Đề tài Chiết xuất quercetin bằng chất lỏng siêu tới hạn

MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình ảnh v Đặt vấn đề 1 Chương 1 - TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cương về phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Dụng cụ 5 1.1.3. Nguyên tắc hoạt động 6 1.1.4. Ưu nhược điểm 7 1.1.5. Ứng dụng 7 1.2. Tổng quan về hành tây 8 1.2.1. Thực vật học 8 1.2.2. Thành phần hoá học 10 1.2.2.1. Sulphur hữu cơ 10 1.2.2.2. Saponin 11 1.2.2.3. Flavonoid 12 1.2.2.4. Các thành phần khác 13 1.2.3. Tác dụng và công dụng 14 1.2.3.1. Hành tây trong y học cổ truyền 14 1.2.3.2. Tác dụng dược lý của hành tây theo y học hiện đại 15 1.2.3.3. Công dụng và cách dùng 16 1.2.3.4. Một số chế phẩm hiện đại từ Hành tây 17 1.3. Tổng quan về quercetin 18 1.3.1. Khái quát 18 1.3.2. Tác dụng trên một số bệnh 19 1.3.3. Tính an toàn 20 1.3.4. Liêu dùng 20 Chương 2 - PHẦN THỰC NGHIỆM 21 2.1. Chiết xuất quercetin bằng carbon dioxide siêu tới hạn 21 2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn 21 2.1.2. Trang thiết bị 21 2.1.3. Quá trình chiết xuất 23 2.1.4. Hệ thống HPLC phân tích mẫu 23 2.1.5. Kết quả và bàn luận 24 2.2. Chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn 28 2.2.1. Nguyên liệu và thiết bị 28 2.2.2. Quá trình chiết xuất 29 2.2.3. Quy trình phân tích bằng HPLC 30 2.2.4. Tối ưu hoá các thông số chiết xuất 31 2.2.4.1. Tác động của nhiệt độ 31 2.2.4.2. Tác động của thời gian chiết xuất 32 2.2.4.3. Tỷ lệ mẫu và DE 33 2.2.5. Kết quả và bàn luận 34 2.2.5.1. Kết quả chiết xuất bằng nước siêu tới hạn 34 2.2.5.2. So sánh SWE với các phương pháp chiết khác 36 2.3. Kiểm nghiệm nguyên liệu hành tây 37 Chương 3 - KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH 38 3.1. Kết luận 38 3.2. Nhận định 38 Tài liệu tham khảo 39 Phụ lục PL DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MeOH Methanol EtOH Ethanol CO2 Carbon dioxide HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) SFE Chiết lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction) Pc Áp suất tới hạn Tc Nhiệt độ tới hạn DE Tảo cát trái đất (diatomaceous earth) SWE Chiết bằng nước siêu tới hạn (subcritical water extraction) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số dung môi có thể sử dụng cho phương pháp chiết siêu tới hạn 4 Bảng 1.2. So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn 4 Bảng 1.3. γ-Glutamyl peptides trong A.cepa L. 11 Bảng 1.4. Các thành phần flavonoid trong Hành tây (mg/kg) 13 Bảng 2.1. Kết quả chiết quercetin của giống hành vàng và giống hành đỏ 24 Bảng 2.2. Hiệu suất chiết và độ phục hồi của SWE 34 Bảng 2.3. Thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE và nguyên liệu vỏ củ hành ban đầu 35 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Giản đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất 3 Hình 1.2. Bộ dụng cụ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn 5 Hình 1.3. Hệ thống máy chiết lỏng siêu tới hạn 6 Hình 1.4. Thân, củ và hoa Hành tây 9 Hình 1.5. Chế phẩm Maderma 17 Hình 1.6. Chế phẩm Allium capa 6C 17 Hình 2.1. Sơ đồ thiết bị chiết quercetin bằng Carbon dioxide siêu tới hạn. 22 Hình 2.2. Biểu đồ tương quan giữa lượng quercetin chiết xuất và thể tích ethanol. 25 Hình 2.3. Biểu đồ tương quan giữa thể tích ethanol trong mỗi ống và thời gian 26 Hình 2.4. Biểu đồ tương quan giữa tỉ lệ chiết xuất và thời gian 26 Hình 2.5. Sơ đồ chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn 28 Hình 2.6. Sắc ký đồ của quercetin từ dịch chiết vỏ củ hành tây 30 Hình 2.7. Ảnh hưởng nhiệt độ lên phương pháp chiết quercetin bằng SWE cho các lần chiết với thời gian 10 phút và 15 phút 31 Hình 2.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất quercetin bằng SWE ở nhiệt độ 165oC và 170oC 32 Hình 2.9. Ảnh hưởng tỷ lệ vỏ củ hành và DE trong chiết xuất quercetin bằng SWE 33 Hình 2.10. So sánh các phương pháp chiết 36 ĐẶT VẤN ĐỀ ----š›&š›----- Flavonoids là polyphenols có rất nhiều trong trái cây, rau củ, và ngũ cốc. Flavonoids được chia thành nhiều nhóm nhỏ, chúng bao gồm các anthocyanidins, chủ yếu tạo các màu đỏ và xanh trong trái cây, nước trái cây, rượu vang và các loài hoa; các catechin, có nhiều trong lá trà; các flavonones và flavanone glycosides, tìm thấy trong cam quýt và mật ong; và các flavon, flavonols và flavonol glycosides, có nhiều trong lá trà, trái cây, rau củ, mật ong. Flavonoids được biết đến với khả năng chống oxy hóa, tạo phức với các ion kim loại hoá trị 2, có lợi cho sức khỏe con người. Các hợp chất này có tác dụng chống lại dị ứng, viêm nhiễm, virus, cao huyết áp, viêm khớp, và được báo cáo ngăn ngừa đột biến, ung thư và AIDS [15]. Quercetin được nghiên cứu bởi Caltagirone rằng quercetin và apigenin ức chế sự tăng trưởng, việc xâm lấn và tiềm năng di căn của khối u ác tính [4]. Quercetin có tiềm năng để trở thành một liệu pháp hóa trị ung thư tuyến tiền liệt như báo cáo của Xing (2001) [25]. Flavonols này cũng được xem là có chức năng chống oxy hóa [19]. Có hai nhóm chất chống oxy hóa chính: tổng hợp và tự nhiên. Một trong các xu hướng quan trọng nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm hiện nay là nhu cầu tìm về và sử dụng các chất chống oxy hoá tự nhiên. Chúng an toàn hơn, ít tác dụng phụ và ít độc tính hơn các chất chống oxy hoá tổng hợp. Củ hành chứa rất nhiều quercetin glucosides (quercetin-3,4'-diglucoside và quercetin-4'-monoglucoside). Lớp vỏ ngoài cùng của củ hành chuyển sang màu nâu và khô trong quá trình già đi, và các glycosides của quercetin chuyển dạng thành quercetin tự do. Herrmann (1976) cũng cho rằng trong củ hành khô chứa chủ yếu là dạng quercetin tự do hơn là dạng glycoside. Theo Bilyk er al. (1984) thì lớp vỏ khô phía ngoài có nhiều quercetin hơn lớp bên trong ở tất cả tám giống hành được nghiên cứu. Giống cao nhất chứa tới 34,15g quercetin/ kg vỏ hành khô. Các giống khác chứa từ 1,14 – 16,53g quercetin/kg [11]. Chiết xuất flavonols từ mô hành trong các nghiên cứu ở trên được thực hiện bằng cách chiết với dung môi methanol. Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuật này là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải methanol, độc tính của methanol còn lẫn trong sản phẩm,…. Do đó, phương pháp chiết quercetin một cách nhanh chóng, rẽ tiền và ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn có nhiều lợi thế hơn các phương pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện, tự động hóa và thân thiện với môi trường. Hy vọng bài báo cáo này sẽ cung cấp thêm một số thông tin về chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn, góp phần hiện đại hoá các phương pháp chiết xuất các hợp chất thiên nhiên trong tương lai. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG SIÊU TỚI HẠN [2],[9],[16],[21],[26]: Được biết đến cách đây rất lâu từ năm 1879, nhưng đến những năm 1980, phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ nghệ để chiết các hợp chất thiên nhiên ra khỏi thực vật như tinh dầu cà phê, trà, gia vị và nhất là hoa bia. 1.1.1. Định nghĩa: Một hợp chất ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn. Ở trạng thái siêu tới hạn, hợp chất này không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí. Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn là phương pháp chiết sử dụng dạng dung môi đặc biệt là dung môi ở trạng thái siêu tới hạn. Trạng thái rắn Trạng thái lỏng Điểm ba Điểm ba Điểm tới hạn Chất lỏng siêu tới hạn T0C Pc Nhiệt độ Áp suất Khí Hình 1.1. Giản đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất Điểm ba là nơi mà ba trạng thái rắn, lỏng và khí giao nhau. Các đường cong là nơi hai trạng thái cùng hiện diện. Quan sát dọc theo đường cong khí - lỏng hướng lên cao gặp 1 điểm, nơi đó nồng độ của khí và lỏng bằng nhau. Điểm này được gọi là điểm siêu tới hạn và hợp chất lúc đó gọi là chất lỏng siêu tới hạn. Tại điểm tới hạn, áp suất và nhiệt độ có các giá trị được gọi lần lượt là áp suất tới hạn (Pc) và nhiệt độ tới hạn (Tc). Hai giá trị này là đặc trưng cho từng chất. Bảng 1.1. Một số dung môi có thể sử dụng cho phương pháp chiết siêu tới hạn Dung môi Nhiệt độ tới hạn Áp suất tới hạn Nước 374 218 EtOH 241 61 MeOH 240 80 Aceton 235 46 NH3 132 115 Propan 97 42 Clorodifloromethan 96 50 Propen 92 45 Ethan 32 48 CO2 31 73 Xenon 17 59 Ethylen 09 50 Methan -83 45 Bảng 1.2. So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn Trạng thái Khí (00C, 1atm) Siêu tới hạn Lỏng Tỷ trọng (g/cm3) 10-3 0,2-0,5 0,6-2 Hệ số khuếch tán (cm2/s) 10-1 10-3-10-4 10-5 Độ nhớt (g/cm/s) 10-4 10-4 10-2 Trong số đó dung môi CO2 là thông dụng nhất vì Áp suất và nhiệt độ tới hạn thấp Giá tiền rẻ Bền về hóa học Không độc, không dễ cháy Độ nhớt thấp Khả năng khuếch tán cao An toàn, độ tinh khiết cao Dễ loại ra khỏi dịch chiết bằng cách giảm áp suất Có thể pha thêm MeOH, EtOH để chiết những chất phân cực. Bình chứa CO2 Bình tách Bình chiết Làm lạnh Bơm Làm nóng Điều chỉnh P, t0C Bình ngưng tụ (CO2 lỏng) 1.1.2. Dụng cụ: Hình 1.2. Bộ dụng cụ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn Hệ thống gồm một nguồn cung cấp CO2, một máy bơm, một bộ làm lạnh, một bộ tăng nhiệt, bình chiết chứa dược liệu, bình tách thu sản phẩm và bình ngưng tụ. 1.1.3. Nguyên tắc hoạt động: Nạp dược liệu vào bình chiết, khóa nắp lại. Mở dòng CO2 lỏng đi qua bộ phận làm lạnh rồi qua bơm nén. Sau đó qua bộ tăng nhiệt. Khi đạt nhiệt độ và áp suất, CO2 trở thành dòng siêu tới hạn Dòng này vào bình chiết. Hoạt chất theo dòng CO2 qua bộ phận làm lạnh. Tại đây CO2 hóa lỏng và được đưa vào bình tách. Điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp, CO2 biến thành dạng khí, sản phẩm sẽ lắng xuống, được thu riêng. CO2 dạng khí được đưa qua bộp phận nén lạnh, hóa lỏng và đưa trở lại bình chứa. Quá trình chiết lại tiếp tục. Một số lưu ý: Hình 1.3. Hệ thống máy chiết lỏng siêu tới hạn Trong vài trường hợp đặc biệt, mẫu cần chiết có thể được điều chỉnh pH, hoặc thêm dung môi hoặc làm thấm ướt. Nếu hợp chất có tính phân cực, một lượng nhỏ nước được thêm vào để làm thấm ướt mẫu cần chiết giúp việc chiết thêm dễ dàng. Nếu hợp chất chiết có tính không phân cực, một lượng dầu nhỏ hoặc chất béo trộn thêm vào mẫu chiết. Chất cho thêm (modifier): CO2 chỉ phù hợp để chiết các hợp chất có độ phân cực kém cho đến trung bình. Nếu muốn chiết các chất có tính phân cực cao, cần bổ sung thêm methanol, ethanol hoặc methylen clorua. Thể tích áp dụng: vài ml cho tới hàng ngàn lít. Có loại thiết bị cấu tạo bộ phận nhận mẫu rời, có loại cấu tạo với bộ phận nhận mẫu được nối trực tiếp với máy sắc ký khí hoặc HPLC để khảo sát ngay sản phẩm vừa thu nhận. 1.1.3. Ưu nhược điểm Ưu điểm: Khả năng khuếch tán tốt. Độ nhớt thấp, áp suất hơi cao, điểm siêu tới hạn của CO2 dễ đạt. Độ chọn lọc cao với loại hợp chất cần chiết. Vì thế chất chiết tương đối sạch. Dễ áp dụng ở qui mô công nghiệp. Thân thiện với môi trường. - Tốc độ phản ứng lớn. - Tc = 31,1o C nên hòa tan chất dễ phân hủy ở nhiệt độ cao. - Có khả năng tái sử dụng vì vậy chi phí rẻ hơn.Nhược điểm: Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền. Không thích hợp với mẫu chiết dạng lỏng. Khó lường được khi chiết trên một mẫu mới. Cần có nhiều nghiên cứu tìm các thông số tối ưu để chiết thành công. 1.1.4. Ứng dụng: Lưu chất siêu tới hạn được ứng dụng trong rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm, trong công nghiệp, trong y học… Ứng dụng của dung môi siêu tới hạn trong ngành dược. Chiết lỏng siêu tới hạn: (supercritical fluid extraction - SFE) chiết từ các chất rắn như cà phê, trà, hoa bia hay các thành phần trong thực phẩm (hoa bia, vitamin, lipid...). Cắt phân đoạn (supercritical fluid fractionation – SFF): từ hỗn hợp lỏng. Ngày nay người ta ứng dụng để ly trích hương liệu từ dịch nhiều thành phần được chưng cất. Hoặc dùng để tách lipid phân cực hay những polyme. Sắc ký lỏng siêu tới hạn (Prerarative scale supercritical fluid chromatography- PSFC): dùng để tách phân đoạn sau cùng gồm những chất có cấu trúc rất giống nhau. Phản ứng (supercritical fluid reactions – SFR): lưu chất siêu tới hạn có thể xúc tác các phản ứng tổng hợp, nhất là phản ứng hydrogen hóa. 1.2. TỔNG QUAN VỀ HÀNH TÂY: 1.2.1. Thực vật học: 1.2.1.1. Vị trí phân loại: [3] Giới thực vật (Plantae) Phân giới thực vật bậc cao (Cormobionta) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Hành (Liliidae) Bộ Hành (Liliales) Họ Hành (Liliaceae) Tên khoa học: Allium cepa L. Tên nước ngoài: onion (Anh). 1.2.1.2. Mô tả thực vật: [31] Cây thảo, nhẵn, sống dai do một hành phình to mà ta thường gọi là củ hành, có kích thước thay đổi, gồm nhiều vẩy thịt tức là các bẹ có chứa nhiều chất dinh dưỡng. Củ hành có hình dạng tròn đều (hình cầu) hoặc tròn hơi dẹp hình bầu dục hoặc hình bầu dục dài, thường có màu vàng hay màu tím hoặc màu trắng. Thân chính thức nằm ở dưới giò mang nhiều rễ nhỏ. Lá dài hình trụ, nhọn, rỗng ở giữa. Hoa họp thành tán giả nằm ở đầu một cán hoa hình ống tròn, phình ở giữa. Hoa màu trắng có cuống dài. Quả hạch, có màng; 3 góc với 3 ngăn, bên trên có núm nhuỵ còn tồn tại. Hạt có cánh dày, đen nhạt, ráp. Hình 1.4. Thân, củ và hoa Hành tây 1.2.1.3. Phân bố sinh thái: [31] Hành tây có nguồn gốc từ vùng Trung Á, được trồng từ thời Thượng cổ. Hành tây chịu lạnh giỏi ở nhiệt độ dưới 10oC. Nhưng yêu cầu nhiệt độ không khí nơi trồng chỉ trong phạm vi 15-25oC. Thường nhân giống bằng hạt. Tốc độ nảy mầm của hạt biến động trong phạm vi 7-15 ngày, có khi tới 20 ngày nhưng nếu gieo hạt vào những tháng có nhiệt độ cao thì hạt mau nảy mầm hơn. Hiện nay, các vùng trồng Hành tây chủ yếu ở nước ta dùng một trong hai giống Grano và Granex nhập từ Pháp và Nhật. Hành Grano có củ hành tròn cao, vỏ ngoài màu vàng đậm, thịt trắng; còn hành Granex có hình tròn dẹp, dáng dẹp, vỏ ngoài màu vàng nhạt, thịt trắng, có đường kính củ lớn hơn; cả hai giống đều có chất lượng ngon, đã thích hợp với hầu hết các vùng trồng hành lớn ở đồng bằng sông Hồng, vùng duyên hải miền Trung cũng như vùng Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng. 1.2.2. Thành phần hoá học: Củ tươi của A. cepa L. bao gồm chủ yếu là nước (khoảng 88%), saccharides (khoảng 6%) và protein (khoảng 1,5%). Tuy nhiên, thành phần hoá học cụ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chẳng hạn như điều kiện phát triển, thời gian thu hoạch, thời gian và điều kiện bảo quản. 1.2.2.1. Sulphur hữu cơ: A. cepa L. chứa nhiều hợp chất khác nhau và đã được nghiên cứu trong vòng hơn 100 năm qua. Giống như các loài khác trong chi Allium, ví dụ: A. sativum L. hoặc A. ursinum L., A. cepa L. đặc trưng bởi hàm lượng cao hợp chất sulphur hữu cơ. Chiếm ưu thế nhiều nhất trong các hợp chất sulphur hữu cơ là các axit amin cysteine và methionine, S-alk(en)yl-cysteine thay thế sulphoxides và γ-glutamyl peptide [23]. S-Alk(en)yl-substituted cysteine sulphoxides: các amino acid như L-cysteine, L-cystine và L-methionine chiếm tỷ lệ tương đối thấp trong hành. Cho đến nay, bốn S-alk(en)yl-cysteine sulphoxides, gồm (+)-S-methyl-, (+)-S-propyl-, trans-(+)-S-(1-propenyl)-L-cysteine sulphoxide và cycloalliin, đã được phát hiện trong A. cepa L. S-alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides được chuyển hóa thành axit sulphenic do tác động của alliinase hoặc khi các mô bị phân hủy (ví dụ như bị cắt hoặc ép). Các hợp chất của lưu huỳnh tạo ra axit sulphenic tạo nên vị hăng cay làm chảy nước mắt và mùi hôi, gây nên những hương vị đặc trưng của hành [23]. γ-glutamyl peptide: cho đến nay tổng cộng 14 γ-glutamyl peptide đã được xác định trong hành và 9 trong số đó có chứa nguyên tử lưu huỳnh (Bảng 1.3). Bảng 1.3. γ-Glutamyl peptides trong A.cepa L. γ-Glutamyl peptides γ-Glutamyl peptides chứa sulphur γ-Glutamyl-valine γ-Glutamyl-methionine γ-Glutamyl-isoleucine γ-Glutamyl-S-methyl-L-cysteine γ-Glutamyl-leucine γ-Glutamyl-S-methyl-L-cysteine sulphoxide γ-Glutamyl-phenylalanine γ-Glutamyl-S-trans-(1-propenyl)-L-cysteine sulphoxide γ-Glutamyl-thyrosine γ-Glutamyl-S-(2-carboxypropyl)-cysteinylglycine Glutathione Glutathione-γ-glutamyl-cysteine-disulphide Glutathione-cysteine-disulphide S-Sulphoglutathione γ-glutamyl peptide xuất hiện chủ yếu ở hạt giống không hoạt động và củ hành khô, đóng góp vào sự nảy mầm của hạt giống và có vai trò như một chất dự trữ. (+)-S-Alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides liên kết với chuỗi axit amin γ-glutamyl không được chuyển hóa bởi alliinase. Sau khi phân cắt bởi peptidases và transpeptidases, alk(en)yl-L-cysteine sulphoxides tự do tạo chất dễ bay hơi trong chiết xuất củ hành. Khoảng 90% hợp chất lưu huỳnh hữu cơ tan được tồn tại ở dạng γ-glutamyl peptide, các hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong chất lượng hương vị của hành tây và hoạt tính dược lực thành phần chiết xuất từ củ hành [20], [23]. 1.2.2.2. Saponin: Các saponin được tìm thấy trong hành tây là: sitosterol, oleanolic acid vàmột ít amyrin [13]. Các chất này đã được phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 1982. Trong đó sitosterol có cấu trúc thuộc nhóm steroid còn oleanolic acid và amyrin có cấu trúc triterpenoid. Gần đây năm 2004, các nhà khoa học đã làn đầu tiên phân lập được 4 saponin trong hành tây đều có cấu trúc ruscogenin là: [14] (25S)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabino pyranoside (I) (25R)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside (II) (25R)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (III) (25S)-ruscogenin 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (IV) Ngoài ra, hành tây còn có các loại sapogenin khác là diosgenin và cepagenin. Sitosterol Oleanolic acid 1.2.2.3. Flavonoid: Flavonoid chủ yếu trong hành tây là dẫn chất của quercetin: isoquercetin, quercetin diglucoside, quercetin monoglucoside và quercetin tự do. Hành tây còn chứa kaempferol nhưng hàm lượng rất ít. Quercetin monoglucoside và quercetin diglucoside là flavonoid chính chiếm 80% các chất có chứa quercetin. Tỷ lệ quercetin monoglucoside và quercetin diglucoside là 1:2,2 [22]. Kaempferol Isorhamnetin Các nhà khoa học Italia đã dùng phương pháp HPLC để tách và xác định hàm lượng các flavonoid khác nhau trong 12 giống hành với các màu vỏ khác nhau. Nhận thấy ngoài các dẫn chất của quercetin và kaempferol còn có isorhamnetin (3-methylquercetin) và Isorhamnetin monoglycoside. Dấu vết của kaempferol chỉ được tìm thấy ở giống White Hawk [13]. Bảng 1.4. Các thành phần flavonoid trong Hành tây (mg/kg) Cultivar Quercetin Quercetin monoglyc Quercetin diglyc Rutin Isorhamnetin Isorham. monoglyc. Tổng flavonoid Hành vàng Festival 55,9 374,0 43,1 1,8 3,8 47,2 525,8 Tamara 66,5 460,0 37,9 4,7 2,7 45,1 616,9 Daytona 111,7 713,4 41,3 5,7 6,5 54,2 932,8 Dorata Density 95,4 725,2 73,3 13,6 5,9 65,7 979,1 Castillo 65,0 610,9 50,6 9,0 n.d. 50,7 786,2 Santana 92,3 547,3 49,2 6,3 6,5 48,2 749,8 Trung bình 81,1 571,8 49,2 6,9 5,1 51,9 765,8 Hành đỏ Tropea rossa 557,8 125,9 11,4 1,8 50,4 15,6 762,9 Rossa Lilia 57,5 352,1 32,6 2,7 3,7 38,3 486,9 Redwing 76,6 418,6 30,4 1,7 6,3 48,1 581,7 Trung bình 230,6 298,9 24,8 2,1 20,1 34,0 610,5 Hành trắng Gladstone 0,7 0,8 n.d. n.d. n.d. n.d. 1,5 Southport 0,7 2,0 n.d. n.d. n.d. tr. 2,7 White Hawk 0,6 0,6 tr. n.d. tr. n.d. 1,2 Trung bình 0,7 1,1 n.d. n.d. n.d. n.d. 1,8 n.d.= not detected (không phát hiện) tr.=trace(<0,5) (phát hiện vết) Theo đó, hành vàng và hành đỏ chứa lượng flavonoid nhiều hơn dáng kể so với giống hành trắng. Đây cũng là cơ sở để chọn hành vàng và hành trắng trong chiết xuất quercetin. 1.2.2.4. Các thành phần khác:[30] Trong 100g hành tây có chứa các chất sau: nước 88g, protid 1,8g, glucid 8,3g, chất xơ 0,1g, tro 0,8g; các chất khoáng vi lượng: Ca 38mg, P 58mg, Fe 0,8 mg; các vitamin: B1 0,03mg, B2 0,04mg, PP 0,02mg, C 10mg, caroten 0,03mg. Ngoài ra còn có các nguyên tố: Na, K, S, Si; acid acetic tinh dầu bay hơi, glucokinin, oxydase và diatase… Trong hành tây có chất kháng sinh rất mạnh là phytoncid, khi nhai hành tây trong miệng từ 1-2 phút miệng trở nên rất sạch. 1.2.3. Tác dụng và công dụng: 1.2.3.1. Hành tây trong y học cổ truyền: Allium cepa L. đã được trồng và sử dụng hơn 6000 năm qua. Con người đã phát hiện tính chất dược lý của hành tây và sử dụng nó trong y cổ truyền điều trị nhiều rối loạn lớn nhỏ khác nhau [6]. Nước ép hành tây tươi thường được dùng trong y học dân gian của nhiều quốc khác nhau để giảm đau và sưng do ong hay ong bắp cày đốt, có các phản ứng dị ứng trên da. Các tài liệu cổ Ai Cập đề cập đến hành tây có tác dụng chống nhiễm giun, tiêu chảy, các bệnh nhiễm trùng và viêm nhiễm khác [10]. Trong thời trung cổ châu Âu, hành tây đã được sử dụng không thành công để tránh bệnh dịch hạch [29]. Tại Bắc Mỹ, thổ dân châu Mỹ sử dụng hành tây để điều trị côn trùng cắn và làm giảm cảm lạnh. Nó cũng được dùng trong y học cổ truyền Trung Quốc. Homeopaths dùng dịch chiết cồn của hành tây để điều trị một loạt các bệnh bao gồm ho, cảm lạnh, tiêu chảy, liệt mặt, sốt, thoát vị, viêm thanh quản, viêm phổi, và chấn thương [29]. Ở Việt Nam, hành tây được dùng chữa ho, trừ đờm, ra mồ hôi, lợi tiểu, chữa chứng bụng nước do gan cứng, đắp mụn nhọt, phòng chữa các chứng huyết áp cao, táo bón, giảm mỡ trong máu, kéo dài thời gian đông máu nên được dùng phòng ngừa bệnh động mạch vành và chứng xơ cứng động mạch, chống thấp khớp, chống bệnh hoại huyết, sát khuẩn và chống nhiễm khuẩn, gây tiết mồ hôi, trị ho, làm dễ tiêu hoá, cân bằng tuyến, chống xơ cứng, chống chứng huyết khối, kích dục, chống đái đường, trị giun, gây ngủ nhẹ, trị bệnh ngoài da và hệ lông. Được dùng ngoài để làm dịu và tan sưng, sát khuẩn, chống đau, xua muỗi [31]. Có nhiều bài thuốc từ hành tây trong y học cổ truyền đã khiến một số nhà khoa học ở những năm 20 của thế kỷ trước nghiên cứu dịch chiết từ hành tây hoặc dầu hành trong việc ức chế sự phát triển của giun đường ruột, nấm và vi khuẩn cả in vivo và in vitro. Các cơ chế tác dụng không được biết đến. Mặc khác, các kỹ thuật sử dụng để chiết xuất và bảo quản rất khác nhau trong các nghiên cứu khác nhau. Vì vậy, liều lượng hoặc nồng độ sử dụng là không thể so sánh [6]. 1.2.3.2. Tác dụng dược lý của hành tây theo y học hiện đại: A.cepa L. không được quan tâm nhiều như tỏi (A. sativum L.) - một loài có quan hệ họ hàng. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu đã được thực hiện chứng tỏ hành tây và dịch chiết của nó có tác dụng trêm tim mạch. Tinh dầu hành ức chế tổng hợp acid arachidonic, ức chế kết tập tiểu cầu in vitro và in vivo. Một phần tác dụng này là do tinh dầu hành ức chế sinh tổng hợp thromboxane. Ngoài ra, tinh dầu hành và hành tươi gia tăng sự phân huỷ fibrin in vivo ở thỏ và người tình nguyện. Hành tây không những có ích cho tim mạch mà còn có lợi trong các bệnh về chuyển hoá như tiểu đường hoặc tăng lipid huyết. Trong bệnh tiểu đường, hành tây giảm bớt sự cần thiết phải sử dụng thuốc hạ đường huyết bằng đường uống. Ở bệnh nhân tăng lipid máu, hành tây ngăn chặn sự gia tăng cholesterol và triglycerides trong huyết tương. Tuy nhiên, cơ chế của các tác động trên vẫn chưa được biết một cách chính xác [27]. Hành tây có chứa thiosulphinate, một hợp chất có hiệu quả trong việc tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn thông thường, bao gồm cả Salmonella typhi, Pseudomonas aeriginosa, và Escherichia coli [29]. Một số nghiên cứu in vitro và động vật cho thấy tinh dầu hành tây có thể ngăn chặn sự phát triển của khối u. Mặc dù những kết quả không áp dụng trên người, nhưng trong một nghiên cứu năm 1989 được thực hiện tại Trung Quốc, những người ăn một lượng lớn các loại rau trong chi Allium giảm đáng kể tỷ lệ bệnh ung thư dạ dày. Hành tây còn có chứa chứa chất chống oxy hóa là những hợp chất bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do giúp chống lại một số bệnh thoái hóa [29]. 1.2.3.3. Công dụng và cách dùng: [30] Hành tây là loại rau được sử dụng phổ biến ở châu Âu trong bữa ăn hàng ngày. Ở nước ta, Hành tây cũng thường được sử dụng để xào với các loại thịt, dùng chế dầu giấm và để ăn sống rất được ưa chuộng. Để làm thuốc, Hành tây được chỉ dẫn dùng trong để trị mệt mỏi, suy nhược cơ thể và thần kinh, chứng ít nước tiểu; bí dịch, thuỷ thũng, thừa urê huyết, tăng chlorur huyết, lên men ruột, đau sinh dục tiết niệu, đau ngực, cúm, mất trương lực tiêu hoá, mất cân bằng tuyến, béo phì, xơ cứng động mạch, đề phòng chứng huyết khối, đề phòng sự già yếu, mệt lả, bất lực, đái đường, viêm hạch, tạng bạch huyết, ký sinh đường ruột. Dùng ngoài để trị áp xe, chín mé, nhọt, ong vò vẽ đốt, cước nứt nẻ, đau nửa đầu, sung huyết não, đau dây thần kinh răng, mụn cóc, vết thương, loét và trừ muỗi. Cách dùng: Thông thường nhất là ăn sống, cũng có thể ngâm trong nước nóng (trị cảm cúm) hoặc đun sôi 10-15 phút (trị ỉa chảy, thấp khớp) hoặc ngâm độ một tuần trong rượu trắng (trị vật ký sinh đường ruột). Người ta còn làm thuốc (ngâm Hành tây trong cồn 90 độ), làm rượu thuốc 20%. Dùng ngoài dưới dạng thuốc đắp trị thấp khớp, đau đầu, sung huyết não, viêm màng não, bí tiểu tiện, rệp đốt, mụn nhọt, áp xe, trị nứt nẻ, vết thương v. v.., thuốc xoa (trị chín mé, tàn nhang), dịch chiết (nhỏ trị ù tai, tẩm bông đặt vào răng sâu) hoặc cắt đôi củ Hành đặt cạnh giường ngủ để xua muỗi. 1.2.3.4. Một số chế phẩm hiện đại từ Hành tây: Kem xoá sẹo Mederma [32] Kem xoá sẹo Mederma của Merzco, Đức được chiết xuất từ Allium cepa, là loại thuốc kích thích tế bào da tái tạo lại hoàn chỉnh, tạo cho da mịn và có sức sống. Cách sử dụng: vết thương sau khi đã lành thoa mỗi ngày 3-4 lần .tùy vào vết sẹo mới cũ và quá trình sản sinh tế bào da nhanh chậm của từng người. Hình 1.5. Chế phẩm Maderma Viên nén Allium Cepa [33] Viên nén Allium Cepa 6C của Weleda, USA trị cảm, ho, mất ngủ. Cách sử dụng: 1-2 viên ngậm dưới lưỡi. Hình 1.6. Chế phẩm Allium capa 6C 1.3. TỔNG QUAN VỀ QUERCETIN: [28] Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one Quercetin Tên khác: Sophoretin, Meletin, Quercetine, Xanthaurine, Quercetol, Quercitin,Quertine. Flavin meletin Công thức phân tử: C15H10O7 Khối lượng mol: 302,236 g/mol Tỷ trọng: 1,799 g/cm3 Nhiệt độ nóng chảy: 316 °C 1.3.1. Khái quát: Quercetin là một flavonol chủ yếu trong hơn 4.000 flavonoids (chất chống oxy hóa) được tìm thấy trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật chẳng hạn như rượu vang đỏ, hành, trà xanh, táo, quả mọng, và rau Brassica (bắp cải, bông cải xanh, súp lơ, củ cải). Quercetin và Rutin (một flavonol khác) được sử dụng ở nhiều nước trong các bệnh tim mạch (bảo vệ mạch máu) và là thành phần của nhiều chế phẩm đa sinh tố và các thuốc từ thảo dược. Quercetin chủ yếu ở dạng glycosides, có nghĩa là chúng được kết nối với đường khác nhau. Tuy nhiên, khả năng cơ thể hấp thụ các hợp chất này chưa rõ ràng. Quercetin và flavonols khác có nhiều tác dụng sinh học, nhưng các bằng chứng khoa học cho việc sử dụng quercetin trong phòng ngừa hoặc điều trị bệnh là không chắc chắn. Quercetin đã được coi là một liệu pháp cho bệnh tim mạch, cholesterol cao, đục thủy tinh thể bệnh tiểu đường, viêm nhiễm, tổn thương thiếu máu cục bộ, viêm tuyến tiền liệt mạn tính, suy tĩnh mạch mạn tính, viêm loét đường tiêu hóa, viêm gan, dị ứng, hen suyễn, nhiễm virus, và cảm mạo. Các tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu về sự kết hợp của quercetin với việc giảm nguy cơ bệnh tim mạch vành và đột quỵ cao huyết áp, ung thư. Tuy nhiên, thiếu bằng chứng thuyết phục chứng minh các thông tin trên. 1.3.2. Tác dụng trên một số bệnh: Các nghiên cứu đã được thử nghiệm ở người hoặc động vật. Tính an toàn và hiệu quả không phải luôn luôn được chứng minh. Bệnh tim mạch Một số tác dụng của flavonoid đã được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và trên động vật cho thấy chúng hiệu quả trong việc giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Các nghiên cứu ở người bằng cách sử dụng các hợp chất polyphenolic từ nho đỏ cho thấy cải thiện chức năng nội mạc ở bệnh nhân có bệnh tim mạch vành. Cao huyết áp Các nghiên cứu báo cáo rằng quercetin có liên quan với giảm nguy cơ bệnh mạch vành và đột quỵ. Quercetin hỗ trợ làm giảm huyết áp ở động vật gặm nhắm và người cao huyết áp. Phòng ung thư tuyến tụy Một số nghiên cứu cho thấy rằng quercetin có thể giúp ngăn ngừa ung thư tuyến tụy ở những người hút thuốc. Tuy nhiên, quercetin đã không có hiệu ứng này ở người không hút thuốc hay hút thuốc lá trước đây. Cần nghiên cứu thêm để xác định xem quercetin có lợi hay không. Viêm tuyến tiền liệt / hội chứng đau vùng chậu mãn tính Có một số bằng chứng cho thấy quercetin có thể hữu ích cho việc điều trị viêm tuyến tiền liệt mãn tính và hội chứng đau mãn tính vùng chậu. Nghiên cứu thêm là cần thiết để xác nhận các kết quả này. 1.3.3. Tính an toàn: Dị ứng Tránh sử dụng ở những người bị dị ứng hoặc quá mẫn cảm với quercetin do ăn hoặc tiếp xúc với da. Có thể gây kích ứng đường hô hấp, mắt, da, đường tiêu hóa. Phản ứng phụ Là một thành phần phổ biến trong thực phẩm, quercetin nói chung là an toàn và dung nạp tốt ở chế độ ăn uống bình thường. Tuy nhiên nó được xem là có liên hệ với đau đầu, rối loạn tiêu hóa, tụ máu, và độc tính trên thận. Tiêm tĩnh mạch có liên quan với cơn đau và nồng độ quercetin có thể được kiểm soát bằng cách giảm tốc độ tiêm. Quercetin tiêm tĩnh mạch cũng dẫn đến đổ mồ hôi, bốc hỏa, khó thở, buồn nôn, ngứa nhẹ của các chi, thờ ơ, và ói mửa. Cần quan tâm hiệu ứng thúc đẩy khối u phát triển có thể có của quercetin. Táo bón nhẹ và tóc mỏng đi đã được báo cáo hai trường hợp trong số 260 bệnh nhân dùng AS195, chứa chiết xuất lá nho đỏ có chứa nhiều quercetin. 1.3.4. Liêu dùng: Người lớn (trên 18 tuổi) Quercetin cần được uống 20 phút trước bữa ăn. Liều 100-500 mg quercetin 2-3 lần / ngày. Các dạng bào chế có thể là: viên nén, viên nang cứng hoặc nang mềm. Có thể tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp với các chế phẩm phù hợp. Trẻ em (dưới 18 tuổi) Không đủ bằng chứng để khuyến cáo liều dùng. CHƯƠNG 2 - PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. CHIẾT XUẤT QUERCETIN BẰNG CARBON DIOXIDE SIÊU TỚI HẠN: [11] Phương pháp này được thực hiện tại đại học bang Michigan của Mỹ năm 2003, sử dụng CO2 làm chất lỏng siêu tới hạn. 2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn: - Carbon dioxide công nghiệp (CO2, BOC gases, Murray Hill, NJ) đượcsử dụng như một chất lỏng siêu tới hạn (SF). - Hành đỏ và hành vàng được lấy từ các trang trại Muck (Đại học bang Michigan, East Lansing, MI). Để bảo vệ nguyên liệu trong giai đoạn nghiên cứu hành được lưu trữ tại – 20oC. - Ethyl alcohol mua từ Pharmco (Brookfield, CT). - Phosphoric acid 86,3% cung cấp bởi J.T. Baker (Phillisburg, NJ). - Quercetin chuẩn được cung cấp bởi Sigma (St Louis, MO). 2.1.2. Trang thiết bị: Quá trình chiết xuất được thực hiện ở một bình thép không gỉ 500 mL (10) chịu được áp suất cao (Autoclave Engineers, Erie, PA). Bình chiết được bao bọc, gia nhiệt và cách ly bằng giấy bạc để duy trì nhiệt độ không đổi. Nhiệt độ này được theo dõi và kiểm soát với một cặp nhiệt điện và bộ điều khiển nhiệt độ (Omega Engineering, Stamford, CT). Carbon dioxide từ bình chứa hình trụ (1) được nén bằng máy nén cao áp (2, Haskel Inc, Burbank, CA) và được lưu trữ trong một bình chứa 2 L (3). Máy đo áp suất (4, 7) sử dụng để theo dõi áp suất trong bình chứa carbon dioxide và van bình chiết. Một máy tạo áp suất về phái trước (6, Tescom Corp., Elk River, MN), vị trí giữa bình chứa carbon dioxide và van bình chiết, kiểm soát áp lực chiết xuất. Dòng khí được theo dõi bằng cách sử dụng một đồng hồ đo (13, American Dry Test Meter Model DTM-200A-3, American Meter Co., Philadelphia, PA). Hai van ngắt (5, 10, Autoclave Engineers, Erie, PA) được sử dụng để hỗ trợ trong điều áp và giảm áp hệ thống. Một bơm piston (8, Model 305, Gilson, Middletown, WI) được sử dụng để tuần hoàn khí CO2 thoát ra vào bình chiết xuất. Tại van micrometering (11, Autoclave Engineers, Erie, PA), áp suất được giảm xuống, dịch chiết sau đó được tách khí và thu vào trong một ống thủy tinh (12). Cái khay bao gồm những lọ thủy tinh (3,7 mL) chèn vào trong một ống thủy tinh, bao quanh bởi nước đá khô. Các ống thuỷ tinh được giữ ở nhiệt độ đủ để CO2 bay hơi và thu được quercetin thô. Hình 2.1. Sơ đồ thiết bị chiết quercetin bằng Carbon Dioxide siêu tới hạn. Chú thích: 1. Bình chứa CO2 2. Máy nén cao áp 3. Bình chứa khí nén 4,7 Máy đo áp suất 5,10 Điều khiển áp suất phía trước 8. Piston bơm, 9. Hệ thống cung cấp nhiệt 11. Van micrometering 12. Nơi thu mẫu 13. Đồng hồ đo thể tích khí TC: temperature control (điều khiển nhiệt độ) 2.1.3. Quá trình chiết xuất: Chuẩn bị mẫu: lớp vỏ củ hành được bốc tách bằng tay, loại bỏ những phần hư hỏng và cắt thành mảnh nhỏ khoảng 0,50,5 inch. Quy trình chiết xuất: áp suất và nhiệt độ được cài đặt ở 5700 psi và 40oC. Phải mất từ 25 – 30 phút để đạt được các điều kiện trên. Bình chiết được gia nhiệt 24h trước khi lấy dịch chiết để thống nhất thời gian chiết giữa các mẫu. Hành tây thái nhỏ và ethanol 5% (nồng độ phân tử so với tổng số mol CO2 sử dụng để tạo áp lực cho hệ thống) được thêm vào bình trước khi nó được đóng lại. Máy bơm được cài đặt 5 ml/phút. Khi các điều kiện mong muốn đạt tới, các van micrometering được mở, CO2 tương đương 15 L khí nén (khoảng 4% tổng số CO2 chiếm thể tích bên trong bình chiết) đi qua khay để lấy mẫu (nhanh nhất có thể để duy trì chế độ tĩnh), sau đó các van micrometering được đóng lại, thay các chai thuỷ tinh đựng mẫu mới. Quá trình này kéo dài khoảng thời gian từ 10-18 phút. Sau đó, mẫu tiếp theo được lấy một lần nữa với việc mở van micrometering. Mỗi mẫu chiết 10 lần và chiết với 5 mẫu khác nhau. 2.1.4. Hệ thống HPLC phân tích mẫu: Hệ thống HPLC gồm: - Phần mềm PEAKSIMPLE - Tiền cột: C18 (1 cm x 4 mm, 5 pm) - Bơm QUAT (Model AGP-1, Cotati, CA) - Cột: BetaBasic C18 (250 x 4.6 mm, 5 pm) - Bơm mẫu: Rheodyne manual injector (10 µL injection loop). - Đầu dò: LC quang phổ (Waters, Lambda-Max, Model 481, Milford, MA). Các thông số sắc ký: - Pha động: dung dịch acid phosphoric [0,5% (v/v)] - methanol (2:3 (v/v)) - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Bước sóng phát hiện: 280 nm - Thời gian phân tích: 10-15 phút cho mỗi mẫu 2.1.5. Kết quả và bàn luận: Từ năm lần lập lại, quercetin chiết xuất được trong phạm vi 226-323 µg cho giống hành đỏ, và 101 - 225 µg cho giống hành vàng (Bảng 2.1). Trung bình 0,024 g quercetin/kg vỏ củ hành trích được cho giống màu đỏ và 0,020 g của quercetin / kg vỏ củ hành cho giống vàng, thời gian chiết xuất tổng cộng 150 phút cho giống màu đỏ và 156 phút cho giống màu vàng. Ở khoảng tin cậy 95% không có sự khác biệt có ý nghĩa (P = 0,182) giữa khối lượng quercetin chiết được/ kg hành đỏ và vàng, giống màu vàng có độ lệch chuẩn thấp (0,003) so với màu đỏ (0,005). Bảng 2.1. Kết quả chiết quercetin của giống hành vàng và giống hành đỏ. Mẫu số Thời gian chiết (phút) Nồng độ (µg/ml) Tổng lượng quercetin (µg) Tỉ lệ µg Quercetin / Lít CO2 số g quercetin/ kg vỏ hành Khối lượng vỏ hành % Ethanol (nồng độ phần mol) Hành đỏ 1 145 0,037 313 2,09 0,027 11,8 7,09 2 143 0,037 323 2,09 0,027 13,9 7,78 3 152 0,035 291 1,94 0,023 12,8 6,80 4 152 0,029 287 1,91 0,024 10,5 7,78 5 157 0,029 226 1,51 0,019 12,0 7,78 Trung bình 150 0,034 288 1,91 0,024 12,2 7,45 Hành vàng 1 156 0,015 193 1,27 0,022 8,6 7,69 2 151 0,016 201 1,32 0,025 8,1 7,69 3 159 0,020 225 1,46 0,023 9,6 8,17 4 164 0,020 149 0,99 0,018 5,8 7,69 5 150 0,014 101 0,67 0,012 8,2 7,69 Trung bình 156 0,017 174 1,14 0,020 8,1 7,79 Kết quả (Bảng 2.1) cho thấy không có sự tương quan giữa thời gian chiết xuất, khối lượng vỏ hành và nồng độ ethanol (trong phạm vi mà các thông số này khác nhau) trên tổng khối lượng quercetin, vì sự thay đổi này không ảnh hưởng đến sự biến động của khối lượng quercetin. Mặt khác, thể tích ethanol thu được trong mẫu cho thấy có ảnh hưởng đến lượng quercetin chiết xuất. Để đánh giá tương quan giữa lượng quercetin chiết được và thể tích ethanol thu trong ống, một phân tích thống kê được thực hiện. Để thực hiện phân tích này, giá trị trung bình của 5 lần chiết trong mỗi ống được thu thập và xử lý số liệu. Các phân tích hồi quy cho thấy, ở mức độ tin cậy 95%, mối quan hệ tuyến tính giữa tổng lượng quercetin chiết xuất và thể tích ethanol thu được là (R2 = 0,82, P <0,001, cho giống hành đỏ và R2 = 0,877, P <0,001, cho giống hành vàng). Kết quả này cho thấy lượng quercetin thu được tỷ lệ thuận với thể tích ethanol trong mỗi ống. Hình 2.2. Biểu đồ tương quan giữa lượng quercetin chiết xuất và thể tích ethanol. Phân tích hồi quy thể tích ethanol (trung bình của năm mẫu chiết trong mười ống) so với thời gian, và tỷ lệ chiết xuất (trung bình của năm mẫu chiết trong mười ống) so với thời gian được thực hiện để tìm thấy bất kỳ xu hướng có thể. Cả hai phân tích cho thấy xu hướng tương tự: khi tăng thời gian thì thể tích ethanol và tỷ lệ chiết xuất đều giảm. Hình 2.3. Biểu đồ tương quan giữa thể tích ethanol trong mỗi ống và thời gian Hình 2.4. Biểu đồ tương quan giữa tỉ lệ chiết xuất và thời gian Hai giả thuyết được đưa ra từ biểu đồ ở hình 2.3. Thứ nhất: ethanol có ái lực cao với vỏ hành hơn so với dòng khí nên rất khó kéo ethanol ra khi chúng đã thấm sâu vào hành. Thứ hai, không phải tất cả ethanol bị lôi cuống theo đều ở lại trong lọ thành phẩn, một số bị kéo theo dòng khí. Ngoài ra còn có các yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến kết quả, ví dụ sự hiện diện của các hợp chất khác tương tự ở vỏ hành, chẳng hạn như kaempferol và myricetin. Các hợp chất này có thể cạnh tranh với quercetin trong dòng khí và ethanol. Tóm lại: Quercetin tự do đã được chiết xuất từ vỏ củ hành đỏ và vàng, bằng cách sử dụng CO2 siêu tới hạn như một dung môi và ethanol như một chất mang. Các kết quả trình bày không có khác biệt thống kê, ở mức độ tin cậy 95% giữa các giống hành. Khối lượng quercetin tự do và thể tích ethanol thu được trong mỗi ống thu tỷ lệ thuận với nhau. Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp thay thế cho phương pháp chiết rắn -lỏng thông thường để chiết quercetin. Tuy nhiên, trong tương lai cần chú ý nhiều hơn các hợp chất tương tự khác có trong hành có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và hiệu suất chiết. 2.2. CHIẾT XUẤT QUERCETIN BẰNG NƯỚC SIÊU TỚI HẠN: [17] Phương pháp này được thực hiện tại đại học Ewha womans Hàn Quốc năm 2010, sử dụng nước làm chất lỏng siêu tới hạn. 2.2.1. Nguyên liệu và thiết bị: Chuẩn bị mẫu thử: củ hành tây được lấy từ Uiseong, Gyeongsangbuk-do, Hàn Quốc, chỉ những củ có bao phủ bên ngoài lớp vỏ màu da cam mới được sử dụng. Vỏ củ hành tây được sấy khô với không khí nóng ở 60oC trong 10 giờ và sau đó cắt thành miếng (<10 mm) sử dụng một máy trộn tốc độ cao (Blender 7012S, Waring Co., Torrington, CT, USA). Tất cả các mẫu được lưu trữ trong tủ lạnh duy trì ở 4oC. Các mảnh vỏ hành và diatomaceous earth (DE, tảo cát trái đất) (ASE® Prep DE, DIONEX Co., Sunnyvale, CA, USA) được pha trộn và cho vào tế bào chiết thép không gỉ 34 ml (DIONEX Co.) có chứa giấy lọc cellulose (30 mm, DIONEX Co.) như ở hình 2.5. Thiết bị: trình bày ở hình 2.5. Hình 2.5. Sơ đồ chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn Sử dụng phần mềm thống kê SPSS (Version 17.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, giá trị biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). 2.2.2. Quá trình chiết xuất: Chiết bằng nước siêu tới hạn: Việc chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng một dung môi nhanh (100 ASE, Công ty DIONEX) với nước Milli-Q (MR-RO800, Công ty TNHH Mirae ST, An Dương, Hàn Quốc) như là dung môi duy nhất. Vỏ hành tây (1-2 g) và DE được trộn tỷ lệ hỗn hợp giữa 0,5:3,5 và 02:02. Quá trình chiết xuất được thực hiện như hình 2.5. Mẫu này được nạp vào tế bào chiết thép không gỉ và điền đầy dung môi trong khoảng 1 phút, tăng áp suất trong 5 phút. Sau khi áp suất đạt 90 bar, tế bào chiết được cung cấp nhiệt (tượng trưng cho thời gian chiết xuất) trong khi áp suất được duy trì ở 90-131 bar, nhiệt độ chiết xuất từ 100-190oC. Tế bào chiết này có thể được rữa sạch dung môi qua các đường bơm mẫu trong vòng 30s. Việc rữa tế bào chiết được thực hiện khoảng 1-2 phút giữa các lần chiết xuất với khí nitơ. Dịch chiết được thu vào một lọ thủy tinh (40-50 ml) đã biết khối lượng. Chiết rắn - lỏng: Sử dụng dung môi chiết là ethanol 95% (Samchun pure chemicals Co., Seoul, Korea) và methanol 99,8% (Duksan pure chemicals Co., Ansan, Korea) ở 60oC trong 2 giờ với 40ml dung môi cho 1g vỏ củ hành. Dịch chiết nước nóng được thực hiện trong 3 giờ ở 100oC với 40 ml nước/ 1g vỏ củ hành. 2.2.3. Quy trình phân tích bằng HPLC: Dịch chiết vỏ củ hành được thêm vào ethyl acetat (Duksan pure chemicals Co., Ansan, Korea) tỷ lệ 1:1, sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng để chiết quercerin, chiết 3 lần và làm bay hơi ethyl acetat ở 56oC. Cắn thu được hoà tan trong vừa đủ 10 ml methanol. Định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC (1200 series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) với cột Zorbax C18 (4,6 mm 150 mm, 5 µm ). Pha động là methanol-nước-trifloroacetic acid (40:60:0,04) với tốc độ dòng 1 ml / phút. Thể tích tiêm mẫu 10 µl, bước sóng phát hiện 370 nm. Đã thiết lập được đường cong chuẩn độ gồm 6 điểm với chất chuẩn quercetin (Quercetin dihydrate minimum 98% HPLC powder, Sigma–Aldrich, Steinheim, Germany) ở các nồng độ 50, 100, 200, 500, 1000, và 2000 ppm. Hình 2.6. Sắc ký đồ của quercetin từ dịch chiết vỏ củ hành tây Thành phần hoá học của vỏ củ hành và sản phẩm quercetin thu được bằng SWE được phân tích theo mô tả của Suutarinen et al. (2003) [24]. Phân tích định lượng các flavonoid trong nguyên liệu sử dụng và sản phẩm chiết xuất được thực hiện theo phương pháp Crozier et al. (1997) [5] để xác định tổng lượng quercetin trong nguyên liệu ban đầu và lượng còn lại trong mẫu đem đi chiết xuất sau lần chiết đầu tiên và các lần chiết sau đó. 2.2.4. Tối ưu hoá các thông số chiết xuất: Ảnh hưởng của các thông số quan trọng trong chiết xuất quercetin được đánh giá bằng cách thay đổi nhiệt độ (100-190oC), thời gian chiết xuất (5-30 phút), và tỷ lệ hỗn hợp của vỏ củ hành và DE (0,5:3,5 đến 02:02) dưới áp suất cao (90-131 bar). Mỗi thông số được kiểm tra trong ba thí nghiệm giống nhau. 2.2.4.1. Tác động của nhiệt độ: Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ nước trong khoảng 100-190oC trên hiệu suất chiết SWE được thực hiện. Hiệu suất chiết quercetin tăng lên khi nhiệt độ tăng đến 165oC ở áp suất 90-131 bar và giảm xuống khi nhiệt độ tăng trên 165oC. Kết quả này tương tự kết quả của Kubatova et al. (2001) [12]. Hình 2.7. Ảnh hưởng nhiệt độ lên phương pháp chiết quercetin bằng SWE cho các lần chiết với thời gian 10 phút (A) và 15 phút (B). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, điểm dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Mặc dù nhiệt độ tăng làm hiệu suất chiết tăng nhưng một số dung môi khi chiết bằng SWE cho thấy sự giảm đáng kể hiệu suất chiết khi nhiệt độ tăng trên 150oC, có thể do sự phân huỷ các chất bởi nhiệt. Những kết quả này chỉ ra rằng hiệu quả chiết bằng SWE chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ. Ở nhiệt độ cao hơn thì độ tan của quercetin cao hơn. Hơn nữa, lượng quercetin chiết được là cao nhất (16,29 ± 0,75 mg/g vỏ củ hành) tại nhiệt độ 165oC, nhiệt độ này ảnh hưởng đến phản ứng thuỷ phân quercetin do hằng số ion hoá của nước tăng. Các kết quả thu được cho thấy tại nhiệt độ từ 150-170oC cho hiệu suất chiết quercetin cao nhất. Trong thời gian gần đây, CO2 siêu tới hạn được ứng dụng để chiết xuất nhiều hợp chất khác nhau thay thế dung môi hữu cơ [18]. Tuy nhiên, phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn thường đắc tiền và đòi hỏi thiết bị phức tạp. Trong phương pháp chiết quercetin thì yếu tố quan trọng nhất là đảm bảo các điều kiện không quá khắc nghiệt để tránh bị phân huỷ. 2.2.4.2. Tác động của thời gian chiết xuất: Top of Form Để xác định tác động của thời gian chiết xuất, SWE được thực hiện từ 5 đến 30 phút ở nhiệt độ 165oC và 170oC (hình 2.8). Hình 2.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất quercetin bằng SWE ở nhiệt độ 165oC (A) và 170oC (B). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, điểm dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Tổng lượng quercetin chiết được giảm khi tăng thời gian chiết xuất, đặc biệt là khi thời gian chiết vượt quá 15 phút. Các kết quả thu được ở 165oC và 170oC là tương tự. Các khía cạnh quan trọng để xem xét quá trình chiết xuất là rút ngắn thời gian chiết xuất (đặc biệt là các phương pháp chiết xuất truyền thống như chiết bằng Soxhlet), chất lượng chất chiết được, độ chọn lọc cao, chi phí thấp, việc tách chiết dung môi dễ dàng và thân thiện môi trường kết hợp với không sử dụng dung môi hữu cơ [12]. 2.2.4.3. Tỷ lệ mẫu và DE: Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp vỏ củ hành và DE trên hiệu suất chiết quercetin được thử nghiệm trong tế bào chiết 34 ml. Tỷ lệ tới ưu cho vỏ củ hành và DE là 1,5:2,5 (hình 2.9). Hình 2.9. Ảnh hưởng tỷ lệ vỏ củ hành và DE trong chiết xuất quercetin bằng SWE. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, điểm dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Trong điều kiện thí nghiệm thử nghiệm, các tế bào chiết chứa 4 g vỏ củ hành và DE. DE là một vật liệu trơ trong việc phân tán mẫu do đó hỗ trợ quá trình chiết xuất. Mẫu không được phân tán tốt sẽ ngăn chặn quá trình chiết xuất, làm giảm hiệu suất chiết. Vì vậy, DE được đề nghị thêm vào mẫu bằng cách trộn chúng với mẫu trước khi đặt vào tế bào chiết. 2.2.5. Kết quả và bàn luận: 2.2.5.1. Kết quả chiết xuất bằng nước siêu tới hạn: Hiệu quả chiết của SWE được đánh giá bằng cách so sánh khối lượng quercetin chiết được (mg/g vỏ củ hành) và % quercetin chiết được của từ vỏ củ hành qua các lần chiết. SWE được thực ở nhiệt độ là 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ hỗn hợp vỏ củ hành và DE là 1,5:2,5 cho kết quả như bảng sau: Bảng 2.2. Hiệu suất chiết và độ phục hồi của SWE Số lần chiét Năng suất (mg/g vỏ củ hành)a Độ phục hồi (%)b 1 16,29 ± 0,75 92,40 2 1,28 ± 0,11 7,26 3 0,06 ± 0,02 0,34 4 Ndc 0 5 Nd 0 Tổng cộng 17,63 ± 0,87 100 a Năng suất (mg/g vỏ củ hành). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn b Độ phục hồi (%) = năng suất/ tổng lượng quercetin chiết được bởi SWE c Không phát hiện Ngoài ra, thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE được so sánh với nguyên liệu ban đầu (Bảng 2.3) Bảng 2.3. Thành phần hóa học của các chiết xuất thu được từ SWE và nguyên liệu vỏ củ hành ban đầu. Chất Vỏ củ hành Chiết xuất của SWEa Carbohydrate (%) Protein (%) Lipids (%) Ash (%) Moisture (%) Quercetin (mg/g vỏ củ hành) Quercetin-40-glucoside (mg/g onion skin) Kempherol (mg/g vỏ củ hành) Isorahmnetin (mg/g vỏ củ hành) Rutin (mg/g vỏ củ hành) 47,63 ± 0,87b 3,98 ± 0,44 5,22 ± 0,59 7,10 ± 0,61 4,81 ± 0,42 17,63 ± 0,87 3,72 ± 0,09 0,88 ± 0,23 0,74 ± 0,18 0,93 ± 0,15 13,24 ± 0,62 1,14 ± 0,19 1,68 ± 0,12 2,10 ± 0,076 9,42 ± 1,63 16,29 ± 0,75 3,15 ± 0,60 0,68 ± 0,13 0,54 ± 0,09 0,58 ± 0,11 a SWE được thực ở nhiệt độ là 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ hỗn hợp vỏ củ hành và DE là 1,5:2,5 b Dữ liệu thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Kết quả trên cho thấy các thành phần hóa học của chiết xuất SWE giảm đáng kể so với nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên, đối với flavonoid, chiết xuất bao gồm một lượng lớn quercetin (16,29 ± 0,75 mg/g vỏ củ hành), một lượng nhỏ quercetin-4’-glucoside (3,15 ± 0,60 mg/g vỏ củ hành), và có dấu vết chất flavonoid khác. Kết quả này chỉ ra rằng quercetin và quercetin-4’-glucoside chiếm khoảng 99% tổng lượng flavonoid có trong chiết xuất và khoảng 92,40% tổng lượng quercetin so với nguyên liệu ban đầu. Các kết quả trong nghiên cứu này chứng minh rằng SWE là một phương pháp rất hiệu quả để chiết flavonol quercetin và do đó nước siêu tới hạn là giải pháp tuyệt vời để thay thế dung môi hữu cơ, góp phần nâng cao hiệu quả chiết xuất và thân thiện với môi trường. 2.2.5.2. So sánh SWE với các phương pháp chiết khác: Hiệu quả của SWE được so sánh với phương pháp chiết xuất thông thường. Hình 2.10 chỉ ra rằng lượng quercetin thu được từ SWE nhiều hơn lần lượt gấp tám, sáu và bốn lần hơn so với sử dụng dung môi là ethanol, methanol và nước. Hình 2.10. So sánh các phương pháp chiết Sử dụng ethanol và methanol làm dung môi chiết ở 60oC trong 2 giờ cho thấy năng suất chiết quercetin không có sự khác biệt đáng kể. Bên cạnh đó, việc sử dụng nước ở nhiệt độ sôi trong 3 giờ cho tỷ lệ khai thác quercetin cao hơn. Tỷ lệ khai thác quercetin cao nhất từ SWE. Vì vậy, SWE là phương pháp hiệu quả cao để chiết flavonol quercetin từ vỏ củ hành tây. 2.3. KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU HÀNH TÂY: Hiệu suất chiết, lượng quercetin chiết được phụ thuộc rất nhiều vào nguyên liệu đầu vào. Vì vậy, kiểm nghiệm bán nguyên liệu hành tây trước khi tiến hành chiết xuất là rất cần thiết. Qua tham khảo nhiều tài liệu khác nhau chúng tôi xin đề nghị phương pháp định lượng quercetin trong hành tây bán nguyên liệu như sau: Chuẩn bị mẫu thử: vỏ hành tây nguyên liệu được nghiền thành mảnh nhỏ, sấy ở 60oC trong 10 giờ, cắt thành mảnh nhỏ. Cân 1,5g vỏ củ hành, tiến hành chiết xuất như phần 2.2.2 ở 165oC, thời gian 15 phút, tỷ lệ hỗn hợp vỏ củ hành và DE là 1,5:2,5, chiết 3 lần. Chiết quercetin với ethyl acetate 3 lần (tỉ lệ dịch chiết-ethyl acetate: 1:1), thực hiện 3 lần. Cô dịch chiết ethyl acetate và hoà tan cắn vào methanol rồi cho vào bình định mức 100ml, bổ sung methanol vừa đủ. Hút chính xác 5ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50ml, bổ sung methanol vừa đủ, lọc quá lọc 0,45µm. Chuẩn bị mẫu chuẩn: hoà tan bằng methanol khoảng 0,5g quercetin chuẩn vào bình định mức 10ml, bổ sung methanol vừa đủ. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Điều kiện và quá trình phân tích bằng HPLC thực hiện như trình bày ở phần 2.2.3. Tiêu chuẩn: có không ít hơn 15mg/g vỏ củ hành. CHƯƠNG 3 - KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH 3.1. KẾT LUẬN: - Tổng quan về hành tây đã được trình bày khá đầy đủ về thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng và công dụng,…Đã làm sáng tỏ nguyên nhân chọn hành tây làm nguyên liệu chiết xuất quercetin trong công nghiệp. - Bài báo cáo đã trình bày 2 phương pháp chiết xuất quercetin bằng chất lỏng siêu tới hạn (bằng CO2 siêu tới hạn và nước siêu tới hạn). Phương pháp chiết xuất quercetin bằng nước siêu tới hạn được so sánh với phương pháp chiết rắn - lỏng truyền thống cho thấy chiết bằng nước siêu tới hạn cho hiệu suất cao hơn từ 4 đến 8 lần. - Phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu Hành tây được đề xuất dựa trên các tài liệu tham khảo. Tuy nhiên cần thẩm định lại để phù hợp với điều kiện từng phòng thí nghiệm. 3.2. NHẬN ĐỊNH: - So với các kĩ thuật cổ điển thì phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn có nhiều ưu điểm hơn như có tính chọn lọc cao các hợp chất cần chiết tách, chất chiết tương đối sạch, ít làm hư hại hoạt chất,… và nhất là thân thiện với môi trường. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi máy móc trang thiết bị phức tạp và đắc tiền. - Các phương pháp chiết quercetin trình bày trong bài báo cáo chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm, để tiến tới quy mô công nghiệp cần sự hợp tác nhiều hơn của các nhà khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương,… (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, tr. 321-323. 2. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, p.43-48. 3. Trương Thị Đẹp (2007), Thực Vật Dược, Nxb Y học - chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, Tp. Hồ Chí Minh, tr. 271-273. Tiếng Anh 4. Caltagirone, S., Rossi, C. and Poggi, A.(2000), “Flavonoids apigenin and quercetin inhibit melanoma growth and metastatic potential”, Intern. J. Cancer 87, pp. 595-600. 5. Crozier, A., Lean, M.E.J., McDonald, M.S., Black, C., (1997), “Quantitative analysis of the flavonoid content of commercial tomatoes, onions, lettuce and celery”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 45, 590–595. 6. Dorsch W. (1996), Allium cepa L. (onion) part 2: Chemistry, analysis and pharmacology. Phytomed. 3:391-7. 7. Hermann, K. (1976), “Flavonols and flavones in food plants”, J.Food Tech 01, IZ, 433-448. 8. Hirota, S., Shimoda, T. and Takamaha (1998), “Tissue and spatial distribution of flavonol and peroxidase in onion bulbs and stability of flavonol glucosides during boiling of the scales”, J. Agric. Food Chem. 46, pp. 3497-3502. 9. Janusz Pawliszyn, Heather L. Lord (2010), Handboook of Sample preparation, pp.191-194. 10. Joachim, K. (1890), Papyrus Ebers. Georg Reimer Verlag, Berlin. 11. Karina Gorostiaga Martin and Daniel Guyer (2003), “Supercritical fluid extraction of quercetin from onion skins”, Michigan State Universiry Department of Agriculrural Engineering East Lansing. MI 48824 . 12. Kubatova, A., Lagadec, A.J.M., Miller, D.J., Hawthorne, S.B.(2001), “Selective extraction of oxygenates from savory and peppermint using subcritical water”, Flavour and Fragrance Journal 16, pp. 64–73. 13. M. Marotti, R. Piccaglia and G. Venturi (2000), “Onion flavonoids: functional compounds for health benefit”, Department of Agroenvironmental Science and Technology, Bologna University, Viale G. Fanin, 44 - 40127 - Bologna, Italy. 14. Maria Aleksandra Smoczkiewicz, Danuta Nitschke, and Hanna Wiel~dek (2008), “Microdetermination of Steroid and Triterpene Saponin Glycosides in Various Plant Materials I. Allium Species”, Mikrochimica Acta [Wien] 1982II, pp. 43-53. 15. Merken, H.M. (2000), “Measurement of food flavonoids by high-performance liquid chromatography”, J. Agric. Food Chem. 48(3), 577-599. 16. Micheal Perrut , Supercritical fluid applications in the pharmaceutical industry 17. Min-Jung Ko, Chan-Ick Cheigh, Sang-Woo Cho, Myong-Soo Chung, “Subcritical water extraction of flavonol quercetin from onion skin”, Journal of Food Engineering 102 (2011), pp. 327–333. 18. Mukhopadhyay, M., (2000). Natural Extracts Using Supercritical Carbon Dioxide., FLL CRC Press, Boca Raton. 19. Price, K.R. and Rhodes, M.J.C. (1997), “Analysis of the major flavonol glycosides present in four varieties of onion (Allium cepa) and changes in composition resulting from autolysis”, J. Sci. Food Agric. 74, 331-339. 20. Randle W.M.; Lancaster J.E.; Shaw M.L.; Sutton K.H.; Hay R.L.; Bussard M.L. (1995), “Quantifying onion flavor compounds responding to sulphur fertility – Sulphur increases levels 94 of alk(en)yl cysteine sulphoxides and biosynthetic intermediates”, J. Amer. Soc. Hort. Sci. 120:1075-81. 21. Rodger Marentis (2001), Processing pharmaceuticals with supercritical fluids. 22. Rodríguez Galdón B, Rodríguez Rodríguez EM, Díaz Romero C, “Flavonoids in onion cultivars (Allium cepa L.).”, Dept. of Analytical Chemistry, Food Science and Nutrition, Univ. of La Laguna, Avda. Astrofísico Francisco Sánchez s/n, 38201, La Laguna, Santa Cruz de Tenerife, Spain. 23. Steinegger E.; Sticher O.; Hänsel R. (1999), Pharmakognosie, Phytopharmazie, 6. Aufl., Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 24. Suutarinen, M., Mustranta, A., Autio, K., Salmenkallio-Marttila, M., Ahvenainen, R., Buchert (2003), “The potential of enzymatic peeling of vegetables”, Journal of the Science of Food and Agriculture 83, pp. 1556–1564. 25. Xing, N., Chen, Y., Mitchell, S.H. and Young, C.Y.F. (2001),” Quercetin inhibits the expression and function of the androgen receptor in LNCaP prostate cancer cells”, Carcinogenesis 22(3), pp. 409-414. 26. Yoshiaki Fukushima , Application of Supercritical fluid, R&D Review of Toyota CRDL, 35(1). 27. Wetli, Herbert Alexander (2004), Bioassay-guided fractionation to isolate compounds of onion (Allium cepa L.) affecting bone resorption, PhD Thesis, University of Basel, Faculty of Science. Trang Web 28. 29. 30. 31. 32. 33.