Đề tài công nghệ lên men: Sản xuất Dextran

Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 9 I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ DEXTRAN: 1. ðịnh nghĩa: Dextran là polymer sinh học, là phức hệ gồm các nhánh glucan (là polysaccharide của các D-glucose được nối với nhau bằng liên kết glucoside). Chuỗi dextran cĩ độ dài khác nhau từ 10 – 100 kDa và cấu trúc nhánh khác nhau tùy thuộc vào các vi sinh vật và điều kiện nuơi cấy. Dextran chỉ được tổng hợp từ đường sucrose và bằng vi khuẩn acid lactic, điển hình là Leuconostoc mesenteroides B-512F và Streptococus mutans, khơng tổng hợp được từ các đường khác, nếu cĩ thì nĩ chỉ là nguồn carbon cho vi sinh vật. Dextran cĩ tính nhớt nội tại, dễ tan trong nước, methylsulfide…và là dung dịch điện li bền, pH khơng ảnh hưởng độ tan của dextran. 2. Cấu tạo của Dextran: Chuỗi mạch thẳng (mạch chính) gồm các phân tử glucose liên kết nhau bằng α-1,6 glucoside, trong khi nhánh bắt đầu từ các liên kết α-1,3 glucoside (trong một vài trường hợp cũng cĩ liên kết α-1,2 hay α-1,4). Hình 1: Cấu trúc của dextran Cấu trúc chủ yếu của Dextran B-512F là một chuỗi các phân tử glucose liên kết bằng α-1,6 và cĩ nhánh là phân tử glucose đơn mà liên kết với chuỗi Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 10 trên bằng α-1,3. Cĩ thể hiểu chuỗi polymer này như chiếc lược: mỗi nhánh glucose α-1,3 đơn như răng lược, trong khi chuỗi α-1,6 giống như xương sống của lược. 3. Cơ chế hình thành dextran: Các vi sinh vật chuyển cơ chất thơng qua chuyển hĩa nội bào thành các hợp chất trung gian rồi thành polymer, đĩ là với polysaccharide bình thường. Cịn với dextran thì khác, cơ chất nhờ vi sinh vật chuyển thành sản phẩm, bên ngồi tế bào vi sinh vật, khơng thơng qua chất trung gian nội bào. Với sucrose, nhờ hệ enzyme dextransucrase loại bỏ fructose, chuyển glucose lên phân tử chất nhận đã được liên kết với enzyme (1,6- α -D-glucosyl)n + sucrose
(1,6- α -D-glucosyl)n+1 + fructose Hình 2: Cơ chế hoạt động của enzym dextransucrase Enzyme tạo ra fructose và glucose từ sucrose, fructose được loại bỏ cịn glucose thì được kết hợp tạo phức. C6-OH của phân tử chất nhận nối với C1 của phân tử glucose, kết quả hai gốc glucose liên kết nhau bằng α-1,6 glucoside. ðộ dài chuỗi phụ thuộc vào phân tử chất nhận, sẽ kết thúc khi phân tử chất nhận giải phĩng chuỗi polymer khỏi enzyme. Trong quá trình tổng hợp dextran, các gốc glucosyl cịn sĩt chuyển thành gốc tự do cĩ vai trị như chất nhận ảnh hưởng tới phản ứng tổng hợp này. Chúng tác dụng với enzyme – glucosyl hay enzyme – dextranosyl để tách enzyme ra khỏi glucose hay dextran đồng thời tạo liên kết Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 11 với glucose hay dextran này tại vị trí enzyme được giải phĩng. Khi chất nhận là dextran cao phân tử, C3 của chất nhận sẽ kết hợp với C1 của phức glucosyl – enzyme hay dextranosyl – enzyme để giải phĩng glucose hay dextran. Kết quả hình thành mạch nhánh liên kết α-1,3 glucoside giữa dextran chất nhận với dextran hay glucose vừa giải phĩng enzyme. Cũng cĩ trường hợp liên kết này là liên kết α-1,2 glucoside nhưng rất ít gặp. 4. Ứng dụng của dextran: Dextran được sử dụng như chất khởi động hay chất trung gian trong các quá trình khác nhau như trong thực phẩm, cơng nghệ nhiếp ảnh, cơng nghệ sản xuất hĩa chất: – Trong cơng nghệ: người ta tổng hợp dextran gọi là Sephadex được dùng để phân riêng, sắc ký lọc gel, tinh sạch protein. – Trong thực phẩm: dextran được sản xuất nhờ Lactobacillus brevis để tạo các tinh thể tibicos hay đồ uống lên men như Kefir (sản phẩm lên men từ sữa) được cho là cĩ lợi cho sức khỏe. Dextran cịn được sử dụng để ngăn chặn quá trình kết tinh đường, cải thiện khả năng hút ẩm, duy trì hương và hình dạng của thực phẩm. Ngồi ra dextran cịn làm chất đồng hĩa, chất ổn định, chất tạo màng trong bảo quản và chế biến thực phẩm. – Trong nhiếp ảnh: cải thiện chất lượng lớp tráng bạc. – ðặc biệt dextran được ứng dụng nhiều trong y học:  ðược sử dụng như chất chống vĩn cục trong sự lưu thơng máu và giảm độ nhớt trong máu giúp máu lưu thơng dễ dàng, tránh nghẽn mạch máu (Dextran 40).  Dextran cĩ độ dài và hình dáng giống albumin, người ta thủy phân khơng hồn tồn dextran nhằm thay thế protein của huyết tương (Dextran 70).  Dextran được sử dụng như là chất làm tăng thể tích huyết tương.  Dextran sulfate dùng để chống vi sinh vật.  Dextran sắt được sử dụng chữa trị thiếu sắt ở người.  DEAE – dextran dùng để giảm cholesterol và triglyceride.  Dextran được dùng như chất bơi trơn khi cĩ vật lạ rơi vào mắt. Thay thế máu trong trường hợp khẩn cấp khi khơng cĩ sẵn máu. Tăng mức đường trong máu Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 12 II. NGUYÊN LIỆU: 1. ðường tinh luyện: a. Khái quát chung về đường tinh luyện: Ngày nay, quá trình sản xuất đường tinh luyện gồm 2 quá trình chính:  Sản xuất đường thơ từ cây mía (hoặc củ cải đường).  Quá trình tinh luyện đường thơ. b. Sơ lược quy trình sản xuất đường tinh luyện:. Trong quá trình sản xuất đường thơ, thân cây mía được chặt thành những phần nhỏ sau đĩ mía được ép thành nước. Phần xác cịn lại được loại bỏ. Nước mía sau đĩ được lọc, một phần bởi lắng, một phần bằng cách gia nhiệt và thêm vơi vào. Kết quả là tạo những khối xốp lắng xuống đáy rồi được loại bỏ để tăng độ trong. Trong nhiều nhà máy sản xuất đường , SO2 được thổi vào dịch ép để tẩy trắng giúp đường cĩ màu sáng hơn. Dịch lọc sau đĩ sẽ đi qua một hệ thống làm bốc hơi để loại bỏ nước (chiếm 85% trong dịch ép mía). Từ đĩ tạo nên một dung dịch đường đậm đặc gọi là syrup. Syrup này sẽ được tiếp tục kết tinh để tạo các tinh thể đường và để phân loại các thành phần khơng tinh khiết. Cuối cùng, quá trình ly tâm đường sẽ tách đường thơ từ syrup. Lúc này syrup được gọi là mật rỉ đường. Mật rỉ đường thường được xử lý ít nhất 1 lần để thu hồi càng nhiều đường càng tốt từ syrup. Trong quá trình tinh luyện, đường thơ sẽ được làm sạch và được nấu chảy. Dịch nấu chảy này tiếp tục được lọc để loại bỏ cặn và các chất khơ đặc biệt khác. Thơng thường, trong quá trình lọc, cần bổ sung thêm những chất khác chẳng hạn vơi để giúp đơng tụ những phần cặn đục và hình thành kết tủa như trong quá trình sản xuất đường thơ. Sau đĩ, dịch lỏng này sẽ được lọc để loại bỏ kết tủa. Tiếp theo là bước tẩy màu bằng cách sử dụng các chất hấp phụ carbon như than xương hoặc carbon hoạt hĩa. ða số các trường hợp, SO2 được sử dụng để tẩy và cải thiện màu sắc của đường tinh luyện. Nhiều khi, người ta sử dụng sự trao đổi ion để tẩy màu. Tại thời điểm này, dịch lỏng nĩi trên khơng cịn cặn đục nữa. Dịch lỏng sẽ được cho qua thiết bị bốc hơi để loại nước, phần sản phẩm cịn lại sẽ cho qua thiết bị sấy chân khơng để bốc hơi triệt để và tạo tinh thể đường. Cuối cùng, sản phẩm này sẽ được đưa qua thiết bị li tâm để tách các tinh thể đường màu trắng ra khỏi dịch lỏng (syrup). Sản phẩm đường tinh luyện này cĩ độ tinh khiết từ 99.4 – 99.99%. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 13 Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của đường tinh luyện và đường thơ Tiêu chí ðường tinh luyện ðường thơ Năng lượng cho 100g (kcal) 390 380 Carbohydrate (g) 99.98 97.33 ðường (g) 99.98 96.21 Dietary fiber (g) 0 0 Béo (g) 0 0 ðạm (g) 0 0 Nước (g) 0.03 1.77 Vit. B1 (mg) 0 0.008 Vit. B2 (mg) 0.019 0.007 Vit. B3 (mg) 0 0.082 Vit. B6 (mg) 0 0.026 Vit. B9 (µg) 0 1 Ca (mg) 1 85 Fe (mg) 0.01 1.91 Mg (mg) 0 29 P (mg) 0 22 K (mg) 2 346 Na (mg) 0 39 Zn (mg) 0 0.18 (Nguồn: USDA Nutrient Database ) Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 14 Hình 3: Cấu tạo saccharose Hình 4: Sản phẩm đường tinh luyện 2. Vi sinh vật: a. Các vi sinh vật cĩ khả năng lên men tạo dextran : Dextran được sản xuất bởi hàng loạt vi khuẩn khác nhau như Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc citrovorus, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sanfrancisco, Streptobacterium dextranicum, Streptococcus mutans (vi khuẩn gây sâu răng ở người)… Sản phẩm dextran tạo thành cĩ thể khác nhau tùy thuộc vào chủng vi sinh vật dùng để lên men và điều kiện nuơi cấy khác nhau. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 15 Một số vi khuẩn chẳng hạn Leuconostoc mesenteroides cĩ khả năng tiết ra enzyme ngoại bào là dextransucrase (α-1,6-glucan: D-fructose 2- glucosyltransferase hay cĩ tên gọi khác là sucrose 6-glucosyltransferase, SGE, CEP, sucrose-1,6-alpha-glucan glucosyltransferase) xúc tác cho phản ứng chuyển nhĩm glucosyl cịn lại từ phân tử sucrose ngoại bào tạo thành dextran, giải phĩng fructose đồng thời tổng hợp glucooligosaccharide khi cĩ mặt sucrose và một chất nhận (ví dụ: maltose). Một số vi khuẩn khác như Acetobacter capsulatum hay Acetobacter viscocum sinh trưởng trên cơ chất như carbonhydrate, alcohol đa chức hoặc một nguồn carbon tương tự sẽ tạo ra ba loại enzyme, đĩ là dextrandextrinase giúp chuyển dextrin thành dextran, amylase thủy phân polymer thành glucose, glucose oxidase hoặc glucose dehydrogenase để chuyển glucose thành acid gluconic. Trong cơng nghiệp, người ta sử dụng L. mesenteroides là vi khuẩn chủ yếu để lên men sản xuất dextran chứa khoảng 95% liên kết α-1,6 glucoside (phần cịn lại là α-1,3) và cĩ trọng lượng phân tử là 4 – 5.107 Da. b. Leuconostoc mesenteroides: Giới Bacteria Ngành Firmicutes Lớp Bacilli Bộ Lactobacillales Họ Leuconostocaceae Giống Leuconostoc Lồi L. mesenteroides Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 16 Hình 5: Vi khuẩn L.mesenteroides Leuconostoc là một vi khuẩn biểu sinh, phân bố rộng rãi trong mơi trường tự nhiên và đĩng vai trị quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm và lên men cơng nghiệp. Leuconostoc mesenteroides là vi khuẩn kỵ khí khơng bắt buộc địi hỏi một phức hệ các yếu tố sinh trưởng và aminoacid. Dưới điều kiện vi hiếu khí, quá trình lên men lactic dị hình được thực hiện. Glucose và các loại đường hexose khác được chuyển thành hỗn hợp đẳng mol bao gồm D-lactate, ethanol và CO2 thơng qua con đường kết hợp hexose monophosphate và pentose phosphate. Những con đường trao đổi chất khác bao gồm quá trình chuyển hĩa của citrate thành diacetyl, acetoin và sự tạo thành dextran và levan từ sucrose. Sinh trưởng ở khoảng nhiệt độ 5 – 30oC, nhiệt độ tối ưu là 25 – 30oC. Hầu hết các giống nằm trong canh trường lỏng cĩ dạng hình cầu, đơn lẻ hoặc tạo thành một cặp hay một chuỗi ngắn. Tuy nhiên, hình thái của chúng cũng cĩ thể thay đổi theo điều kiện sinh trưởng; tế bào sinh trưởng trên glucose hay trên mơi trường rắn cĩ thể kéo dài ra hay ở dạng hình que. Là vi khuẩn G(+), khơng sinh bào tử và khơng di chuyển, cĩ khả năng tạo ra acid lactic nên chịu được pH thấp. Khơng cĩ enzyme catalase và khơng thủy phân được arginine, cĩ khả năng kháng vancomycin (kháng sinh từ Streptomyces). Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 17 Cĩ khả năng chịu được nồng độ đường và muối cao. Mặt khác cĩ thể sinh trưởng nhanh chĩng trên thực vật ở một khoảng nhiệt độ và nồng độ muối rộng hơn các vi khuẩn lactic khác. Vi khuẩn L.mesenteroides cĩ bao nhầy dày chứa hợp chất polymer là dextran. ðây là vi khuẩn được tìm thấy phổ biến trên cây mía. Chúng lên men mật rỉ từ cây mía tạo ra chất dày (dextran) trong suốt quá trình phân hủy cây mía. Vi khuẩn này thường gặp ở các nhà máy đường và gây tổn thất đường trong các bể chứa nước ép mía. Chúng cịn được tìm thấy trong đất, nước, rau quả và thường sống trong mơi trường giàu chất dinh dưỡng như sữa, thịt, nước uống lên men... Chúng là nhĩm vi khuẩn cĩ lợi vì dùng để làm nhiều thực phẩm lên men như yogurt, buttermilk, cheese, nước tương và dưa chua... Bảng 2: Một số đặc tính của Leuconostoc mesenteroides STT Một số đặc tính Kết quả 1 Gram Gram dương 2 Chuyển động Khơng 3 Bao nhầy Cĩ. Bao nhầy chứa dextran. 4 Sinh bào tử Khơng 5 Sinh trưởng ở 37oC + 6 Sinh trưởng ở 30oC + 7 Sinh trưởng ở 4oC + Tính chất hĩa sinh 8 Indole - 9 Methyl red + 10 Voges Proskauer + 11 Citrate - 12 Urease - 13 Arginine - Khả năng lên men đường 14 Glucose + (acid và khí) Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 18 15 Arabinose + 16 Lactose + 17 Mannitol + 18 Sucrose + 19 Dextrose + 20 Maltose + c. Tiêu chí chọn giống Leuconostoc mesenteroides:  Khả năng sinh độc tố: khơng cĩ.  Khả sinh tổng hợp dextran: càng mạnh càng tốt.  Khả năng thích nghi của giống phải cao, tốc độ sinh trưởng mạnh.  ðiều kiện nuơi cấy: đơn giản, là mơi trường đặc trưng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn và tổng hợp dextran. Mơi trường dễ kiếm, giá thành khơng quá cao.  Sự ổn định của giống theo thời gian: càng lâu càng tốt. III. QUY TRÌNH SẢN XUẤT DEXTRAN: A. Sơ đồ khối: Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 19 Chuẩn bị mơi trường Giống Leuconostoc mesenteroides Lọc lần 1 Rửa lần 1 Hịa tan lần 1 Tạp chất Thanh trùng Lên men Kết tủa lần 1 Ly tâm lần 1 Lọc lần 2 Rửa lần 2 Hịa tan lần 2 Kết tủa lần 2 Ly tâm lần 2 Sấy phun Dextran Mầm dextran Ethanol lạnh Nhân giống Rửa Ethanol lạnh Tạp chất ðường tinh luyện Nước vơ trùng Nước vơ trùng Nước và các thành phần dinh dưỡng khác Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 20 B. Thuyết minh quy trình cơng nghệ: 1. Chuẩn bị mơi trường lên men: a. Hịa tan đường: Hịa tan đường tinh luyện vào nước cất sao cho dung dịch cĩ nồng độ 15% ( 15g/100ml). b. Bổ sung thêm các thành phần dinh dưỡng khác: Thành phần Hàm lượng (g/100ml) Chất chiết men Bacto-peptone K2HPO4 NaCl CaCl2 FeSO4 MnCl2.H2O MgSO4.7H2O 0.5 0.5 1.5 0.001 0.005 0.001 0.001 0.02 Bổ sung thêm các vitamin như: B1, B3, B5… ðối với mơi trường sucrose thì khơng cần bổ sung thêm biotin. ðối với L.dextranicum 8086 và L.mesenteroides 683 thì nhu cầu về acid folic là ưu tiên nhất, tiếp theo là B2. c. Chỉnh pH: pH được điều chỉnh về 7 trước khi thanh trùng. 2. Thanh trùng mơi trường lên men: Mục đích: chuẩn bị mơi trường để cấy giống và lên men. Những biến đổi:  Vật lý: nhiệt độ tăng, độ nhớt giảm.  Hĩa học: chất dinh dưỡng tổn thất, biến đổi khơng đáng kể do điều kiện thanh trùng khơng quá khắc nghiệt.  Hĩa lý: độ hịa tan tăng, cĩ sự bốc hơi nước.  Sinh học: tiêu diệt hầu hết các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 21 Thiết bị: thiết bị thanh trùng bản mỏng. Hình 6: Thiết bị truyền nhiệt bản mỏng Bộ phận chính của thiết bị là những tấm bản hình chữ nhật với độ dày rất mỏng và được làm bằng thép khơng rỉ. Mỗi tấm bản sẽ cĩ 4 lỗ tại 4 gĩc và hệ thống các đường rãnh trên khắp bề mặt để tạo sự chảy rối và tăng hệ số truyền nhiệt. Khi ép các tấm bản mỏng lại với nhau, trên bộ khung của thiết bị sẽ hình thành hệ thống vào và ra cho mẫu khảo sát và chất tải nhiệt. Tùy thuộc vào điều kiện cụ thể, các nhà sản xuất sẽ bố trí đường dẫn thích hợp. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 22 Hình 7: Ví dụ về sơ đồ dịng chảy của mơi trường và chất tải nhiệt trong thiết bị truyền nhiệt bản mỏng ( 42/24 ×× ) Dung dịch mơi trường sẽ lần lượt đi qua 2 vùng, mỗi vùng gồm 4 khoang được ký hiệu là 24× . chất tải nhiệt sẽ lần lượt đi qua 4 vùng, mỗi vùng gồm 2 khoang được ký hiệu là 42× . 3. Nhân giống: Mục đích: chuẩn bị lượng giống cần thiết cho lên men. Phương pháp thực hiện: a. Phân lập: Trong bài báo cáo này, chúng tơi chọn giống Leuconostoc mesenteroides CMG 713 vì nĩ lên men sản xuất dextran cĩ tính đặc trưng cao (Bảng 16) và hoạt tính enzyme dextransucrase cũng cao. Canh trường vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides CMG 713 được phân lập từ Vitis vinifera L.(từ nho) đã được làm giàu. Mơi trường cĩ chứa: Mơi trường Chất tải nhiệt Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 23 Thành phần Hàm lượng (g/l) Sucrose Chất chiết men Tryptone K2HPO4 50 1 10 2.5 pH được điều chỉnh về 7 sau đĩ hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp cho thêm natriazide 0.005% đã được vơ trùng vào mơi trường. Mẫu được ủ trong mơi trường trên trong 24h, 25oC và sau đĩ được cấy ria trên hộp petri chứa mơi trường trên cĩ bổ sung thêm agar để phân lập thành canh trường thuần khiết. Khuẩn lạc cĩ độ nhớt cao phát triển trên sucrose agar sẽ được chọn. b. Giữ giống: Mơi trường bảo quản Leuconostoc mesenteroides CMG 713: Thành phần Hàm lượng (g/l) Peptone Chất chiết men Nước ép cà chua lọc Agar 10 10 200ml 15 pH được điều chỉnh về 7 trước khi tiệt trùng. Giống được bảo quản ở 4oC trên mơi trường agar MRS nghiêng cho đến khi cần cấy giống vào mơi trường lên men c. Nhân giống: 10ml chứa mơi trường sucrose được tiệt trùng và canh trường vi sinh vật được ủ ở 26oC trong 24h. Sau 24h, canh trường sẽ được chuyển vào 90ml mơi trường đã tiệt trùng tương tự và tiếp tục ủ ở 26oC trong 18h. 100ml giống này sẽ được chuyển tiếp đến 900ml mơi trường và được ủ tiếp. Các cấp nhân giống được thực hiện cho đến khi cĩ đủ số lượng giống cần thiết cho quá trình lên men. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 24 4. Rửa giống: Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men. Giống vi khuẩn qua nhân giống thu được sinh khối để lên men khơng được chứa vết của các dextran cĩ trọng lượng phân tử cao. Nguyên nhân là các dextran cĩ trọng lượng phân tử cao xuất hiện trong mơi trường lên men sẽ tạo mầm cho quá trình tổng hợp dextran cao phân tử, ảnh hưởng tới sự điều khiển quá trình lên men tạo dextran cĩ trọng lượng phân tử thấp, đồng nhất và theo mục đích sử dụng của nhà sản xuất. Do đĩ cần rửa sạch dextran đã tạo thành trong quá trình nhân giống. Những biến đổi:  Hĩa học: loại bỏ dextran trong mơi trường nuơi cấy.  Hĩa lý: độ nhớt giảm. Phương pháp thực hiện: cĩ thể dùng dịch nước muối rửa để làm sạch dextran bám vào tế bào. 5. Lên men: Mục đích: khai thác, biến đổi sucrose thành dextran. Những biến đổi:  Vật lý: nhiệt độ của bình lên men tăng lên do cĩ sự tỏa nhiệt.  Hĩa lý: mơi trường lên men thay đổi độ nhớt, tạo hợp chất keo.  Hĩa học: hàm lượng cơ chất và các thành phần dinh dưỡng giảm xuống, hàm lượng lactic acid tăng lên.  Hĩa sinh: enzyme xúc tác cho các phản ứng trao đổi chất trong tế bào vi khuẩn diễn ra mạnh.  Sinh học: sinh khối tế bào tăng lên. Phương pháp thực hiện:  Nạp mơi trường: Bơm mơi trường từ thiết bị làm lạnh vào bồn lên men và châm canh trường nuơi cấy vào. Khí qua bộ lọc vào hệ thống dẫn khí và vào bồn lên men qua mâm sục khí. Sau đĩ, điều khiển hệ thống cánh khuấy trộn đều khí vào canh trường nuơi cấy, khí thốt ra qua hệ thống ngưng tụ, tiếp tục qua hệ thống lọc để trả lại khơng khí sạch cho mơi trường. Trong quá trình bơm mơi trường vào bồn lên men ta kết hợp nạp một lượng khơng khí vào mơi trường lên men với tốc độ thơng khí là 0.5 lít/phút để cung cấp nguồn khí oxy ban đầu cho vi khuẩn sinh trưởng. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 25 Nhiệt độ của bồn lên men được giữ ở 30oC. pH 7 được giữ khơng đổi trong suốt quá trình lên men nhờ sử dụng hệ đệm phosphate.  Cấy giống: Giống L.mesenteroides CMG 713 với nồng độ là 5% (v/v) được cấy vào thiết bị lên men đã bổ sung mơi trường từ trước.  Bổ sung mầm dextran: Trong quá trình lên men, ta bổ sung “mầm” dextran là những mạch dextran cĩ phân tử lượng thấp, đã biết rõ phân tử lượng để tạo ra các sản phẩm cĩ phân tử lượng mong muốn. Nếu các dextran trọng lượng phân tử thấp được đưa vào làm mồi thì enzyme sẽ cĩ nhiều điểm khởi đầu và các polymer tương đối đồng nhất sẽ được tạo thành. Thiết bị: Bồn lên men. Hình 8: Cấu tạo bồn lên men Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 26 a. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose: Nồng độ cơ chất sucrose cĩ vai trị rất quan trọng trong sản xuất dextran. Quá trình hình thành enzyme dextransucrase chỉ được thực hiện khi cĩ mặt sucrose trong mơi trường. Nồng độ sucrose cao dẫn đến dextran tạo thành sẽ nhiều hơn. Nhưng canh trường cĩ chứa quá nhiều dextran sẽ làm cho việc tách tế bào vi khuẩn gặp khĩ khăn. Ảnh hưởng của những nồng độ cơ chất sucrose khác nhau được quan sát ở 5 – 25%. Cĩ thể thấy rõ được điều này qua Hình 9. Hình 9: Ảnh hưởng của sucrose đến sự sản xuất dextran của L.mesenteroides CMG 713 ðể đạt được lượng dextran tối đa, cần thiết phải xác định được nồng độ sucrose tối ưu để cho vào mơi trường lên men. Lượng dextran tối đa cĩ thể đạt được ở CMG 713 khi nồng độ sucrose là 20%. Tuy nhiên, cũng cĩ sự giảm xuống về hiệu suất chuyển hĩa sucrose thành dextran. ðiều này sẽ ảnh hưởng đến sản lượng dextran được tạo ra. Cĩ thể vì nồng độ sucrose quá cao khiến nĩ Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 27 trở thành tác nhân ức chế ở mức cơ chất, do đĩ sẽ làm giảm hiệu suất sản xuất dextran. Một số nghiên cứu trên chủng đột biến L.mesenteroides FMCM cho thấy việc tăng nồng độ cơ chất (0.5 – 5%) thúc đẩy sự tăng sản lượng enzyme. Ở những nồng độ sucrose cao, một lượng lớn hơn của dextran cao phân tử được hình thành. Nếu trong mơi trường cĩ chứa đường maltose thì oligosaccharide trung gian sẽ được hình thành, dẫn đến việc làm giảm sản lượng dextran. Bên cạnh sucrose, dịch chiết từ vỏ hạt cây carob (loại hạt dùng để thay thế hạt cacao), cheese whey, mật đường, dịch chiết từ cám của lúa mì cũng được sử dụng như một nguồn carbon chính trong quá trình lên men sản xuất dextran. Cĩ thể so sánh với L.mesenteroides PCSIR-4, L.mesenteroides PCSIR-9, L.mesenteroides NRRL B-512F về ảnh hưởng của thời gian đến sự sản xuất dextran thơng qua bảng sau: Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose lên sự tạo thành dextran ở các chủng L.mesenteroides PCSIR 4, L.mesenteroides PCSIR 9, L.mesenteroides NRRL B-512F PCSIR-4 PCSIR-9 NRRL B-512F Sucrose (g/100ml) Dextran (g) Hiệu suất chuyển hĩa Dextran (g) Hiệu suất chuyển hĩa Dextran (g) Hiệu suất chuyển hĩa 5 10 20 30 40 50 1.79 4.78 7.01 9.04 8.09 5.32 35.8 47.8 35.05 30.13 20.23 10.63 1.57 3.79 5.87 5.74 5.57 3.65 31.4 37.9 29.35 19.13 11.43 7.3 1.7 4.08 5.46 5.45 4.46 3.12 34 40.8 27.3 18.17 11.15 6.24 Nhận thấy: lượng dextran tối đa tạo ra ở 3 chủng trên cĩ được khi nồng độ sucrose trong mơi trường nuơi cấy cũng là 20%. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Sự sản xuất dextran được xem xét ở nhiều nhiệt độ khác nhau từ 20 – 45oC và lượng dextran tối đa được tạo ra bởi CMG 713 cĩ được khi nhiệt độ của mơi trường lên men là 30oC. Khi nhiệt độ cao hơn thì lượng dextran tạo thành bị Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 28 giảm xuống. Nhiệt độ ảnh hưởng đến sản lượng, tỷ lệ hình thành cũng như khối lượng phân tử dextran. Khi nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ cực đại thì dextran tạo thành sẽ cĩ phân tử lượng thấp. Sản lượng của dextran giảm xuống rõ rệt ở nhiệt độ cao hơn (35oC) khi so sánh với quá trình sản xuất dextran ở 23oC. ðĩ là vì sự khơng bền vững của enzyme trong quá trình lên men. Nhiệt độ lên men quá cao sẽ cĩ ảnh hưởng khơng tốt đến sự gia tăng số lượng tế bào và dẫn đến lượng enzyme bị giảm xuống khi so sánh với nhiệt độ tối ưu là 30oC. Hình 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sản xuất dextran ở L.mesenteroides CMG 713 Ảnh hưởng của pH Quá trình lên men sản xuất dextran của CMG 713 được quan sát tại pH 6 – 8. Ảnh hưởng của pH đến quá trình này được chỉ rõ trên Hình 11. Khi pH ban đầu của mơi trường được giữ ở 7 trước khi tiệt trùng thì lượng dextran tối đa sẽ đạt được. Ở những pH khác so với pH tối ưu (pH = 7), lượng dextran tạo thành bị giảm đi một nửa. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 29 Hình 11: Ảnh hưởng của pH lên sự sản xuất dextran bởi L.mesenteroides CMG713 ðối với L.mesenteroides NRRL B-512F: pH 6.7 được điều chỉnh là pH tối ưu cho sự lên men khi muốn cực đại hĩa sự sinh trưởng của tế bào. Ở pH 6.7 sự phát triển của giống là tốt nhất, nhưng ở pH 5.5 hoạt tính enzyme cao hơn rất nhiều, ngay cả khi khối lượng chất khơ của tế bào rất thấp (Hình 12a và 12b). Thời gian lên men tại pH 5.5 là 3h, ít hơn ở pH 6.7. Kết quả của quá trình lên men chuẩn (khơng cĩ điều khiển pH) được thể hiện trong Bảng 4. Ở pH = 4 khơng cĩ sự phát triển của tế bào. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 30 Hình 12: Ảnh hưởng của pH lên (a) sự tiêu thụ sucrose và sinh trưởng tế bào (b) điều kiện sản xuất enzyme; T=25oC, nồng độ sucrose đầu = 20g/l. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 31 Bảng 4: Ảnh hưởng của pH lên sự lên men tĩnh sucrose bằng L.mesenteroides. Nồng độ sucrose ban đầu là 20g/l, T=25oC pH Nồng độ dextran (g/dm3) Nồng độ fructose (g/dm3) Hoạt tính ezyme (DSU/cm3) Nồng độ tế bào (g/dm3) Thời gian lên men (h) Khơng điều khiển 6.46 8.09 67.0 5.46 11.5 6.7 6.71 7.01 57.0 7.76 11 5.5 7.74 8.1 85.0 5.11 8.0 5.0 8.51 8.54 51.1 5.11 10 4.0 - - - 0 - Ảnh hưởng của peptone: Ảnh hưởng của peptone lên sự tạo thành dextransucrase được xem xét ở nồng độ 0.1 – 0.5%. Khi thêm chỉ 0.1% peptone vào mơi trường, hoạt tính của enzyme tăng lên 17% (Hình 13). Nếu tiếp tục tăng nồng độ của peptone lên quá 0.5% thì khơng thích hợp cho sự sản xuất enzyme, mặt khác cịn giảm xuống. ðiều này cĩ thể do sự cĩ mặt của một số nguyên tố vết nào đĩ trong peptone. Hình 13: Ảnh hưởng của nồng độ peptone lên hoạt tính của enzyme. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 32 Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy: ðối với L.mesenteroides CMG 713: Dextran cao phân tử được sản xuất bởi L.mesenteroides CMG713. Hoạt tính của enzyme và sự tạo thành dextran là một hàm theo thời gian. Sự sản xuất dextran và hoạt tính enzyme tạo ra bởi CMG 713 được tham khảo ở Bảng 5. Hoạt tính enzyme tối đa được quan sát ở 20h nuơi cấy và cĩ giá trị là 40DSU/ml/h (Hình 14). Sinh khối (ướt) ban đầu tăng từ 0.21 – 2.4g/dl trong 20h và sau đĩ đi vào pha suy vong. Hoạt tính enzyme cĩ liên quan chặt chẽ đến sự sinh trưởng của CMG 713. Sự sản xuất dextran và hoạt tính của enzyme tăng lên theo thời gian và sau khi đạt đến đỉnh cực đại là 20h thì sự tạo thành dextran sẽ giảm đi và hoạt tính enzyme giảm đi đáng kể (Hình 14). pH để lên men canh trường cũng bị giảm xuống từ pH khởi điểm là 7.5 xuống pH cuối là 4.5 trong suốt quá trình lên men. Hình 14: Thời gian để sản xuất dextran và dextransucrase ở L.mesenteroides CMG 713 sử dụng 2% đường sucrose trong mơi trường (▲) Sự tạo thành dextransucrase cực đại được nhận thấy sau 20h nuơi cấy và giảm mạnh tại thời điểm t=24h. (●). Sự tạo thành dextran cực đại được nhận thấy sau 20h và sau đĩ giảm xuống sau 48h. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 33 Bảng 5: Sự sản xuất dextran và hoạt tính enzyme bởi L.mesenteroides CMG 713 Thời gian ủ (h) pH cuối Lượng sinh khối ướt (g/dl) Hoạt tính enzyme (DSU/ml/h) Sự tạo thành dextran (tinh sạch) (g%) 0 7.50 0.21 - - 2 7.15 0.29 - - 4 6.93 0.38 5.4 - 6 6.64 0.61 10.0 0.11 8 6.03 0.89 13.0 0.19 12 5.33 1.36 16.5 0.28 16 4.90 1.62 20.9 0.36 20 4.77 2.40 30.0 0.65 24 4.52 2.31 21.7 0.52 36 4.50 2.11 11.8 0.50 48 4.50 1.32 7.2 0.45 Thời gian sinh trưởng của tế bào, hoạt tính enzyme, pH và sự tạo thành dextran ở CMG 713 sử dụng 2% sucrose trong mơi trường lên men. ðối chiếu với sự ảnh hưởng của thời gian đến sự sản xuất dextran ở L.mesenteroides PCSIR 4, L.mesenteroides PCSIR 9, L.mesenteroides NRRL B- 512F, ta thấy lượng dextran tối đa được tạo thành ở: – L.mesenteroides PCSIR-4: 18 h – L.mesenteroides PCSIR-9: 18 h – L.mesenteroides NRRL B-512F: 18 h Vậy khoảng thời gian để lên men tạo ra lượng dextran tối đa ở vi khuẩn L. mesenteroides vào khoảng 18 – 20 h. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 34 Bảng 6: Thời gian tạo thành dextran ở L.mesenteroides PCSIR 4, L.mesenteroides PCSIR 9, L.mesenteroides NRRL B-512F Dextran Thời gian nuơi cấy (h) PCSIR-4 PCSIR-9 NRRL B-512F 2 4 6 8 12 18 24 48 72 1.27 1.30 2.16 3.72 4.12 4.78 4.49 4.48 4.31 1.37 1.58 2.94 3.23 3,68 3.79 3.02 3.02 3.00 1.26 1.54 2.61 2.71 3.00 4.08 4.00 3.69 3.35 Ảnh hưởng của sự thơng khí và hệ đệm (CaCO3): Sự thơng khí trong mơi trường khơng cĩ lợi đối với sự sản xuất dextran. Dữ liệu dựa trên sự thay đổi về pH và độ nhớt trong mơi trường nuơi cấy thơng khí và khơng cĩ chất đệm được trình bày trong Bảng 7 và đặc điểm của loại dextran F phân lập từ mơi trường này được trình bày trong Bảng 8. So sánh với kết quả từ mơi trường nuơi cấy khơng thơng khí: sự thơng khí làm giảm tỉ lệ hình thành, hàm lượng và độ nhớt của dextran nhưng mơi trường vẫn trải qua giai đoạn cĩ độ nhớt cao cực đại. Bảng 7 : Tác động của việc thơng khí tới pH và độ nhớt của mơi trường lên men Tiến hành Thời gian nuơi cấy (giờ) pH của mơi trường nuơi cấy ðộ nhớt tuyệt đối của mơi trường nuơi cấy (cP) Bắt đầu sục khí Dừng sục khí Dextran F 0 23.5 32 47.5 55 7.5 5.2 4.7 4.4 4.3 2 5 12 16 14 Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 35 Bảng 8 : Dữ liệu về các loại dextran thu đươc từ các mơi trường nghiên cứu Tính chất của dextran tinh sạch Dextr an ðộ nhớt tuyệt đối của mơi trường (cP) Hàm lượng (%) N (%) P (%) ðộ nhớt tương đối tại 25oC, nồng độ 0.5% trong nước 25][ Dα trong NaOH 1N (phân ly hồn tồn) Chỉ số kiềm tính A 446 25.3 0.017 0.005 2.253 +203 0.0 B 73 24.7 0.033 0.008 2.003 +201 0.0 C 5 22.2 0.022 0.011 1.414 +199 0.6 D 203 23.7 0.032 0.007 2.133 0.1 E 10 21.6 0.010 0.004 1.565 +200 0.3 F 14 <14.7 1.855 +200 G 847 24.0 0.000 <0.002 1.719 +202 0.0 ðộ nhớt tương đối trong dung dịch 0.1M Ca(CH3COO)2 của dextran A, C và G lần lượt là 2.235, 1.405 và 1.683. Trong dung dịch 1M Ca(CH3COO)2 độ nhớt tương đối của dextran A là 2.298. Khơng cĩ sự thuận lợi cho sự hình thành dextran khi sử dụng hệ đệm CaCO3. Mơi trường được đệm ở pH khoảng 6.4 – 7.0 đạt độ nhớt cực đại sau khoảng 48 – 56 h và sau đĩ giảm nhanh chĩng. Loại dextran G trong Bảng 8 được phân lập từ mơi trường này tại thời điểm độ nhớt cao cực đại. So sánh các kết quả với khi khơng sử dụng hệ đệm cho thấy hệ đệm cĩ tác dụng làm tăng độ nhớt của mơi trường đáng kể, khơng làm tăng sản lượng dextran thu được, làm giảm độ nhớt nhưng khơng làm giảm độ tinh khiết của dextran được tinh sạch. Mơi trường thơng khí và sử dụng hệ đệm CaCO3 khơng trải qua giai đoạn độ nhớt cực đại. ðộ nhớt mơi trường tăng chậm trong vịng 30 ngày. Trong những điều kiện đĩ, tốc độ lên men giảm so với khi lên men khơng thơng khí và cĩ hệ đệm. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 36 Ảnh hưởng của những hệ đệm khác nhau đến hoạt tính enzyme dextransucrase: Ảnh hưởng của các ion khác nhau trong dung dịch đệm lên hoạt tính enzyme được trình bày trong Hình 15. Hình 15: Ảnh hưởng của các hệ đệm khác nhau lên hoạt tính dextransucrase ngoại bào Các loại dung dịch đệm khác nhau ở cùng pH và nồng độ ion được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy rằng ảnh hưởng của các hệ đệm khác nhau cũng đĩng một vai trị quan trọng đối với hoạt tính enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại được tìm thấy khi sử dụng hệ đệm citrate phosphate 0.1M trong trường hợp dextransucrase được sản xuất từ L.mesenteroides PCSIR- 4. Khi sử dụng hệ đệm acetate, citrate và succinate thì enzyme cĩ hoạt tính tương đối thấp. Ảnh hưởng của MgSO4, MnSO4, NaCl và CaCl2 lên sự hình thành dextransucrase: Ảnh hưởng của MgSO4 lên detransucrase được nghiên cứu trong khoảng 0.02 – 0.05%. Sự tạo thành enzyme dextransucrase tăng lên cùng với sự tăng dần lượng MgSO4 cho vào từ 0.02 (4.8 U/ml) – 0.04% (5.3 U/ml) (Hình 16a). Những ion Mg++ đĩng một vai trị quan trọng trong chuyển nạp bằng việc tăng khả năng sản xuất enzyme và sự giải phĩng chúng vào mơi trường. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 37 MnSO4 cĩ khả năng làm giảm độc tính của oxi trong mơi trường lên men của L.mesenteroides. Ảnh hưởng của MnSO4 lên sự sản xuất dextransucrase được khảo sát trong khoảng nồng độ từ 0.001 – 0.005% và lượng enzyme sẽ tăng lên 13% khi nồng độ MnSO4 trong mơi trường là 0.005% (Hình 16b). Ảnh hưởng của các ion Na+ được nghiên cứu trong khoảng 0.001 – 0.005%. Khi nồng độ Na+ tăng từ 0.001% đến cao hơn 0.003% thì sự sản xuất enzyme tăng lên từ 4.8 U/ml lên 5.4 U/ml. Tuy nhiên sự tăng cao hơn nữa nồng độ Na+ sẽ làm giảm khả năng sản xuất enzyme. Sự tăng lên 12% trong sản xuất enzyme được nhận thấy ở 0.003% NaCl (Hình 16c). Ảnh hưởng của CaCl2 lên sự tạo thành dextransucrase được thể hiện ở Hình 16d. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 38 D Hình 16 : Ảnh hưởng của (A) MgSO4, (B) MnSO4, (C) NaCl và (D) CaCl2 lên sự hình thành dextransucrase. Nhu cầu và ảnh hưởng của vitamin: Cĩ thể thấy được ảnh hưởng của vitamin đến quá trình sản xuất dextran thơng qua các bảng sau: Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 39 Bảng 9: Nhu cầu vitamin của L.mesenteroides Bảng 10: Ảnh hưởng của sự thiếu vitamin lên sự sản xuất dextran từ mơi trường cĩ chứa glucose Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 40 Tất cả những dữ liệu trong 2 bảng trên đã loại trừ nhân tố kích thước của giống cấy và hoạt động trao đổi chất của sinh vật. Trong mơi trường glucose, fructose và sucrose thì thiamine, acid nicotinic, acid pantothenic cần thiết cho L. mesenteroides. Trong mơi trường glucose và fructose thì nếu thiếu biotin sẽ làm giảm đáng kể sự phát triển của L.mesenteroides, nhưng khơng cần thiết trong mơi trường sucrose. Sản lượng dextran dịng L.mesenteroides 683 với lượng vitamin cao thì đạt 67%, trong khi ở mức vitamin thấp thì đạt 82%. Do vậy việc tăng cường mức vitamin vượt quá giá trị trong Bảng 9 sẽ ức chế sản lượng dextran, sản xuất acid hoặc cả hai. Do đĩ thiamin, acid nicotinic và acid pantothenic cần phải cĩ cho tất cả các dịng. Với acid folic và riboflavin cĩ nhu cầu khác nhau cho các dịng khác nhau. Biotin cĩ chức năng trong việc sử dụng nguồn carbohydrate, nhưng nĩ khơng thật sự cần thiết trong mơi trường sucrose. Một số hợp chất khơng cĩ ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính của enzyme: Một số lượng lớn nguyên liệu thường được sử dụng trong nghiên cứu enzyme lại khơng cĩ ảnh hưởng đến tỷ lệ tổng hợp dextran bởi Leuconostoc trong thí nghiệm với 5% sucrose ở pH 5.6. Những nguyên liệu và nồng độ của chúng được liệt kê trong Bảng 11. Những dung dịch nồng độ cao tương đối azide, flouride, cyanide hoặc iodoacetate khơng cĩ khả năng làm chậm hoạt tính của Leuconostoc. ðiều đĩ cho thấy rằng sự tổng hợp dextran từ sucrose khơng đi kèm với hoặc phụ thuộc vào quá trình oxy hĩa. Aniline, Ag+ và Cu++ khơng cĩ ảnh hưởng đáng kể lên sự hình thành dextran. Trong khi đĩ, ảnh hưởng ức chế của aniline và Ag+ lên invertase nấm men và Cu++ lên glycogen phosphorylase là đáng kể. Bảng 11: Những cơ chất khơng cĩ ảnh hưởng đáng kể sự tổng hợp dextran từ sucrose bởi L. mesenteroides Hợp chất Nồng độ Natriazide NaCl KCN Monoiodoacetic acid 0.025, 0.005, 0.001 0.05, 0.01, 0.002 0.05, 0.01, 0.002 0.025, 0.005 Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 41 CuSO4 MnCl2 ZnSO4 AgNO3 Pyridine Aniline 0.001, 0.0001, 0.00001 0.001, 0.0001 0.001, *0.00001, 0.000001 0.0001, 0.00001, 0.000001 0.01, 0.001 0.01, 0.001 (*) : cĩ khả năng làm chậm khơng đáng kể sự tổng hợp dextran. b. Mơ hình động học: Phản ứng hĩa học và nghiên cứu tế bào: Sucrose được tiêu thụ cho phép vi sinh vật phát triển và sản xuất enzyme ngoại bào dextransucrase. Enzyme sử dụng sucrose trong mơi trường để sản xuất dextran và fructose. Trong suốt quá trình, những phản ứng xảy ra: Sucrose →cell Nhiều tế bào hơn Tế bào → Enzyme (1) nSucrose  →Enzyme Dextran + nFructose Dextran là một polymer mà những đơn phân là glucose. Do đĩ, chúng ta cĩ thể viết cơng thức tiêu thụ sucrose bởi enzyme như sau: nSucrose  →Enzyme z[(Glucose ― water)n/z] + nFructose (2) Trong đĩ: n là sucrose trong phản ứng z là số mole dextran chứa n/z mole glucose ― là loại bỏ Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 42 Cân bằng vật chất được viết như sau: ðối với tế bào: X dt dX rX µ== (3) Trong đĩ: rX là tốc độ sinh trưởng tế bào (g/l/h) X là nồng độ tế bào (g/l) T là thời gian (h) µ là hằng số tốc độ sinh trưởng (h-1) ðối với enzyme: dt dX Y dt dE r XEE /== (4) Trong đĩ: rE là tốc độ sản xuất enzyme (DSU/ml/h) E là lượng enzyme sản xuất (DSU/ml) YE/X là hệ số sản lượng của quá trình sản xuất enzyme dựa trên sinh khối tế bào đã sản xuất (DSU/mg tế bào) Xem xét cân bằng mole cho fructose và dextran và thừa nhận rằng cơ chất và enzyme thay đổi theo quy luật bậc 1, dẫn đến: Fructose: )()( tStnkE dt dF rF == (5) Dextran: )()( tStzkE dt dD rD == (6) Trong đĩ: rF và rD là tốc độ hình thành fructose và dextran (mole/l/h) F và D là nồng độ mole/l của fructose và dextran S là nồng độ sucrose (mole/l) k là hằng số cân bằng động học của phản ứng (ml/DSU h) n và z là hệ số định lượng của fructose và dextran (xem PT (2)) Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 43 Bằng cách sử dụng nồng độ theo khối lượng (g/l) cho fructose, dextran và sucrose, giá trị F’, D’, S’ ở PT (5) và (6) trở thành: SF F M tS tnkE dt dF M r )(' )( '1 == (7) SD D M tS tzkE dt dD M r )(' )( '1 == (8) Trong đĩ: MF, MD, MS là khối lượng phân tử của fructose, dextran và sucrose (g/mole) Từ PT (2), ta cĩ mối quan hệ giữa MD với MG và MW (khối lượng phân tử nước): )( WGD MMz n M −= (9) Tốc độ hình thành fructose và dextran tính theo g/l/h là: )(')(' ' ' tStE M M k dt dF r S F F == (10) )(')(' ' ' tStE M MM k dt dD r S WG D − == (11) Với k’=nk Giả thiết rằng chỉ sucrose được tiêu thụ bởi sinh khối cũng như là bởi enzyme ngoại bào được sản xuất thơng qua trao đổi chất tế bào, nghĩa là: ∆S = ∆S tạo sinh khối + ∆S sử dụng bởi enzyme ngoại bào để sản xuất dextran và fructose Với sucrose ta cĩ cân bằng vật chất sau: Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 44 )(')( 1' ' / tStnkE dt dX Ydt dS r SX S +==− (12) Trong đĩ: r’S là tốc độ tiêu thụ sucrose (g/l/h) YX/S là số lượng tế bào sinh trưởng trong lên men (g tế bào/g sucrose) Mơ hình sinh trưởng của tế bào: Hình sigma được quan sát trên đường cong sinh trưởng của tế bào. Phép tính gần đúng cho sự sinh trưởng tế bào là một PT logic mơ tả sự sinh trưởng của tế bào dưới dạng những thời kỳ đạt được giá trị cực đại. Phép tính gần đúng được sử dụng liên hệ tới độ sinh trưởng xác định µ và X như sau: )1( maxX X m −= µµ (13) Khi µm và Xmax lần lượt là tốc độ sinh trưởng xác định cực đại và nồng độ tối đa cĩ thể đạt tới của sinh khối. Tốc độ sinh trưởng của tế báo rX là: X X X X dt dX rX )1( max −== µ (14) Sau khi lấy tích phân PT (14) với điều kiện ban đầu X(0) = X0 (nồng độ tế bào ban đầu) ta được PT: ))exp(1)(/(1 )exp( )( max0 0 tXX tX tX m m µ µ −− = (15) Hoặc )1ln() 1 ln( 0 max −−= − X X t X X mµ (16) Với: max )( X tX X = Mơ hình sản xuất dextransucrase: Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 45 Nồng độ enzyme là một hàm theo thời gian cĩ được từ việc thay thế dt dX trong PT (4). Sau khi tích phân ta được: )1 ))exp(1)(/(1 )exp( ()( max0 0/ −−− = tXX t XYtE m m XE µ µ (17) YE/X được tính tốn từ những số liệu thực nghiệm về hoạt tính enzyme E(t). Mơ hình tiêu thụ sucrose và hình thành fructose, dextran: ðể tính –r’S (PT (12)) chúng ta cần phải tính được YX/S. Sản lượng chỉ được tính tốn khi liên hệ tới lượng sucrose được dùng cho sự sinh trưởng tế bào nghĩa là nồng độ sucrose ban đầu trừ lượng sucrose tiêu thụ để sản xuất fructose và dextran trừ đi lượng sucrose dư. Lượng đường này cĩ thể tính tốn dựa trên PT cân bằng vật chất sau: dt dD Mdt dF M M dt d WF S '' − ==− G senzyme bởidụngsử M M dt S (19) Tích phân PT (19) ta được: S’sử dụng bởi enzyme final WG S final F S D MM M F M M '' − == (20) Nồng độ fructose cuối cùng được sử dụng để tính tốn lượng đường sucrose tiêu thụ bởi enzyme bởi vì nhũng kết quả thực nghiệm này về fructose chính xac hơn những kết quả tương tự của dextran. Chúng ta cĩ thể giải PT (10) – (12) để thu được nồng độ dextran, fructose, sucrose như là một hàm bậc 1 theo thời gian. ðiều giả định của quá trình động học bậc 1 về sucrose và enzyme cho sản xuất dextran được ủng hộ hơn nữa bằng cách sắp xếp các PT (10) và (11) trở thành Fr tE ' )( và Dr tE ' )( theo )(' 1 tS . Cả 2 biểu đồ đều là đường thẳng. Từ độ dốc của đồ thị ta cĩ thể ước tính được ' 1 k . Bảng 12 cung cấp một bảng tổng hợp về những PT động học và dữ liêu đầu vào cần thiết cho sự mơ phỏng mơ hình. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 46 Bảng 12: Mơ hình mẫu, dữ liệu đầu vào, thơng số tính tốn cho quá trình lên men tĩnh sucrose để sản xuất dextran Phương trình vi phân '' ' '' ' '' 1' 1 / / max ES M MM k dt dD ES M M k dt dF ESk dt dX Ydt dS dt dX Y dt dE X X X dt dX S WG S F SX XE m − = = −−= =       −= µ ðiều kiện ban đầu 0 0 0 XX SS t = = = Dữ liệu đầu vào 0maxmax ,, SEX Thơng số tính tốn SXXE YYX //max0 ,,, µ Thơng số 'k được chọn tối ưu 6. Kết tủa lần 1: Mục đích: khai thác Những biến đổi:  Hĩa lý: sự kết tủa và tách pha của dextran.  Hĩa học: hàm lượng dextran hịa tan trong dung dịch giảm.  Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt hoặc ức chế. Vi sinh vật nổi lên trên bề mặt  Vật lý: nhiệt độ giảm Phương pháp thực hiện: Sau 20 h nuơi cấy, thêm vào mơi trường ethanol (hoặc methanol, acetone) theo tỉ lệ giữa thể tích mơi trường và thể tích chất làm kết tủa là 1:5. Trong quá trình thêm vào, hỗn hợp được khuấy với tốc độ 1000rpm. Quá trình trên nhằm mục đích đưa alcohol, acetone hoặc các tác chất tương tự để kết tủa dextran vào mơi trường nuơi cấy. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 47 Theo cách này, chúng ta sẽ tạo được một hỗn hợp cĩ tỷ lệ trộn lẫn cao và những tác nhân kết tủa sẽ tạo thành dextran ở dạng bơng. Quá trình kết tủa được thực hiện trong 30 phút. Thiết bị: bình khuấy Hình 17: Cấu tạo bình khuấy Một cách tổng quát, thiết bị khuấy gồm các bộ phận chủ yếu sau: thùng khuấy 1 hình trụ với đáy trịn hoặc nĩn; phía trên đậy nắp 3 ghép với thân bằng bích 2. Theo đường tâm của đường lắp trục khuấy 10 với cánh khuấy 11. Trục Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 48 khuấy xuyên qua nắp và được bít kín bởi hộp đệm 4. Truyền chuyển động cho trục khuấy từ động cơ 7 qua hộp giảm tốc độ 6 để tạo tốc độ thích hợp cho cánh khuấy. Tháo và lắp trục khuấy thơng qua khớp nối 5. Thùng khuấy được gắn tay đỡ 12, nhờ bù-lon lắp vào chân đỡ 13. Thực hiện nhập liệu qua các cửa 8 trên nắp thiết bị cịn tháo sản phẩm qua đường 14 dưới đáy. Trên nắp và thân thiết bị cĩ khi người ta bố trí cửa sửa chửa và cửa quan sát. Hiệu suất thu hồi sản phẩm: là tỷ số giữa hàm lượng dextran kết tủa và hàm lượng dextran trong dung dịch ban đầu. Sau khi lên men, nồng độ dextran là 0.65g/100ml (Bảng 5). Trong quá trình kết tủa lần 1, hiệu suất thu hồi khoảng 84%. ðộ tinh sạch của sản phẩm: là tỷ số giữa nồng độ dextran trong phần kết tủa và nồng độ dextran ban đầu trong dung dịch. Trong quá trình kết tủa lần 1, độ tinh sạch của dextran là 20 lần. 7. Ly tâm lần 1: Mục đích: khai thác. Những biến đổi:  Hĩa học: nồng độ của dextran trong dung dịch tăng lên.  Vi sinh: hàm lượng vi sinh vật giảm xuống. Phương pháp thực hiện: Dùng bơm để bơm dịch lên men đã được kết tủa với ethanol vào trong thiết bị ly tâm. Dịch này được ly tâm với tốc độ 10000rpm trong 15 phút ở 4oC. Thiết bị: Sử dụng thiết bị lắng ly tâm. Lắng ly tâm dựa trên việc áp dụng các cơn lốc ly tâm để phân riêng các phần tử và chất lỏng cĩ kích thước và tỉ trọng khác nhau. Các trụ đứng trữ những phần tử cĩ tỉ trọng nhẹ hơn trong khi hệ thống nĩn chứa những phần tử cĩ tỉ trọng nặng hơn. Hệ thống trụ và nĩn được kết hợp hiệu quả trong hệ thống ly tâm liên tục. Các đĩa ly tâm cĩ lỗ giúp việc phân riêng bằng phương pháp ly tâm các chất lỏng cĩ tỉ trọng khác nhau dễ dàng hơn. Các chất lỏng được nhập vào phối trộn tại trung tâm của đĩa và chúng được phân riêng bằng lốc ly tâm. Những phần tử nặng hơn sau khi phân riêng sẽ được tách ra bằng hệ thống ống dẫn đặc biệt. Việc tháo sản phẩm sau ly tâm được thực hiện khi một lượng đáng kể các phần tử rắn lắng xuống trong mơi trường ly tâm. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 49 Hình 18: Thiết bị lắng ly tâm 8. Lọc và rửa lần 1: Mục đích: khai thác. Những biến đổi:  Hĩa học: hàm lượng ẩm khối dextran giảm.  Vi sinh: hàm lượng vi sinh vật giảm xuống. Phương pháp thực hiện: Dùng bơm để bơm dịch sau ly tâm vào thiết bị lọc. Thiết bị: sử dụng thiết bị lọc chân khơng thùng quay. Loại máy lọc này được ứng dụng để tách sinh khối vi sinh vật khỏi dung dịch canh trường và để lọc huyền phù cĩ cấu trúc khác nhau của các thể vẩn rắn (cấu trúc sợi, cấu trúc keo hay cấu trúc khơng định hình). Các thể vẩn rắn thường chứa khoảng từ 50 đến 500 g/l. Năng suất đơn vị của thiết bị phụ thuộc vào các tính chất hố lý của huyền phù phân ly, vào vật liệu lọc, vào các giai đoạn xảy ra trước khi lọc và dao động Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 50 trong giới hạn rộng. Máy lọc chân khơng dạng thùng quay cĩ hiệu quả nhất khi phân ly huyền phù cĩ nồng độ pha rắn cao hơn 2%. Hình 19: Sơ đồ thiết bị lọc chân khơng dạng thùng quay tác động liên tục 1,8- Thùng két cĩ bộ khuấy trộn huyền phù; 2- Bơm đẩy huyền phù; 3- Bơm đẩy huyền phù của chất lọc hỗ trợ; 4-Thùng két cĩ bộ khuấy chất lọc hỗ trợ; 5- Bơm tuần hồn; 6- Thùng két cĩ bộ khuấy để chứa huyền phù khi trào ra;7- Lọc chân khơng; 9- Thùng chứa phần lọc; 10- Bơm hút phần lọc; 11- Bình chứa chất lọc đã được rửa; 12- Bơm hút phần lọc đã được rửa; 13- Bộ tách nước; 14- Máy quạt giĩ; 15- Hộp áp kế; 16- Bơm chân khơng; 17- Bộ ngưng tụ; 18- Bộ thu hồi; I- Phương án chính để nối thiết bị phụ; II- Phương án kết hợp để huyền phù lắng nhanh; III- Huyền phù của chất lọc hỗ trợ ở phương án hoạt động cĩ lớp bồi tích; IV- Phương án kết hợp thu hồi; V- Phương án kết hợp bộ ngưng tụ; VI-Phương án kết hợp bộ thu hồi và bộ ngưng tụ Tuy nhiên khi cơ sơ bộ huyền phù bằng phương pháp lắng hay nhờ bộ xốy thuỷ lực cĩ thể đạt hiệu suất lọc cao nhất. Khi lọc các chất trung hồ, năng suất đơn vị tính theo huyền phù là 2 – 3 m3/(m2.h), đối với các chủng nấm mốc – gần 1, cịn đối với chủng vi khuẩn – đến 0.2 m3/(m2.h). ðiều đĩ cĩ thể giải thích ở chỗ khối lượng mixen được tách ra một cách trực tiếp trong các phịng chân khơng dạng thùng quay, khi đĩ các tế bào nấm men và tế bào vi khuẩn chưa cĩ lớp bồi khơng được lọc, cịn khi bồi đắp lớp lọc và bổ sung 4 – 8% peclit, diatomite hay chất tác nhân tăng phẩm chất lọc vào chất lỏng canh trường, năng suất đơn vị lọc cĩ thể đạt 0.2 m3/(m2.h). Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 51 Thùng quay được phân chia ra thành một số khoang mà trong một vịng các khoang này trực tiếp qua bốn vùng, là những vùng cơ bản trong thiết bị lọc chân khơng dạng thùng quay (Hình 20). Các khoang của thùng quay được bao phủ bởi tấm đột lỗ và bị kéo căng bởi vật liệu lọc. Số vịng quay của thùng được thay đổi nhịp nhàng trong giới hạn từ 0.13 – 3 vịng/phút. Thùng quay được lắp trong các ổ đặc biệt. Tấm đáy dưới thùng cĩ máng chảy và máy khuấy lắc hoạt động nhờ bộ dẫn động riêng biệt cĩ số vịng quay đến 0.3rpm. Máy lọc chân khơng dạng thùng quay được thiết kế theo chế độ nạp liệu đến 1/3 và 2/3 đường kính, phụ thuộc vào các tính lắng đọng của huyền phù. Gĩc nạp liệu tối ưu của thùng quay bằng 130 – 1490. Hoạt động của thiết bị lọc chân khơng được tiến hành như sau: Chất lỏng canh trường từ thùng chứa được đẩy vào tấm đáy, tại đây mực chảy lỏng được giữ khơng đổi. Quá trình lọc được thực hiện trong bốn vùng theo chu kỳ quay của thùng (Hình 20). Hình 20: Cấu tạo thùng quay Trong vùng I (130 – 1490), lọc dưới chân khơng xảy ra qua lớp trên thùng và đồng thời chất cặn nằm trên đĩ. Trong vùng II (54 – 550), cặn được sấy khơ do đĩ bị hút vào, khơng khí mang ẩm từ chất cặn. Ở vùng III (90 – 1000) tiến hành rửa chất cặn bằng xối nước hay dung dịch rửa khác. Ở vùng IV (85 – 550), Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 52 khơng khí được vào bên trong địa phận để tiến hành thổi và làm rời chất cặn và tiến hành làm sạch bộ lọc khỏi chất cặn để khơi phục lại các tính chất lọc của nĩ. Hệ tạo chân khơng gồm bơm chân khơng, các thùng chứa phần lọc, nước rửa và bộ thu hồi. Loại bỏ chất cặn khỏi bộ lọc được thực hiện bằng một số phương pháp, phụ thuộc vào các tính chất của lớp cặn. Sử dụng cào để loại khối mixen dễ bĩc ở dạng lớp dày, đối với các lớp tế bào vi khuẩn dạng mỏng và dính dùng trục cán và để loại chất cặn cĩ bề dày trung bình và lớn thường sử dụng dây cào. Bộ lọc được chế tạo bằng thép khơng rỉ, chất dẻo và các vật liệu được bọc cao su, cho nên cĩ thể ứng dụng chúng để lọc các huyền phù cĩ tính ăn mịn ở nhiệt độ từ 0 đến 50oC. Chọn năng suất của bơm chân khơng xuất phát từ định mức tiêu hao khơng khí cĩ rửa hay khơng rửa chất cặn mà cĩ bề mặt lọc tương ứng: 0.5 – 2 và 0.4 – 1.4 m3 trên 1 m2. Trong trường hợp lọc các huyền phù độc, dễ nổ, ví dụ sau khi làm lắng enzyme từ dung dịch rượu hay acetone tốt nhất là ứng dụng bộ lọc chân khơng dạng khí. Với mục đích ngăn ngừa sự tạo ra hỗn hợp dễ nổ với khơng khí, nạp khí trơ dưới áp suất dư 10 kPa vào phần trên của thiết bị. Khơng khí dưới áp suất 50 – 100 KPa được nạp vào thiết bị để thổi chất cặn và hồn nguyên vải lọc, tiêu hao khơng khí từ 0.1 đến 0.5 m3/m2. 9. Hịa tan lần 1: Mục đích: chuẩn bị. Những biến đổi:  Hĩa học: hàm ẩm tăng lên.  Hĩa lý: chuyển pha. Phương pháp thực hiện: Dùng nước để hịa tan dextran kết hợp khuấy trộn. Hịa tan theo tỉ lệ: cứ 200ml nước cất thì cần 100g dextran để chuyển thành dạng paste. Thiết bị: bình khuấy. 10. Kết tủa lần 2: Mục đích: hồn thiện Những biến đổi: tương tự như quá trình lắng lần 1. Phương pháp thực hiện: Dịch đã được ly tâm (tách bớt vi sinh vật) sẽ được tiếp tục cho ethanol lạnh vào. Tiến hành tương tự như trên. Hiệu suất thu hồi sản phẩm: 92% Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 53 ðộ tinh sạch của sản phẩm: 25 lần. 11. Ly tâm lần 2: Mục đích: hồn thiện. Những biến đổi: tương tự quá trình ly tâm lần 1. Tuy nhiên lúc này lượng cặn đã được giảm đáng kể. Phương pháp thực hiện: tương tự ly tâm lần 1. 12. Lọc và rửa lần 2: Mục đích: khai thác. Những biến đổi:  Hĩa học: hàm lượng ẩm khối dextran giảm.  Vi sinh: hàm lượng vi sinh vật giảm xuống. Phương pháp thực hiện: Dùng bơm để bơm dịch sau ly tâm vào thiết bị lọc. Thiết bị: sử dụng thiết bị lọc chân khơng thùng quay. 13. Hịa tan lần 2: Mục đích: chuẩn bị cho quá trình sấy phun. Những biến đổi:  Hĩa học: hàm ẩm tăng lên.  Hĩa lý: giảm độ nhớt. Phương pháp thực hiện: Dùng nước kết hợp khuấy trộn để hịa tan dextran thành dung dịch. Tỷ lệ hịa tan là: cứ 100g dextran thì hịa tan trong 1 lít nước. Thiết bị: bình khuấy. 14. Sấy phun: Mục đích: khai thác và bảo quản. Những biến đổi:  Vật lý: nhiệt độ tăng.  Hĩa lý: sự bốc hơi nước.  Hĩa sinh: vơ hoạt các enzyme.  Sinh học: tiêu diệt vi sinh vật. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 54 Phương pháp thực hiện: Dịch dextran sau khi ly tâm được bơm vào máy sấy phun trong điều kiện chân khơng để sấy ở 30oC và thu được dextran ở dạng bột. Lượng dextran tạo thành được tính tốn theo hàm lượng chất khơ. Thiết bị: máy sấy chân khơng 2 giai đoạn. Hình 21: Hệ thống sấy phun 2 giai đoạn. Với hệ thống này, độ ẩm bột sản phẩm từ buồng sấy phun được hiệu chỉnh cao hơn 2 – 5% so với giá trị độ ẩm cuối cùng. Phần ẩm cịn lại cần tách sẽ được bốc hơi tiếp trong thiết bị sấy tầng sơi. Mặc dù giai đoạn sấy tầng sơi cũng tiêu tốn một năng lượng nhất định, tuy nhiên hệ thống sấy phun hai giai đoạn giúp tiết kiệm được trung bình 10% so với máy sấy phun một giai đoạn. Cấu tạo: Cơ cấu phun: Chọn cơ cấu phun bằng khí động: cịn được gọi là cơ cấu phun hai dịng. Nguyên lý hoạt động: Mẫu nguyên liệu được bơm vào đầu phun theo ống trung tâm. Tác nhân sẽ theo ống ở phần biên đầu phun đi vào buồng sấy. Trong trường hợp này gĩc phun dao động từ 20 – 600 phụ thuộc vào cấu tạo của đầu phun. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 55 Ưu điểm của cơ cấu phun bằng khí động là cĩ thể sử dụng cho các mẫu dạng huyền phù hoặc các mẫu cĩ độ nhớt cao (dextran). Năng suất hoạt động của đầu phun bằng khí động cĩ thể lên đến 1000kg nguyên liệu/h. Tuy nhiên, đầu phun khí động tiêu tốn nhiều năng lượng. Buồng sấy: Buồng sấy là nơi hịa trộn mẫu sấy (dạng sương mù) và tác nhân sấy (khơng khí nĩng). Buồng sấy phun cĩ thể cĩ nhiều hình dạng khác nhau nhưng phổ biến nhất là buồng sấy hình trụ đứng, đáy cơn. Kích thước buồng sấy (chiều cao, đường kính...) được thiết kế phụ thuộc vào kích thước các hạt lỏng và quỹ đạo chuyển động của chúng tức phụ thuộc vào cơ cấu phun sương sử dụng. Dựa vào hướng chuyển động của dịng nguyên liệu và tác nhân sấy trong buồng sấy, ta cĩ 3 trường hợp sau đây:  Dịng nguyên liệu và tác nhân sấy chuyển động cùng chiều.  Dịng nguyên liệu và tác nhân sấy chuyển động ngược chiều. (*)  Dạng hỗn hợp. Trong trường hợp sấy dextran, sử dụng trường hợp (*) : ðầu phun nguyên liệu được bố trí trên đỉnh buồng sấy và các giọt lỏng sẽ chuyển động theo chiều từ trên xuống. Ngược lại, cửa vào của tác nhân sấy được bố trí ở phần bên dưới thiết bị và khơng khí nĩng sẽ chuyển động theo chiều từ dưới lên trên. Thơng thường, cửa thốt chính cho bột sản phẩm được đặt phía dưới đáy buồng sấy, cịn cửa thốt cho tác nhân sấy đặt ở phía trên đỉnh buồng. Trong trường hợp này, nhiệt độ bột sản phẩm thu được sẽ cao hơn nhiệt độ tác nhân sấy tại cửa thốt. ðiều này thích hợp cho những sản phẩm bột thơ yêu cầu cĩ tỉ trọng cao và cĩ độ xốp thích hợp. Loại cơ cấu phun thường sử dụng là đầu phun bằng khí động hoặc đầu phun áp lực. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 56 Hình 22: Hướng chuyển động ngược chiều nhau của nguyên liệu và tác nhân sấy trong buồng sấy Tác nhân sấy: Khơng khí nĩng là tác nhân sấy thơng dụng nhất. ðể gia nhiệt khơng khí ta cĩ thể sử dụng những tác nhân và phương pháp gia nhiệt khác nhau. Bảng 13: Các tác nhân dùng để gia nhiệt trong máy sấy phun Tác nhân gia nhiệt Phương pháp gia nhiệt Phạm vi sử dụng Hơi Gián tiếp Sản xuất cơng nghiệp Dầu Gián tiếp hoặc trực tiếp Sản xuất cơng nghiệp Gas Gián tiếp hoặc trực tiếp Sản xuất cơng nghiệp ðiện Nghiên cứu (PTN hay pilot) Việc chọn tác nhân gia nhiệt cho khơng khí phụ thuộc vào nguồn cung cấp nhiệt sẵn cĩ của nhà máy và nhiệt độ khơng khí nĩng cần sử dụng. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 57 Hệ thống thu hồi sản phẩm: Thơng thường bột sản phẩm sau khi sấy sẽ thu hồi tại của đáy của buồng sấy. ðể tách sản phẩm ra khỏi khí thốt, người ta cĩ thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: lắng xốy tâm, lọc, lắng tĩnh điện... Phổ biến nhất hiện nay là phương pháp lắng xốy tâm, sử dụng cyclon. Khí thốt cĩ chứa các hạt sản phẩm sẽ đi vào cyclon từ phần đỉnh theo phương tiếp tuyến với thiết bị. Bột sản phẩm sẽ di chuyển theo quĩ đạo hình xoắn ốc và rơi xuống đáy cyclon. Khơng khí sạch thốt ra ngồi theo cửa trên cyclon. Hình 23: Cyclon thu hồi bột sản phẩm từ khí thốt Quạt: ðể tăng lưu lượng của những dịng tác nhân sấy, người ta thường sử dụng quạt ly tâm. Ở quy mơ cơng nhiệp, các hệ thống sấy phun được trang bị hệ thống 2 quạt. Quạt chính được đặt sau thiết bị thu hồi bột sản phẩm từ dịng khí thốt. Cịn quạt phụ được đặt trước thiết bị gia nhiệt khơng khí trước khi vào buồng Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 58 sấy. Ưu điểm của việc sử dụng hệ thống 2 quạt là người ta cĩ thể kiểm sốt dễ dàng áp lực trong buồng sấy. Trong trường hợp chỉ sử dụng 1 quạt ly tâm đặt sau cyclon thu hồi sản phẩm, buồng sấy sẽ hoạt động dưới áp lực chân khơng rất cao. Chính áp lực chân khơng này sẽ ảnh hưởng đến lượng sản phẩm bị cuốn theo dịng khí thốt, do đĩ ảnh hưởng đến năng suất hoạt động và hiệu quả thu hồi sản phẩm của cyclon. Trong hệ thống sấy phun, người ta cĩ thể sử dụng thêm một số quạt ly tâm nhằm vào các mục đích khác nhau như để vận chuyển bằng khí động bột khí động bột sản phẩm sau khi sấy vào thiết bị bảo quản... IV. SẢN PHẨM: 1. Tính chất của dextran: a. Tính bền vững của dextran: Bột dextran khơ: Dextran cĩ thể bảo quản dưới dạng bột khơ trong 5 năm trong những thiết bị cĩ độ kín cao tại nhiệt độ phịng. Dextran hấp thu ẩm rất chậm khi để ngồi khơng khí hay khi được bảo quản trong thiết bị chứa khơng kín. Tiệt trùng dung dịch dextran: Dung dịch dextran cĩ thể được tiệt trùng bằng cách đun trong nồi hấp. Dung dịch này bền trong vịng nhiều năm ở nhiệt độ bảo quản xác định, pH bảo quản tối ưu là 6 – 7. Tuy nhiên, dextran vẫn cĩ thể được bảo quản trong một khoảng nhiệt độ rộng hơn với khoảng pH 4 – 10. Các kỹ thuật tiệt trùng như chiếu xạ… cĩ thể làm giảm chất lượng dextran. Trong quá trình hấp tiệt trùng, sự giảm nhẹ pH và làm chuyển màu thành màu vàng nhạt cĩ thể xảy ra nhưng khơng ảnh hưởng nhiều đến chất lượng dextran. Tiệt trùng khơng làm thay đổi khối lượng phân tử của dextran. b. Trọng luợng và kích thước phân tử: Dextran cĩ trọng lượng phân tử khoảng từ 1000 – 2000000 Da. Trọng lượng phân tử trung bình được định nghĩa một cách rõ ràng thành trung bình trọng lượng và trung bình trọng số phân tử. Trọng lượng phân bố khác nhau trong phân tử là cơ sở dùng trong phương pháp sắc kí để xác định các tính chất của dextran. Sự phân bố trọng lượng của dextran 10 được miêu tả qua Hình 24: Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 59 Hình 24: Biểu đồ phân bố trọng lượng phân tử dextran 10 Việc phân lọai dextran thành các lọai 5, 10,… dựa vào khối lượng phân tử khỏang 1000 Da. Như vậy phù hợp với sự phân lọai đĩ, ta cĩ dextran 10 cĩ khối lượng phân tử là 10000 Da. Dextran rất dẻo và cĩ tính chất của polymer dạng thẳng, và trương nở khi hịa tan. Kích thước phân tử của một số dạng dextran được trình bày trong Bảng 14. Bảng 14: Kích thước phân tử một số dạng dextran 310−×WM Stoke’s radius 2000 1000 500 200 100 70 50 40 10 27 19.9 14.7 9.5 6.9 5.8 4.95 4.45 2.36 Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 60 c. Tính hịa tan của dextran: Dextran dễ dàng tan trong nước và các dung dịch điện phân tạo thành dung dịch hịa tan bền vững. pH khơng cĩ ảnh hưởng tới việc hịa tan. Cĩ thể tạo ra được dung dịch hịa tan đậm đặc của dextran (>50% w/v) Dextran cĩ thể tan trong một số dung mơi khác, đặc biệt là methyl sulfide, formamide, ethylene glycol và glycerol. Dextran khơng tan trong rượu đơn chức như methanol, ethanol, isopropanol, và hầu hết ketone như acetone và 2- propanone. Dextran cĩ thể tạo thành dung dịch trong, nhưng dextran cĩ khối lượng phân tử thấp cỡ 5 và 10 Da cĩ thể tạo thành dung dịch đục, đặc biệt là khi dung dịch cĩ nồng độ cao. ðiều này cĩ thể làm chậm quá trình đun sơi dung dịch sau giai đoạn chuẩn bị. d. Lọc dung dịch dextran: Dung dịch dextran cĩ thể được lọc dễ dàng. ðối với dung dịch đậm đặc thì cần phải cĩ hệ thống lọc lớn và sử dụng áp suất cao để tăng hiệu suất quá trình lọc. Hơn nữa hiệu suất lọc cĩ thể tăng lên nhờ việc tăng nhiệt độ. Kích thước của bộ lọc phải dựa trên thể tích và nồng độ của dung dịch dextran sử dụng. e. ðộ nhớt của dung dịch dextran: Vì dextran là một polysaccharide trung tính nên độ nhớt của dung dịch ít bị ảnh hưởng bởi pH hay nồng độ muối. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 61 Hình 25: ðộ nhớt của các loại dextran phụ thuộc vào nồng độ của chúng. (ðộ nhớt được đo ở 25oC) f. Áp suất thẩm thấu gel của dung dịch dextran: Áp suất thẩm thấu gel rất quan trọng trong nhiều ứng dụng sử dụng dextran. Khi so sánh áp suất thẩm thấu, điều quan trọng là phân tư khơng được đi xuyên qua màng mà nĩ tiêp xúc. ðối với những dung dịch tương tự, áp suất thẩm thấu phụ thuộc rất lớn vào khối lượng phân tử của chất tan. Bởi vì dextran là một polymer trung tính cĩ kích thước lớn nên nĩ dễ dàng thấm vào mơ của người và do đĩ duy trì mội trường thẩm thấu cần thiết cho cơ thể ví dụ như muối cĩ thể dễ dàng khuếch tán vào trong tế bào và các mơ. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 62 Hình 26: So sánh áp suất thẩm thấu gel của dextran 40 và 70 g. Gĩc quay cực của dextran: Cơng thức tính gĩc quay cực : [α]D = +195 – +201 (ở 25 0C) Với [α]D là gĩc quay cực của dextran. Khi khối lượng phân tử của dextran nhỏ hơn 20000 Da thì gĩc quay cực sẽ giảm theo sự giảm của khối lượng phân tử. – Da: đơn vị đo khối lượng phân tử. – Mw: khối lượng phân tử trung bình – Mn: trung bình số h. Tương tác sinh học của dextran: Ứng dụng trong y học của dextran trong hơn 50 năm qua là bằng chứng thuyết phục về tính an tồn và chất lượng của nĩ. Hầu hết nghiên cứu được áp Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 63 dụng đối với dextran 40 và 70. Liều gây chết của dextran 70 là 55g/kg thể trọng ở chuột, 18 ở thỏ và 10 ở chĩ. Dextran cĩ thể được tiêu hĩa hồn tồn và bền vững. Quá trình tiêu hĩa của dextran được theo dõi bởi sự tăng rất nhanh nồng độ đường trong máu và nồng độ glycogen trong gan. Từ đĩ cĩ thể kết luận là dextran cĩ thể tiêu hĩa được. Hiện nay, dextran đã được ứng dụng trong ngành dược. Dextran là thành phần của thuốc nhỏ mắt, cream và thuốc mỡ bơi da. Cho nên dextran cĩ tương tác sinh học tốt. i. Sự phân hủy sinh học của dextran: Enzyme dextranase từ nấm mốc như Penicilium và Verticillium cĩ thể phân hủy dextran, tạo các sản phẩm đường cĩ khối lượng phân tử thấp như là glucose và isomaltose. Nhiều vi khuẩn sinh dextranase ngoại bào cũng cĩ khả năng tương tự như : Lactobacillus, Cellvibrio, Cytophaga, và Bacillus spp. Do vậy dextran dễ bị phân hủy và tạo những sản phẩm dễ hấp thu vào mơi trường tự nhiên. 2. Chỉ tiêu chất lượng của dextran: a. Chỉ tiêu vật lý: Tiêu chuẩn về khối lượng phân tử dextran - Tiêu chuẩn GPC (Gel Permeation Chromatography - Sắc ký thẩm thấu gel): Tiêu chuẩn Pharmacosmos GPC cung cấp 10 bộ tiêu chuẩn GPC để xác định khối lượng phân tử dextran trong một khoảng rộng từ 1000 đến 670000 Da. – Mp : Peak average molecular weight of log(Mw) of Dextran fractions. – Mw : Weight average molecular weight of Dextran fractions. – Mn : Number average molecular weight of Dextran fractions. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 64 Sản phẩm Phân tử lượng chuẩn GPC standard 1 1,000 Da GPC standard 5 5,000 Da GPC standard 12 12,000 Da GPC standard 25 25,000 Da GPC standard 50 50,000 Da GPC standard 80 80,000 Da GPC standard 150 150,000 Da GPC standard 270 270,000 Da GPC standard 410 410,000 Da GPC standard 670 670,000 Da Cĩ thể tham khảo kỹ hơn bộ tiêu chuẩn này ở phần phụ lục. b. Chỉ tiêu hĩa học: pH dung dịch khi hồ tan trong nước ở bất kỳ nồng độ nào : 4.5 – 7.0. c. Chỉ tiêu về hĩa lý: ðộ nhớt tùy thuộc vào độ dài của mạch carbon và thay đổi tùy theo yêu cầu của từng sản phẩm. d. Chỉ tiêu về sinh học: Sạch về mặt vi sinh. Khơng lẫn các vi sinh vật như Lactobacillus, Cellvibrio, Cytophaga, và Bacillus spp…vì chúng cĩ khả năng phân giải dextran làm giảm đi tác dụng của dextran. Khơng cĩ độc tính khi sử dụng. 3. Các loại dextran thường gặp: a. Dextran y học: Dextran được đĩng bao bì 100 g, 500 g, 5 kg và 50 kg. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 65 Khối lượng Mơ tả 100 g Hộp chứa dextran, DMF loại III 500 g Hộp chứa dextran, DMF loại III 5 kg Hộp chứa dextran. Bột dextran được bảo quản kín bên trong bao PE kép 50 kg Hộp chứa dextran. Bột dextran được bảo quản kín bên trong bao PE kép. Dextran 1: MW = 1000 Da. Dùng để phịng ngừa phản ứng mẫn cảm với dextran. Dạng tiêm của nĩ được pha vào Dextran 40 và 70, làm cho chúng trở thành những chất làm tăng thể tích huyết thanh an tồn nhất. Dextran 40: MW = 40,000 Da. Dùng làm chất tăng thể tích huyết thanh trong việc điều trị chứng giảm lưu lượng máu đột ngột. Dextran 60: MW = 60,000 Da. Dùng làm chất tăng thể tích huyết thanh trong việc điều trị chứng khơ mắt với các chỉ dẫn chữa trị tương tự như Dextran 70. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 66 Dextran 70: MW = 70,000 Da. Cơng dụng như Dextran 40. b. Dextran kỹ thuật : Dextran kỹ thuật (T-Dextran) là dextran cĩ độ tinh khiết cao với khối lượng phân tử trung bình và được sắp xếp theo khối lượng phân tử. Cĩ thể hịa tan một cách dễ dàng, các loại dextran kỹ thuật được dùng như những chất phản ứng lúc đầu hay trung gian trong vài quá trình thực phẩm khác nhau, cơng nghệ sinh học, nhiếp ảnh và cơng nghiệp sản xuất hĩa chất. Bảng 15: Các dịng sản phẩm Dextran cơng nghiệp Sản phẩm Phân tử khối tiêu chuẩn (Da) Dextran T1 1,000 Dextran T1.5 1,500 Dextran T3.5 3,500 Dextran T5 5,000 Dextran T6 6,000 Dextran T10 10,000 Dextran T20 20,000 Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 67 Dextran T25 25,000 Dextran T40 40,000 Dextran T70 70,000 Dextran T110 110,000 Dextran T150 150,000 Dextran T250 250,000 Dextran T500 500,000 Dextran T2000 2,000,000 c. Sản phẩm dextran từ CMG 713: Dextran sản xuất bởi CMG 713 cĩ khối lượng phân tử lớn. Khối lượng phân tử của dextran khoảng 2 triệu Daltons (Hình 27) và gần với dextran cơng nghiệp. Trước đây, maltose và sucrose được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của nĩ lên khối lượng phân tử dextran và đã đi đến kết luận maltose khơng cĩ ảnh hưởng lớn đến khối lượng phân tử dextran. Dextran khối lượng phân tử lớn (>1000kDa) được sinh ra khi sucrose được sử dụng như là một cơ chất trong suốt quá trình lên men cùng oligodextrin (<10 kDa). Dextran cao phân tử này được sản xuất bởi CMG 713 cĩ thể được dùng trong cơng nghệ sinh học, ứng dụng trong cơng nghiệp cũng như được thủy phân để trở thành những phần cĩ khối lượng phân tử nhỏ hơn theo nhu cầu của các ngành cơng nghiệp khác nhau. Dextran cĩ khối lượng phân tử từ 12 – 98 kDa cĩ tầm quan trọng trong y học và cĩ thể thu nhận bằng việc thủy phân dextran cao phân tử chẳng hạn như dextran cao phân tử sản xuất bởi CMG 713. Dextran sản xuất bởi CMG 713 cĩ độ nhớt 14.58 cP. Dextran cĩ độ nhớt cao đã chỉ ra rằng nĩ là mạch dài các liên kết α-1,6 trong các mạch chính. Polysaccharide cĩ liên kết α-1,6 đại diện cho một loại polymer dẻo và cĩ thể kéo dài được. Khối lượng phân tử trung bình của dextran tự nhiên sản xuất bởi NRRL B- 512F đã được khảo sát và giá trị khối lượng phân tử trung bình được xác định trong khoảng 9.106 – 500.106 Da. Bằng chứng về sự hiện diện của những nhánh dài đã được dẫn chứng từ những nghiên cứu về khối lượng phân tử và độ nhớt trong quá trình sinh tổng hợp dextran. Mối quan hệ giữa khối lượng phân tử và độ nhớt nội tại đã được khảo sát trong một dãy khối lượng phân tử khác nhau. Hibbert et al cũng đã tìm ra sự khác nhau của tính chất vật lý và hĩa học của dextran được sản xuất bởi L.mesenteroides. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 68 Hình 27: Sự phân loại phân tử khối của dextran sản xuất từ L.mesenteroides CMG 713 Phân tử khối trung bình: Blue Dextran: 2,000,000 Dextran cơng nghiệp: 5,000,000 – 40,000,000 Dextran từ L.mesenteroides CMG 713: 5,000,000 – 20,000,000. Tính chất của dextran sản xuất bởi CMG 713 Sự so sánh tính chất vật lý và hĩa học của dextran sản xuất bởi CMG 713 và NRRL B-512F cĩ trong Bảng 16. Dextran sản xuất bởi CMG 713 vơ định hình và khơng màu. Tuy nhiên những loại dextran sản xuất bởi những chủng L.mesenteroides khác thì lại cĩ dạng sền sệt cho đến dạng hạt kết tủa. Sự khác nhau về tính chất vật lý này cĩ thể là do sự khác nhau về sự kết tụ các phân tử lại với nhau. Dextran sản xuất từ CMG 713 thì tan trong nước tạo thành dung dịch đồng nhất cĩ nồng độ 5% được sử dụng để phân tích các tính chất hĩa lý của dextran. Các kết quả tương tự cũng được cơng bố cho dextran sản xuất bởi NRRL B-512F rằng nĩ tan hồn tồn trong nước, methyl sulfoxide, fomamide, ethylenglycol và glycerol. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 69 Bảng 16: Sự so sánh tính chất vật lý và hĩa học của dextran sản xuất bởi CMG 713 và NRRL B-512F ðặc tính L.mesenteroides CMG713 L.mesenteroides NRRL B512F Màu sắc và kết cấu Trắng, bột vơ định hình Khơng màu, sáng pH 6.3 5.0-7.0 Tro (%) 9.09 0.056 ðộ ẩm (%) 10.2 - ðộ nhớt (cP) 14.58 2.5 – 3.5 Phân tử lượng trung bình (kDa) 5,000 – 20,000 900 – 50,000 Carbohydrate tổng (%) 79 - Protein tổng (%) 1.9 1.0 ðường khử (%) 1.0 25 Liên kết Chỉ cĩ liên kết α-1,6 Liên kết α-1,6; α-1,4 ở nhánh. V. THÀNH TỰU CƠNG NGHỆ: 1. Hướng phát triển trong tương lai - Cố định tế bào để sản xuất dextran và dextransucrase: A. Cố định tế bào: Việc gắn enzyme vào một chất nền trơ là một quá trình rất quan trọng cho mục đích thực tế và lý thuyết. Enzyme thường cĩ nguồn gốc từ vi khuẩn và sự mở rộng khái niệm cố định là đính cả tế bào vi khuẩn vào một chất mang trơ mà khơng cần ngăn cách và làm tinh sạch những thành phần trao đổi đặc biệt. Thuận lợi của việc cố định cả tế bào so với tinh sạch enzyme là rất lớn:  Chi phí ngăn cách, phân lập và tinh sạch enzyme được giảm thiểu.  Phạm vi phản ứng rộng hơn bao gồm cả những phản ứng phức tạp sử dụng nhiều enzyme Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 70  Làm tăng tính bền của enzyme thành phẩm bởi vì enzyme được duy trì được trạng thái tự nhiên của nĩ.  Kéo dài được hoạt tính enzyme bởi sự cĩ mặt của các cofactor và sự tổng hợp sinh học bên trong tế bào.  Sự sản xuất khơng bị giới hạn trong những sản phẩm lên men cổ điển mà cịn được mở rộng bao gồm những sản phẩm cĩ kích thước của virus, hoặc những tế bào đồng bộ, sự phân chia quang phổ của những tế bào đặc biệt cấy vào mơ của động vật. a. Cố định tế bào trên acrylamide: Cơng nghệ thường được dùng là đính tồn bộ tế bào trên gel polyacrylamide. Tiến trình bao gồm sự polymer hĩa dung dịch cĩ nước của các monomer là acrylamide khi các vi sinh vật bị treo lơ lửng. Bảng 17: Hiệu suất cố định tế bào trên các thành phần hệ gel khác nhau No Acrylamide (%w/v) MBA (%v/v) TEMED (%v/v) Potassium persulphate (g) Khối lượng tế bào ướt (g) Tế bào được giữ lại (g) Hiệu suất cố định tế bào 1 2 3 4 5 6 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 20.0 0.8 0.6 0.4 0.8 0.8 0.8 2.0 1.0 1.0 0.5 1.0 1.0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4934 0.4934 0.4934 0.4934 0.4934 0.4934 0.4092 0.4052 0.4448 0.4124 0.3666 0.4301 82.90 82.12 90.14 83.58 74.30 87.17 MBA: Methyl bis acrylamide TEMED: N, N, N, N – Tetram ethyl ethylene diamine Bảng 17 cho thấy rằng việc cố định tế bào bị ảnh hưởng bởi thành phần của hệ gel. 6 thành phần khác nhau của acrylamide được sử dụng để đạt được hiệu suất cố định tế bào cao nhất. Tế bào ướt được sử dụng trong tất cả 6 thành phần. Hiệu suất 90% cố định tế bào (cao nhất) đạt được khi cĩ 15% gel acrylamide với 0,4% các chất cĩ liên kết ngang. Những nồng độ khác nhau của TEMED và kali persulfate được sử dụng trong nghiên cứu này. Martin và Perlman (1976) đã cơng bố rằng nhữn thành phần khác nhau cho việc cố định tế bào Gluconobacter melanogenus IFO 3293. Họ đã thêm vào dung dịch 5% 3- dimethylamino propionitrile để làm tăng khả năng cố định của gel. Nồng độ tương đối của tế bào, acrylamide và MBA trong dung dịch polymer hĩa cĩ thể Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 71 ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme của tế bào được cố định. Hầu hết các nhà nghiên cứu sử dụng acrylamide 15% (w/v) và MBA 0,4-0,8%. Nhiệt độ mà tại đĩ quá trình polymer hĩa diễn ra cũng cĩ thể ảnh hưởng đến hoạt tính của tế bào đã được cố định. Quá trình cố định L.mesenteroides PCSIR-4 được thực hiện ở 20oC cho kết quả khơng cĩ sự mất mát quan trọng của tế bào. Ở 45oC, tế bào mất nhiều hoạt tính chỉ trong vịng 2 phút. Shimizu et al (1975) cơng bố rằng khả năng của Brevibacterium ammoniagenes đã được cố định để sản xuất coenzyme A giảm khi tăng nhiệt độ polymer hĩa chỉ cịn 85% ở 20oC và 75% ở 37oC. Bảng 18: Sự sản xuất dextran bởi vi khuẩn L.mesenteroides PCSIR-4 đã được cố định ở những nhiệt độ khác nhau, sử dụng 10% sucrose Hiệu suất chuyển hĩa No Thời gian ủ (h) Thời gian hồn tất 26oC 35oC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 5.82 5.20 3.10 2.90 2.70 2.70 2.60 2.55 1.10 0.72 3.50 2.30 2.10 2.00 1.90 1.80 1.50 1.20 - - Những dữ liệu ở trên cho thấy rằng hiệu suất chuyển hĩa sucrose thành dextran ở 26oC cao hơn ở 35oC. Tế bào cĩ khả năng sống cao và cĩ khả năng sản xuất dextran trong một khoảng thời gian trên 480h. Nhưng hiệu quả của dextran thành phẩm giảm dần theo thời gian. Ở 26oC, sản phẩm dextran gấp 1.6 lần so với ở 35oC trong 48h đầu và tăng lên 2.2 lần trong 48h tiếp theo. Hoạt tính của tế bào cố định giảm khoảng 50% sau 1 tuần ở 26oC. Những kêt quả tương tự được cơng bố từ trước cho thấy rằng hoạt tính của nấm (mycellia) cố định trong gel cũng giảm 50% sau 1 tuần bảo quản ở 4oC. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 72 Bảng 19: Sản phẩm dextran sản xuất từ L.mesenteroides PCSIR-4 ở những nhiệt độ khác nhau, sử dụng 20% sucrose Hiệu suất chuyển hĩa No Thời gian ủ (h) Thời gian hồn tất 26oC 30oC 1 2 3 4 5 6 7 8 48 48 48 48 48 48 48 48 48 96 144 192 240 288 336 384 5.53 2.50 2.26 2.15 1.80 1.55 1.45 1.20 6.22 3.40 2.71 2.50 2.14 2.10 1.60 1.45 Nồng độ cơ chất cũng đĩng một vai trị quan trọng đến việc sản xuất dextran bằng tế bào cố định. Nồng độ cơ chất cao gây ra sự ức chế ở mức cơ chất, điều này được quan sát rằng nồng độ cơ chất ban đầu càng cao thì sản lượng dextran thu được trên 1 đơn vị thể tích càng cao. Nhưng hiệu suất chuyển hĩa sucrose thành dextran lại giảm khi tăng nồng độ sucrose ban đầu. Sucrose cũng được sử dụng để sản xuất dextran bằng việc cố định lồi Rhizopus trên chất mang giống như vi sợi cellulose. Bảng 20: Sản xuất dextran bằng L.mesenteroides PCSIR-4 cố định và tự do, sử dụng 10% sucrose Hiệu suất chuyển hĩa No Thời gian ủ (h) Thời gian hồn tất Tế bào tự do Tế bào cố định 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 8.00 6.00 2.10 - - - - - - - 5.82 5.20 3.10 2.90 2.70 2.70 2.60 2.55 2.50 2.40 Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 73 Bảng 20 cho thấy hiệu suất chuyển hĩa sucrose thành dextran cao được thấy ở tế bào tự do. Tế bào tự do tiếp tục sản xuất dextran trên 96h nhưng sau đĩ hiệu suất chuyển hĩa lại giảm thấp hơn so với tế bào cố định. Tế bào tự do mất hoạt tính và dừng quá trình sản xuất dextran sau 144h, trong khi tế bào cố định vẫn hoạt động mạnh và cĩ thể sàn xuất dextran trong thời gian trên 480h. Hiệu suất chuyển hĩa thấp của tế bào cố định được giải thích là vì tế bào ở trạng thái cố định khơng cĩ khả năng di chuyển và phân chia trong khi tế bào tự do cĩ thể dễ dàng di chuyển và phức hợp enzyme – cơ chất cĩ thể dễ dàng hình thành. Trong tế bào cố định, sản phẩm hình thành được giữ lại trong những lỗ của gel và khơng cho phép cơ chất mới tiến vào từ bên ngồi tế bào và phản ứng với những enzyme nội bào để sản xuất dextran. Tuy nhiên, cĩ thể dễ dàng thấy rằng tế bào ở trạng thái cố định bền hơn ở dạng tự do và sản xuất dextran liên tục trong một thời gian dài. Sản phẩm dextran cĩ phân tử lượng thấp từ những tế bào cố định là do sự tổn thương một phần của enzyme nội bào bởi vì việc tiêp xúc với các chất cĩ khả năng polymer hĩa. ðiều này cũng đúng trong trường hợp cố định tế bào Pseudomonas putida để sản xuất L-citruline. Một lý do khác cĩ thể xảy ra là những phần nhỏ enzyme chìm được đặt trên hoặc gần bề mặt cĩ hoạt tính enzyme. Chỉ cĩ tế bào được đặt trong những lớp khơng dày hơn 0.35mm cĩ thể sử dụng được cơ chất và khi độ dày của hệ gel tăng lên thì quá trình hình thành sản phầm giảm xuống. b. Cố định tế bào trên calcium alginate: Khả năng của dung dịch natri alginate để hình thành những viên hoặc hạt bền vững khi cho vào dung dịch calcium cloride bởi vì sự hình thành của những hạt gel calcium alginate khơng tan được sử dụng để cố định tế bào thực vật và vi sinh vật, enzyme và những cơ quan dưới mức tế bào. Ảnh hưởng của kích thước hạt calcium alginate lên việc cố định tế bào: Kích thước của các hạt cũng đĩng vai trị quan trọng trong việc cố định tế bào. Sự khuếch tán nội tại cĩ thể trở thành một bước giới hạn trong cả chất xúc tác sinh học, đặc biệt khi hoạt tính xác định hoặc khi sản xuất các oligosaccharide cĩ khả năng khuếch tán thấp. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 74 Hình 28: Ảnh hưởng của kích thước hạt đến việc cố định tế bào Hình 28 cho thấy rằng sự cố định tế bào đạt cực đại khi đường kính của hạt đạt 0.6mm và khi đường kính tăng dần thì tỉ lệ hiệu suất cố định giảm dân. Những kết quả tương tự cũng được cơng bố bởi Quirasco et al (1995) người đã khám phá ra rằng sau khi kích thước của các chất xúc tác sinh học đạt tối ưu, khả năng cố định giảm khi tăng đường kính các hạt gel. Dưới đường kính tối ưu,tỉ lệ phản ứng khơng được kiểm sốt bởi sự khuếch tán bên trong tế bào. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên việc sản xuất dextran bằng cố định tế bào: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose được nghiên cứu khi đường kính hạt gel là 0.6mm. Kết quả trong Hình 29 cho thấy rằng phản ứng dưới sự kiểm sốt động học chỉ khi cĩ nồng độ cơ chất trên 10%. ðiều này cũng được cơng bố sớm hơn rằng, việc tăng nồng độ sucrose lên 0.1% để làm giảm hoạt tính từ 1 xuống 4. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 75 Hình 29: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến việc sản xuất dextran bằng tế bào cố định Ảnh hưởng của nhiệt độ đến việc sản xuất dextran bằng tế bào cố định: Dextran sản xuất bởi L.mesenteroides PCSIR-4 đã được cố định bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Sự sản xuất dextran tăng lên khi nhiệt độ tăng và ở 30oC sự sản xuất dextran đạt cực đại. Khi nhiệt độ tăng lên 50oC thì khả năng sản xuất giảm 25%. ðiều này cũng thấy ở Gluconobacter melanoganas. Sự sản xuất sorbosone đạt cực đại ở 50oC. và khi nhiệt độ tăng lên 60oC thì sự sản xuất bị giàm đi. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 76 Hình 30: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản xuất dextran từ tế bào tự do và cố định Hình 30 chỉ ra rằng khả năng sản xuất dextran bởi L.mesenteroides PCSIR-4 tự do cao hơn bởi tế bào cố định nhưng nhiệt độ tối đa cho sản xuất dextran của 2 phương pháp là giống nhau. B. Cố định enzyme: Enzyme dextransucrase sẽ polymer hĩa các gốc glucosyl của sucrose để hình thành nên dextran, nhánh α-1,2 hoặc α-1,3 hoặc a-1,4 được tạo thành phụ thuộc vào enzyme sản xuất. Dextransucrase từ L.mesenteroides NRRL B- 512F là một enzyme khử sucrose chứa những liên kết đồng hĩa trị bao gồm 95% là liên kết α-1,6 trên mạch chính và 5% liên kết α-1,3 trên mạch nhánh. Sự phát triển của việc tổng hợp các oligosaccharide trong cơng nghiệp, việc cố định enzyme dextrasucrase sẽ làm bền các enzyme này và đồng thời phân loại các xúc tác sinh học từ hỗn hợp phản ứng. Một vài phương pháp để cố định dextransucrase đã được nghiên cứu. Chang et al (1981) đã sử dụng các hạt phenoxyaceltyl cellulose để cố định enzyme dextransucrase từ L.mesenteroides. Monsan và Lopez (1980) đã cố định được enzyme này từ L.mesenteroides NRRL B-512F trên chất mang silic amino xốp (Spherosil) được kích hoạt cùng với glutaraldehyde. Alcade et al (1999) đã cố định được enzyme dextransucrase từ L.mesenteroides NRRL B-512F trên 2 chất mang. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 77 L.mesenteroides PCSIR-4 sẽ sản xuất 2 loại enzyme, nội bào và ngoại bào. Enzyme dextransucrase nội bào được sử dụng để sản xuất dextran bằng cách cố định cả tế bào vi sinh vật. Chất lượng của dextran sản xuất theo phương pháp trên rất thấp bởi vì enzyme này khơng cĩ khả năng hình thành phức hợp enzyme – cơ chất. Do đĩ dextransucrase ngoại bào được sử dụng để sản xuất các loại dextran quan trọng trong cơng nghiệp với khối lượng phân tử đa dạng. Dextran một phần được tinh sạch bằng 36% ethanol lạnh cùng với sự thêm vào của CaCl2 như là chất làm bền. Sau quá trình tinh sạch dextransucrase sẽ được cố định trên các hạt alginate. Thơng thường các hạt alginate được sử dụng để cố định một phần hoặc cả tế bào bởi vì protein hình cầu quá nhỏ so với kích thước các lỗ xốp của alginate. Tuy nhiên trong trường hợp vủa dextransucrase, các lớp dextran sẽ bao bọc lấy bề mặt protein ngăn cản sự rị rỉ của enzyme bởi các lỗ xốp của alginate. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của enzyme dextransucrase cố định: Thời gian của phản ứng tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất luơn luơn là một thơng số quan trọng để cực đại hĩa hoạt tính enzyme. Những enzyme hịa tan khi được ủ với cơ chất trong 15 phút bởi điều kiện chuẩn đạt được hoạt tính enzyme tối đa và sẽ giảm dần theo thời gian. Hình 31: Ảnh hưởng của thời gian ủ lên hoạt tínhdextransucrase cố định và dextransucrase tan Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 78 Hình 31 cho thấy sự so sánh của enzyme cố định so với các enzyme tan. Hoạt tính của enzyme cố định đạt cực đại ở 60 phút. Do đĩ cĩ thể giả định rằng cơ chất mất thời gian lâu hơn để tiến vào bên trong hạt chất mang và phản ứng với enzyme. Kích thước của hạt chất mang là một nhân tố quan trọng trong cơng nghệ cố định enzyme. Trước đĩ nhiều nhà khoa học đã cho rằng đường kính của hạt chứa dextransucrase từ L.mesenteroides B-1299 khơng nên vượt quá 2mm để khuếch tán dễ dàng hơn trong điều kiện cơ chất bão hịa. Remaud – Sincon et al (2001) cho rằng trong phương pháp cố định dextransucrase, sự tắt nghẽn xảy ra bên trong các hạt gel là do ngưỡng hoạt động của hoạt tính các hạt gel. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính của enzyme dextransucrase cố định: Nồng độ cơ chất tối đa cho dextransucrase cố định và dextransucrase tan được chỉ ra trong Hình 32. Hình 32: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính dextransucrase từ enzyme tan và enzyme cố định Những nồng độ khác nhau của sucrose được sử dụng cho thấy rằng nồng độ cực đại của cơ chất trong trường hợp enzyme cố định sẽ cao hơn enzyme tan. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 79 Hoạt tính tăng dần khi nồng độ cơ chất sucrose là 125mg/ml và đạt cực đại ở 200mg/ml. Sau khi đạt cực đại sự ức chế cơ chất xảy ra và gây ra sự khác biệt nhỏ về sự cố định enzyme invertase trong cả 2 trường hợp. Enzyme tan sẽ bị ức chế bởi nồng độ sucrose lớn hơn 10%, ngược lại đối với enzyme cố định thì hoạt tính của nĩ sẽ được giữ lại hồn tồn khi nồng độ sucrose lớn hơn 20%. Kobayashi và Matsuda (1975) cho rằng nồng độ cơ chất khoảng 125mg/ml là cực đại đối với enzyme tan. Trước đĩ nhiều nhà khoa học cho rằng nồng độ sucrose 10% là phù hợp cho sự sản xuất cực đại glucooligosaccharide bởi dextransucrase cố định. Dextransucrase cố định từ L.mesenteroides NRRL B- 512F địi hỏi nồng độ đường rất cao trong thiết bị phản ứng tầng sơi. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme dextransucrase cố định: Enzyme cố định và enzyme tan được thí nghiệm ở nhiều giá trị pH khác nhau. Người ta thấy rằng hoạt tính enzyme cực đại là ở pH 5.0 ở cả 2 trường hợp (Hình 33). Hình 33: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme dectransucrase cố định Kaboli và Reilly (1980) cũng cho rằng hoạt tính enzyme sextransucrase đạt cực đại ở pH 5.2 và enzyme tan cũng tương tự. Trong trường hợp cố định Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 80 enzyme invertase của lịng trắng trứng cĩ một sự thay đổi về pH theo hướng giảm trong trường hợp enzyme cố định. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme dextransucrase cố định: Hình 34: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính dextransucrase tan và cố định Hình 34 cho thấy hoạt tính enzyme dextransucrase cố định đạt cực đại ở 35oC giống như là enzyme tan. Trong khoảng nhiệt độ 20 – 30oC hoạt tính enzyme tăng dần và đạt cực đại ở 35oC rồi giảm xuống. Sự khác nhau giữa enzyme tan và enzyme cố định là enzyme tan cĩ hoạt tính cao hơn. Khi dextransucrase được cố định trên silica xốp, enzyme cố định và enzyme tan đều cho hoạt tính tối đa ở cùng một nhiệt độ là 30oC nhưng hoạt tính của enzyme tan lại cao hơn enzyme cố định. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tính bền của enzyme dextransucrase cố định: Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 81 Hình 35: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của enzyme cố định Những mẫu khác nhau của enzyme dextransucrase cố định được ủ trong một khoảng nhiệt độ 25 – 40oC trong dung dịch đệm citrate phosphate 0.1M (pH 5.0) ở những thời gian khác nhau. Mỗi mẫu sẽ được lấy ra thử nghiệm ở điều kiện chuẩn. Hình 35 cho thấy rằng sau 180 phút ủ, enzyme cố định sẽ mất 21% hoạt tính ở 25oC, 36% ở 30oC và 85% ở 40oC. Kaboli và Reilly (1980) cơng bố rằng khi cố định enzyme dextransucrase trên silica xốp trong 150 phút ủ tại 25 và 30oC, sự mất hoạt tính enzyme tương ứng là 77% và 95%. Kết quả trên cho thấy dextransucrase cố định trên calcium alginate sẽ bền hơn silica xốp. Khi so sánh độ bền của enzyme cố định trên alginate với enzyme tan, ta thấy rằng enzyme tan mất khoảng 86% hoạt tính ở 40oC trong 120 phút ủ trong khi enzyme cố định chỉ mất cĩ 74% trong cùng nhiệt độ và thời gian. Lopez – Munguia et al (1998) cơng bố con số 98% hoạt tính enzyme mất đi ở 45oC trong 125 phút. 2. Hướng sản xuất dextran khác - Sản xuất dextran từ dextrin: Những bài báo hiện tại đã nghiên cứu hồn tất sự sản xuất dextran từ dextrin. Trước đĩ, người ta chỉ biết đến dextran được sản xuất từ sucrose bởi enzyme của vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides hay các vi khuẩn thuộc Lactobacteriaceae. Sự nhận ra con đường tương tự trong việc sinh tổng hợp dextran đã được tiến hành song song trong những nghiên cứu trước đĩ bởi Hehre Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 82 và Hamilton, cho thấy rằng những polysaccharide tương tự tinh bột khơng phải lúc nào cũng được hình thành từ gluco-1-phosphate bằng hệ enzyme phosphorylase, mà cịn cĩ thể được phát sinh từ sucrose bởi sự hoạt động của những enzyme Neisseria perflava. Cả những sự theo dõi trong quá khứ và trong hiện tại đều cho thấy một bằng chứng cĩ giá trị của quy luật: những sản phẩm tự nhiên cĩ thể được tạo thành từ nhiều con đường trao đổi chất khác nhau, từ những cơ chất khác nhau mà ta khĩ thể dự đốn trước được. Sự chuyển hĩa dextrin thành dextran bởi Acetobacter đã tạo ra mối quan hệ chặt chẽ về sự tồn tại giữa polysaccharide của glycogen tinh bột (starch – glycogen) và dextran. Rõ ràng cĩ sự giống nhau về tính chất hĩa học cơ bản giữa chúng. Cả amylopolysaccharide và dextran đều là những polymer của D- glucopyranose. Cấu trúc của amylopolysaccharide là những chuỗi liên kết α-1,4 với các nhánh α-1,6 xuất hiện trong amylopectin, trong khi đĩ dextran được tạo thành từ chuỗi liên kết α-1,6 với α-1,4 ở nhánh. Cả dextran và amylopolysaccharide đều cĩ thể được tổng hợp từ một cơ chất giống nhau (sucrose) bởi những enzyme thích hợp. Thực vậy, dấu hiệu đầu tiên của sự chuyển hĩa sinh học cĩ được theo kết quả thực nghiệm với một lượng nhỏ sản phẩm tạo thành từ hỗn hợp của tinh bột hoặc glycogen bổ sung thêm fructose được lên men thành cơng nhờ enzyme amylosucrase và dextransucrase mang tính chất miễn dịch của dextran. Nghiên cứu về khả năng chuyển hĩa sinh học của các nguyên liệu thuộc nhĩm tinh bột để chuyển thành dextran với 1 sản lượng cao hơn đã cho ta kết quả bởi Shimwell rằng: chắc chắn cĩ vi khuẩn acid acetic từ “ropy” beer là Acetobacter viscosum và Acetobacter capsulatum. Chúng trở nên cực kì nhớt khi sinh trưởng ở mơi trường cĩ lượng dextrin thích hợp (là một thành phần tự nhiên của beer), nhưng khơng cĩ khả năng này khi sinh trưởng trên glucose, fructose, sucrose hoặc maltose. Chúng ta cĩ thể thấy rằng vật liệu nhớt đã được tạo ra trong canh trường dextrin cĩ tính chất huyết thanh học giống như dextran được sản xuất từ sucrose bởi L.mesenteroides. Hơn nữa, vật liệu cĩ tính huyết thanh học giống dextran đĩ được sản xuất khi cĩ sự tác động bởi enzyme của A.capsulatum lên cơ chất dextrin. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 83 Những bằng chứng hĩa học đã đạt được cho đến nay cho thấy sản phẩm được tạo thành từ dextrin trong canh trường cĩ chứa vi khuẩn A.capsulatum thật sự là dextran. Thêm vào đĩ, những dữ liệu bao gồm sự chuẩn bị và phương thức chung về sự tác động của enzyme hịa tan cho thấy cĩ khả năng chuyển dextrin thành dextran. Sự phân lập và phân tích sản phẩm tạo thành từ dextrin bởi canh trường cĩ chứa A.capsulatum: Chủng NCTC của A.capsulatum được cấy vào 2 lít mơi trường cĩ chứa 10g chất chiết men Difco và 66g Pfanstiehl alcohol đã được lắng, dextrin hịa tan từ tinh bột bắp. Sau khi lên men ở 25oC trong 10 ngày, canh trường trở nên rất nhớt, cĩ chứa một lượng rất nhỏ phần tử giống thạch, và biểu hiện tính chất huyết thanh học của dextran khi tiến hành kiểm tra bằng cách hịa tan với nước ở tỉ lệ 1:100000. Ước tính lượng đường khử (như maltose) giải phĩng ra được xử lý với amylase nước bọt cho thấy một lượng xấp xỉ 14.5g (22%) dextrin trong canh trường đã được sử dụng. Sản phẩm thu được từ canh trường nhớt được phân lập mà khơng cần phải thủy phân lượng dextrin cịn dư bởi amylase để giữ được những liên kết hĩa học chứa trong sản phẩm. Sự phân tách được chỉ dẫn bởi những kiểm tra về huyết thanh học và kiểm tra về khoảng đổi màu của iod. Sản phẩm đạt được đã cho thấy rằng cĩ ít nhất 99% vật liệu cĩ tính huyết thanh học được tạo ra bởi canh trường và cĩ chứa ít hơn 1% lượng dextrin sĩt. ðầu tiên canh trường được điều chỉnh về pH 6 được làm ấm lên 70oC và lắc trong 10 phút để làm phân tán những phần tử giống thạch. Sau đĩ cho thêm 0.8 thể tích ethanol. Hỗn hợp được ly tâm sau khi được giữ lạnh qua đêm và sản phẩm nhớt lắng xuống được hịa tan trong nước cất, và tách những tế bào vi khuẩn bằng sự ly tâm. Dung dịch gum thơ của A.capsulatum sau khi cho thêm 20g natri acetate được xử lý với 800ml (0.4 thể tích) ethanol; sau 15 phút giữ ở nhiệt độ phịng, hỗn hợp được lắng và những dịch lỏng nổi trên bề mặt được tách ra khỏi hỗn hợp. Những cặn này cũng cịn sĩt lại dextran với hàm lượng vết. ðể tách những cặn này, một lượng thể tích nhiều hơn 400ml (0.2 thể tích) được thêm vào. Lượng sản phẩm kết tủa được tách ra bằng phương pháp ly tâm, hịa tan vào trong 1l nước, lắng bởi 0.6 thể tích methanol và cuối cùng đem đi sấy bằng máy sấy chân khơng ở 25oC với CaCl2. Sản lượng thu được là 14.96g (tính trên hàm lượng chất khơ) tương đương với 22% dextrin đã được chuyển hĩa. Tính chất của dextran lên men bởi A.capsulatum : Sản phẩm được phân lập cĩ màu trắng như tuyết, ở dạng bột vơ định hình, tan chậm trong nước, sau khi trương nở tạo dung dịch trắng đục giống sữa. Hàm lượng tro và nitơ khơng đáng kể (< 0.05%) và lượng đường khử nhỏ hơn 1:2000 (tính trên glucose). Gĩc Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 84 quay cực 215893][α = +190 o (c = 0.25 trong dung dịch NaOH 0.5N). Sau khi gia nhiệt 6 giờ với H2SO4 trong bồn thủy tinh kín được nhúng vào nước sơi, sản phẩm thủy phân ( trung tính) cĩ gĩc quay cực là 225893][α = +53,7(c = 2,5) và cĩ chứa 94% lượng đường khử như glucose. 1g sản phẩm mẫu sau quá trình thủy phân như vậy được loại bỏ sulfate bằng BaSO4, bốc hơi alcohol sẽ cho 0.98 g tinh thể D-glucose (tính trên hàm lượng chất khơ). Dữ liệu trên đã chỉ ra rằng sản phẩm của A.capsulatum là polysaccharide cao phân tử, chứa chủ yếu là các liên kết α-glucopyranose. Những thơng tin chi tiết về cấu trúc của polysaccharide của A.capsulatum cĩ được khi so sánh với 4 polysaccharide khác, đĩ là: dextran được phân lập từ canh trường vi khuẩn L.mesenteroides B, glycogen của hàu, amylopectin của bắp và dextrin “becteriological” được sử dụng trong mơi trường nuơi cấy.Tất cả được đồng thời được khảo sát theo trình tự sau đây: Giới hạn của sự chuyển hĩa thành maltose bởi α-amylase và β-amylase được xác định trong mẫu cĩ chứa 5 g mỗi polysaccharide khảo sát ở trên hịa tan trong 3 ml NaCl 0.15M (cĩ gia nhiệt). Mỗi mẫu được ủ trong 22h ở 30oC với (a) 3ml dịch nước bọt đã được lọc với tỷ lệ 1:25, pH 5.8 và với (b) 3 ml dung dịch chứa 3 ml dung dịch chứa 1 mg β-amylase luá mì trong dung dịch đệm acetate 0.3 M, pH 4.6. Lượng đường khử được giải phĩng ra được tính tốn bằng lượng maltose, sau khi đã hiệu chỉnh bằng nước cất. Quan sát sự chuyển màu của iod như sau: 5 ml dung dịch 0.2% của polysaccharide được pH 5.8 được cho vào thêm 0.2 ml dung dịch iod 1% và KI 2%. Tốc độ thủy phân bởi HCl 0.5 N được xác định dựa trên 0.05% dung dịch polysaccharide. Hỗn hợp được gia nhiệt kín ở 100oC trong 15, 30 và 45 phút, sau đĩ được làm lạnh, trung hịa và kiểm tra hàm lượng glucose. Tốc độ phản ứng được diễn tả bằng hằng số tốc độ bậc nhất K1.10 3. Dung lượng để đưa ra sự lắng huyết thanh với dextran-reactive antisera được xác định bằng cách pha lỗng ở những nồng độ khác nhau tất cả các polysaccharide. Sự so sánh chi tiết về tính chất huyết thanh học của polysaccharides được tinh sạch của Acetobacter và Leuconostoc đã được cơng bố. Quá trình oxy hĩa bởi natri metaperiodate được thực hiện bằng sự thay đổi đơi chút kỹ thuật của Jeans và Wilham. Một lượng nằm giữa 105 – 110 mg các polysaccharide (khơ) được hịa tan vào nước cất nĩng và được xử lý với 6 ml natri metaperiodate 0.275 M (cứ 1 mol glucose anhydride thì cần xấp xỉ là 2.5 mol NaIO4 ) và cho vào một lượng nước vừa đủ để tạo 250 ml dung dịch. Hỗn hợp được giữ ở trong tối ở 25oC và được phân tích sau 24, 48, 72 giờ. ðể xác định lượng periodate đã tiêu thụ, 50 ml hỗn hợp được xử lý với 6 ml NaHCO3, 10 ml dung dịch 0.1 Na2HAsO3 trong NaHCO3 2N và 0.4 ml KI 20%; sau khi giữ trong tối 10 phút , lượng dư Na2HAsO3 được ước tính bằng sự chuẩn độ với iod 0.1N. Sự tạo ra acid fomic được xác định bằng 25 ml hỗn hợp polysaccharide Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 85 periodate thơng qua sự chuẩn độ bằng phenolphtalein với NaOH 0.01N sau khi ủ sơ bộ trong tối 1 giờ ở 25oC với 0.5 ml ethylen glycol. Bảng 21 liệt kê lượng periodate được tiêu thụ và lượng acid fomic được giải phĩng ra sau 48 giờ tính theo mol/mol đơn vị cơ bản (glucose – H2O) của polysaccharide. Từ những dữ liệu được minh họa trong Bảng 21, nĩ cho thấy rõ rằng đặc điểm chính của polyglucoside sản xuất bởi A.capsulatum tương đồng với dextran Leuconostoc, khác với các polysaccharide khác như glycogen hàu, amylopectin của bắp, “bacteriological” dextrin. ðặc điểm của dextran sản xuất bởi A.capsulatum là sự chống lại hầu hết α-amylase và β-amylase, khơng cĩ hoặc chuyển màu rất ít iod, tốc độ phản ứng thủy phân bằng acid khá chậm, cĩ hoạt tính huyết thanh và cĩ phản ứng vĩi periodate. Sự tạo ra một lượng đường khử khơng đáng kể khi cho xử lý với amylase và lượng ít ỏi sản phẩm của A.capsulatum cho phản ứng màu với iod được xem như là thuộc tính của chúng. Cĩ thể do trong sản phẩm cịn lẫn một lượng vết các vật liệu thuộc nhĩm tinh bột cĩ trong canh trường dextrin ban đầu. Những dữ liệu thu được bởi quá trình oxy hĩa periodate cung cấp một bằng chứng thuyết phục về sản phẩm của Acetobacter, giống như dextran của Leuconostoc với liên kết α-1,6 glucoside chiếm chủ yếu. Polyglucoside của Acetobacter làm giảm 1.89 mol periodate và làm giải phĩng 0.82 mol acid formic/mol glucose anhydride sau thời gian oxy hĩa 48 giờ. Kết quả này cũng tương tự như ở dextran B của Leuconostoc. Một polysaccharide chứa tồn bộ liên kết α-1,6 glucoside theo lý thuyết sẽ tiêu thụ 2 mol periodate và giải phĩng 1 mol acid formic/mol glucose; trong khi đĩ polymer cao phân tử của glucose khác với liên kết α-1,6 glucoside được cho rằng hoặc khơng tạo ra một lượng acid forrmic đáng kể hoặc khơng làm giảm hơn 1 mol periodate/ mol glucose bởi vì những đơn vị glucose cơ bản của chúng sẽ khơng thay thế những nhĩm glucosyl trên nhũng nguyên tử carbon cận kề nhau như các đơn vị glucose cấu thành nên dextran. Từ lượng acid formic được thải ra, người ta đã tính tốn tỷ số giữa liên kết α-1,6 glucoside so với các liên kết kết khác cho sáu mẫu dextran của Leuconostoc. Tỷ lệ này vào khoảng 24:1 – 3:1. Trong trường hợp polysaccharide của Acetobacter và dextran B của Leuconostoc, tỷ lệ này lại xấp xỉ là 5:1. Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 86 Bảng 21: Tính chất của Acetobacter polyglucoside trong sự so sánh với Leuconostoc dextran B, Glycogen hàu, Amylopectin từ bắp, “Bacteriological” dextrin Sự chuyển hĩa thành maltose Sự oxy hĩa periodate Polysaccharide α- amylase nước bọt (%) β- amylase từ lúa mì (%) Phản ứng màu với iod, dung dịch 1:500 Tốc độ thủy phân bằng acid, K1.10 3 (min- 1) Hoạt tính huyết thanh * Lượng periodate tiêu thụ (mol) Lượng acid formic giải phĩng (mol) Acetobacter polyglucoside Leuconostoc dextran B Glycogen hàu Amylopectin từ bắp “Bacteriological” dextrin 1.0 0.0 71 93 86 0.2 0.0 33 61 64 Khơng (!) Khơng (!) Nâu đỏ Tím đậm Nâu sẫm 11 10 41 54 52 +++ +++ 0 0 0 1.89 1.83 1.02 1.06 1.22 0.82 0.84 0.08 0.04 0.22 (!): Màu xanh lá cây nhạt cĩ thể được tạo thành khi nồng độ polysaccharide cao hơn lúc xử lý với Iod. (+++): Sự kết tủa ở tỷ lệ pha lỗng trên 1:1 triệu polysaccharide với huyết thanh miễn dịch cầu khuẩn tuýp 2 và 20, ở tỷ lệ từ 1:10,000 đến 1:50,000 với huyết thanh miễn dịch cầu khuẩn tuýp 12. Khơng cĩ sự kết tủa ở tỷ lệ trên 1:10,000 với huyết thanh miễn dịch cầu khuẩn tuýp 2, 20, 12. Sự chuyển hĩa của dextrin thành dextran bởi enzyme của tế bào A.capsulatum tự do: Trong mơi trường cĩ dextrin, A.capsulatum cĩ khả năng sản xuất dextran rất mạnh. ðối với những nguồn carbohydrate khác thì sự tạo thành dextran hồn tồn khơng xảy ra. Lượng dextran tạo thành và lượng mất đi xấp xỉ bằng nhau đã Cơng nghệ lên men Sản xuất Dextran 87 phản ánh rằng hoạt động của hệ enzyme của A.capsulatum đã chuyển đổi các gốc α-1,4 D-glucopyranose của dextrin thành các gốc α-1,6 của dextran. Dung dịch của hệ thống enzyme này được chuẩn bị cho thí nghiệm bằng cách nuơi cấy vi khuẩn A.capsulatum ở 25oC trong 3 – 4 ngày trong mơi trường cĩ chứa 0.5% chất chiết men Difco, 0.2% glucose. 4 lít canh trường (thường ở pH 4.5) được xử lý với amonium sulphate (1.5 kg). Sau đĩ canh trường sẽ được ly tâm trong vịng 1h với tốc độ 1500 rpm và phần lắng xuống sẽ được hút cho vào 75 ml nước cất. Sau khi tách hầu hết các tế bào vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm sơ bộ, dung dịch enzyme sẽ được làm tinh sạch bằng cách sử dụng máy ly tâm đầu nghiêng cỡ lớn (large angle head centrifuge) và được giữ ở -70oC. Những hỗn hợp dung dịch dextrin “bacteriogical” cho thấy sự giảm xuống khơng ngừng của mức độ nhuộm màu cho bởi iod và lượng đường khử được giải phĩng ra bởi amylase nước bọt và cũng chứng minh được tính hữu dụng của dextrin trong sự sản xuất dextran. Trong cùng một khoảng thời gian, chúng đạt được sự tăng lên về mức độ một đặc tính mới. ðiều này cung cấp một bằng chứng cĩ cơ sở về việc tổng hợp dextran từ dextrin, cụ thể là ở khả năng cho kết tủa huyết thanh với huyết thanh miễn dịch cầu khuẩn tuýp 2 và 20. Những sự thay đổi này thể hiện một cách nổi bật ở