söï trong suoát duy trì thò löïc. Collagen ñöôïc xem nhö moät vaät lieäu mang tính xaây döïng. Söï linh hoaït cuûa noù laø nhôø vaøo caáu truùc caáp baäc phöùc taïp, taïo neân söï ña daïng trong tính chaát nhaèm phuïc vuï nhöõng chöùc naêng nhaát ñònh. Xeùt veà maët kinh teá, nguoàn nguyeân lieäu giaøu collagen duøng ñeå saûn xuaát ra gelatine- chaát coù nhieàu öùng duïng trong nhieàu lónh vöïc khaùc nhau: thöïc phaåm, y hoïc vaø döôïc phaåm, myõ phaåm, coâng ngheä nhieáp aûnh,... 1.1.2 Lòch söû phaùt trieån cuûa Collagen Theo tieáng Hy Laïp, collagen coù nghóa laø “ngöôøi saûn xuaát keo hoà”, noùi ñeán quaù trình naáu da vaø gaân cuûa ngöïa cuøng nhöõng loaøi ñoäng vaät khaùc ñeå thu ñöôïc hoà. Keo daùn collagen ñaõ ñöôïc ngöôøi Ai Caäp söû duïng caùch ñaây 4000 naêm vaø ngöôøi Myõ söû duïng noù caùch ñaây khoaûng 1500 naêm. Töø hôn 2000 naêm tröôùc, con ngöôøi ñaõ bieát söû duïng moâ lieân keát vaø saûn phaåm cuûa noù trong cheá bieán thöïc phaåm ñeå taïo ra caùc saûn phaûm daïng gel, caùc chaát dính. Ngöôøi Ai Caäp coå ñaïi ñaõ saûn xuaát ra ñöôïc collagen vaø nhöõng nghieân cöùu cho thaáy trong nhöõng theá kæ tieáp theo ñaõ thaät söï xuaát hieän collagen trong caùc böõa tieäc, ví duï trong moùn caù hoài hay baùnh hoa quaû,... Naêm 1682, moät ngöôøi Phaùp teân Papin ñaõ coâng boá moät keát quaû laø ñaõ thu ñöôïc moät hoãn hôïp gioáng jelly töø xöông. Töø naêm 1700, thuaät ngöõ collagen trôû neân thoâng duïng. Naêm 1754, baøi baùo ñaàu tieân trong lónh vöïc chaát dính ñöôïc coâng nhaän ôû Anh veà vieäc saûn xuaát chaát daùn cuûa moät ngöôøi thôï laøm ñoà goã. Caùc chaát hoà daùn töï nhieân ñöôïc saûn xuaát treân thaønh phaàn cô baûn laø collagen vaø moät vaøi chaát khaùc. Naêm 1850, coâng nghieäp saûn xuaát collagen xuaát hieän taïi Myõ, nguoàn nguyeân lieäu chính luùc naøy laø xöông. Naêm 1871, moät phaùt hieän quan troïng cuûa baùc só ngöôøi Anh Richard Leach Maddox veà öùng duïng cuûa collagen ñaõ ñöa ñeán böôùc ñoät phaù trong ngaønh coâng nghieäp hình aûnh, vò baùc só ñaõ caûi tieán “dry plate” vôùi moät lôùp gelatin – baïc bromua vaø coøn nhaïy hôn khi so vôùi “wet plate” . Sau ñoù nghieân cöùu cuûa Charles Bennet ñaõ tieáp tuïc hoaøn thieän phöông phaùp duøng “dry plate”. Öu ñieåm lôùn nhaát cuûa phöông phaùp naøy laø giaûm raát nhieàu thôøi gian trong coâng nghieäp nhieáp aûnh. Cuoái theá kæ 19, khi ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát collagen xuaát hieän ñaõ laøm taêng theâm caùc öùng duïng cuûa collagen trong caùc ngaønh coâng nghieäp khaùc vaø oån ñònh tính chaát saûn phaåm. Naêm 1930, ngaønh saûn xuaát collagen ñöôïc phaùt trieån maïnh meõ khi da heo ñöôïc xem nhö laø moät nguoàn nguyeân lieäu thu nhaän collagen. Ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát collagen ôû Chaâu AÂu chæ môùi baét ñaàu khoaûng nhöõng naêm 1930 nhöng Chaâu AÂu laïi trôû thaønh khu vöïc saûn xuaát collagen quan troïng nhaát treân theá giôùi. Naêm 1950, coâng nghieäp saûn xuaát collagen coù nhöõng böôùc phaùt trieån ñaùng keå veà kó thuaät, töø ñoù laø neàn taûng cho caùc tieâu chuaån trong saûn xuaát vaø chaát löôïng saûn phaåm ngaøy nay. Ngaøy nay, söï hieåu bieát veà acid amin vaø protein noùi chung, collagen cuõng nhö gelatin noùi rieâng ngaøy caøng nhieàu. Theâm vaøo ñoù laø nhöõng tieán boä trong kó thuaät ñaõ giuùp saûn phaåm collagen ñaït an toaøn veä sinh, chaát löôïng theo tieâu chuaån quoác teá vaø yeâu caàu nghieâm ngaët cuûa caùc yeáu toá kó thuaät. 1.1.3 Nguoàn goác thu nhaän Collagen Trong nhöõng naêm tröôùc ñaây, ñeå ñaùp öùng nhu caàu trong coâng nghieäp, collagen ñöôïc trích ly chuû yeáu töø da, xöông cuûa caùc loaøi gia suùc vaø lôïn. Khoaûng thôøi gian gaàn ñaây, söï buøng phaùt cuûa caùc loaïi beänh truyeàn nhieãm nhö beänh boø ñieân (Bovine Spongiform Encephalopathy – BSE, Tranmissible Spongiform Encephalopathy – TSE) vaø beänh lôû moàm long moùng (Food and Mouth Disease – FMD) ôû lôïn vaø gia suùc ñaõ haïn cheá phaïm vi söû duïng cuûa collagen coù nguoàn goác töø nhöõng loaøi ñoäng vaät treân bôûi vì nhöõng beänh truyeàn nhieãm coù khaû naêng laây truyeàn sang con ngöôøi thoâng qua caùc moâ cuûa ñoäng vaät. Beân caïnh ñoù, ôû moät soá quoác gia, collagen trích ly töø lôïn khoâng ñöôïc söû duïng vì raøo caûn toân giaùo. Vôùi nhöõng nguyeân nhaân treân, caùc nhaø khoa hoïc ñang taäp trung vaøo caùc nghieân cöùu cuûa hoï ñeå tìm ra nhöõng nguoàn collagen thay theá. Da, xöông, vaây, vaûy cuûa caû nhöõng loaøi caù nöôùc ngoït, ñaëc bieät laø caù da trôn: caù tra, caù ba sa, caù bieån, da gaø, da eách, da möïc,…coù theå ñöôïc söû duïng nhö nhöõng nguoàn thay theá. Trong soá nhöõng nguoàn thay theá, caù cung caáp moät nguoàn nguyeân lieäu thoâ toát nhaát vì: - Deã tìm, saün coù ñeå söû duïng - Khoâng coù söï laây truyeàn beänh - Khoâng gaëp phaûi trôû ngaïi veà maët toân giaùo. - Coù khaû naêng thu ñöôïc collagen vôùi hieäu suaát cao Khoaûng 70% toång troïng löôïng cô theå cuûa caù bò boû ñi döôùi daïng caùc pheá phaåm nhö da, xöông, vaây, ñaàu, vaûy, ruoät,…trong suoát quaù trình cheá bieán. Vieäc taän duïng nhöõng chaát thaûi naøy coù theå naâng giaù trò kinh teá cuûa caùc loaøi caù leân. Döïa vaøo thaønh phaàn % cuûa toång löôïng collagen tính treân toång löôïng protein, caùc loaøi caù ñöôïc chia thaønh 3 nhoùm: Nhoùm coù haøm löôïng collagen thaáp: toång löôïng collagen chieám ñeán 5 % so vôùi toång löôïng protein. Nhoùm coù haøm löôïng collagen trung bình : toång löôïng collagen chieám töø 5 ¸ 10 % toång löôïng protein. Nhoùm coù haøm löôïng collagen cao: toång löôïng collagen treân 10 % toång löôïng protein. Thòt cuûa nhöõng loaøi caù khaùc nhau chöùa haøm löôïng khaùc nhau cuûa collagen hoøa tan trong acid (acid soluble collagen) vaø collagen khoâng hoøa tan (insoluble collagen). Haøm löôïng collagen toång coäng dao ñoäng töø 0,3 ¸ 2,99 % so vôùi troïng löôïng töôi cuûa caùc moâ, töông öùng vôùi phaïm vi töø 1,58 ¸ 13,39 % so vôùi toång löôïng protein. Baûng 1.1 Thaønh phaàn collagen trong thòt caù Loaïi caù Collagen hoøa tan trong acid (so vôùi troïng löôïng töôi) Collagen khoâng hoøatan (so vôùi troïng löôïngtöôi) Collagen toång (so vôùi troïng löôïngtöôi) Collagen toång (so vôùi protein toång) Caù chim traéng 0,19 0,11 0,3 1,58 Sardine 0,36 0,09 0,45 2,42 Caù thu 0,38 0,09 0,47 2,41 Caù bôn 0,4 0,18 0,58 2,98 Caù cheùp 0,49 0,21 0,7 3,25 Caù ñoái 0,94 0,25 1,19 5,89 Caù ngöø 1,06 0,39 1,45 7,35 Caù maäp 2,13 0,86 2,99 13,11 Caù ñuoái 2,3 0,5 2,8 13,39 Toång löôïng collagen trong cô theå thay ñoåi töø 3,26 % (ôû caù thu) cho ñeán 6,97% (ôû caù chình Nhaät Baûn). Löôïng collagen coù theå hoøa tan trong acid (acid soluble collagen) naèm trong khoaûng töø 13,1 % (caù chình) ñeán 56,6 % (caù bôn). Haøm löôïng collagen thu ñöôïc seõ thay ñoåi tuøy theo loaøi vaø loaïi moâ ñöôïc söû duïng trong quaù trình trích ly. Trong taát caû caùc loaøi, khaû naêng hoøa tan cuûa collagen trong thòt töông ñoái cao nhöng thaáp ñoái vôùi nhöõng loaïi collagen trong noäi taïng. Collagen trong da, vaûy, xöông vaø vaây chieám phaàn lôùn trong toång löôïng Collagen. Cho ñeán nay, haàu heát caùc loaïi myõ phaåm treân neàn collagen ñeàu coù chöùa protein chieát xuaát töø gia suùc. Bôûi söï boäc phaùt cuûa beänh boø ñieân BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy – mad cow disease), collagen töø gia suùc ñang daàn ruùt khoûi phaïm vi söû duïng, thay vaøo ñoù laø nguoàn collagen ñöôïc trích töø caù, ñaëc bieät laø caù da trôn: caù tra, caù ba sa. Nguoàn collagen ñöôïc chieát taùch töø nguoàn nguyeân lieäu naøy coù nhieàu ñaëc ñieåm toát hôn cho vieäc öùng duïng trong thöïc phaåm, y hoïc vaø myõ phaåm. Trong coâng ngheä saûn xuaát myõ phaåm, myõ phaåm treân neàn collagen töø gia suùc coù toác ñoä haáp thuï raát chaäm treân da ngöôøi. Ñoái maët vôùi vaán ñeà naøy, lieäu phaùp tieâm collagen vaøo da ñöôïc giôùi thieäu. Tuy nhieân, nhöõng baát lôïi cuûa caùch thöùc naøy laø ñaét tieàn, ñau ñôùn vaø ñi keøm vôùi noù laø nhöõng ruûi ro nguy hieåm cho con ngöôøi. Hieän nay, caùc nhaø khoa hoïc Phaàn Lan ñaõ phaùt trieån moät tieán trình trích ly collagen töø caù. Khoâng gioáng vôùi nhöõng loaïi collagen thu ñöôïc töø nhöõng phöông phaùp tröôùc ñaây, collagen töø caù ñöôïc haáp thuï hoaøn toaøn treân da ngöôøi. Vì caù soáng trong phaïm vi roäng lôùn vôùi caùc ñieàu kieän veà nhieät ñoä, ñoä saâu vaø aùp suaát khaùc nhau. Ñieàu naøy coù nghóa laø collagen trích töø da caù coù moät söùc choáng chòu ñaëc bieät vôùi caùc phaù huûy lyù vaø hoùa hoïc. Ñoái vôùi caùc thuoác hay thöùc uoáng coù chöùa collagen, collagen töø caù cuõng ñöôïc chöùng minh laø coù toác ñoä haáp thuï vaøo maùu nhanh hôn gaáp 1,5 laàn so vôùi collagen töø lôïn. So saùnh khaû naêng haáp thuï vaøo maùu giöõa collagen töø caù vaø collagen töø lôïn Thôøi gian sau khi söû duïng Khaû naêng haáp thuï vaøo maùu Hình 1.1 Ñoà thò so saùnh khaû naêng haáp thuï vaøo maùu cuûa collagen trích ly töø caù vaø töø lôïn Vieät Nam laø moät nöôùc ñang phaùt trieån, coù neàn noâng nghieäp vôùi caùc saûn phaåm phong phuù. Trong ñoù, caùc saûn phaåm töø caù chieám moät phaàn lôùn trong kim ngaïch xuaát khaåu. Nhöõng naêm gaàn ñaây, vieäc nuoâi caù da trôn : caù tra, caù ba sa raát phaùt trieån, ñaëc bieät ôû Ñoàng baèng soâng Cöûu Long. Trong quaù trình cheá bieán caù, song song vôùi nhöõng chính phaåm duøng cho vieäc xuaát khaåu (chuû yeáu laø fillet) laø moät khoái löôïng lôùn caùc phuï phaåm nhö da, xöông, vaây,… Ñaây laø nhöõng nguoàn giaøu collagen, coù theå söû duïng thay theá cho nhöõng nguoàn cung caáp Collagen coå ñieån nhö da, xöông töø lôïn, boø. Vieäc taän duïng nhöõng nguoàn naøy seõ goùp phaàn laøm taêng giaù trò kinh teá cuûa caùc loaøi caù da trôn ôû nöôùc ta. 1.2 CAÁU TAÏO COLLAGEN 1.2.1 Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa Collagen [1] Thaønh phaàn protein trong collagen coù gaàn ñaày ñuû caùc loaïi acid amin, bao goàm taát caû 20 loaïi acid amin ( Schrieber vaø Gareis,2007). Thaønh phaàn acid amin coù theå thay ñoåi tuøy theo nguoàn goác cuûa collagen, nhöng vaãn toàn taïi moät vaøi tính chaát chung vaø duy nhaát cho taát caû collagen. Trong thaønh phaàn collagen khoâng chöùa cystein vaø trytophan, nhöng chöùa moät löôïng lôùn glycine (Gly), chieám khoaûng 33% vaø proline (Pro), chieám tæ leä 12% vaø hydroxyproline (Hyp), chieám tæ leä 22% (Theo Balian vaø Bowes 1977). Collagen laø moät trong soá ít nhöõng protein coù chöùa hydroxylysine (Hyl), ngoaøi ra trong thaønh phaàn Collagen coøn chöùa khoaùng, chieám tæ leä 1%. Baûng 1.2 So saùnh thaønh phaàn caùc acid amin trong collagen vaø caùc loaïi protein khaùc (soá goác/1000 goác) Collagen Casein Albumin Glycine 363 30 19 Alanin 107 43 35 Valine 29 54 28 Leucine 28 60 32 Isoleucine 15 49 25 Serin 32 60 36 Threonine 19 41 16 Cystein - 2 1 Methionine 5 17 16 Aspatic acid 47 63 32 Glutamic acid 77 153 52 Lycine 31 61 20 Hydroxylycine 7 - - Arginine 49 25 15 Histidine 5 19 7 Phennylalanine 15 28 21 Tyrosine 5 45 9 Trytophan - 8 3 Proline 131 65 14 Hydroxyproline 107 - - Proline vaø Hydroxyproline lieân quan tôùi caáu truùc baäc 2 cuûa collagen. Nhöõng amino acid naøy giuùp giôùi haïn söï quay cuûa boä khung polypeptide, do ñoù goùp phaàn taïo neân söï beàn vöõng cho caáu truùc xoaén oác baäc 3. Nhoùm hydroxyl cuûa hydroxylproline ñoùng vai troø quan troïng trong söï beàn vöõng caáu truùc xoaén oác baäc 3 cuûa collagen. Polypeptide cuûa collagen maø thieáu hydroxylproline seõ taïo neân caáu truùc gaáp khuùc ôû nhieät ñoä thaáp vaø seõ khoâng beàn vöõng ôû nhieät ñoä thaân nhieät. Hydroxyproline laø moät acid amin ñaëc tröng cuûa collagen maø caùc loaïi protein khaùc khoâng coù. Hydroxyproline ñöôïc hình thaønh sau quaù trình ñieàu chænh proline khi ñöôïc keát hôïp vaøo vò trí Y trong chuoãi Gly-X-Y. Hydroxyproline coù coâng thöùc phaân töû laø C5H9NO3, khaùc vôùi proline, trong coâng thöùc caáu taïo cuûa Hyp coù gaén nhoùm OH naèm ôû vò trí cacbon gamma, acid amin naøy coù vai troø quan troïng trong söï oån ñònh caáu truùc cuûa collagen, laø daãn xuaát cuûa proline trong quaù trình hình thaønh chuoãi collagen coù söï xuùc taùc cuûa enzyme hydroxylase proline vaø söï coù maët cuûa Vitamin C ñeå giuùp boå sung theâm Oxy, thieáu vitamin C seõ laøm chaäm quaù trình toång hôïp hydroxyproline, aûnh höôûng ñeán quaù trình xaây döïng caáu truùc protein gaây ra nhöõng roái loaïn trong cô theå. Hình 1.2 Coâng thöùc caáu taïo cuûa hydroxyproline Phaân töû collagen bao goàm 3 chuoãi xoaén laïi vôùi nhau taïo thaønh collagen triple- helix taïo thaønh caáu truùc 3D- moät moâ hình lyù töôûng cho caùc lieân keát hydro giöõa caùc chuoãi ( Te Nijenhuis, 1997). Moãi chuoãi trong triple- helix quay theo chieàu kim ñoàng hoà. Triple-helix daøi xaáp xæ 300nm vaø chuoãi coù khoái löôïng phaân töû khoaûng 105 kDa (Papon, Leblon vaø Meijer, 2007). Triple-helix ñöôïc oån ñònh bôûi lieân keát hydro noäi giöõa caùc chuoãi. Trong caáu truùc phaân töû collagen, do töông taùc giöõa caùc maïch polypeptide laøm cho phaân töû coù nhöõng vuøng kî nöôùc vaø vuøng phaân cöïc mang ñieän tích seõ taïo neân khaû naêng haùo nöôùc laøm tröông nôû collagen. Söï bieán tính collagen laøm cho caùc caàu noái bò taùch moät phaàn hoaëc hoaøn toaøn gaây neân söï taùch rôøi caùc chuoãi do phaù huûy caùc lieân keát hydro, chính ñieàu naøy laøm maát ñi caáu truùc triple-helix. Moâ hình “ triple-helice” cuûa collagen döïa treân nhöõng nghieân cöùu veà hieän töôïng nhieãu xaï sôïi. Chuoãi nhieãu xaï sôïi theå hieän treân möùc trung bình cuûa toaøn boä phaân töû collagen , vaø moâ hình ñaëc tröng theå hieän ñoù laø söï saép xeáp laëp ñi laëp laïi cuûa caùc chuoãi polypeptid, thoâng thöôøng laø Gly-Pro-Hyp. Moät ñaëc ñieåm ñaëc tröng cuûa collagen laø söï saép xeáp ñeàu ñaën cuûa caùc amino acid trong moãi maét xích cuûa töøng chuoãi xoaén oác collagen naøy. Moãi sôïi collagen naøy ñöôïc caáu taïo töø ba chuoãi polypeptid noái vôùi nhau gioáng nhö sôïi daây thöøng. Caáu truùc cuûa collagen töông töï nhö hình xoaén oác, moãi moät chuoãi polypeptid trong collagen ñöôïc caáu taïo töø caùc acid amin theo moät traät töï, thoâng thöôøng laø Gly – Pro – Y, hoaëc Gly – X – Hyp. Hình 1.3 Trình töï saép xeáp caùc acid amin trong phaân töû Collagen Trong ñoù X, Y laø nhöõng ñôn vò aminoacid khaùc nhau, coù theå laø proline (Pro) vaø hydroxyproline ( Hyp) chieám khoaûng 1/6 chieàu daøi chuoãi. Glycine chieám gaàn 1/3 trong toång soá caùc amino acid vaø noù ñöôïc phaân boá moät caùch ñeàu ñaën taïi vò trí moãi 1/3 xuyeân suoát trong phaân töû collagen. Do glycine coù caùc nhaùnh phuï nhoû nhaát neân söï laëp laïi cuûa noù cho pheùp caùc chuoãi polypeptide keát hôïp chaët cheõ vôùi nhau hình thaønh neân moät ñöôøng xoaén oác vôùi khoaûng troáng nhoû ôû phaàn loõi. Toång coäng chæ rieâng proline, hydroxyproline vaø glycine ñaõ chieám ½ chuoãi Collagen. Caùc acid amin coøn laïi chieám ½ Baûng 1.3 Söï phaân boá caùc amino acid trong chuoãi polypeptide Triple helix Tæ leä so vôùi toång boä ba(%) Gly – X – X 44 Gly – X – Y 20 Gly – Y – X 27 Gly – Y – Y 9 Collagen cuõng chöùa caùc ñôn vò carbonhydrate, caû monosaccharide galactose hoaëc disaccharide glucosylgalactose, lieân keát vôùi phaàn dö hydroxylysine thoâng qua nhoùm hydroxyl chöùc naêng cuûa amino acid. Tyû leä cuûa mono/disaccharide phuï thuoäc vaøo loaïi collagen vaø tình traïng sinh hoïc. Chöùc naêng cuûa caùc ñôn vò carbohydrate vaãn chöa ñöôïc hieåu bieát ñaày ñuû, nhöng aûnh höôûng cuûa chuùng trong vieäc gaén keát phaàn beân phaân töû collagen hình thaønh neân sôïi vaø baùn kính cuûa sôïi ñang ñöôïc nghieân cöùu. Ngoaøi ra, trong phaân töû collagen coù nhöõng vuøng goàm khoaûng 9 ¸ 26 amino acid taïi caùc ñieåm ñaàu muùt amino hay carboxyl cuûa chuoãi. Caùc vuøng naøy khoâng saùp nhaäp vôùi caáu truùc xoaén oác vaø ñöôïc goïi laø telopeptide. 1.2.2 Caáu truùc phaân töû Collagen [1] Phaân töû collagen laø moät protein hình truï, coù caáu truùc baäc 4, do caùc ñôn vò tropocollagen caáu truùc baäc 3 toå hôïp theo caùc höôùng doïc vaø ngang laøm collagen coù nhieàu möùc caáu truùc.. Ñôn vò cô baûn cuûa collagen laø “Tropocollagen”, lieân keát vôùi nhau taïo thaønh nhöõng sôïi nhoû. Tropocollagen laø moät caáu truùc daïng sôïi hình oáng chieàu daøi khoaûng 300nm, ñöôøng kính 1.5nm, goàm ba sôïi polypeptide (coøn goïi laø 3 chuoãi α) cuoän laïi vôùi nhau, moãi chuoãi a cuoän thaønh ñöôøng xoaén oác theo höôùng töø phaûi sang traùi vôùi 3 goác treân moät voøng xoaén, hay coøn goïi laø proline I ( xoaén traùi vôùi 3.3 goác aminoacid/ voøng, lieân keát peptid coù hình theå cis ), ba chuoãi naøy xoaén laïi vôùi nhau theo höôùng töø traùi sang phaûi taïo thaønh ñöôøng boä ba xoaén oác (triple helix) hay coøn goïi laø proline II ( xoaén traùi vôùi 3 goác aminoacid/ voøng, lieân keát peptid coù hình theå trans), khoaûng caùch giöõa hai goác tính töø hình chieáu cuûa chuùng leân caùc truïc laø 0,31nm. Hai caáu truùc naøy coù theå chuyeån ñoåi cho nhau vaø thöôøng thì daïng II trong moâi tröôøng nöôùc thì beàn hôn. Hình 1.4 Caáu truùc cuûa Tropocollagen ( triple helix ) Caùc chuoãi collagen saép xeáp song song theo chieàu doïc lieân keát vôùi nhau baèng caùc lieân keát ngang taïo thaønh caùc sôïi theo chu kyø nhaát ñònh. Chuùng ñöôïc saép xeáp so le nhau moät khoaûng 67nm vaø coù 1 khoaûng troáng 40nm ôû giöõa nhöõng phaân töû lieàn keà nhau. Nhôø vaøo caáu truùc coù traät töï, ñoä beàn voán coù cuûa caùc chuoãi xoaén oác ñöôïc chuyeån sang caùc sôïi collagen, cung caáp cho caùc moâ ñoä cöùng, ñoä ñaøn hoài vaø nhöõng ñaëc tính cô hoïc rieâng. Vì theá collagen raát chaéc, dai vaø beàn. Hình 1.5 Lieân keát ngang giöõa caùc phaân töû Tropocollagen Caùc tropocollagen seõ lieân keát ngang vôùi nhau theo kieåu coäng hoùa trò vaø chính nhôø vaøo lieân keát naøy maø caùc phaân töû tropocollagen hình thaønh neân sôïi collagen. Caùc sôïi collagen raát daøi vaø maûnh, chuùng saép xeáp taïo thaønh maïng collagen. Hình1.6 Caáu truùc cuûa procollagen vaø söï chuyeån töø procollagen sang tropocollagen Caùc böôùc hình thaønh neân collagen: Böôùc 1: Toång hôïp chuoãi alpha, giai ñoaïn tröôùc procollagen treân riboxom vaø trong maïng löôùi noäi chaát. Böôùc 2: Söï toå hôïp 3 chuoãi alpha hình thaønh procollagen. Söï hình thaønh caàu noái disulphide giöõa caùc phaàn cuûa chuoãi polypeptide taïi ñaàu C- Ba chuoãi alpha lieân keát laïi, hình thaønh chuoãi xoaén oác, taïo procollagen. Böôùc 3: Söï giaáu caùc phaân töû procollagen baèng caùch hình thaønh lôùp maøng theâm bao boïc. Böôùc 4: Söï phaân caét caùc peptide ñònh danh taïi lôùp maøng bao boïc, keát quaû laø hình thaønh neân phaân töû collagen. Böôùc 5: Quaù trình töï saép xeáp cuûa collagen phaân töû hình thaønh neân sôïi collagen. Böôùc 6: Taïo caùc lieân keát ngang giöõa caùc phaân töû collagen ñöùng caïnh nhau. Hình 1.7 Söï hình thaønh chuoãi xoaén oác noäi phaân töû vaø giöõa caùc chuoãi polypeptide Moãi chuoãi polypeptide coù khoái löôïng phaân töû khoaûng 100 kDa, taïo neân toång khoái löôïng phaân töû cuûa collagen khoaûng 300 kDa. Chuoãi a ñöôïc caáu taïo bôûi khoaûng 1000 amino acid. Caùc chuoãi a khaùc nhau (a1, a2 vaø a3) ôû thaønh phaàn amino acid. Söï phaân boá cuûa caùc chuoãi a1, a2 vaø a3 trong caùc phaân töû collagen khaùc nhau tuøy thuoäc vaøo söï khaùc nhau veà gene. 1.2.3 Caáu truùc sôïi cuûa collagen [3] Phaàn lôùn collagen trong maïng löôùi ngoaïi baøo ñöôïc tìm thaáy ôû daïng sôïi, bao goàm nhöõng sôïi maûnh, nhoû. Thoâng qua quaù trình taïo sôïi, caùc phaân töû collagen toå hôïp vôùi nhau hình thaønh neân caùc vi sôïi (microfibril) bao goàm töø 4 ¸ 8 phaân töû collagen hoaëc vôùi soá löôïng nhieàu hôn seõ taïo thaønh caùc sôïi (fibril). Nhöõng sôïi naøy coù ñöôøng kính töø 10 ¸ 500 nm tuøy thuoäc vaøo loaïi moâ vaø giai ñoaïn phaùt trieån. Caùc sôïi collagen seõ thieát laäp neân caùc sôïi lôùn hôn (fiber) vaø cao hôn nöõa laø caùc boù sôïi (fiber bundle). Chuoãi polypeptide Phaân töû collagen Vi sôïi Sôïi Boù sôïi Hình 1.8 Caáu truùc sôïi cuûa collagen Sôïi collagen laø caùc toå hôïp coù caáu truùc baùn keát tinh cuûa caùc phaân töû collagen. Caùc vi sôïi keát hôïp taïo neân sôïi lôùn hôn. Caùc sôïi lôùn hôn seõ keát hôïp vôùi nhau taïo thaønh nhöõng boù sôïi collagen. Caùc sôïi collagen ñöôïc saép xeáp vôùi nhöõng caùch thöùc keát hôïp vaø möùc ñoä taäp trung khaùc nhau trong caùc moâ khaùc nhau ñeå cung caáp caùc ñaëc tính khaùc nhau cuûa moâ. Caùc chuoãi collagen saép xeáp song song theo chieàu doïc taïo thaønh caùc sôïi vôùi tính chu kyø nhaát ñònh. Chuùng ñöôïc saép xeáp so le nhau moät khoaûng 67 nm vaø coù moät khoaûng troáng khoaûng 40 nm giöõa nhöõng phaân töû lieàn keà nhau. Nhôø vaøo caáu truùc coù thöù baäc, ñoä beàn voán coù cuûa caùc chuoãi xoaén oác ñöôïc chuyeån sang caùc sôïi collagen, taïo cho caùc moâ coù ñöôïc ñoä cöùng, ñoä ñaøn hoài vaø nhöõng ñaëc tính cô hoïc rieâng bieät. Coù vaøi lieân keát beân trong moãi chuoãi triple helix vaø moät soá löôïng bieán thieân caùc lieân keát ngang giöõa caùc chuoãi ñeå hình thaønh neân nhöõng toå hôïp coù traät töï (nhö sôïi collagen). Caùc boù sôïi lôùn hôn ñöôïc taïo neân nhôø vaøo söï trôï giuùp cuûa moät vaøi loaïi protein (bao goàm nhöõng loaïi collagen khaùc nhau), glycoprotein vaø proteolycan ñeå hình thaønh caùc loaïi moâ khaùc nhau töø söï saép xeáp luaân phieân cuûa nhöõng thaønh phaàn treân. Söï khoâng hoøa tan cuûa collagen laø moät trôû ngaïi cho vieäc nghieân cöùu noù cho tôùi khi ngöôøi ta phaùt hieän tropocollagen coù theå ñöôïc trích ly töø nhöõng ñoäng vaät coøn non do chöa xaûy ra lieân keát ngang hoaøn toaøn. Tuy nhieân, söï phaùt trieån cuûa kyõ thuaät hieån vi (Electron Microscopy (EM) vaø Atomic Force Microscopy (AFM)) vaø söï nhieãu xaï tia X ñaõ cho pheùp caùc nhaø nghieân cöùu thu ñöôïc nhöõng hình aûnh chi tieát veà caáu truùc cuûa collagen. Nhöõng tieán boä naøy coù yù nghóa quan troïng trong vieäc hieåu ñöôïc caùch thöùc maø collagen taùc ñoäng leân maïng löôùi teá baøo, söï xaây döïng, phaùt trieån, phuïc hoài, thay ñoåi cuûa moâ trong quaù trình phaùt trieån. Hình 1.9 Söï saép xeáp cuûa phaân töû collagen trong moät sôïi PHAÂN LOAÏI COLLAGEN [4] Tính ñeán thôøi ñieåm hieän taïi, coù 42 loaïi chuoãi polypeptide ñöôïc nhaän daïng. Chuùng ñöôïc maõ hoùa bôûi 41 loaïi gene khaùc nhau, taïo thaønh 27 loaïi collagen. Hoï collagen ñöôïc phaân loaïi thaønh nhöõng phaân hoï khaùc nhau döïa vaøo söï toå hôïp cuûa caùc sieâu phaân töû. Söï phaân boá trong caùc moâ cuûa nhöõng loaïi protein khaùc nhau theå hieän tính ña daïng vaø phaïm vi ñaùng chuù yù, töø nhöõng loaïi collagen rieâng bieät nhö collagen II, X coù trong suïn ñeán nhöõng loaïi collagen daïng sôïi phaân boá roäng khaép nhö collagen I vaø V. Nhöõng loaïi collagen khaùc nhau thöïc hieän nhöõng chöùc naêng chuyeân duïng trong caùc moâ vaø coù phöông thöùc saép xeáp rieâng bieät cuûa caùc sieâu phaân töû. Moät soá loaïi ñöôïc caáu taïo töø moät tam phaân (homotrimer), trong khi ñoù nhöõng loaïi khaùc ñöôïc caáu taïo töø nhieàu tam phaân. Loaïi collagen phong phuù nhaát laø nhöõng collagen daïng sôïi hình thaønh nhöõng neàn taûng caáu truùc cuûa da, gaân, xöông, suïn vaø nhöõng loaïi moâ khaùc. Hình 1.10 Moät vaøi daïng sinh hoïc cuûa collagen Döïa theo caáu truùc vaø caùch toå chöùc saép xeáp caùc phaân töû trong chuoãi, collagen ñöôïc phaân chia thaønh 7 nhoùm chính : collagen daïng hình sôïi, FACIT collagen, collagen daïng maïng, collagen daïng giöõ chaët, collagen chuyeån maøng, collagen maøng neàn vaø caùc loaïi collagen coù chöùc naêng duy nhaát khaùc. Nhöõng loaïi collagen naøy khaùc nhau veà chieàu daøi cuûa chuoãi xoaén oác cuõng nhö baûn chaát vaø kích côõ cuûa nhöõng phaàn khoâng xoaén oác. Baûng 1.4 Phaân loaïi vaø vò trí phaân boá caùc loaïi collagen Daïng collagen Loaïi Caáu taïo phaân töû Phaân boá Collagen daïng sôïi I [α1(I)]2 α2(I)] Xöông, gaân, daây chaèng, giaùc maïc,.. II [α1(II)]3] Suïn, thuûy tinh theå, ... III [α1(III)]3] Da,thaønh maïch maùu, löôùi soïi cuûa caù moâ( phoåi, gan, laùch,... V α1(V), α2(V),α3(V) Phoåi, giaùc maïc, xöông,... XI α1(XI)α2(XI)α3(XI) Suïn, thuûy tinh theå,... Maøng neàn collagen IV [α1(IV)]2 α2(IV)] α1 - α2 Maøng neàn Collagen vi sôïi VI α1(VI), α2(VI),α3(VI) Suïn, phoåi, thaønh maïch maùu, Sôïi neo collagen VII [α1(VII)]3 Da, vuøng chuyeån tieáp bieåu bì - da, nieâm maïc mieäng,... Daïng maïng löôùi luïc giaùc collagen VIII [α1(VIII)]2 α2(VIII)] Maøng teá baøo,... X [α3(X)]3 Suïn,... FACIT collagen FACIT collagen IX α1(IX)α2(IX)α3(IX) Suïn, dòch thuûy tinh, giaùc maïc,... XII [α1(XII)]3 Maøng suïn, daây chaèng, gan,... XIV [α1(XIV)]3 Gan, thaønh maïch maùu, phoåi, cô vaân,... XIX [α1(XIX)]3 Sarcoma cô vaân cuûa con ngöôøi XX [α1(XX)]3 Bieåu moâ giaùc maïc, phoâi da, xöông öùc suïn, gaân,... XXI [α1(XXI)]3 Thaønh maïch maùu,... Collagen chuyeån maøng XIII [α1(XIII)]3 Bieåu bì, nang toùc, ruoät, suïn baøo, phoåi, gan,... XVII [α1(XVII)]3 Vuøng chuyeån tieáp bieåu bì – da,... XV [α1(XV)]3 Nguyeân baøo sôïi, caùc teù baøo cô trôn, thaän, tuïy,.. XVI [α1(XVI)]3 Nguyeân baøo sôïi, phieán keratin,... XVII [α1(XVII)]3 Phoåi, gan,... Collagen loaïi I laø phoå bieán nhaát vaø thöôøng ôû trong caùc moâ lieân keát nhö da, xöông, gaân. Collagen loaïi II haàu nhö toàn taïi ôû caùc moâ suïn. Collagen loaïi III laïi phuï thuoäc raát lôùn vaøo ñoä tuoåi cuûa ñoäng vaät, da heo coøn treû chöùa tôùi 50%, theo thôøi gian tyû leä naøy giaûm 5÷ 10%. Nhöõng loaïi colagen khaùc chæ hieän dieän vôùi löôïng raát nhoû vaø chæ ôû moät vaøi cô quan ñaëc bieät. Hôn 90% collagen trong cô theå laø caùc collagen loaïi I, II, III vaø IV. Nhöõng beänh taät lieân quan ñeán collagen laø do söï khuyeát taät veà gene aûnh höôûng ñeán söï sinh toång hôïp, söï saép xeáp cuõng nhö caùc quaù trình khaùc trong söï saûn sinh collagen moät caùch bình thöôøng. 1.3.1 Collagen daïng sôïi Collagen daïng sôïi coå ñieån bao goàm caùc loaïi I, II, III, V, XI. Nhöõng loaïi collagen naøy coù khaû naêng keát hôïp taïo thaønh moät toå hôïp caáu truùc sieâu phaân töû ñöôïc ñònh höôùng cao, ñoù laø chuoãi sôïi so le baäc 4 vôùi ñöôøng kính töø 25 – 400nm. Döôùi kính hieån vi ñieän töû, nhöõng sôïi naøy ñöôïc xaùc ñònh bôûi moät moâ hình ñaëc tröng vôùi moät daûi chu kyø khoaûng 70nm ( ñöôïc goïi laø chu trình D) döïa vaøo söï saép xeáp so le cuûa moãi ñôn phaân collagen rieâng bieät. Loaïi I Collagen loaïi I laø collagen chieám thaønh phaàn vaø ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát. Noù chieám hôn 90% khoái löôïng cuûa xöông vaø laø thaønh phaàn chính cuûa moâ lieân keát trong gaân, da, daây chaèng, giaùc maïc, chieám thaønh phaàn raát ít trong suïn, thuûy tinh theå,... Caáu truùc triple_helix cuûa collagen loaïi I bao goàm hai chuoãi xoaén α1 gioáng heät nhau vaø moät chuoãi α2 . Trong cô theå sinh vaät, haàu heát chuoãi xoaén α3 ñöôïc keát hôïp vaøo hoãn hôïp coù chöùa loaïi III collagen ( coù trong da vaø löôùi sôïi) hoaëc loaïi IV collagen ( coù trong xöông, gaân vaø giaùc maïc). Trong haàu heát caùc cô quan ñaëc bieät laø trong gaân, collagen loaïi I coù chöùc naêng taïo neân ñoä giaõn, chaéc. Trong xöông, noù tham gia xaây döïng caáu truùc cuûa xöông, ñaûm baûo khaû naêng chòu taûi troïng, ñoä cöùng chaéc cuûa xöông. Loaïi II Collagen loaïi II laø thaønh phaàn ñaëc tröng vaø chieám haøm löôïng cao trong suïn trong suoát. Tuy nhieân, haøm löôïng collagen loaïi II naøy ngaøy caøng chieám tæ leä lôùn trong toång soá collagen ( khoaûng 80%) khi ñöôïc tìm thaáy trong caùc cô quan nhö : thuûy tinh theå, caùc bieåu moâ giaùc maïc, daây soáng, ...Caáu truùc triple_helix cuûa collagen loaïi II ñöôïc ñaëc tröng bôûi ba chuoãi xoaén α1 hình thaønh moät phaân töû “ homotrimeric” töông töï nhau veà kích thöôùc vaø caû chöùc naêng sinh hoïc nhö cuûa collagen loaïi I. Nhöõng sôïi collagen khaùc trong suïn ñoùng vai troø keát hôïp vôùi collagen loaïi II, cuõng nhö loaïi XI vaø IX nhaèm ñeå giôùi haïn ñöôøng kính trong khoaûng töø 15 – 50nm. Khaùc vôùi collagen loaïi I , chuoãi xoaén collagen loaïi II chöùa haøm löôïng hydrolysine khaù cao, caân baèng noàng ñoä cuûa proteoglycan – moät thaønh phaàn ñaëc tröng ôû daïng ngaäm nöôùc cuûa suïn trong suoát. Loaïi III Gioáng nhö loaïi II, collagen loaïi II cuõng ñöôïc taïo thaønh töø 3 chuoãi xoaén α1. Collagen loaïi III ñöôïc phaân boá roäng raõi trong caùc moâ ngoaïi tröø xöông. Noù laø thaønh phaàn quan troïng cuûa nhöõng sôïi löôùi trong caùc moâ hôû ôû phoåi, gan, laù laùch, ... Phaân töû “Homotrimeric” thöôøng keát hôïp vôùi collagen loaïi I taïo thaønh moät thaønh phaàn phong phuù trong caùc moâ ñaøn hoài. Baûng 1.5 Söï phaân boá acid amin cuûa 3 chuoãi α trong collagen loaïi I vaø loaïi III Thaønh phaàn Thaønh phaàn theo tæ leä α1 ( loaïi I) α2 ( loaïi I) α1 ( loaïi III) 3-Hydroxyproline 1 2 0 4-Hydroxyproline 108 93 125 Proline 124 113 107 Lysine 26 18 30 Hydroxylysine 9 12 5 Glycine 333 338 350 Cystein 0 0 2 Serine 34 30 39 Alanine 115 102 96 Histidine 3 12 6 Valine 21 35 14 Methionine 7 5 8 Isoleucine 6 14 13 Leucine 19 30 22 Arginine 50 50 46 Phennyalanine 12 12 8 Aspartic acid 42 44 42 Threonine 16 19 13 Glutamic acid 73 68 71 Tyrosine 1 4 3 Loaïi V vaø XI Collagen loaïi V vaø XI nhö laø moät phaân nhoùm nhoû trong collgen daïng sôïi,caáu truùc cuûa hai loaïi collagen naøy laø moät “heterotrimer” ñaëc tröng bôûi 3 chuoãi xoaén α1 , va α2ø, α3 khaùc nhau. Ñieàu ñaùng chuù yù laø chuoãi xoaén α3 trong caáu truùc loaïi collgen XI ñöôïc maõ hoùa bôûi caùc gen töông töï nhö chuoãi α1 trong caáu truùc collagen loaïi II, chæ khaùc ôû kích thöôùc cuûa glycosylation vaø hydroxylation. Söï keát hôïp giöõa söï gioáng vaø khaùc nhau cuûa caáu truùc hai loaïi collagen naøy xuaát hieän khaù nhieàu trong caùc moâ. Theo nhöõng nghieân cöùu tröôùc ñaây cho thaáy, collagen loaïi V laø moät hình thöùc ñaëc thuø cuûa collagen loaïi I vaø loaïi III ôû trong xöông, giaùc maïc vaø naèm xen keõ trong cô baép, gan , phoåi. Collagen loaïi XI cuõng phaân phoái roäng trong cô suïn nhö loaïi II. Moät löôïng lôùn phía cuoái ñaàu amino non- collagen cuûa chuùng chæ ñöôïc toång hôïp moät phaàn vaø söï hôïp nhaát cuûa hai loaïi collagen ñeå taïo thaønh caáu truùc “heterotrimer” ñöôïc cho laø ñeå kieåm soaùt khaû naêng laép raùp, sinh tröôûng vaø ñöôøng kính cuûa chuùng. Keå töø ñoù, caáu truùc triple helix ñöôïc cho laø moät maøn che trong caùc moâ, chuùng ñöôïc ñaët ôû trung taâm hôn laø treân beà maët. Do vaäy, collagen loaïi V coù chöùc naêng nhö laø moät caáu truùc sôïi coát loõi cuøng vôùi loaïi I vaø III xung quanh truïc trung taâm. Töông töï nhö moâ hình naøy, collagen loaïi XI ñöôïc cho hình thöùc coát loõi cuûa nhöõng sôïi collagen loaïi II. “Fibril – Associated Collagens with Interrupted Triple helices”:FACIT collagen Caáu truùc cô baûn cuûa nhöõng loaïi collagen naøy ñöôïc ñaëc tröng bôûi nhöõng phaàn thuoäc collgen bò giaùn ñoaïn bôûi nhöõng chuoãi ngaén khoâng xoaén vaø nhöõng phaân töû “ trimer” hoùa coù lieân quan ñeán beà maët cuûa caùc sôïi khaùc nhau. Loaïi IX Collagen loaïi IX ñöôïc phaân boá trong suïn vaø thuûy tinh theå nhö collagen loaïi II. Collagen naøy thuoäc loaïi “ heterotrimeric”, caáu truùc bao goàm 3 chuoãi xoaén α1, α2 vaø α3 khaùc nhau taïo thaønh ba ñoaïn xoaén hai beân hình caàu. Phaân töû collagen loaïi IX ñöôïc ñaët doïc theo beà maët cuûa sôïi collagen loaïi II theo höôùng ñoái song vôùi nhau. Söï töông taùc naøy ñöôïc oån ñònh bôûi lieân keát coäng hoùa trò töø lysine ñeán ñaàu amino cuûa collagen loaïi II. Loaïi XII vaø XIV Collagen loaïi XII vaø loaïi XIV coù caáu truùc goàm 3 chuoãi xoaén α1 keát hôïp vôùi nhau, caùc loaïi collagen naøy ñöôïc phaân boá chuû yeáu trong xöông da, gaân phoåi, thaønh maïch maùu,...cuõng nhö collagen loaïi XIX vaø XX, chöùc naêng cuûa caùc collagen naøy vaãn chöa döôïc tìm hieåu roõ. 1.3.3 Collagen vi sôïi Collagen loaïi VI ñöôïc taïo thaønh töø 3 chuoãi xoaén α1, α2 vaø α3 khaùc nhau vôùi caáu truùc xoaén môû roäng vaø keùo daøi daïng hình caàu. Chuoãi xoaén α3 gaàn nhö laø daøi gaáp ñoâi caùc chuoãi khaùc vì chieàu daøi ñaàu amino vaø cacboxyl khaù lôùn. Nhöõng sôïi ban ñaàu keát hôïp beân trong teá baøo theo höôùng ñoái song vôùi nhau, töøng caëp choàng cheùo leân nhau, sau ñoù saép xeáp boán phaàn song song nhau. Trong maïng löôùi ngoaïi baøo, chuùng taäp hôïp thaønh nhöõng toå hôïp sôïi vaø hình thaønh maïng löôùi vi sôïi ñoäc laäp trong haàu heát caùc moâ lieân keát, ngoaïi tröø trong xöông. 1.3.4 Collagen chuoãi ngaén  Collagen loaïi X laø thaønh phaàn ñaëc tröng cuûa suïn trong xöông söôøn, xöông soáng,…, noù ñöôïc taïo thaønh töø 3 chuoãi xoaén α3 gioáng nhau, caáu truùc maïng löôùi hình luïc giaùc vôùi ñaàu cacboxyl lôùn vaø ñaàu amino ngaén. Chöùc naêng cuûa collagen loaïi X vaãn chöa ñöôïc tìm hieåu saâu, caùc nhaø nghieân cöùu vaãn ñang thaûo luaän veà vai troø cuûa noù trong quaù trình hoùa xöông suïn vaø voâi hoùa. Collagen loaïi VIII coù caáu truùc gioáng nhö collagen loaïi X nhöng coù söï phaân phoái khaùc bieät nhau, vì theá maø chöùc naêng cuûa noù cuõng khaùc. Quaù trình hình thaønh maïng löôùi trong collagen naøy ñöôïc thöïc hieän baèng caùc noäi moâ teá baøo hình thaønh neân caáu truùc hình luïc giaùc. 1.4 TÍNH CHAÁT CUÛA COLLAGEN Collagen laø moät protein caáu truùc. Chính vì vaäy collagen cuõng coù ñaày ñuû caùc tính chaát hoùa lyù cuûa moät protein. 1.4.1 Taùc duïng vôùi nöôùc Collagen khoâng hoøa tan trong nöôùc maø noù huùt nöôùc ñeå nôû ra, nguyeân nhaân laø do töông taùc giöõa caùc maïch polypeptide laøm cho phaân töû coù nhöõng vuøng kî nöôùc vaø vuøng phaân cöïc mang ñieän tích seõ taïo neân khaû naêng haùo nöôùc laøm tröông nôû collagen. Cöù 100g collagen khoâ coù theå huùt ñöôïc khoaûng 200g nöôùc. Collagen keát hôïp vôùi nöôùc nôû ra trong nöôùc, ñoä daøy taêng leân chöøng 25% nhöng ñoä daøi taêng leân khoâng ñaùng keå, toång theå tích cuûa phaân töû collagen taêng leân 2 – 3 laàn. Do nöôùc phaân cöïc taùc duïng leân lieân keát hydro trong lieân keát phoái trí cuûa collagen laøm giaûm tính vöõng chaéc cuûa sôïi collagen töø 3 – 4 laàn. Khi nhieät ñoä taêng leân cao, tính hoaït ñoäng cuûa maïch polypeptide taêng maïnh, laøm cho maïch bò yeáu vaø baét ñaàu ñöùt thaønh nhöõng maïch polypeptide töông ñoái nhoû. Khi nhieät ñoä taêng leân trong khoaûng 60 – 650C collagen huùt nöôùc bò phaân giaûi. Nhieät ñoä phaân giaûi cuûa collagen trong nguyeân lieäu chöa xöû lyù töông ñoái cao. Khi nguyeân lieäu ñaõ khöû heát chaát khoaùng, thì nhieät ñoä phaân giaûi cuûa nguyeân lieäu seõ giaûm xuoáng. Taùc duïng vôùi acid vaø kieàm Collagen coù theå taùc duïng vôùi acid vaø kieàm, do treân maïch cuûa collagen coù goác carboxyl vaø amin. Hai goác naøy quyeát ñònh hai tính chaát cuûa noù. Trong ñieàu kieän coù acid toàn taïi, ion cuûa noù taùc duïng vôùi goác amin, ñieän tích treân carboxyl bò öùc cheá (hình thaønh acid yeáu coù ñoä ion hoùa thaáp). Traùi laïi goác amin bò ion hoùa taïo NH3+. Moâi tröôøng H+ NH3+…Cl- COOH NH3+…Cl- NH3+…Cl- COOH COOH NH3+…Cl- Moâi tröôøng OH- COO-…Na+ NH2 COO-…Na+ NH2 NH2 COO-…Na+ NH2 COO-…Na+ Trong ñieàu kieän coù nöôùc, nöôùc coù theå taùc duïng vôùi nhoùm goác coù mang ñieän trong keát caáu protide vaø nhöõng ion Na+, Cl- hình thaønh taùc duïng hôïp nöôùc phuï cuûa collagen, khieán collagen trong moâi tröôøng acid, kieàm coù ñoä huùt nöôùc cao hôn trong nöôùc nguyeân chaát. Ngoaøi ra acid vaø kieàm coù theå laøm cho collagen bieán ñoåi nhö sau: COO- NH3+ +H3N +H3N NH3+ OOC Na+ -OH H+ HO- H+ Cl- H+ OH- H+ OH- Na HO- H+ Cl- H+ OH- Caét ñöùt maïch muoái (lieân keát giöõa –NH3+…COO-) laøm ñöùt maïch peptide trong maïch chính. Laøm ñöùt lieân keát hydrogen giöõa goác –CO…NH– cuûa maïch xung quanh noù. Laøm acid amin bò phaân huûy giaûi phoùng amoniac. Cuøng vôùi nhöõng bieán ñoåi ñoù, ñieåm ñaúng ñieän cuûa collagen haï xuoáng thaáp, (vì nhöõng bieán ñoåi ñoù mang tính chaát thuûy phaân laøm cho caùc nhoùm goác coù tính hoaït ñoäng taêng leân nhieàu). Acid vaø kieàm ñeàu coù theå phaân huûy collagen, nhöng söï phaân huûy cuûa collagen cho tôùi nay vaãn chöa coù khaùi nieäm chính xaùc. Ñeå bieåu thò söï bieán ñoåi chính xaùc cuûa collagen döôùi taùc duïng cuûa acid, kieàm noùi chung ñeàu duøng ñoä keo phaân giaûi laøm chæ tieâu. Ñoä keo phaân giaûi laø chæ soá keo sinh thaønh saûn phaåm coù theå tan trong nöôùc (thöôøng laø trong ñieàu kieän ñun noùng), nhöõng saûn phaåm naøy döôùi noàng ñoä töông öùng tieán haønh laøm laïnh coù theå bieán thaønh keo. Theo keát quaû nghieân cöùu taùc duïng cuûa voâi ñoái vôùi collagen coù theå laøm taêng ñoä phaân giaûi cuûa noù raát maïnh, trong ñieàu kieän nhieät ñoä thöôøng thôøi gian daøi coù theå xuùc tieán söï phaân giaûi cuûa collagen (tuøy ñoä phaân giaûi cuûa noù raát thaáp) luùc nhieät ñoä taêng leân hoaëc xöû lyù baèng kieàm thì ñoä phaân giaûi taêng leân. Collagen phaân giaûi bieán thaønh gelatin, caên cöù vaøo giaû thuyeát cuûa Hofmeister phaûn öùng seõ tieán haønh nhö sau: to ;xt C102H149N31O38 + H2O C102H151N31O39 (Collagen) (Gelatin) Luùc xöû lyù ôû nhieät ñoä cao trong nöôùc, keo deã tieáp tuïc thuûy phaân thaønh: to C102 H151N31 O39 + 2H2O C55 H85 N17O22 + C47 H70O19 + 7N2 (Gelstose) (Gletone) Töø ñoù thaáy raèng trong quaù trình trích ly gelatin caàn thieát phaûi khoáng cheá nhieät ñoä vaø thôøi gian thích hôïp ñeå ñaûm baûo chaát löôïng cuûa gelatin. Ngoaøi ra, Collagen trong dung dòch muoái trung tính cuøng vôùi goác –COOH vaø –NH2 taïo thaønh caùc hôïp chaát muoái. Taùc duïng phaân giaûi collagen cuûa NaCl so vôùi Na2SO4 maïnh hôn ( do ñoä ñieän ly cuûa NaCl lôùn hôn). Nhieàu thöïc nghieäm cho thaáy raèng taùc duïng cuûa trypsine ñoái vôùi collagen ñaõ xöû lyù ( nhö ñun noùng, ngaâm acid, kieàm , muoái, taùc duïng cuûa pepsin, taùc duïng cô hoïc,...) thì noù coù taùc duïng phaân giaûi, vôùi ñieàu kieän thích hôïp nhaát laø ôû nhieät ñoä 370C, pH = 8,1 – 8,2. 1.4.3 Söï bieán tính Döôùi taùc duïng cuûa caùc chaát hoùa hoïc nhö axit, bazô, muoái, caùc dung moâi nhö ancohol, caùc taùc nhaân vaät lyù nhö khuaáy troän cô hoïc, nghieàn, tia cöïc tím,… Caáu truùc xoaén baäc ba cuûa collagen bò bieán ñoåi laøm cho caùc lieân keát hydro, caùc lieân keát ion bò phaù vôõ nhöng khoâng phaù vôõ ñöôïc lieân keát peptid, töùc laø caáu truùc baäc moät vaãn giöõ nguyeân. Sau khi bò bieán tính Collagen thöôøng coù caùc tính chaát sau : Ñoä hoøa tan giaûm do laøm loä caùc nhoùm kî H2O voán ôû beân trong phaân töû protein. Töùc laø khi collagen chöa bieán tính, caùc acidamin coù caùc nhoùm kî nöôùc naèm beân trong phaân töû collagen. Khi bò bieán tính, phaân töû Collagen luùc naøy chæ laø trình töï saép xeáp caùc acidamin maïch thaúng, laøm cho caùc nhoùm kî nöôùc loä ra ngoaøi neân ñoä hoøa tan caû collagen bò giaûm ñi. Khaû naêng giöõ nöôùc giaûm, caáu truùc baäc boán giuùp cho collagen coù khaû naêng hydrat hoùa taïo thaønh maøng hydrat bao quanh. Khi bieán tính maát ñi caáu truùc baäc boán thì khaû naêng hydrat hoùa khoâng coøn, vì theá neân collagengiöõ õnöôùc keùm. Hoaït tính sinh hoïc ban ñaàu maát ñi. Ñieàu naøy laø hieån nhieân vì hoaït tính sinh hoïc cuûa moät protein ñöôïc quyeát ñònh bôûi caùc caáu truùc baäc hai, baäc ba vaø baäc boán. Khi caáu truùc naøy maát ñi, protein chæ laø caùc polypeptid, vaø khoâng coù hoaït tính sinh hoïc. Hoaït tính sinh hoïc ban ñaàu maát ñi. Ñieàu naøy laø hieån nhieân vì hoaït tính sinh hoïc cuûa moät protein ñöôïc quyeát ñònh bôûi caùc caáu truùc baäc hai, baäc ba vaø baäc boán. Khi caáu truùc naøy maát ñi, protein chæ laø caùc polypeptid, vaø khoâng coù hoaït tính sinh hoïc. Taêng ñoä nhaïy ñoái vôùi söï taán coâng cuûa enzyme protease do laøm xuaát hieän caùc lieân keát peptide öùng vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa protease. Taêng ñoä nhôùt hieän taïi. Maát khaû naêng keát tinh, collagen coù khaû naêng keát tinh trong caùc moâi tröôøng muoái hoaëc coàn. ÔÛ caùc ñieàu kieän pH nhaát ñònh dung dòch collagen khoâng beàn vaø keát tinh goïi laø pH ñaúng ñieän. Khi bò bieán tính ñieåm ñaúng ñieän cuûa protein khoâng coøn vaø chuùng khoù coù theå keát tinh. Tính kî nöôùc Do caùc goác kî nöôùc cuûa acidamin trong chuoãi polypeptid cuûa collagen höôùng ra ngoaøi, caùc goác naøy lieân keát vôùi nhau taïo lieân keát kî H2O. Ñoä kî nöôùc coù theå giaûi thích laø do caùc acidamin coù chöùa goác R-khoâng phaân cöïc neân noù khoâng coù khaû naêng taùc duïng vôùi nöôùc. Tính kî nöôùc seõ aûnh höôûng raát nhieàu ñeán tính tan cuûa collagen. 1.4.5 Tính chaát cuûa dung dòch keo Khi hoøa tan protein thaønh dung dòch keo thì noù khoâng ñi qua maøng baùn thaám. Hai yeáu toá ñaûm baûo ñoä beàn cuûa dung dòch keo laø : Söï tích ñieän cuøng daáu cuûa caùc protein. Lôùp voû hydrat bao quanh phaân töû protein. Khi dung dòch keo khoâng beàn, seõ coù hai daïng keát tuûa : keát tuûa thuaän nghòch vaø keát tuûa khoâng thuaän nghòch. Keát tuûa thuaän nghòch: sau khi chuùng ta loaïi boû caùc yeáu toá gaây keát tuûa thì protein vaãn coù theå trôû laïi traïng thaùi dung dòch keo beàn nhö ban ñaàu. keát tuûa khoâng thuaän nghòch: sau khi chuùng ta loaïi boû caùc yeáu toá gaây keát tuûa thì protein khoâng trôû veà traïng thaùi dung dòch keo beàn vöõng nhö tröôùc nöõa. Dung dòch collagen coù ñoä nhôùt cao trong khoaûng pH = 2 -5 , trong ñoù pH = 2 cho ñoä nhôùt cao nhaát, ñieàu naøy giuùp cho vieäc nghieân cöùu, taùch chieát collagen. 1.4.6 Tính chaát Hydrat hoùa cuûa collagen Trong quaù trình hydrat hoùa, protein töông taùc vôùi nöôùc qua caùc noái peptid hoaëc caùc goác R ôû maïch beân nhôø lieân keát hydro. Noàng ñoä protein, pH, nhieät ñoä, thôøi gian, löïc ion, söï coù maët cuûa caùc thaønh phaàn khaùc laø nhöõng yeáu toá aûnh höôûng ñeán caùc phaûn öùng protein – protein vaø protein – nöôùc. Khi noàng ñoä protein taêng thì löôïng nöôùc haáp thuï toáng soá taêng, pH thay ñoåi daãn ñeán thay ñoåi möùc ñoä ion hoùa vaø söï tích ñieän treân beà maët phaân töû Collagen, laøm thay ñoåi löïc huùt vaø löïc ñaåy giöõa caùc phaân töû naøy vaø khaû naêng lieân keát vôùi nöôùc. Khi nhieät ñoä taêng thì khaû naêng giöõ nöôùc cuûa Collagen giaûm do laøm giaûm caùc lieân keát hydro. Ngoaøi ra, baûn chaát vaø noàng ñoä caùc ion gaây aûnh höôûng ñeán löïc ion trong moâi tröôøng vaø söï phaân boá ñieän tích treân beà maët phaân töû Collagen neân cuõng aûnh höôûng ñeán khaû naêng hydrat hoùa. Ngöôøi ta nhaän thaáy coù söï caïnh tranh cuûa phaûn öùng giöõa nöôùc, muoái vaø caùc nhoùm ngoaïi cuûa acid amin. Khi noàng ñoä muoái thaáp, tính hydrat hoùa cuûa protein coù theå taêng do söï ñính theâm caùc ion giuùp môû roäng maïng löôùi protein. Tuy nhieân khi noàng ñoä muoái cao, caùc phaûn öùng muoái – nöôùc trôû neân noåi troäi hôn, laøm giaûm lieân keát protein – nöôùc vaø protein bò “saáy khoâ”. 1.5 CAÙC PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH GIAÙ VAØ PHAÂN TÍCH COLLAGEN Coù nhieàu phöông phaùp ñaùnh giaù vaø phaân tích collagen : phaân tích ñoä nhôùt, ñoä aåm, haøm löôïng tro, xaùc ñònh khoái löôïng phaân töû, vi sinh, phaân tích thaønh phaàn protein trong collagen (Xaùc ñònh toång nitô baèng phöông phaùp Kjeldahl), phaân tích thaønh phaàn axit amin. 1.5.1 Phöông phaùp ñieän di treân gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) ñeå xaùc ñònh troïng löôïng phaân töû collagen. Ñieän di theo phöông phaùp SDS- PAGE cuûa phöông phaùp cuûa Kittiphattanabawon, Benjakul, Visessanguan, Nagai, Tanaka, (2005), söû duïng Buffer System laø maùy ñieän di ñöùng, loaïi mini- PROTEAN Tetra cell cuûa haõng BIORAD. Maãu collagen ñöôïc hoøa tan trong dung dòch acid acetic 0,5M ñeán noàng ñoä 2,5 mg/ml. Chænh pH cuûa dung dòch collagen baèng sodium phosphate 0,2 M ñeán giaù trò pH 4,4. Sau ñoù, hoøa dung dòch maãu naøy vaøo hoån hôïp chöùa 1% SDS (sodium dodecyl sunfate) vaø urea 3,5M (pH 7,2), khuaáy troän lieân tuïc ôû nhieät ñoä phoøng. Hoãn hôïp ñöôïc ly taâm ñeå loaïi boû taïp chaát khoâng tan. Dung dòch naøy ñöôïc troän theo tæ leä 1/1(v/v) vôùi dung dòch ñeäm (0,5M tris-HCl, pH 6,8 chöùa 4% SDS, 20% glycerol). Taïo gieáng: Chuùng ta pha resolving gel 7% vaø stacking gel 5% sau ñoù laàn löôït bôm vaøo gieáng vaø caøi löôïc taïo caùc mieäng gieáng. Dung dòch maãu ñöôïc bôm vaøo caùc mieäng gieáng cuûa maùy ñieän di, ñoå dung dòch ñeäm vaøo beå, chænh doøng ñieän khoaûng 20 mA/gel. Sau khi ñieän di, gel ñöôïc nhuoäm maøu baèng dung dòch chöùa Co-omassie blue R-250 0,05% (w/v) trong methanol 15% (v/v) vaø acetic 5% (v/v), trong 1 – 2 giôø vaø taåy maøu baèng dung dòch methanol 30% (v/v) vaø acetic 5% (v/v) cho ñeán khi xuaát hieän caùc vaïch protein . Protein chuaån ñöôïc ñieän di ñeå so saùnh coù troïng löôïng phaân töû töø 75 – 250 kDa. 1.5.2 Xaùc ñònh söï bieán tính cuûa collagen theo nhieät ñoä baèng phöông phaùp bieán ñoåi ñoä nhôùt (Denaturation temperature determined by viscosity method). Ñoä nhôùt cuûa dung dòch collagen ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp cuûa L.S. Senaratne vaø coäng söï (2006) Thoâng qua vieäc ño ñoä nhôùt cuûa dung dòch collagen, chuùng ta xaùc ñònh nhieät ñoä bieán tính cuûa collagen. Nhieät ñoä bieán tính cuûa collagen laø nhieät ñoä taïi ñoù giaù trò ñoä nhôùt giaûm ñi moät nöûa. Dung dòch collagen 0,03 % trong acetic acid 0,1N, ñöôïc khuaáy ñeàu cho tan heát. Tieán haønh ño ñoä nhôùt trong moät beå ñieàu nhieät. Nhieät ñoä ñöôïc gia taêng raát chaäm khoaûng 1oC/ph. Baét ñaàu ño ôû 33oC vaø keát thuùc ôû 50oC. Moät phuùt laáy giaù trò moät laàn. Ñoä nhôùt cuûa dung dòch collagen ñöôïc xaùc ñònh töông öùng ôû caùc möùc nhieät ñoä. Ñoä nhôùt töông ñoái ñöôïc tính nhö sau: Trong ñoù: ht: ñoä nhôùt ño ñöôïc taïi moãi möùc nhieät ñoä hmax: ñoä nhôùt lôùn nhaát hmin: ñoä nhôùt nhoû nhaát Ñöôøng cong bieán tính nhieät ñöôïc xaây döïng baèng caùch veõ ñoà thò ñoä nhôùt töông ñoái theo nhieät ñoä. Nhieät ñoä bieán tính chính laø nhieät ñoä maø taïi ñoù ñoä nhôùt töông ñoái giaûm ñi moät nöûa. Hình 1.11 Ñöôøng cong bieán tính nhieät cuûa 2 loaïi collagen thu ñöôïc töø da caù vaø da lôïn trong axit axetic 0,1N vaø noàng ñoä collagen laø 0,03% Phaân tích haøm löôïng hydroxyproline Hydroxyproline laø moät acid amin ñaëc tröng cuûa collagen .Chuùng khoâng coù trong baát kyø moät loaïi protein naøo khaùc, ngoaïi tröø moät löôïng nhoû trong elastin. Do ñoù, coù theå ñònh löôïng collagen thoâng qua ñònh löôïng hydroxyproline vaø nhaân vôùi heä soá chuyeån ñoåi 14,7 (Sadowska, Kolodziejska, & Niecikowska, 2003). Quy trình xaùc ñònh hydroxyproline ñöôïc thöïc hieän theo phöông phaùp cuûa Ignat’eva, Danilov, Averkiev, Obrezkova, Lunin, Sobol, 2005. Caáu truùc cuûa hydroxyproline coù chöùa voøng pyrrolidine, noù coù theå bò oxy hoùa ñeå hình thaønh voøng pyrrole. Voøng pyrrole naøy taùc duïng vôùi taùc chaát Ehrlich, 4–(N,N– dimethylamino) benzaldehyde taïo thaønh hôïp chaát quinoid coù maøu (maøu saéc phuï thuoäc vaøo nhoùm theá vaø thay ñoåi töø maøu cam ñeán maøu hoa caø). Thöïc hieän phöông phaùp so maøu ñeå tính haøm löôïng hydroxyproline. Ño phoå hoàng ngoaïi infrared (IR) spectroscopy. Phoå hoàng ngoaïi IR laø moät trong nhöõng kyõ thuaät phoå ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát, laø phöông phaùp ño ñoä haáp thuï cuûa maãu thöû ôû caùc böôùc soùng khaùc nhau cuûa tia hoàng ngoaïi. Muïc ñích chính cuûa vieäc phaân tích phoå IR laø xaùc ñònh caùc nhoùm chöùc hoùa hoïc coù trong maãu thöû. Nhöõng nhoùm chöùc khaùc nhau seõ haáp thuï nhöõng böôùc soùng rieâng bieät. Vôùi nhieàu thieát bò phuï tuøng, maùy phoå hoàng ngoaïi coù theå laøm vieäc vôùi nhieàu daïng maãu töø khí, loûng ñeán raén. Phaân tích phoå IR laø moät coâng cuï phoå bieán vaø quan troïng ñeå laøm saùng toû caáu truùc vaø xaùc ñònh caùc hôïp chaát. Hình 1.12 Phoå hoàng ngoaïi collagen trong dung dòch axit Collagen treân phoå hoàng ngoaïi coù theå thaáy treân hình. Nhoùm amide A phaùt hieän ôû peak coù cöôøng ñoä 3330 cm-1, nhoùm amide B ñöôïc thaáy ôû peak coù cöôøng ñoä 3080 cm-1. Treân quang phoå coøn thaáy xuaát hieän söï dao ñoäng cuûa amide baäc I ôû 1650 cm-1, amide baäc II ôû 1545 cm-1 vaø amit baäc III ôû 1237 cm-1. Caáu truùc cuûa protein vaø amide baäc III chöùng minh söï toàn taïi cuûa keát caáu coù hình xoaén oác (Surewicz vaø Mantsch, 1988, Muyonga, 2004). CHÖÔNG 2: CAÙC PHÖÔNG PHAÙP SAÛN XUAÁT COLLAGEN Trong caùc coâng trình nghieân cöùu, qui trình thu nhaän collagen goàm 3 giai ñoaïn chính : Giai ñoaïn phaù vôõ teá baøo: - Caùc phaân töû collagen khoâng coù khaû naêng ñi qua maøng teá baøo, vì vaäy caàn phaù vôõ caáu truùc teá baøo ñeå chuyeån collagen vaøo dung dòch. Caùc bieän phaùp ñöôïc söû duïng coù theå laø caùc bieän phaùp cô hoïc nhö tieán haønh ngieàn vôùi boät thuûy tinh hoaëc caùt thaïch anh, sau ñoù tieán haønh ñoàng hoùa (homogenizator). Thieát bò naøy coù chaøy thuûy tinh gaén vôùi motor quay vaø coù theå ñieàu chænh toác ñoä quay theo yeâu caàu. Caùc teá baøo naèm giöõa chaøy thuûy tinh vaø thaønh coái seõ bò phaù vôõ. - Söû duïng caùc dung moâi höõu cô nhö butanol, acetone keát hôïp vôùi caùc chaát taåy röûa. Caùc hoùa chaát naøy giuùp cho vieäc phaù vôõ caùc baøo quan cuûa teá baøo. Giai ñoaïn taùch chieát collagen: - Sau khi phaù vôõ caáu truùc teá baøo, vieäc taùch chieát collagen ñöôïc tieán haønh deã daøng hôn, collagen coù theå ñöôïc chieát taùch baèng acid hoaëc baèng enzyme, quaù trình taùch chieát collagen ñöôïc thöïc hieän trong caùc reactor ôû nhieät ñoä laïnh vaø trong ñieàu kieän voâ truøng, keát hôïp khuaáy troän lieân tuïc ñeå ñaûm baûo collagen thu ñöôïc coù chaát löôïng toát. Giai ñoaïn tinh saïch collagen: - Trong dòch chieát thoâ, ngoaøi collagen coøn coù caùc protein taïp, caùc lipid, muoái khoaùng, ñeå loaïi caùc thaønh phaàn naøy caàn söû duïng caùc bieän phaùp khaùc nhau. - Ñeå loaïi muoái khoaùng thöôøng duøng phöông phaùp thaåm tích. Thaåm tích laø söï khuyeách taùn vi phaân qua maøng voán khoâng thaám ñoái vôùi nhöõng chaát keo hoøa tan ( protein, moät soá polysaccaride...) nhöng thaám ñoái vôùi caùc dung dòch tinh theå ( caùc muoái cuûa hôïp chaát höõu cô coù troïng löôïng phaân töû thaáp,...). Ñeå loaïi caùc protein taïp coù theå tieán haønh keát tuûa phaân ñoaïn baèng muoái trung tính hoaëc caùc dung moâi höõu cô hay duøng caùc phöông phaùp saéc kyù trao ñoåi ion, ñieän di, phöông phaùp loïc gel,… 2.1 CAÙC COÂNG TRÌNH NGHIEÂN CÖÙU TREÂN THEÁ GIÔÙI Collagen thaønh phaåm Na2SO4 Da heo Ngaâm Caïo loâng Röûa Loaïi beùo Nöôùc Ly taâm Trích ly Keát tuûa Keát tuûa laïi HCl 5M Baõ Ly taâm CH3COOH 0,1M Baõ 2.1.1 Qui trình chieát taùch collagen töø da heo [6] Thuyeát minh qui trình coâng ngheä : Da heo sau khi thu nhaän seõ qua quaù trình xöû lyù ngaâm vôùi dung dòch Na2SO4, sau ñoù tieán haønh caïo loâng roài cho qua quaù trình röûa vôùi nöôùc theo tæ leä H20 : da = 6 : 1(w/w). Tieán haønh röûa laàn 1 trong voøng 30 phuùt, sau ñoù röûa tieáp laàn 2 vaø 3, moãi laàn ñöôïc thöïc hieän trong voøng 20 phuùt, nhieät ñoä 300C. Quaù trình röûa giuùp loaïi bôùt caùc taïp chaát nhö phaàn thòt dö, maùu, môõ thöøa, nhaày nhôùt,… ñeå chuaån bò cho caùc quaù trình tieáp theo. Sau khi tieán haønh röûa vôùi nöôùc, da heo seõ ñöôïc loaïi beùo baèng dung dòch isopropyl keát hôïp vôùi boå sung chaát hoaït ñoäng beà maët khoâng ion. Tieán haønh boå sung chaát hoaït ñoäng beà maët 2 laàn vaøo dung dòch chöùa da heo vaø ngaâm trong voøng 6h, tröôøng hôïp loaïi beùo baèng dung dòch isopropyl ta tieán haønh trong voøng 10h. Da heo sau khi ñöôïc loaïi chaát beùo seõ ñöôïc trích ly baèng dung dòch NaOH 3% (w/v) vaø monomethylamine 1,9%(v/v) ñeå taùch chieát collagen, quaù trình ñöôïc tieán haønh ôû nhieät ñoä 200C trong voøng 1 tuaàn ñeå ñaûm baûo collagen coù chaát löôïng toát. Ñeå keát tuûa collagen vöøa ñöôïc trích ly ta duøng dung dòch acid HCl 5M. Ñeán ñaây collagen thoâ ñaõ ñöôïc keát tuûa, pH luùc naøy baèng 4,6 – 4,7. Ñeå thu ñöôïc collagen saïch ta tieán haønh ly taâm laáy phaàn tuûa hoøa tan laïi trong dung dòch dòch acid acetic 0.1M, quaù trình ñöôïc thöïc hieän ôû 40C trong voøng 72h, tieán haønh ly taâm laàn nöõa ta thu ñöôïc collagen thaønh phaåm. Nhöõng keát quaû phaân tích collagen treân da heo : Keát quaû cho thaáy collagen ñöôïc thu nhaän töø da heo coù caáu truùc chuû yeáu goàm hai chuoãi α1 vaø α2. ÖÙng vôùi moãi chuoãi coù 8 peptide khaùc nhau vaø nhöõng peptide naøy ñöôïc phaân tích giöõa söï keát hôïp trao ñoåi ion vaø saéc kyù loïc gel ñeå xaùc ñònh thaønh phaàn caùc acid amin coù trong moãi chuoãi. Keát quaû cuõng cho thaáy chuoãi collagen ñöôïc ñaëc tröng bôûi vò trí vaø troïng löôïng phaân töû cuûa caùc acid amin. Baèng caùc phöông phaùp xaùc ñònh cho thaáy collagen töø da heo coù nhieät ñoä bieán tính ôû 370C, nhieät ñoä bieán tính cuûa collagen coù lieân quan ñeán caùc thaønh phaàn acid amin, ñaëc bieät laø caùc thaønh phaàn proline, hydroxyproline, glycine. Nhieät ñoä bieán tính naøy coøn phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän nhieät ñoä moâi tröôøng soáng ñoäng vaät. 2.1.2 Qui trinh chieát taùch collagen töø gaân chaân gaø [7] Collagen thaønh phaåm Gaân gaø Caét nhoû Loaïi protein hoøa tan vaø carbonhydrat Trích ly Loïc DD ñeäm citrate 0,15M CH3COONa 0,5M Thaåm tích Röûa Keát tinh Na2HPO4 0,02M Nöôùc muoái Baõ Thuyeát minh qui trình coâng ngheä : Nguyeân lieäu laø gaân chaân gaø sau khi ñöôïc caét nhoû ñöôïc ngaâm vôùi dung dòch CH3COONa ñeå loaïi ñi caùc protein hoøa tan vaø caùc carbonhydrat trong thôøi gian 3 ngaøy. Dung dòch thu ñöôïc ta tieán haønh trích ly ñeå thu ñöôïc collagen baèng caùch boå sung dung dòch ñeäm citrat 0,15M. Dung dòch sau khi trích ly ñöôïc ñem ñi loïc ñeå loaïi ñi caùc taïp chaát raén khaùc, sau ñoù tieán haønh thaåm tích dung dòch vöøa thu ñöôïc ñeå loaïi ñi caùc muoái ra khoûi hoãn hôïp ñeå tinh saïch collagen. Thaåm tích laø söï khueách taùn vi phaân qua maøng voán khoâng thaám ñoái vôùi nhöõng chaát keo hoøa tan ( protein, moät soá polysaccaride...) nhöng thaám ñoái vôùi caùc dung dòch tinh theå ( caùc muoái cuûa hôïp chaát höõu cô coù troïng löôïng phaân töû thaáp,...). Caùc tinh theå coù theå khueách taùn töø dung dòch coù noàng ñoä thaáp hôn (thöôøng laø dung dòch röûa) vaøo dung dòch keo. Trong khi ñoù, caùc ion vaø caùc chaát phaân töû nhoû seõ chuyeån töø dung dòch keo vaøo dung dòch coù noàng ñoä thaáp hôn. Trong quaù trình taùch chieát vaø tinh saïch protein, ñeå loaïi muoái ra khoûi dung dòch protein thì dung dòch protein ñöôïc cho vaøo caùc tuùi ñaëc hieäu laøm baèng nguyeân lieäu baùn thaám, thöôøng laø duøng caùc tuùi cellophan. Sau ñoù ñaët caû tuùi vaøo bình chöùa löôïng lôùn, H20 hay löôïng lôùn dung dòch ñeäm ñöôïc pha loaõng. ÔÛ ñaây taùc giaû duøng dung dòch Na2HPO4 0,02M. Vì maøng cellophan laø maøng baùn thaám coù kích thöôùc loã chæ cho caùc chaát coù troïng löôïng phaân töû nhoû ñi qua caùc dung dòch ñeäm loaõng. Nhö vaäy, muoái seõ khueách taùn vaøo dung dòch ñeäm loaõng ( di chuyeån theo höôùng giaûm noàng ñoä), coøn dung dòch ñeäm loaõng seõ di chuyeån töø dung dòch röûa vaøo tuùi chöùa protein. Protein laø nhöõng ñaïi phaân töû khoâng theå vöôït qua tuùi thaåm tích vaø ñöôïc giöõ laïi trong tuùi. Sau khi thaåm tích , tieán haønh röûa laïi vaø sau ñoù keát tinh seõ thu ñöôïc collagen thaønh phaåm. 2.1.3 Qui trình chieát taùch Collagen töø da möïc [7] Boät Collagen Da möïc Röûa saïch Laøm khoâ Loaïi noncollagenous protein vaø maøu NaOH 0,1M Ly taâm Röûa Trích ly Keát tuûa CH3COOH 0,5M Baõ Ly taâm NaCl 0,8M Saáy laïnh Thuyeát minh qui trình coâng ngheä : Da möïc sau khi ñöôïc röûa saïch ñöôïc laøm khoâ roài cho dung dòch NaOH 0,1M vaøo ñeå tieán haønh loaïi nhöõng hôïp chaát noncollagenous protein vaø maøu. Sau ñoù tieán haønh röûa vaø trích ly baèng dung dòch acid acetic trong voøng 3 ngaøy . Hoãn hôïp sau khi trích ly seõ ñöôïc tieán haønh ly taâm vôùi toác ñoä 50000 voøng / phuùt trong voøng 1h ñeå thu laáy phaàn dòch, phaàn dòch chieát thu ñöôïc laø dòch loûng, hôi saùnh goïi laø acid-soluble collagen. Ñeå keát tinh collagen, cho NaCl saün vaøo dòch chieát ñeán noàng ñoä 0.8M. Ñeán ñaây collagen thoâ ñaõ ñöôïc keát tuûa. Ñeå thu ñöôïc collagen saïch, ta tieán haønh ly taâm vôùi toác ñoä 50000 voøng / phuùt trong voøng 1h roài tieán haønh saáy laïnh thu ñöôïc saûn phaåm collagen daïng boät. Quy trình trích ly collagen töø da caù tuyeát (Baltic cod) [9] Thuyeát minh qui trình coâng ngheä Nguyeân lieäu laø da caù ñöôïc caét nhoû tôùi ñöôøng kính khoaûng 3mm baèng maùy nghieàn, sau ñoù tieán haønh khuaáy troän vôùi dung dòch acid acetic noàng ñoä 0,1÷ 0,5M vôùi tæ leä 1:6 ÷ 1:40 ôû nhieät ñoä laïnh trong voøng 2h. Tieán haønh ñoàng nhaát hoùa dung dòch vöøa khuaáy troän ôû nhieät ñoä trong thôøi gian 4 phuùt, toác ñoä ñoàng nhaát laø 6000 voøng / phuùt. Sau ñoù dung dòch ñöôïc tieáp tuïc khuaáy troän trong thôøi gian 24h ôû nhieät ñoä roài ñöôïc ñöa qua maùy ñoàng nhaát hoùa vôùi thoâng soá kó thuaät gioáng nhö giai ñoaïn ñaàu. Sau khi hoãn hôïp ñaõ ñöôïc ñoàng nhaát vôùi nhau ta tieán haønh ly taâm thu laáy phaàn dòch coù chöùa collagen, quaù trình ly taâm ñöôïc tieán haønh ôû nhieät ñoä laïnh trong thôøi gian 20 phuùt, toác ñoä ly taâm ñaït 6000 voøng / phuùt. Caùc quaù trình ñöôïc tieán haønh ôû nhieät ñoä laïnh vaø trong ñieàu kieän voâ truøng ñeå traùnh da caù bò bieán tính aûnh höôûng ñeán chaát löôïng collagen. Nhöõng keát quaû phaân tích collagen treân da caù tuyeát Taùc giaû ñaõ tính haøm löôïng collagen thoâng qua vieäc phaân tích haøm löôïng hydroxyproline vaø nhaân vôùi heä soá chuyeån ñoåi töø hydroxyproline qua collagen laø 14,7. Haøm löôïng collagen trong da caù tuyeát laø 21,5% (tính theo troïng löôïng öôùt), vaø 71,2% (tính theo troïng löôïng khoâ). Ñoái vôùi phöông phaùp chieát baèng acetic cho thaáy hieäu suaát chieát phuï thuoäc raát nhieàu vaøo noàng ñoä acid vaø tæ leä nguyeân lieäu/dung dòch. Cho neân khi khaûo saùt quaù trình chieát, caàn tieán haønh ôû caùc noàng ñoä vaø tæ leä khaùc nhau ñeå tìm moái lieân heä cuûa chuùng aûnh höôûng ñeán hieäu suaát taùch chieát. Ñoái vôùi phöông phaùp chieát baèng acid citric, vaãn chieát ñöôïc collagen nhöng hieäu suaát taùch chieát khoâng cao hôn acetic. Tuy nhieân taùc giaû chæ döøng laïi ôû vieäc khaûo saùt caùc quaù trình taùch chieát maø chöa phaân tích ñöôïc nhöõng thoâng soá cuûa collagen nhö caùc chuoãi caáu truùc cuûa collagen, troïng löôïng phaân töû, vò trí vaø thaønh phaàn acid amin, nhieät ñoä bieán tính cuûa collagen,… 2.1.5 Qui trình taùch chieát Collagen töø phuï phaåm da, xöông, vaây cuûa caùc loaøi caù ngöø ngöø ( Katsuwonus Pelamis), caù Pecca Nhaät Baûn ( Lacteolabrax japonias), caù Thu (Samber japonus), caù Traùp Vaøng( Dentex tumifrons), caù Maäp ( Heterodonus japonius). Collagen saïch NaOH Da caù Loaïi taïp chaát Loaïi taïp chaát Chieát Ly taâm Butyl alcohol Acid acetic 0.5M Ly taâm Keát tuûa Thaåm tích Saáy thaêng hoa NaCl Maøng Cellophan Nöôùc baån Baõ Nöôùc Thuyeát minh qui trình coâng ngheä : Da, xöông, vaø vaây ñöôïc baûo quaûn ôû 25oC ñeán khi söû duïng. Taát caû quaù trình tieàn xöû lyù ñeán taùch chieát ñeàu tieán haønh ôû 4oC. - Muïc ñích: quaù trình loaïi taïp chaát nhaèm muïc ñích loaïi ñi caùc chaát non- collagen ( chaát beùo, chaát maøu, chaát gaây muøi tanh,...) ñeå chuaån bò cho caùc quaù trình tieáp theo. - Caùc bieán ñoåi cuûa nguyeân lieäu: da caù coù quaù trình huùt nöôùc, tröông nôû, luùc naøy troïng löôïng cuûa da caù taêng leân. - Thieát bò vaø thoâng soá coâng ngheä : laàn loaïi taïp chaát ñaàu tieân, ta tieán haønh xöû lyù baèng dung dòch NaOH 1%, sau ñoù da caù ñöôïc cho xöû lyù tieáp vôùi dung dòch Butyl alcohol 10% ñeå loaïi tieáp taïp chaát. Sau quaù trình loaïi taïp chaát, collagen ñöôïc taùch chieát baèng dung dòch acid acetic 0.5M trong 3 ngaøy. Quaù trình chieát collagen ñöôïc thöïc hieän trong caùc bình reactor ôû nhieät ñoä laïnh, trong ñieàu kieän voâ truøng, khuaáy troän lieân tuïc ñeå ñaûm baûo chieát ñöôïc collagen coù chaát löôïng toát. Sau quaù trình chieát collagen ta tieán haønh ly taâm thu laáy phaàn dòch, caû hai phaàn dòch chieát thu ñöôïc laø dung dòch loûng, hôi saùnh goïi laø acid-soluble collagen. Phaàn baõ thu ñöôïc cuõng ñöôïc chieát laàn hai vôùi dung dòch aid acetic 0.5M trong voøng 2-3 ngaøy. Ñeå keát tinh collagen, cho NaCl saün vaøo dòch chieát ñeán noàng ñoä 0.9M. Ñeán ñaây collagen thoâ ñaõ ñöôïc keát tuûa. Ñeå thu ñöôïc collagen saïch, ta tieán haønh ly taâm, laáy phaàn tuûa hoøa tan vaøo dung dòch acid acetic 0.5M. Tieán haønh thaåm tích thu ñöôïc collagen saïch. Collagen saïch ñöôïc laøm laïnh vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä laïnh. Trong quaù trình taùch chieát vaø tinh saïch protein, ñeå loaïi muoái ra khoûi dung dòch protein thi dung dòch protein ñöôïc cho vaøo caùc tuùi ñaëc hieäu laøm baèng nguyeân lieäu baùn thaám, thöôøng laø duøng caùc tuùi cellophan. Sau ñoù ñaët caû tuùi vaøo bình chöùa löôïng lôùn, H20 hay löôïng lôùn dung dòch ñeäm ñöôïc pha loaõng ( coù theå duøng ñeäm phosphat coù pH = 7, noàng ñoä 0.01M). Vì maøng cellophan laø maøng baùn thaám coù kích thöôùc loã chæ cho caùc chaát coù troïng löôïng phaân töû nhoû ñi qua caùc dung dòch ñeäm loaõng. Nhö vaäy, muoái seõ khueách taùn vaøo nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm loaõng ( di chuyeån theo höôùng giaûm noàng ñoä), coøn nöôùc hay dung dòch ñeäm loaõng seõ di chuyeån töø dung dòch röûa vaøo tuùi chöùa protein. Protein laø nhöõng ñaïi phaân töû khoâng theå vöôït qua tuùi thaåm tích vaø ñöôïc giöõ laïi trong tuùi. Sau khi tieán haønh thaåm tích ta thöïc hieän ly taâm collagen vöøa thu ñöôïc, sau ñoù tieán haønh saáy thaêng hoa ñeå thu ñöôïc saûn phaåm : - Caùc bieán ñoåi nguyeân lieäu: taùch nöôùc khoûi vaät lieäu baèng caùch bieán nöôùc trong vaät lieäu thaønh ñaù, sau ñoù bieán nöôùc ñaù thaønh hôi nöôùc maø khoâng qua traïng thaùi loûng. - Thieát bò: Heä thoáng saáy thaêng hoa tuaàn hoaøn * Haï nhieät ñoä saûn phaåm saáy xuoáng döôùi ñieåm ñoâng laïnh (-10oC÷-20oC) vaø ñöôïc ñaët trong bình chaân khoâng coù aùp suaát gaàn vôùi aùp suaát chaân khoâng tuyeät ñoái, khi ñoù nöôùc thoaùt ra khoûi saûn phaåm saáy ôû traïng thaùi raén, töùc laø thaêng hoa aåm. * Moâ hình heä thoáng thieát bò saáy thaêng hoa goàm 5 boä phaän: bình thaêng hoa, bình ngöng cuûa maùy laïnh, maùy neùn cuûa maùy laïnh, bình ngöng-ñoùng baêng, bôm chaân khoâng. Quaù trình saáy thaêng hoa goàm 3 giai ñoaïn: giai ñoaïn ñoâng laïnh, giai ñoaïn thaêng hoa vaø giai ñoaïn saáy aåm dö. Saáy thaêng hoa coù öu ñieåm giaûm thôøi gian saáy xuoáng 3 laàn, khoâng aûnh höôûng lôùn ñeán giaù trò dinh döôõng vaø muøi vò saûn phaåm, tuy nhieân chi phí naêng löôïng rieâng cao hôn caùc phöông phaùp khaùc khoaûng 50-60%. Hình 2.1 sô ñoà laøm vieäc thieát bò saáy thaêng hoa Nhöõng keát quaû phaân tích collagen trích chieát töø da caù Veà hieäu suaát taùch chieát: ñaït ñöôïc hieäu suaát töông ñoái cao 51,4% (caù pecca Nhaät Baûn), 49,8% (caù thu), 50,1% (caù maäp) tính treân troïng löôïng khoâ. Veà phaân tích caáu truùc chuoãi collagen : Hình 2.2 Saéc kí ñieän di SDS-PAGE collagen loaïi I cuûa da heo vaø collagen da caù. (Ñieän di treân 3,5% gel chöùa urea 3,5M: (A) Da heo; (B) Caù Pecca; (C) Caù maäp; (D) Caù thu Baèng phöông phaùp ñieän di nhö ñaõ noùi treân, hình 2.2 cho thaáy collagen da cuûa caù pecca vaø caù maäp goàm 2 chuoãi α khaùc nhau, ñoù laø α1 vaø α2. Trong ñoù, α2 coù haøm löôïng raát nhoû. Neáu coù α3 toàn taïi thì cuõng khoâng theå taùch khoûi α1 trong ñieàu kieän ñieän di naøy. Coøn ñoái vôùi caù thu, collagen daïng α chæ goàm chuoãi α1 maø hoaøn toaøn khoâng coù α2. Trong hình 2.2 ta cuõng thaáy coù söï toàn taïi cuûa chuoãi ôû caû 3 loaøi caù. Trong nghieân cöùu naøy, taùc giaû ñaõ söû duïng phöông phaùp ñieän di SPS-PAGE theo phöông phaùp cuûa Weber vaø Osborn ( 1969) ñeå xaùc ñònh chuoãi collagen. Trong ñoù chuoãi collagen ñöôïc hoøa tan vaøo Sodium photphat 0.02M ( pH = 7.2) chöùa 1% Sodium dodecyl sunphat ( SDS) vaø 3.5 ure. Tieán haønh ñieän di treân 3.5% gel vôùi ñeäm photphate 0.1M (pH = 7.2) chöùa 1% SDS. Taùc giaû ñaõ ño nhieät ñoä bieán tính cuûa hoãn hôïp collagen 0.03% hoøa tan vaøo acid acetic 0.1M taïi moät soá nhieät ñoä. - Nhieät ñoä bieán tính collagen cuûa da caù raát thaáp : 26.5oC ( caù Pecca), 25.6oC(caù thu), 25oC (caù maäp), thaáp hôn khoaûng 10 oC so vôùi collagen cuûa da caù heo ( 37oC). Nhìn chung, taùc giaû ñaõ ñöa ra phöông phaùp taùch chieát ñôn giaûn, deã thöïc hieän, chæ laø taùch chieát döïa treân caùc hoaù chaát thoâng duïng, khoâng quaù ñaét tieàn, caùc thieát bò cuõng thoâng duïng trong phoøng thí nghieäm. Taùc giaû cuõng khaûo saùt ñöôïc caáu truùc chuoãi collagen goàm α1, α2, vaø α3. Khaûo saùt ñöôïc nhieät ñoä bieán tính cuûa collagen da caù vaø so saùnh vôùi collagen da heo. Tuy nhieân cuõng coù moät soá nhöôïc ñieåm laø khi söû duïng butyl alcohol trong quaù trình röûa da caù loaïi taïp chaát, phaûi qua coâng ñoaïn chöng caát thu hoài dung moâi. Butyl alcohol khoâng ñöôïc khuyeán caùo söû duïng trong thöïc phaåm. Taùc giaû khaûo saùt caáu truùc collagen nhöng chöa xaùc ñònh ñöôïc troïng löôïng phaân töû cuûa chuùng, chöa xaùc ñònh thaønh phaàn acid amin trong collagen. 2.1.6 Naêm 2005, Kittiphattanabawon, Benjakul, Visessanguan, Nagai, Tanaka, treân cô sôû söû duïng caùc phöông phaùp taùch chieát collagen theo qui trình treân coù keát hôïp moät soá thay ñoåi vaø phaùt trieån theâm vieäc taùch chieát collagen treân da vaø xöông cuûa loaøi caù chæ vaøng (Priacanthus tayenus). Taùc giaû ñaõ coù nhöõng nghieân cöùu khaù hoaøn thieän vaø ñaày ñuû caùc phaân tích veà collagen: - Ñaõ phaân tích caùc chæ tieâu veà haøm löôïng aåm, haøm löôïng tro, haøm löôïng caùc chaát beùo, protein vaø haøm löôïng hydroxyproline. Trong ñoù haøm löôïng chaát beùo trong da caù nguyeân lieäu laø 0,98%, coøn trong collagen thaønh phaåm laø 0,33% (theo troïng löôïng öôùt), cho thaáy vieäc xöû lí da caù chöa loaïi saïch trieät ñeå caùc chaát beùo. - Ñaõ phaân tích thaønh phaàn acid amin trong collagen vaø xaùc ñònh trong ñoù glycine laø acid amin chính chieám 30%. - Veà saéc kí ñieän di xaùc ñònh chuoãi collagen : taùc giaû cuõng coù nhaän ñònh gioáng nhö caùc baøi baùo khaùc, collagen chöùa chuoãi α goàm chuû yeáu laø α1 vaø α2 ; coøn α3 khoù taùch ra trong ñieàu kieän ñieän di. Ngoaøi ra, trong collagen coøn coù caùc chuoãi vaø . ÔÛ ñaây chuùng ta caàn löu yù raèng vieäc xaùc ñònh söï toàn taïi cuûa caùc chuoãi α , , laø quan troïng, noù cho chuùng ta bieát ñöôïc moät thoâng tin laø chuoãi daïng α laø nhöõng monomer coù troïng löôïng phaân töû 100kDa, chuoãi daïng laïi laø nhöõng polymer coù troïng löôïng phaân töû töø 100-200 kDa, chuoãi daïng cuõng laø nhöõng polymer nhöng laïi coù troïng löôïng phaân töû 200 kDa. - Troïng löôïng phaân töû collagen naèm trong khoaûng 186,5-69,5 kDa. - Vieäc xaùc ñònh ñoä nhôùt cuûa dung dòch collagen: taùc giaû cho raèng khi nhieät ñoä caøng cao caøng laøm cho moái lieân keát hydro bò phaù vôõ, nhôø moái lieân keát hydro naøy caáu truùc collagen môùi beàn. Treân 40oC, collagen bò bieán ñoåi thaønh moät hoån hôïp caùc daây ñôn, ñoâi, vaø ba cuoän laïi moät caùch voâ traät töï (random-coil single, double, triple strand). Söï phaù vôõ caáu truùc collagen gaây ra bôûi söï thay ñoåi nhieät ñoä vaø coù lieân heä vôùi söï thay ñoåi ñoä nhôùt cuûa dung dòch collagen. - Taùc giaû coøn phaân tích theâm aûnh höôûng cuûa pH leân ñoä nhôùt cuûa dung dòch collagen. Dung dòch collagen coù ñoä nhôùt cao trong khoaûng pH töø 2-5. Ñieàu naøy giuùp cho chuùng ta nghieân cöùu taùch chieát collagen trong dung dòch coù pH thích hôïp, trong ñoù pH = 2 cho ñoä nhôùt cao nhaát. - Coøn ñoái vôùi aûnh höôûng cuûa NaCl leân dung dòch collagen. ÔÛ noàng ñoä khoaûng 3% NaCl trong dung dòch acetic 0,5M cuûa collagen, ñoä nhôùt khoâng thay ñoåi. Nhöng khi taêng noàng ñoä NaCl leân, ñoä nhôùt giaûm xuoáng. Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích laø khi noàng ñoä NaCl taêng, ñoä hoøa tan cuûa protein giaûm do laøm loä caùc nhoùm kò nöôùc naèm beân trong phaân töû protein. 2.1.7 Qui trình taùch chieát Collagen treân da cuûa loaøi caù noùc baèng acid acetic vaø enzyme pepsin. Collagen saïch NaOH Da caù Loaïi taïp chaát Loaïi taïp chaát Chieát Ly taâm Butyl alcohol Acid acetic 0.5M Ly taâm Keát tuûa Thaåm tích Saáy thaêng hoa NaCl Maøng Cellophan Nöôùc baån Nöôùc baån Baõ Nöôùc Chieát laàn 2 Thuyeát minh qui trình coâng ngheä : Quaù trình tieàn xöû lyù taïp chaát vaãn söû duïng dung dòch NaOH 1% vaø butyl alcohol 10% . Beân caïnh vieäc taùch chieát baèng acid acetic, qui trình coøn söû duïng enzyme pepsine. Da caù sau khi röûa saïch taïp chaát seõ ñöôïc chieát vôùi dung dòch acid acetic 0,5M trong voøng 3 ngaøy. Ly taâm laáy phaàn dòch cho keát tuûa vôùi NaCl boå sung ñeäm tris – HCl (pH = 7,5) thu ñöôïc collgen thoâ. Coøn phaàn baõ ñöôïc chieát tieáp baèng hoãn hôïp acid acetic 0,5M vaø enzyme pepsin 10%(w/v) trong 2 ngaøy , ôû 40C . Ñieåm ñaúng ñieän cuûa enzyme pepsin trong khoaûng pH = 1, pepsin thuûy phaân maïnh caùc lieân keát peptide noái maïch do caùc nhoùm amin cuûa caùc acid amin thôm trong trong phaân töû protein taïo thaønh. Saûn phaåm ñöôïc taùch ra laø caùc peptide vaø caùc acid amin töï do. Trong moâi tröôøng acid, pepsin hoaït ñoäng thích hôïp nhaát trong khoaûng pH = 1.5 – 2 , pepsin coù ñoä beàn toái ña ôû pH = 4-5, ôû vuøng pH naøy, hoaït löïc cuûa pepsin thaáp, töø pH = 5,6 thì haàu nhö khoâng coù hoaït tính protease. Dung dòch pepsin trong H20 ôû daïng pepsinogen vaø ñöôïc hoaït hoùa bôûi H+ vôùi pH = 1.5 – 2, chuùng tieán haønh phaân giaûi gaàn 30% maïch peptide vaø thuûy phaân protein thaønh polypeptide. Tieán haønh ly taâm laáy phaàn dòch naøy vôùi dung dòch Na2HPO4 0,02M (pH= 7.2) trong 3 ngaøy. Sau ñoù, dòch thaåm taùch ñöôïc ly taâm, laáy phaàn keát tuûa hoøa tan vaøo acid acetic 0,5M . Keát tuûa collagen baèng NaCl boå sung ñeäm tris – HCl (pH = 7,5). Ly taâm laáy phaàn tuûa hoøa tan vaøo dung dòch acid acetic 0,5M ñeå loaïi boû caùc taïp chaát khoâng tan trong acid. Tieán haønh thaåm tích loaïi boû acid acetic, laøm khoâ laïnh thu ñöôïc saûn phaåm collagen. Keát quaû phaân tích collagen Ñoái vôùi phöông phaùp söû duïng enzyme ñeå chieát collagen, ta nhaän thaáy collagen khoâng tan hoaøn toaøn trong acid nhöng tan hoaøn toaøn trong enzyme pepsin. Hieäu suaát chieát baèng enzyme ñaït 44,7% trong khi ñoù chieát baèng acid acetic chæ ñaït 10,7%. Vieäc boå sung enzyme giuùp cho söï phaù vôõ caùc maøng teá baøo nhanh vaø maïnh hôn. Vì theá collagen deã daøng ñöôïc taùch ra vaø cho hieäu suaát cao. Keát quaû cuõng cho thaáy raèng nhieät ñoä bieán tính cuûa collagen ôû da caù noùc laø 280C thaáp hôn collagen ôû da heo. Thaønh phaàn acid amin trong collagen ôû loaøi caù noùc goàm 19 loaïi, trong ñoù haøm löôïng glycine chieám 30% cho thaáy ñöôïc glycine laø thaønh phaàn amino acid chuû yeáu trong collagen. Baûng 2.1 Thaønh phaàn a.a cuûa dung dòch collagen da caù noùc chieát baèng enzyme pepsine. Thaønh phaàn acid amin Soá goác / 1000 goác Hydroxyproline 67 Acid aspartic 50 Threonine 25 Serin 48 Glutamic acid 87 Proline 103 Glycine 351 Alanine 106 Cystein 2 Valine 17 Methionine 14 Isoleucine 12 Leucine 23 Tyrosine 4 Phennylalnine 10 Trytophan 0 Lysine 19 Histidine 8 Arginine 54 Toång 1000 2.1.8 Naêm 2009, Zhang Liu Li ñaõ coù caùc nghieân cöùu treân loaøi caù da trôn (Largefin longbabel) Trong nghieân cöùu naøy, quaù trình taåy röûa ñöôïc tieán haønh ôû 40C, trong ñieàu kieän khuaáy troän. Da ñöôïc ngaâm vôùi dung dòch NaOH 0,1M vôùi tæ leä 1/20 (w/v) trong voøng 24h. Tieán haønh thay dung dòch moät laàn sau 24h ñeå loaïi bôùt taïp chaát non-collagen, chaát beùo, chaát maøu vaø muøi tanh. Röûa laïi vôùi nöôùc cho saïch. Sau ñoù tieáp tuïc loaïi beùo baèng dung dòch butyl ancohol 15%(v/v), tæ leä 1÷ 20 thöïc hieän 2 laàn trong voøng 12h. Röûa laïi vôùi nöôùc laïnh cho saïch, sau ñoù tieáp tuïc taåy maøu vôùi dung dòch H2O2 3%, röûa 2 laàn trong voøng 24h. Röûa laïi vôùi nöôùc laïnh cho saïch. Sau khi ñöôïc xöû lyù, da ñöôïc chieát vôùi dung dòch acetic 0,5M coù khuaáy troän, tæ leä nguyeân lieäu / dung dòch laø 1/15, thöïc hieän trong thôøi gian 24h ôû nhieät ñoä laïnh 40C, sau ñoù dòch chieát ñöôïc ly taâm laïnh. Phaàn baõ ñöôïc chieát tieáp laàn 2 baèng dung dòch acid acetic trong thôøi gian 12h. Ly taâm dòch chieát, taát caû 2 phaàn dòch chieát ñöôïc theâm NaCl ñeán noàng ñoä 0,7M ñeå keát tuûa collagen. Ly taâm laáy phaàn keát tuûa ñem tinh saïch. Löôïng collagen thoâ ñöôïc hoøa tan hoaøn toaøn vaøo dung dòch acid acetic 0,5M ñeå loaïi boû caùc taïp chaát khoâng tan trong acid. Dung dòch ñöôïc thaåm taùch vôùi acid acetic 0,1M trong 3 ngaøy, thay acid moãi ngaøy. Phaàn keát tuûa ñöôïc laøm laïnh khoâ baèng thieát bò ñoâng khoâ khoâ (Labconco Freezone 2,5L, USA) thu ñöôïc saûn phaåm collagen saïch acid soluble collagen (ASC). Phaàn baõ sau khi ñaõ chieát 2 laàn vôùi acid acetic, ñem chieát tieáp tuïc vôùi dung dòch acid acetic 0.5M chöùa 15%(w/w) pepsin trong thôøi gian 30 phuùt ôû nhieät ñoä 40C, khuaáy lieân tuïc. Cho keát tuûa vaø tinh saïch nhö treân, thu ñöôïc collagen saïch pepsin soluble collagen (PSC). Ngoaøi caùc phöông phaùp phaân tích collagen nhö tieán haønh chaïy saéc kí ñieän di, ño ñoä nhôùt vaø nhieät ñoä bieán tính cuûa collagen, taùc giaû coøn nghieân cöùu saâu theâm veà collagen baèng caùch ño phoå haáp thu töû ngoaïi cuûa dung dòch collagen baèng quang phoå keá. Keát quaû cho thaáy raèng maëc duø protein coù böôùc soùng haáp thu cöïc ñaïi ôû vuøng töû ngoaïi gaàn laø 280nm nhöng collagen khoâng coù böôùc soùng naøo trong vuøng naøy. Caû collagen ASC vaø PSC ñeàu haáp thu ôû böôùc soùng laø 233nm. Beân caïnh ñoù, taùc giaû coøn tieán haønh ño phoå hoàng ngoaïi FTIR ñeå xaùc ñònh böôùc soùng haáp thu cuûa caùc amide cuûa caû 2 loaïi collagen laø ASC vaø PSC. Qui trình taùch chieát Collagen söû duïng qui trình leân men cuûa vi khuaån Bacillus Collagen saïch Da caù Nuoâi,uû 37oC(24h) Khuaáy troän UÛ (48h) Röûa saïch Gioáng Bacillus Keát tuûa Chieát Loïc Thaåm tích Pepsin 0.4% Than hoaït tính Nöôùc baån Baõ Nöôùc NaCl Membrance Ly taâm Saáy thaêng hoa 2.2 CAÙC COÂNG TRÌNH NGHIEÂN CÖÙU ÔÛ VIEÄT NAM 2.2.1 Naêm 2008, taùc giaû Leâ Thò Hoàng Nhan coù nhöõng nghieân cöùu treân loaøi caù basa (Pangasius Bocourti) nuoâi taïi caùc tænh ñoàng baèng soâng Cöûu Long. Trong nghieân cöùu naøy ,ôû quaù trình taåy röûa da caù, taùc giaû söû duïng chaát hoaït ñoäng beà maët LasNa keát hôïp vôùi NaOH ñeå loaïi caùc chaát nhaày, chaát beùo. Vaø cuõng söû duïng H2O2 ñeå taåy maøu. Coøn trong quaù trình taùch chieát collagen, phöông phaùp ñöôïc aùp duïng laø chieát baèng acid citric nhöng hieäu suaát thaáp khoaûng 5,76%. Taùc giaû cuõng coù moät soá phaân tích treân saûn phaåm collagen thu ñöôïc. Trong ñoù, nhieät ñoä bieán tính collagen ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ño ñoä nhôùt, söû duïng thieát bò Brookfield viscometer HDBV- II. Phaân tích ñoä nhôùt ñöôïc thöïc hieän trong moät beå nöôùc. Nhieät ñoä beå ñöôïc caøi ñaët töø 30oC leân 50oC vôùi toác ñoä 5oC/phuùt vaø giöõ ôû 50oC trong 10 phuùt. Keát quaû ñoä nhôùt giaûm khi ta taêng nhieät ñoä Hình 2.3 Bieåu ñoà söï phuï thuoäc ñoä nhôùt theo nhieät ñoä. Veà nghieân cöùu caáu truùc, taùc giaû söû duïng phöông phaùp chuïp electron ñieän töû queùt scanning electon microscopy-SEM ñeå thaáy roõ hôn veà caáu truùc beà maët collagen vaø so saùnh vôùi beà maët cuûa gelatin. (a) (b) Hình 2.4 Caáu truùc beà maët collagen (a) vaø gelatin (b) CHÖÔNG 3 : ÖÙNG DUÏNG CUÛA COLLAGEN Collagen laø moät daïng protein caáu truùc sôïi daøi vaø haàu heát caùc chöùc naêng cuûa noù khaùc vôùi daïng daïng protein phoå bieán khaùc nhö enzym. Nhöõng boù collagen hay coøn goïi laø nhöõng sôïi collagen laø thaønh phaàn chính cuûa theå neàn maøng teá baøo caáu taïo neân haàu heát caùc moâ vaø caáu truùc beân ngoaøi cuûa teá baøo, nhöng collagen cuõng ñöôïc tìm thaáy beân trong cuûa teá baøo. Collagen coù cöôøng ñoä keùo ñöùt raát lôùn vaø laø thaønh phaàn chính cuûa baêng trong y hoïc, gaân, suïn, xöông, daây chaèng vaø da. Cuøng vôùi keratin meàm, laø nguyeân nhaân taïo ra ñoä deûo dai vaø ñang hoài cuûa da vaø neáu noù thoaùi hoùa seõ gaây ra neáp nhaên daãn ñeán tuoåi giaø. Noù taïo neân ñoä beàn cuûa thaønh maïch maùu vaø ñoùng vai troø quan troïng trong söï phaùt trieån moâ teá baøo. Noù coù trong giaùc maïc, thuûy tinh theå cuûa maét. Collagen cuõng ñöôïc duøng trong phaãu thuaät thaåm myõ vaø phaãu thuaät boûng. Collagen ñaõ thuûy phaân coù theå ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc ñieàu chænh caân naëng, gioáng nhö protein khi ta duøng noù coù caûm giaùc cung caáp ñuû naêng löôïng. Collagen thuûy phaân goïi laø collagen hydrolysate. Tuøy theo möùc ñoä thuûy phaân maø collagen coù caùc öùng duïng khaùc nhau. Collagen hydrolysate ñöôïc söû duïng phoå bieán trong coâng ngheä thöïc phaåm, döôïc phaåm, myõ phaåm, vaø coâng nghieäp nhieáp aûnh. Chuùng ñöôïc söû duïng nhö chaát ñoâng, chaát gaây laéng trong thöïc phaåm. Chuùng ñöôïc duøng nhö chaát thay theá cao su, keo daùn, xi maêng, möïc in luïa nhaân taïo, laø chaát taïo keát dính trong dieâm queït. Chuùng ñöôïc duøng trong boä loïc saùng cho ñeøn thuûy ngaân,… 3.1 ÖÙNG DUÏNG COLLAGEN TRONG COÂNG NGHIEÄP THÖÏC PHAÅM Collagen ñöôïc duøng ñeå laøm voû bao xuùc xích, maøng boïc keïo, laøm nguyeân lieäu saûn xuaát moät soá loaïi thöïc phaåm dinh döôõng, thöïc phaåm chöùc naêng. Dó nhieân chuùng phaûi traûi qua moät quaù trình cheá bieán ñeå ñaït ñöôïc nhöõng tính chaát öùng duïng mong muoán, nhö tính tan chaûy ôû nhieät ñoä cao vaø ñoâng ñaëc ôû nhieät ñoä thaáp, luùc naøy collagen ñoùng vai troø moät chaát keo baûo veä ngaên chaën söï keát tinh cuûa ñöôøng. Chính vì vaäy maø trong caùc öùng duïng ngöôøi ta thöôøng söû duïng chuû yeáu laø daïng thuûy phaân cuûa collagen, ñöôïc goïi laø collagen hydrolysate. 3.1.1 ÖÙng duïng collagen trong coâng nghieäp saûn xuaát baùnh keïo Coâng nghieäp saûn xuaát baùnh keïo coù leõ laø lónh vöïc coù nhieàu öùng duïng cuûa collagen hydrolysate nhaát tính cho ñeán hieän nay. Collagen hydrolysate ñöôïc söû duïng trong caùc saûn phaåm baùnh keïo ngoït nhö: “winegums”, “gummy bears”, “fruit chews”, “marshmallow” vaø “licoride”. Chöùc naêng cuûa collagen hydrolysate phuï thuoäc vaøo loaïi saûn phaåm. Chaúng haïn nhö trong “marshmallows”, collagen ñoùng vai troø laøm beàn boït. Trong “fruit chews” vaø “licoride”, collagen tham gia taïo caáu truùc, ñoä dai cho saûn phaåm,... Hình 3.1 Saûn phaåm keïo deûo coù voû maøng laø collagen hydrolysate Yeâu caàu cuûa collagen hydrolysate trong coâng nghieä saûn xuaát baùnh keïo: Collagen hydrolysate caàn phaûi ñöôïc hoøa tan hoaøn toaøn tröôùc ñeå coù theå phaùt huy caùc tính naêng coâng ngheä cuûa chuùng. Ñeå ñaït yeâu caàu naøy thì caàn hydrat hoùa collagen vôùi moät löôïng nöôùc thích hôïp keát hôïp vôùi khuaáy ñaûo hôïp lyù ñeå caùc phaân töû coù theå lieân keát laïi vôùi nhau. Collagen caàn ñöôïc gia nhieät ñeán 600C ñeå coù theå tan hoaøn toaøn. Noù coù theå hoøa tan raát nhanh khi ñöôïc ñöa tröïc tieáp vaøo nöôùc noùng lôùn hôn 900C hoaëc gia nhieät collagen ñaõ ñöôïc laøm öôùt trong nöôùc laïnh, quaù trình naøy ñöôïc thöïc hieän trong voøng töø 15 phuùt ñeán 1h. Dung dòch naøy khoâng taïo gel ñöôïc cho ñeán khi noù ñöôïc laøm nguoäi ñeán nhieät ñoä thích hôïp, gel naøy coù tính thuaän nghòch vôùi nhieät ñoä, do vaäy noù coù theå tan chaûy ra sau khi theå gel ñöôïc taïo thaønh. Nhieät ñoä tan chaûy cuûa chuùng thaáp hôn nhieät ñoä thaân nhieät ( khoaûng 3536oC) Collagen hydrolysate ñöôïc phaân haïng vaø kieåm tra döïa vaøo cöôøng ñoä ñöôïc ñaëc tröng baèng chæ soá Bloom. Ñaây laø chæ soá ño ñaïc ñoä maïnh cuûa collagen hydrolysate. Chæ soá naøy caøng cao thì ñoä beàn gel cuûa collagen hydrolysate caøng lôùn ôû cuøng moät noàng ñoä. Ñoái vôùi caùc öùng duïng taïo gel ñieån hình thì collagen hydrolysate coù ñoä Bloom naèm trong khoaûng töø 100 ÷ 280. Collagen hydrolysate coù ñoä Bloom cao hay thaáp ñöôïc söû duïng trong caùc lónh vöïc khaùc nhau. Chaúng haïn nhö trong lónh vöïc “gummy” thì collagen coù ñoä Bloom cao vaø trung bình ñöôïc söû duïng nhieàu hôn vì chuùng taïo ra moät caáu truùc ñaëc tröng vaø caûi thieän khaû naêng ñònh hình, nhöng trong saûn xuaát loaïi keïo “chewy” thì collagen coù ñoä Bloom thaáp (70 ÷ 140) laïi ñöôïc öa chuoäng hôn vôùi möùc ñoä söû duïng naèm trong khoaûng 0,2 ÷ 2,5%. Neáu söû duïng collagen coù ñoä Bloom cao hôn thì haøm löôïng söû duïng seõ thaáp hôn. Ñoä nhôùt cuûa collagen laø moät trong nhöõng yeáu toá quan troïng trong coâng ngheä saûn xuaát baùnh keïo. Chaúng haïn nhö trong saûn xuaát caùc saûn phaåm “gum”, ñoä nhôùt cuûa collagen coù theå taùc ñoäng ñeán quaù trình coá ñònh trong saûn phaåm, ñaëc bieät laø khi collagen coù haøm löôïng cao. Ñaëc bieät trong quaù trình saûn xuaát caùc saûn phaåm “marshmallow” thì ñoä nhôùt cuûa collagen ñoùng vai troø quan troïng hôn trong caùc öùng duïng khaùc cuûa collagen, cuï theå noù aûnh höôûng ñeán quaù trình ñaùnh troän syrup, quaù trình giöõ caùc boït khí, keát hôïp vôùi caùc phöông phaùp taïo hình ñöôïc söû duïng. Chaûng haïn nhö ñoái vôùi phöông phaùp taïo hình söû duïng khuoân tinh boät thì ñoä nhôùt cuûa collagen yeâu caàu phaûi thaáp ñeå khoái keïo coù theå chaûy deã daøng vaøo caùc khuoân, coøn ñoái vôùi phöông phaùp eùp ñuøn thì ñoä nhôùt cuûa collagen phaûi cao ñeå ñònh hình cho saûn phaåm sau khi ñuøn. Hình 3.2 Collagen hydrolysate laøm chaát keát dính trong thanh keïo Collagen hydrolysate laø chaát nhaïy caûm vôùi nhieät ñoä vaø acid, ñaëc bieät laø khi coù söï keát hôïp giöõa hai yeáu toá naøy coù theå laøm hoûng khaû naêng taïo gel cuûa collagen. Neáu quaù trình naáu dieãn ra nhanh thì collagen coù theå ñöôïc ñöa vaøo ngay töø ñaàu coøn neáu quaù trình naáu yeâu caàu thôøi gian daøi thì collagen neân ñöa vaøo quaù trình troän sau coâng ñoaïn naáu ñeå haïn cheá phaûn öùng Maillard vaø phaûn öùng nghòch ñaûo ñöôøng. Vieäc theâm acid vaøo neân giöõ ôû möùc toái thieåu coù theå ñöôïc vaø neân theâm chæ vaøo tröôùc coâng ñoaïn ñaùnh troän taïi nhieät ñoä nhoû nhaát coù theå. Baûng 3.1 ÖÙng duïng cuûa collagen hydrolysate trong coâng nghieäp saûn xuaát baùnh keïo Loaïi saûn phaåm Chöùc naêng Ñoä Bloom Ñoä nhôùt Löôïng söû duïng Gum Taïo gel, taïo caáu truùc, xaây döïng tính ñaøn hoài 100260. Thaáp,trung bình, cao 2 10%. Keïo “Chewy” Taïo khí, ñoä deûo, ñoä ñaøn hoài 100150. Trung bình, cao 0,53%. Keïo “marshmallow” Taïo khí, taïo gel, taùc nhaân beàn vöõng 200260. Trung bình, cao 25%. Keïo “nuga” Taïo tính dai, daøn hoài 100150 Trung bình, cao 0,21,5%. Lôùp maøng phuû ngoaøi Taïo lôùp maøng, taïo lieân keát 120150 Trung bình, cao 0,21%. 3.1.2 ÖÙng duïng collagen trong coâng nghieäp saûn xuaát söõa vaø caùc saûn phaåm töø söõa Collagen hydrolysate ñöôïc söû duïng nhö moät phuï gia taïo caáu truùc trong coâng nghieäp söõa vaø caùc saûn phaåm töø söõa. Chöùc naêng cuûa chuùng laø: Taïo caùc moái lieân keát vôùi nöôùc: collagen coù khaû naêng tröông nôû ñeå taïo lieân keát gaáp 5 laàn khoái löông cuûa chuùng vôùi nöôùc. Noù giuùp ngaên caûn söï ræ nöôùc trong caùc saûn phaåm söõa. Cuûng coá caáu truùc cho caùc saûn phaåm söõa : collagen khoâng taïo phaûn öùng vôùi caùc thaønh phaàn cuûa söõa vaø phuï thuoäc vaøo haøm löôïng söû duïng, collagen coù theå laøm chaët caáu truùc cream, taïo lôùp gel chaéc töø dòch loûng. Ngoaøi ra noù coøn giuùp oån ñònh caùc boït khí cuûa caùc saûn phaåm töø söõa coù boït ôû nhieät ñoä thaáp vaø ngaên caûn söï hoûng caáu truùc cho saûn phaåm trong suoát quaù trình toàn tröõ. Gioáng nhö caùc loaïi protein khaùc, collagen coù khaû naêng tao boït toát khi coù maët cuûa ñöôøng vaø söõa. Söï coù maët cuûa chaát beùo coù xu höôùng ngaên caûn söï taïo boït, vì vaäy caàn phaûi söû duïng theâm caùc phöông phaùp vaät lyù nhö : bôm khoâng khí, khí CO2, khí N2 ñeå taêng theå tích vaø taïo boït cho caùc saûn phaåm söõa coù boït. Vaø chính collagen cuõng tham gia vaøo quaù trình oån ñònh, söï beàn chaët cho caùc saûn phaåm söõa coù boït. Collagen khoâng muøi do ñoù khoâng aûnh höôûng ñeán muøi vò cuûa saûn phaåm. Noù khoâng chòu söï taán coâng cuûa taùc nhaân oxy hoùa, coù khaû naêng ngaên caûn söï bieán tính vaø löu giöõ ñöôïc muøi traùi caây cho saûn phaåm. Collgen ñoùng vai troø nhö moät chaát keo laøm nhieäm vuï baûo veä vì söï ñoâng tuï cuûa söõa vaø casein seõ hoaøn toaøn hôn vaø ñoàng nhaát hôn khi coù maët cuûa collagen. Ñoàng thôøi khi coù maët moät haøm löôïng nhoû cuûa collagen trong caùc saûn phaåm söõa thì caáu truùc cuûa saûn phaåm seõ trôû neân meàm maïi hôn. Boät collagen hydrolysate seõ ñöôïc hoøa troän vôùi caùc thaønh phaàn khaùc nhö : ñöôøng, caùc chaát tao höông, moät soá chaát oån ñònh khaùc roài ñöa vaøo dung dòch söõa. Hoãn hôïp söõa nguoäi naøy ñöôïc khuaáy troän, khi ñoù collagen seõ tröông nôû vaø haáp thu moät löôïng nöôùc gaáp 10 laàn khoái löôïng cuûa chuùng, trong quaù trình thanh truøng thì collagen seõ ñöôïc hoøa tan. Tuy nhieân, khi söõa ñöôïc loïc tröôùc quaù trình thanh truøng thì toát nhaát neân ñöa collagen vaøo döôùi daïng dung dòch neáu khoâng thì quaù trình loïc seõ loaïi boû nhöõng haït collagen coøn ñang tröông nôû. Dung dòch collagen cuõng coù theå theâm vaøo söõa nguoäi keøm theo söï khuaáy troän lieân tuïc. Collagen coù theå theâm vaøo söõa tröôùc khi caáy gioáng maø khoâng aûnh höôûng ñeán caùc ñieàu kieän leân men, collagen khoâng phaûn öùng vôùi caùc thaønh phaàn cuûa söõa vaø khoâng taïo keát tuûa. Collagen laø moät loaïi protein, do ñoù noù coù khaû naêng bò thuûy phaân bôûi caùc taùc nhaân nhö : nhieät ñoä, acid, kieàm, caùc tia phoùng xaï, enzyme, vi sinh vaät. Nhöng nhìn chug ñoä maïnh cuûa gel bò phaù huûy khi collagen chòu taùc duïng ñoàng thôøi cuûa pH (nhoû hôn 4) vaø nhieät ñoä ( lôùn hôn 60oC) trong moät khoaûng thôøi gian ñuû lôùn. Do ñoù quaù trình tieät truøng, thanh truøng ñoä acid cuûa saûn phaåm töø söõa thöôøng khoâng aûnh höôûng nhieàu ñeán taùc duïng cuûa collagen trong saûn phaåm. Moät soá lónh vöïc coù öùng duïng collagen hydrolysate trong coâng nghieäp saûn xuaát söõa vaø caùc saûn phaåm töø söõa: Yogurt : yogurt laø saûn phaåm tö söõa phoå bieán treân toaøn theá giôùi vaø collagen hydrolysate ñöôïc söû duïng cho saûn phaåm naøy vôùi vai troø cuûa moät chaát oån ñònh giuùp ngaên caûn söï taùch nöôùc töø khoái ñoâng. Ngoaøi ra noù coøn tham gia vaøo quaù trình taïo caáu truùc kem vaø caûm giaùc beùo trong mieäng vì noù coù khaû naêng tan chaûy taïi nhieät ñoä thaân nhieät, söï tan chaûy naøy ñoâi khi coøn mang laïi höông vò toát cho saûn phaåm. Trong caùc saûn phaåm kem : colagen hydrolysate ñoùng vai troø cuûa moät taùc nhaân oån ñònh vaø noù coù chöùc naêng ñieàu chænh ñoä nhôùt cuûa hoãn hôïp, giuùp beàn vöõng heä nhuõ töông cho tôùi khi ñöôïc söû duïng, ngaên caûn söï bieán tính trong quaù trình baûo quaûn. Collagen khi keát hôïp vôùi caùc taùc nhaân oån ñònh khaùc coù khaû naêng taïo cho saûn phaåm caáu truùc vaø höông vò thích hôïp. Beân caïnh ñoù, collagen giuùp taêng giaù trò caûm quan cho saûn phaåm, khi aên taïo caûm giaùc kem, beùo cho saûn phaåm maø khoâng taïo caûm giaùc nhôùt dính nhö ôû caùc saûn phaåm coù haøm löôïng beùo cao. Caùc saûn phaåm söõa leân men coù qua quaù trình xöû lyù nhieät: quaù trính thanh truøng hay tieät truøng cho caùc saûn phaåm söõa leân men laøm taêng thôøi gian baûo quaûn cho saûn phaåm nhöng laïi laøm maát tính oån ñònh cuûa caáu truùc saûn phaåm daãn ñeán hieän töôïng taùch nöôùc. Vieäc boå sung hoãn hôïp collagen hydrolysate vaø tinh boät tröôùc khi thanh truøng seõ giuùp taïo caáu truùc toát vaø ngaên ngöøa ñöôïc baát kyø söï taùch loûng naøo. Caùc saûn phaåm traùng mieäng coù söû duïng söõa nhö thaønh phaàn taïo gel, höông vò cho saûn phaåm : trong caùc saûn phaåm naøy collagen hydrolysate cuõng ñoùng vai troø laø chaát oån ñònh noù bò hoøa tan trong quaù trình xöû lyù nhieät vaø söï coù maët cuûa collagen hydrolysate giuùp ngaên caûn söï taêng ñoä nhôùt vaø tham gia taïo gel cho saûn phaåm khi ñöôïc laøm nguoäi. Noù coù theå ñöôïc söû duïng rieâng hoaëc keát hôïp vôùi caùc chaát taïo gel khaùc nhö carrageenan ñeå taïo neân moät caáu truùc gel meàm maïi. Trong saûn phaåm phoâ mai, phaàn lôùn collagen hydrolysate ñöôïc boå sung vaøo ñoùng vai troø cuûa moät chaát nhuõ hoùa vaø taùc ñoïng vaøo caùc moát lieân keát vôùi nöôùc. Khi so saùnh caùc saûn phaåm phoâ mai coù söû duïng theâm collagen hydrolysate thì möùc ñoä aåm, caáu truùc vaø höông vò cuûa saûn phaåm toát hôn so vôùi caùc loaïi phoâ mai ñöôïc saûn xuaát theo phöông phaùp truyeàn thoáng. Hình 3.3 Saûn phaåm Phoâ mai coù chöùa collagen hydrolysate laøm giaûm haøm löôïng beùo Trong caùc saûn phaåm ít calo laøm töø söõa, caùc saûn phaåm naøy ñoøi hoûi phaûi caét giaûm löôïng chaát beùo, thaäm chí laø loaïi khoûi saûn phaåm caùc chaát beùo töø söõa. Thay theá vaøo ñoù laø loaïi chaát beùo coù nguoàn goác töø thöïc vaät hoaëc laø keát hôïp giöõa chaát beùo töø thöïc vaät vaø chaát beùo coù saün trong söõa. Ñeå laøm beàn vöõng heä nhuõ töông nhö theá caàn phaûi coù söï hieän dieän cuûa chaát oån ñònh vaø chaát nhuõ hoùa. Caùc chaát naøy giuùp ñaûm baûo moái lieân keát vôùi nöôùc, caûi thieän caáu truùc( ñoä chaéc, ñoä ñaêc, ñoä caêng) cho saûn phaåm. Collagen hydrolysate coù ñoä Bloom cao coù khaû naêng thöïc hieän ñöôïc chöùc naêng naøy vì ngoaøi tính naêng thoâng thöôøng cuûa noù, loaïi naøy coù nhieät ñoä tan chaûy xaáp xæ baèng nhieät ñoä cuûa nhieàu loaïi chaát beùo thoâng thöôøng (3133oC). Moät soá chaát keo öa nöôùc khaùc nhö : pectin, carrageenan, xanthan coù theå keát hôïp vôùi collagen hydrolysate ñeå taêng khaû naêng lieân keát vôùi nöôùc. Trong caùc saûn phaåm thöùc uoáng töø söõa thì collagen hydrolysate coù vai troø oån ñònh caáu truùc, traùnh hieän töôïng taùch pha trong thôøi gian baûo quaûn. Baûng 3.2 Loaïi vaø löôïng collagen hydrolysate söû duïng trong coâng nghieäp cheá bieán söõa vaø caùc saûn phaåm töø söõa. ÖÙng duïng Ñoä maïnh Bloom Löôïng söû duïng Yogurt 150 0,22% Caùc saûn phaåm söõa leân men qua xöû lyù nhieät 150 0,22% Jelly höông söõa 150 0,22% Kem 150 0,21% Caùc saûn phaåm kem traùng mieäng 150 0,22% Caùc saûn phaåm coù haøm löôïng calo thaáp 250 0,53% 3.1.3 ÖÙng duïng collagen trong coâng nghieäp saûn xuaát ñoà uoáng Caùc thöùc uoáng nhö röôïu , röôïu traùi caây, caùc saûn phaåm nöôùc quaû chöa leân men coù chöùa caùc thaønh phaàn khoâng hoøa tan laøm ñuïc saûn phaåm thöôøng khoâng ñaït hieäu quaû cao neáu duøng phöông phaùp loïc ñeå loaïi boû. Töø thôøi neân vaên minh La Maõ hoaëc cuõng coù theå laø vaøo tröôùc ñoù, collagen hydrolysate ñöôïc söû duïng cho quaù trình loïc trong röôïu. Collagen hydrolysate laø taùc nhaân tinh saïch phoå bieán trong quaù trình saûn xuaát röôïu vang ñoû. Khi ñöôïc boå sung vaøo saûn phaåm collagen hydrolysate coù taùc duïng naâng cao thôøi gian baûo quaûn saûn phaåm, vôùi khaû naêng taïo tuûa nhanh vaø taïo cho röôïu coù maøu saùng maø khoâng bieán ñoåi maøu ñaëc tröng cuûa saûn phaåm. Hieän nay collagen hydrolysate ñöôïc söû duïng phoå bieán cho quaù trình laøm saïch röôïu vang, bia vaø nöôùc traùi caây vì noù laøm giaûm ñoä ñuïc, taêng giaù trò caûm quan cho saûn phaåm maø khoâng aûnh höôûng tôùi höông vò cuûa saûn phaåm cuoái cuøng. Caùc phaûn öùng cuûa quaù trình tinh saïch dieãn ra vôùi söï tham gia cuûa collagen hydrolysate: Phaûn öùng cô baûn xaûy ra vôùi collagen hydrolysate ñoù laø phaûn öùng taïo phöùc giöõa polyphenol coù trong röôïu vaø protein cuûa collagen hydrolysate ñeå taïo neân caùc boâng tuï laéng xuoáng. Phaûn öùng thöù hai ít ñöôïc bieát ñeán hôn nhöng khoâng ñoùng vai troø quan troïng ñoù laø phaûn öùng taïo phöùc giöõa protein coù trong röôïu vaø protein theâm vaøo cuûa collagen hydrolysate. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình tinh saïch coù söï tham gia cuûa collagen hydrolysate: Nhieät ñoä : ñieàu kieän laïnh thöôøng thích hôïp cho quaù trình keo tuï vaø loïc. Ngöôøi ta chöùng minh ñöôïc raèng quaù trình boâng tuï khoù xaûy ra ôû nhieät ñoä 2530oC vaø thaäm chí laø khoâng theå ñoái vôùi caùc loaïi röôïu traéng. Löôïng chaát keát tuûa nhieàu thu ñöôïc ôû nhieät ñoä thaáp coù theå ñöôïc giaûi thích bôûi söï ñoàng laéng cuûa caùc thaønh phaàn hôn laø söï keát hôïp giöõa polyphenol vôùi collagen hydrolysate trong quaù trình tinh saïch. Ñoä acid : trong caùc saûn phaåm röôïu, ñoä acid caøng yeáu thì quaù trình ñoâng tuï seõ dieán ra nhanh hôn, ñoàng thôøi haøm löôïng collagen hydrolysate söû duïng cuõng thaáp hôn. Baûng 3.3 Löôïng collagen hydrolsate söû duïng trong quaù trình loïc trong caùc saûn phaåm ñoà uoáng Saûn phaåm Löôïng söû duïng Ñoái vôùi caùc saûn phaåm röôïu Röôïu traéng Röôïu nho hoàng Röôïu ñoû 27g/hl 38g/hl 1215g/hl Ñoái vôùi caùc saûn phaåm nöôùc taùo eùp Saûn phaåm laøm töø taùo ñaéng Saûn phaåm laøm töø taùo ngoït Saûn phaåm laøm töø taùo chaùt Saûn phaåm laøm töø taùo chua 70 ÷ 120 g/hl 50 ÷ 100 g/hl 30 ÷ 80 g/hl 20 ÷ 60 g/hl Saûn phaåm bia Khoaûng 450g cho 150l bia ÖÙng duïng collagen trong coâng nghieäp cheá bieán thòt Collagen hydrolysate ñaõ ñöôïc söû duïng töø nhieàu thaäp nieân ñeå saûn xuaát ra caùc moùn thòt ñoâng, laøm voû bao caùc saûn phaåm xuùc xích. Vaøo thôøi ñieåm naøy collagen hydrolysate coøn ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå tieâm vaøo thòt nhaèm muïc ñích taêng haøm löôïng protein trong saûn phaåm. Vì khaû naêng taïo lieân keát toát vôùi nöôùc, collagen hydrolysate coøn ñöôïc suû duïng ñeå taêng haøm löôïng aåm vaø haï giaù thaønh saûn phaåm. Moät soá saûn phaåm thòt coù söû duïng colagen hydrolysate Giaêm boâng : ñoái vôùi giaêm boâng co ù quaù trình hun khoùi, boät collagen hydrolysate haáp thu nöôùc trong thòt vaø trong quaù trình cheá bieán seõ taïo moät lôùp maøng giuùp haøn kín khoái thòt khi laøm nguoäi. Ñoái vôùi saûn phaåm giaêm boâng coù qua quaù trình naáu, collagen hydrolysate taïo gel vôùi dòch loûng taùch ra trong quaù trình cheá bieán, quaù trình naøy giuùp giöõ nöôùc beân trong vaø chung quanh saûn phaåm. Collagen hydrolysate cuõng giuùp laøm cöùng chaéc lôùp thaïch thu ñöôïc tröïc tieáp töø caùc moâ lieân keát nhaèm taïo veû beà ngoaøi haáp daãn vaø nhaùt caét ñeïp cho saûn phaåm. Beân caïnh ñoù, collagen hydrolysate ñöôïc theâm vaøo caùc saûn phaåm giaêm boâng nhaèm taêng haøm löôïng protein. Thòt hoäp : collagen hydrolysate taïo gel vôùi nöôùc thaát thoaùt trog quaù trình cheá bieán vaø tranh truøng. Collagen hydrolysate ñöôïc söû duïng trong saûn phaåm naøy laø loaïi collagen coù ñoä beàn gel cao ( 200 ÷ 250 Bloom) vôùi löôïng 0,5 ÷ 2%. Hình 3.4 Saûn phaåm thòt nguoäi coù chöùa collagen hydrolysate Ñoái vôùi caùc saûn phaåm thòt coù haøm löông nöôùc vaø haøm löôïng chaát beùo raát deã xaûy ra hieän töôïng taùch nöôùc, taùch beùo aûnh höôûng ñeán caáu truùc cuûa saûn phaåm. Collagen hydrolysate giuùp lieân keát nöôùc, laøm beàn heä nhuõ töông, taïo caáu truùc ñoàng nhaát. Löôïng collagen söû duïng phuï thuoäc vaøo söï coù maët cuûa caùc taùc nhaân lieân keát khaùc. Baûng 3.4 ÖÙng duïng cuûa collagen hydrolysate trong coâng ngheä cheá bieán thòt Saûn phaåm Chöùc naêng Ñoä Bloom Ñoä nhôùt Haøm löôïng Giaêm boâng Taïo lieân keát 200 ÷ 250 Trung bình 1 ÷ 2% Thòt ñoâng Taïo gel, taïo caáu truùc 150 ÷ 280 Trung bình - cao 3,5 ÷ 8% Thòt hoäp Taïo caáu truùc 250 ÷ 280 Trung bình - cao 1,5 ÷ 3% Thòt boø muoái Taïo lieân keát 250 ÷ 280 Trung bình - cao 1,5 ÷ 3% Pate Taùc nhaân laøm oån ñònh 180 ÷ 250 Trung bình - cao 1,5 ÷ 3% Thòt ñaõ naáu chín ñoâng laïnh Taïo lieân keát vôùi thòt 200 ÷ 240 Trung bình - cao 0,5 ÷ 3% 3.2 ÖÙNG DUÏNG TRONG Y HOÏC VAØ DÖÔÏC PHAÅM Collagen laø moät vaät lieäu coù khaû naêng phaân huûy sinh hoïc, taùc duïng cuûa collagen döïa treân söï keát hôïp khaû naêng taïo maøng vaø taïo gel moät caùch töï nhieân. Collagen ñöôïc söû duïng lónh vöïc y döôïc coù muøi vaø vò trung hoøa, khoâng gaây dò öùng vaø ñöôïc haáp thuï hoaøn toaøn trong cô theå con ngöôøi, coù tính töông thích sinh hoïc cuõng nhö khaû naêng caàm maùu neân coù theå ñöôïc cheá taïo thaønh nhöõng daïng khaùc nhau, laø moät loaïi vaät lieäu sinh hoïc lyù töôûng cho vieäc saûn