Đề tài Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 1 LỜI NÓI ĐẦU Enzyme giữ vai trò cực kì quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện đại, hiện nay việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzym đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta là một nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Vì thế ngành công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng chúng ở nước ta hiện nay rất phát triển, trong đó hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Với đề tài: “Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng”, thuộc môn Công nghệ Lên Men Thực Phẩm, đây là đề tài rất thú vị và phù hợp với xu thế phát triển hiện nay của ngành công nghiệp enzyme, nhờ sự chỉ dẫn tận tình của quý thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, mà đặc biệt là thầy Lê Văn Việt Mẫn, chúng tôi đã hoàn thành đề tài này. Trong quá trình thực hiện đề tài, không tránh khỏi thiếu sót, kính mong sự góp ý của thầy và để chúng tôi có thêm kinh nghiệm cho các bài báo cáo tiếp theo, và luận văn sau này. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 2 MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU CHUNG ...................................................................................... 4 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI .......................................................................... 4 2.1 Định nghĩa .................................................................................................... 4 2.2 Phân loại ....................................................................................................... 4 2.2.1 α – amylase .......................................................................................... 5 2.2.2 β – amylase .......................................................................................... 7 2.2.3 Glucoamylase ....................................................................................... 8 2.2.4 Một số amylase khác ......................................................................... 10 3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ................................................ 12 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật ......................................................... 12 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật ...................................................... 13 4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG .............. 13 A. Sơ đồ quy trình công nghệ .......................................................................... 14 B. Giải thích quy trình ..................................................................................... 15 4.1 Chọn giống vi sinh vật ................................................................................ 15 4.2 Nhân giống vi sinh vật ................................................................................ 16 4.2.1 Môi trường nhân giống ..................................................................... 16 4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống ............................................. 16 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống ............................. 17 4.2.4 Thiết bị nhân giống ........................................................................... 17 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men .................................................................... 18 4.4 Tiệt trùng môi trường ................................................................................ 19 4.4.1 Mục đích ............................................................................................. 19 4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng ........................................ 19 4.4.3 Thiết bị ............................................................................................... 19 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme .................................................................. 20 4.5.1 Mục đích ............................................................................................. 20 4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men .................................... 20 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ................................... 21 4.5.4 Thiết bị ............................................................................................... 22 4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô .................................................... 24 4.7 Tách và tinh sạch enzyme .......................................................................... 25 4.7.1 Siêu lọc ................................................................................................ 25 4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel ................................... 27 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 3 4.8 Sấy ............................................................................................................... 32 5. CHẾ PHẨM AMYLASE ................................................................................. 34 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp ........................... 34 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme ...................................................................... 35 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại ..................................................... 35 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ .......................................................................... 38 6 α – amylase Bacillus subtilis .................................................................................. 38 6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải trong công nghiệp thực phẩm .......... 43 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 47 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 4 1. GIỚI THIỆU CHUNG Hệ enzyme amylase là một trong những hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp thực phẩm, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu từ những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi nhà bác học Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết malt nảy mầm và nhận thấy trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, tức là vào năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột thành đường từ dịch chiết malt, hai ông đã dùng rượu để kết tủa nó và thu được enzyme dưới dạng bột, đồng thời đặt tên nó là diastase. Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Hiện nay, người ta chủ yếu sản xuất amylase từ vi khuẩn và nấm mốc. Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm amylase và là cơ sở khoa học để áp dụng chúng trong sản xuất và đời sống, đồng thời cũng mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn đối với nền kinh tế quốc dân. 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 2.1 Định nghĩa Amylase thuộc nhóm hydrolase, phân giải liên kết glycoside, enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử có chiều dài mạch ngắn hơn như dextrin, oligosaccharide, glucose, … 2.2 Phân loại Dựa theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có thể chia amylase thành các loại sau: Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 5 2.2.1 α – amylase Hình 2.2.1.1: Cấu trúc không gian của α – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  α – amylase (α – 1,4 – glucan – 4glucanohydrolase) là một endo enzyme. Nó xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α – 1,4 – glycoside nằm bên trong phân tử của các cơ chất amylase, amylopectin và glycogen.  α – amylase được tìm thấy trong cơ thể của động vật, thực vật và tế bào vi sinh vật.  Tùy theo nguồn gốc mà phân tử lượng của enzyme sẽ thay đổi, thường dao động trong khoảng 45 – 60kDa. Có một số trường hợp đặc biệt như α – amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130kDa.  Tất cả các α – amylase đều là metalloenzyme. Người ta tìm thấy Ca2+ trong phân tử enzyme với hàm lượng từ 1 – 30g.nguyên tử/1g.mol enzyme. Nếu chúng ta tách toàn bộ Ca 2+ ra khỏi α – amylase, enzyme sẽ bị vô hoạt.  Nhìn chung, tỷ lệ tryptophan và tyrosin trong phân tử của các amylase là khá cao. Riêng thành phần acid glutamic và acid aspartic có thể chiếm tới 25% trọng lượng phân tử. Ngoài thành phần protein, một số enzyme amylase từ nấm mốc còn có phân đoạn glucid có chứa mannose, xylose và hexosamine. Chức năng của thành phần glucid này hiện này còn chưa rõ.  Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết các α – amylase khá bền với các tác động của các protease như peppin, trypsin, papain, … Bảng bên dưới giới thiệu tính chất của 1 số chế phẩm α – amylase từ vi sinh vật. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 6 Bảng 2.2.1.1: Một số tính chất của α – amylase từ vi sinh vật (Fogarty, 1983) Tên vi sinh vật pHopt Topt Phân tử lượng (kDa) Bacillus acidocaldarius 3.5 75 68 Bacillus stearothermophilus 4.5 – 6.5 65 – 73 48 Bacillus subtilis 5.3 – 6.4 50 47 Acinetobacter sp.I 7.0 50 – 55 55 Acinetobacter sp.II 7.0 50 – 55 65 Bacteirodes amylophilus 6.3 43 92 Micrococcus halobius 6.0 – 7.0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5.0 – 6.0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4.6 – 5.3 40 40 Thermonospora curvata 5.5 – 6.5 65 62 Aspergillus oryzae 5.5 – 5.9 40 52 Mucor pusillus 3.5 – 4.0 65 – 70 48 Lipomyces kononenkaae 5.5 40 38 Schwaniomyces castellii 6.0 60 40  Dựa trên quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose, người ta tạm thời chia α – amylase thành hai nhóm: enzyme dịch hóa và enzyme đường hóa. o α – amylase dịch hóa - Sản phẩm thủy phân tinh bột bởi các amylase dịch hóa chủ yếu là các dextrin. - Enzyme này thường được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân tinh bột, nhằm hỗ trợ cho quá trình hồ hóa và dịch hóa. o α – - α – oligosaccharide. - Tùy . Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 7 ư α – Aspergillus oryzae ủy 2 (maltose 3 (maltotriose α – Bacillus subtilis thủy 6 (malitohexaose 9. α – amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững đối với acid hơn α – amylase của malt và vi khuẩn Bacillus subtilis. , tùy thủy α – thủy . 2.2.2 β – amylase Hình 2.2.1.2: Cấu trúc không gian của β – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  β – amylase là một exo enzyme, thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin và glycogen. Chúng phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra maltose (dạng β – anomeric).  Enzyme này không thủy phân được liên kết α – 1,6 – glycoside ở amylopectin nên sản phẩm cuối cùng thường gồm 50 – 60% maltose và β – dextrin.  β – amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa, enzyme này vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca2+.  Điều kiện hoạt động:  β – amylase bền trong môi trường acid (kể cả pH 3 – 4), enzyme này hoạt động mạnh trong môi trường có pH 4.5 – 5.5.  β – amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, bị vô hoạt hoàn toàn dưới tác dụng của nhiệt độ 700C, nhưng trong dịch nấu, topt là 60 – 65 0 C. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 8 2.2.3 Glucoamylase Hình 2.2.1.3: Cấu trúc không gian của glucoamylase  Đặc điểm và hoạt động:  Glucoamylase ( – c ủy – – – amylase.  .  5 – 48 – bên dưới . Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 9 2.2.3.1: a glucoamylase t Gratreva, 1987) pHopt Topt ( o C) (kDa) pH Aspergillus awamori 4.5 60 83.7 – 88 3.7 Aspergillus niger 1 4.5 – 5.0 - 99 3.4 Aspergillus niger 2 4.5 – 5.0 - 112 4.0 Aspergillus oryzae 1 4.5 60 76 5.6 Aspergillus oryzae 2 4.5 50 38 5.6 Aspergillus oryzae 3 4.5 40 38 5.6 Aspergillus saitoi 4.5 - 90 3.9 Cephalosporium eichhorniae 4.2 45 – 62 26.85 - Lipomyces kononenkoae 4.5 50 81.5 6.1 Mucor rouxianus 1 4.6 55 59 8.4 Mucor rouxianus 2 5.0 55 49 8.4 Penicillium oxalicum 1 5.0 55 – 60 84 7.0 Penicillium oxalicum 2 4.5 60 86 7.45 Rhizopus delemar 4.5 40 100 - Rhizopus javanicis 5.0 – 5.2 - 48 7.5 – 8.0 Endomycopsis sp. 20-9 5.7 – 5.9 50 53 3.8 Endomyces JF 00111 4.8 – 5.0 - 55 4.8 – 5.5  Nhận xét: o Đa số các chế phẩm glucoamylase của vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) và của mô động vật đều có pH tối ưu ở vùng acid: pH 3.5 – 5.5. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 10 o T0opt của glucoamylase là 50 – 60 0C, nhưng hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 700C. o So với α – amylase, glucoamylase bền acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu, acetone, không được bảo vệ bằng Ca2+. Bảng 2.2.3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến glucoamylase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau Chỉ số Nguồn thu glucoamylase Rhizopus detemar Aspergillus niger pHopt 4.5 3.8 pH bảo đảm độ bền cho enzyme trong 1 ngày ở 300C 3.5 – 8.0 2.2 – 7.5 Nhiệt độ cao nhất (0C) mà enzyme có thể chịu được trong 15 phút ở pH 5.5 55 70 Điểm đẳng điện pI 7.4 6.5 2.2.4 Một số amylase khác Bên cạnh 3 loại amylase trên, các enzyme thủy phân liên kết nhánh cũng được sử dụng nhiều trong công nghiệpt thủy phân tinh bột. α – glucosidase thủy phân từ đầu không khử các liên kết α – 1,4 – glycoside và α – 1,6 – glycoside của các gốc glucopyranose để tạo ra α – D – glucose. Enzyme này thủy phân rất tốt đường đôi và các oligosaccharide, có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong chuyển hóa syrup giàu maltose sang syrup giàu glucose. Enzyme thủy phân liên kết α – 1,6 – glycoside trong phân tử amylopectin, glycogen và một số polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isomaltose. Enzyme này thường được sử dụng kết hợp với β – amylase, glucoamylase trong sản xuất một số sản phẩm syrup hay glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân. Kể từ khi Robyt và Ackerman phát hiện amylase thủy phân tinh bột thành maltotetraose năm 1971, một số amylase của vi khuẩn đã được công bố có khả năng tạo ra các sản phẩm từ DP2 đến DP6. Hiện nay, các enzyme thủy phân tinh bột tạo các malto – oligosaccharide đang được quan tâm. Malto – oligosaccharide có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp hóa chất tinh khiết. Những sản phẩm từ DP2 đến DP6 đã được sử dụng trong việc chẩn đoán lâm sang để xác định sự có mặt của α – amylase. Những chất này đều tan rất tốt, tạo ra một dung dịch nhớt và là một thực phẩm tuyệt hảo cho trẻ sơ sinh cũng như người già. Tuy nhiên, giá thành của những sản phẩm này khá đắt do những khó khăn trong việc sản xuất chúng. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 11  Amylase tạo maltotriose: Lần đầu tiên, Wako mô tả một exo – amylase từ Streptomyces griceus có khả năng thủy phân tinh bột từ đầu không khử, cho sản phẩm chủ yếu là maltotriose, không có glucose và maltose. Gần đây, một số công bố về khả năng tạo maltosetriose của α – amylase từ chủng Bacillus subtilis với hàm lượng 56%. Enzyme này không tác dụng lên pullutan và cyclodextrin, khi sử dụng cùng pullulanase, lượng maltosetriose có thể tăng lên 73% (Forgaty 1990, Hebeda 1995).  Amylase tạo maltotetraose:  Đặc điểm và hoạt động: Hoạt tính này được tìm thấy ở amylase của Pseudomonas stutzeri. Đây là một exo – amylase ngoại bào, nó tấn công tinh bột từ đầu không khử của mạch và phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside thứ tư để tạo maltotetraose.  Điều kiện hoạt động: o pHopt 8.0. o Bị mất hoạt tính ở 400C. Một số tác giả thử nghiệm sản xuất maltotetraose liên tục bằng cách sử dụng amylase từ Pseudomonas stutzeri NRRLB – 3389, được cố định trên các hạt xốp resin kị nước. Gen sinh tổng hợp exo – maltotetraose của chủng Pseudomonas sacharophila cũng đã nghiên cứu biểu hiện ở E.coli với hoạt tính enzyme thu được cao gấp 4 lần chủng bình thường (Duedahl – Olesen 2000, Gerhartz 1990).  Αmylase tạo maltopentaose: Maltopentaose được sử dụng như cơ chất để nhận biết serum α – amylase. Nó cũng được sử dụng làm thức ăn cho người bị bệnh thận hoặc suy dinh dưỡng. α – amylase từ ngoại bào của Bacillus cereus có thể tạo ra pentaose với hàm lượng 44% từ tinh bột. Một số chủng Pseudomonas từ đất cũng có khả năng tạo maltopentaose, đặc biệt trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân (Duedahl – Olesen 2000, Forgaty 1990).  Amylase tạo maltohexaose:  Đặc điểm và hoạt động: Acetobacter aerogenes (Klebsiella pneumonia) tổng hợp một exo – enzyme có khả năng tạo maltohexaose từ tinh bột, amylopectin và amylase. Khi thủy phân amylopectin và glycogen, ngoài maltohexaose, còn có một lượng dextrin giới hạn, các β – limit dextrin sau đó tiếp tục được thủy phân tạo ra các oligo phân nhánh.  Điều kiện hoạt động: o pHopt 5.8 – 6.0. o t0opt = 50 – 520C. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 12 Enzyme này có hoạt tính transferase tạo maltohexaose từ maltotetraose. α – amylase của Bacillus circulans và Bacillus amyloliquefacines cũng có khả năng thủy phân tinh bột đến 30 – 34% maltohexaose. Sự có mặt của pullanase có thể tăng lượng maltohexaose thêm 12%. 3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật Từ lâu, người ta đã biết sử dụng các loại enzyme từ hạt nảy mầm để sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia), … hoặc sản xuất bột enzyme amylase để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho trẻ em, người già, những người bị suy tiêu hóa. Hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp để giữ nguyên hoạt tính của enzyme được gọi là malt. Malt có thể được sản xuất từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại mạch, lúa, ngô, đậu, … mà chủ yếu là từ đại mạch, lúa,…  Đại mạch (Hordeum sativum): Các enzyme có vai trò rất quan trọng: nó tham gia xúc tác tất cả các phản ứng sinh hóa trong suốt quá trình sản xuất malt và sản xuất bia. Trong hạt khô, enzyme phần lớn ở dạng liên kết, chúng chỉ được giải phóng và hoạt động khi hạt đi vào giai đoạn nảy mầm và các quá trình đường hóa sau đó. Các enzyme thủy phân tinh bột: chủ yếu là amylase gồm có – amylase và – amylase. Quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển các enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời còn tổng hợp nên hàng loạt các enzyme mới và trong giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của hạt bằng cách đảo trộn thường xuyên để tạo độ thóang khí. Hạt đại mạch trước khi ngâm không có hoạt lực của enzyme - amylase. Khi hạt trải qua 3 – 4 ngày trong giai đoạn nảy mầm thì hoạt lực của enzyme đạt đến mức cực đại vào ngày thứ 7, sau đó sẽ giảm xuống.  Lúa (Oryza sativa L.): Hệ enzyme amylase trong hạt lúa gồm – amylase và – amylase Trong quá trình nảy mầm hoạt động của các enzyme tăng cao thúc đẩy cho các quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và các quá trình sinh hóa gần giống ở đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phản ứng. Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. Khi hạt nảy mầm, các enzyme này chuyển sang hoạt động. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 13 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật Trong ba nguồn sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật) để khai thác và thu nhận enzyme thì nguồn vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất, do nguồn enzyme khai thác từ vi sinh vật có ưu điểm sau: - Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác. - Hệ enzyme từ vi sinh vật vô cùng phong phú. - Khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính của các enzyme rất mạnh. - Vi sinh vật có tốc độ sinh sản nhanh. - Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật đơn giản, rẻ tiền, … - Sản xuất enzyme từ vi sinh vật được thực hiện theo quy mô công nghiệp và dễ dàng kiểm soát quá trình sản xuất. Các giống vi sinh vật được sử dụng trong công nghiệp sản xuất amylase trong môi trường lỏng: - Nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Rhizopus delemar. - Nấm men: Candida, Saccharomyces. - Vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus polymixa, Bacillus macerans. 4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 14 A. Sơ đồ quy trình công nghệ Nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Ly tâm Lên men sinh tổng hợp enzyme Nhân giống Cấy giống Tiệt trùng Sấy Giống VSV Chế phẩm enzyme Sinh khối Tạp chất Tách và tinh sạch enzyme Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 15 B. Giải thích quy trình 4.1 Chọn giống vi sinh vật  Chọn nấm mốc Aspergillus oryzae do các ưu điểm sau: - Không sinh tổng hợp độc tố. - Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao. - Khả năng thích nghi nhanh và tốc độ sinh trưởng mạnh. - Điều kiện nuôi cấy: đơn giản. - Môi trường nuôi cấy: rẻ tiền, dễ tìm. - Dễ dàng tách được khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu nhận enzyme ngoại bào.  Đặc điểm về hình thái của nấm mốc Aspergillus oryzae: Aspergillus oryzae hay còn gọi là mốc hoa cau, được nghiên cứu sớm nhất bởi ông bà Jokichi Takamine (1854 – 1922, người Nhật). Aspergillus oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 – 7 m, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều bào tế bào (nấm đa bào). Hình 4.1.1: Hình thái của Aspergillus oryzae Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 16 Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus oryzae thường dài 1.0 – 2.0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus oryzae có màu vàng lục, chính là màu ta thường thấy ở mốc tương. Nấm sợi thường có màu vàng khi già nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng. Khi mới phá triển, hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang màu lục và khi già thì chuyển hẳn sang màu vàng. Nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất mạnh, trong đó có enzyme amylae. 4.2 Nhân giống vi sinh vật Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần thiết. Có thể coi đây là việc “đánh thức” chủng giống, đồng thời để kiểm tra hoạt tính của giống sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ thấp. Từ những những tế bào hoặc bào tử riêng rẽ của chủng bảo quản, cấy ra một số canh trường, những canh trường này được nhân giống trong phòng thí nghiệm và được kiểm tra hoạt tính. Nếu có sự khác nhau thì dùng canh trường có hoạt tính mạnh nhất để gây nguyên liệu cấy và tạo thành chủng mới. 4.2.1 Môi trường nhân giống o 3% saccharose o 0.3% NaNO3 o 0.1% KH2PO4 o 0.05% MgSO4.7H2O o 0.05% KCl o 0.001% FeSO4 o 10 – 20mL dịch tự phân nấm men o 1000mL nước cất o 0.3% agar 4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống Nhân giống trên môi trường rắn xốp (thường áp dụng đối với nấm sợi như Aspergillus oryzae, với mục đích thu nhận bào tử) với các thông số kỹ thuật sau: - Độ ẩm của môi trường : 45 – 50%. - Nhiệt độ : 27 – 300C. - Thời gian : 30 – 36 giờ. - Độ ẩm của không khí : 85 – 95%. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 17 Aspergillus oryzae là vi sinh vật hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2.5 – 3cm. Theo thực nghiệm, để thỏa mãn cho sự hô hấp của Aspergillus oryzae trong toàn bộ chu kỳ phát triển, cứ 1kg môi trường cần khoảng 1.7m3 không khí. Aspergillus oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong khí quyển lên tới 8%. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này, có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ. Trong sản xuất công nghiệp hiện nay, quá trình nhân giống vi sinh vật thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture). 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống  Nhiệt độ: Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng nhiệt độ tối ưu (topt = 27 – 30 0 C) thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc độ sinh trưởng của giống (µexpo) sẽ giảm xuống.  Oxy: Đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như Aspergillus oryzae, việc cung cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối. Cụ thể: cứ 1kg môi trường cần khoảng 1.7m 3 không khí.  Sự khuấy trộn: Đối với nấm mốc sử dụng trong chế biến thực phẩm, giống thường được sử dụng dưới dạng bào tử. Khi đó, người ta thường nhân giống trên môi trường rắn xốp. Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp này, sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng nhất cao hơn.  Thời gian: Theo lý thuyết, vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định, số lượng tế bào thu được trong canh trường là cao nhất và chúng có hoạt tính sinh lý ổn định. Do đó, ta kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm này để đạt được hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất. Thông thường thời gian nhân giống từ 30 – 36 giờ. 4.2.4 Thiết bị nhân giống  Nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm: Sau khi chuẩn bị môi trường, tiến hành tiệt trùng môi trường ở 1210C trong 40 phút. Môi trường sau khi tiệt trùng được lắc đều nhằm làm cho môi trường được tơi xốp và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 18 Hình 4.2.4.1: Máy lắc ổn nhiệt (Personal – 11 , TAITEC) Giống được nuôi trên môi trường thạch nghiêng, và giữ ở nhiệt độ phòng.  Nhân giống giai đoạn phân xưởng: Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng nhất cao hơn. 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men Để nuôi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15 với mục đích thu – amylase, Fenikxova và Dvatxatova (1959, 1960) chọn môi trường có 65% bột ngô; 0.9% NaNO3; 0.005% MgSO4 và 10% nước chiết mầm mạch (100g/1 lít nước), pH môi trường 6 – 7.  Nguồn glucid:  Ngoài bột ngô, môi trường cần chứa maltose và dextrin.  Các loại đường: Sự có mặt của glucose, fructose và saccharose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc, nhưng lại hạn chế sự tích tụ amylase. Ngược lại, khi thêm lactose và MgO vào môi trường thì nấm mốc kém phát triển hơn nhưng lại tích tụ nhiều amylase.  Nguồn carbon được vi sinh vật sử dụng để đáp ứng các nhu cầu sinh sản và phát triển: - Cung cấp năng lượng cho vi sinh vật. - Cung cấp các tiền chất cho vi sinh vật. - Tạo các quá trình oxy hóa nhờ vi sinh vật. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 19  Các yếu tố khác: Sự tạo thành và tích tụ amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+, và sự có mặt của các nguyên tố phosphor, đặc biệt là magie. - Trong môi trường thiếu MgSO4, amylase hầu như không được tạo thành, hàm lượng MgSO4 cần thiết chỉ vào khoảng 0.005%. Sau magie là phosphor, nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0.1 – 0.2%. - Calci có trong thành phần của α – amylase. Mỗi phân tử α – amylase có 2 hoặc 3 ion calci, mà tính chịu nhiệt của enzyme này lại phụ thuộc vào số ion calci có trong phân tử. - Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ amylase gắn liền với sự có mặt của nhóm – SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu thành enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0.04g/100ml bảo đảm cho hoạt độ amylase cực đại và bằng 360 đơn vị/100ml. Nếu giảm tới 0.004%, hoạt độ amylase của Aspergillus oryzae 3 – 9 – 45 chỉ còn 50% và bằng 180 đơn vị/100ml. - Các nguyên tố vi lượng như đồng, thiếc molipden, borac, mangan, sắt, coban,… làm tăng hoạt độ của nhiều enzyme. 4.4 Tiệt trùng môi trường 4.4.1 Mục đích Bảo quản: vô hoạt enzyme, ức chế vi sinh vật. 4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng  Biến đổi vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), … Độ nhớt của dung dịch giảm.  Biến đổi hóa học: Thay đổi tốc độ các phản ứng hóa học (sự oxy hóa vitamin C, các chất màu).  Biến đổi hóa lý: Độ hòa tan tăng, sự bốc hơi nước.  Biến đổi hóa sinh: Enzym bị vô hoạt.  Biến đổi sinh học: Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật.  Biến đổi về mặt cảm quan: Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin, …). 4.4.3 Thiết bị  Dùng thiết bị trao đổi nhiệt dạng bản mỏng. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 20  Thông số công nghệ:  : 1210C.  : 20 – . 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme Sử dụng phương pháp lên men bề sâu. 1. Thùng trộn môi trường dinh dưỡng. 7. Thùng dịch lên men. 2. Nồi tiệt trùng. 8. Thùng lên men. 3. Thùng chứa. 9. Lọc khí sơ bộ. 4. Van xả. 10. Nén khí. 5. Thiết bị trao đổi nhiệt. 11. Lọc khí bước hai. 6. Bơm ly tâm. 12. Thùng canh trường thành phẩm. Hình 4.5.1: Sơ đồ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề sâu 4.5.1 Mục đích Khai thác: tạo điều kiện cho mốc phát triển đều trên môi trường nuôi cấy để hình thành hệ enzyme amylase. 4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men  Biến đổi vật lý: sự tăng nhiệt độ do quá trình hô hấp của nấm mốc.  Biến đổi hóa sinh: sự tổng hợp enzyme amylase.  Biến đổi sinh học: sự gia tăng sinh khối. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 21 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men  Môi trường lên men:  Hàm lượng chất khô: Các chất hòa tan trong môi trường sẽ tạo nên một áp lực thẩm thấu. Hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường càng lớn thì giá trị áp lực thẩm thấu càng cao. Khi hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường quá cao, màng tế bào chất không thể duy trì sự cân bằng áp lực thẩm thấu được nữa, do đó phải xác định hàm lượng chất khô tối ưu cho môi trường trước khi lên men.  pH môi trường: pH có ảnh hưởng nhiều đến tích tụ enzyme nên trong thực tế sản xuất, người ta thường sử dụng acid hoặc ammoniac để điều chỉnh cho pH luôn trong khoảng tối ưu: - Nếu như thêm vào môi trường các muối ammonium, thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion ammonium, các ion được giải phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế, cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzyme amylase. - Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình vi sinh vật tiêu thụ anion (NO3 - ) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa làm pH tăng lên. Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6- 7.  Điều kiện lên men:  Lượng giống cấy: Nếu lượng giống cấy quá ít, thời gian lên men kéo dài. Các vi sinh vật tạp nhiễm trong môi trường lên men dễ phát triển và có thể gây hư hỏng sản phẩm. Nếu lượng giống cấy quá nhiều, thời gian lên men có thể rút ngắn, nhưng hàm lượng các sản phẩm phụ tạo thành sẽ thay đổi và gây ảnh hưởng đến chất lượng thành phẩm, hơn nữa, việc tăng lượng giống cấy sẽ làm tăng chi phí cho quá trình nhân giống trong sản xuất. Tỉ lệ giống cấy: 2 – 5%.  Nhiệt độ: Khi nhiệt độ thấp, quá trình lên men kéo dài. Khi nhiệt độ quá cao, hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bị giảm và các cấu tử mẫn cảm với nhiệt bị tổn thất. Trong quá trình lên men, một phần năng lượng do vi sinh vật chuyển hóa sẽ được thải vào môi trường dưới dạng nhiệt năng, dẫn đến làm tăng nhiệt độ dịch lên men, do đó ở quy mô công nghiệp, thiết bị lên men có bộ phận hiệu chỉnh nhiệt độ để ổn định hoạt tính cho giống trong suốt quá trình lên men. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 22  Thời gian lên men: Trong sản xuất, xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men thông qua việc lấy mẫu đánh giá kiểm tra một số chỉ tiêu hóa lý, vi sinh và cảm quan (thường 2 – 4 ngày).  Cung cấp oxy: Trong môi trường lỏng, tế bào vi sinh vật phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của tế bào với oxy phải thông qua môi trường nuôi cấy. Do đó, khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy của không khí có thể hòa tan vào canh trường. Lượng oxy hòa tan vào môi trường phải đủ để bù đắp cho sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời phải dư ra từ 1 – 3mg/L. Mức độ hòa tan của oxy phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp sục khí, trong đó nhiệt độ cao thì oxy hòa tan kém, còn nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hòa tan của oxy. Một số chất khi hòa tan vào môi trường sẽ ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa tan của oxy, ví dụ như trong dung dịch có nồng độ chất khô là 13%, độ hòa tan oxy sẽ giảm 85%, và nếu chỉ bỏ 2% bột giấy hoặc xác tế bào chết vào dung dịch thì độ hòa tan của oxy sẽ giảm đến 85 – 90%. Ngược lại, có một số chất khi hòa tan vào dung dịch lại làm tăng độ hòa tan của oxy, đó là các ester, rượu, acid hữu cơ và các hợp chất háo nước khác. Khi nuôi cấy nấm mốc để thu nhận enzyme, lượng không khí cần sục vào 1m3 môi trường vào khoảng 30 – 40m3/m3×giờ. Với sự phát triển của kỹ thuật sục khí, tiêu hao không khí cho 1m 3 môi trường×giờ sẽ giảm dần. Chiều hướng phát triển hiện nay không phải là giảm lượng không khí cho 1m3 môi trường mà người ta tăng nồng độ chất dinh dưỡng tương đương với lượng oxy hòa tan để đạt sinh khối cao và do đó tăng năng suất của thiết bị. 4.5.4 Thiết bị Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 23 Hình 4.5.2: Thùng lên men  Cấu tạo thiết bị: Thiết bị có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ. Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy và các đầu dò nhiệt độ, pH, … để theo dõi trực tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men. Hệ thống sục khí được bố trí trên đáy thiết bị để cung cấp lượng oxy cần thiết cho vi sinh vật hiếu khí. Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo cho tác nhân điều nhiệt để ổn định nhiệt độ canh trường trong quá trình lên men. Phần trên nắp thiết bị có các cửa với nhiều chức năng khác nhau: cửa thông cánh khuấy gắn với motor, cửa nạp giống, cửa vào và ra cho không khí, cửa nạp chất phá bọt, cửa nạp chất điều chỉnh pH, … Cửa nạp môi trường và tháo canh trường ra khỏi thiết bị thường được bố trí ở phần đáy. Thiết bị được thiết kế ở dạng vô trùng: kín và có thể chịu được áp lực cao, có thể dùng hơi vô trùng trực tiếp và vệ sinh thiết bị.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ: 28 – 320C.  Không khí cần sục vào môi trường: 30 – 40m3/m3×giờ. ] Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 24 4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô  Mục đích  Khai thác: Tách sinh khối ra khỏi canh trường sau lên men.  Những biến đổi trong quá trình ly tâm  Biến đổi hóa học: tăng độ tinh sạch của sản phẩm  Biến đổi vật lý: khối lượng giảm.  Biến đổi hóa lý: tách pha .  Thiết bị:  Cấu tạo thiết bị Hình 4.6.1: Thiết bị lọc ly tâm nằm ngang Thiết bị lọc ly tâm Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 25 - Tốc độ 4500 – 6000 vòng/phút. - Đường kính đĩa ly tâm 200mm, chiều dài 1m. - Công suất động cơ đạt 5.5kW, khối lượng 600kg.  Ưu điểm - Năng suất lớn, kích thước nhỏ. - Thời gian nhanh. - Khả năng tách tốt, độ đồng đều cao. - Khả năng cơ giới hóa cao.  Nhược điểm Kết cấu thiết bị phức tạp.  - : 15 – 200C. - – . 4.7 Tách và tinh sạch enzyme 4.7.1 Siêu lọc  Mục đích Khai thác: làm giảm hàm lượng các chất có phân tử lượng nhỏ ra khỏi dung dịch enzyme thô.  Những biến đổi trong quá trình siêu lọc  Biến đổi vật lý: Khối lượng riêng hỗn hợp giảm.  Biến đổi hóa học: Hàm lượng enzyme tăng.  Thiết bị: thiết bị UF Phương pháp siêu lọc dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Các chất có phân tử lượng nhỏ như đường, muối, nước… sẽ chui qua màng, enzyme và protein phi enzyme được giữ lại trên màng.  Cấu tạo thiết bị Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 26 Hình 4.7.1.1: Thiết bị lọc UF Thiết bị membrane có dạng hình trụ, bên trong chứa nhiều ống trụ nhỏ đặt song song với nhau. Mỗi ống trụ nhỏ thường được chế tạo bằng thép không rỉ, có đường kính dao động từ 12.5 – 75mm, chiều dài khoảng 0.6 – 6.4m và được đục các lỗ nhỏ trên than. Các membrane cũng có dạng hình trụ được lồng ép sát thành trong của các ống trụ nhỏ trên.  Nguyên lý hoạt động Nguyên liệu sẽ được bơm vào từ một đầu của thiết bị và được phân phối vào bên trong các ống trụ nhỏ. Dòng ra retentate sẽ tiếp tục đi hết theo chiều dài các ống trụ nhỏ Hình 4.7.1.2: Module phân riêng với membrane ceramic Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 27 và thoát ra bên ngoài các ống trụ nhỏ, sau đó được tập trung theo cửa ra chung nằm phía trên thân của thiết bị. Bên trong thiết bị membrane có thể được chia thành nhiều khoang, mỗi khoang gồm một số ống trụ nhỏ song song nằm cạnh nhau. Đầu tiên nguyên liệu sẽ được bơm vào một khoang trong thiết bị. Dòng retentate thoát ra khỏi khoang này và đi tiếp vào khoang thứ hai, còn dòng retentate thoát ra từ khoang thứ hai sẽ đi tiếp vào khoang thứ ba, … Như vậy, dòng retentate thoát ra từ khoang cuối cùng sẽ có nồng độ đạt giá trị yêu cầu.  Ưu điểm - Dễ tạo ra dòng chảy rối trong quá trình vận hành. - Đơn giản khi vệ sinh, thay thế membrane sử dụng và bảo trì thiết bị. - Màng membrane từ vật liệu ceramic có rất nhiều ưu điểm: trơ với các hóa chất như acid, kiềm, chlorine, …, khoảng nhiệt độ và pH hoạt động rất rộng (Tmax ≤ 350 0 C, pH = 0.5 – 13), do đó có thể sử dụng hơi để vô trùng thiết bị.  Nhược điểm - Thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều không gian nhà xưởng. - Tốn nhiều năng lượng sử dụng do có sự tụt áp của dòng nguyên liệu trong các ống hình trụ nhỏ. - Membrane từ vật liệu ceramic dễ vỡ bởi những va chạm cơ học, giá thành cao và đường kính lỗ mao dẫn các membrane ceramic hiện nay không thể nhỏ hơn 10-2µm.  - Áp lực thẩm thấu: 6.9 bar. - . - Đường kính mao quản trung bình từ 2 đến 50nm. - Để tinh sạch canh trường nuôi cấy thu nhận loại enzyme này thì cần vật liệu có kích thước nhỏ hơn kích thước của enzyme amylase (38kDa). 4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel  Mục đích: tách các protein ra khỏi nhau để thu được enzyme tinh khiết.  Nguyên tắc  Phương pháp này được ứng dụng để tách hỗn hợp các chất dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng.  Quá trình triển khai sắc ký được thực hiện thông qua sự tương tác của 2 pha: - Pha tĩnh là các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên trong và bên ngoài hạt gel có các mao quản kích thước nhỏ. Cả cột gel được giữ cân bằng cách rửa qua dung dịch đệm. - Pha động là hỗn hợp gồm dịch enzyme và các tạp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 28 Dung dịch mẫu chứa enzyme và các cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác nhau được chạy qua cột. Những phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ mao quản của gel thì không thể đi vào bên trong hạt gel, vì thế chúng di chuyển trong khoảng không gian giữa các hạt. Những phân tử có kích thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong các hạt gel.  Một số điều kiện khi tiến hành lọc gel Để tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel, ta cần phải loại được các protein tạp ra khỏi hỗn hợp.  Lựa chọn kích thước cột gel: Để tinh sạch enzyme, người ta sử dụng những loại cột dài hơn 100 cm, tỷ lệ chiều dài và đường kính cột vào khoảng 2.5 – 10.0.  Lựa chọn loại gel: Sephadex được sử dụng phổ biến nhất đối với quá trình chiết tách mà ở đó tốc độ chảy không phải là yếu tố quan trọng.  Lựa chọn kích thước hạt gel: Thông thường, trong sắc ký lọc gel dùng để tinh sạch protein – enzyme, người ta thường chọn hạt gel có kích thước nhỏ. Kích thước nhỏ có thể khắc phục hiện tượng chảy tràn do trọng lực, chảy rối và tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha động và pha tĩnh. Tuy nhiên, nếu gel có kích thước quá nhỏ, đặc biệt là các gel có cấu trúc mềm thì xuất hiện sự tăng áp suất trong quá trình sắc ký và dễ xảy ra hiện tượng đè nén cục bộ.  Lựa chọn dung dịch đệm chiết xuất: Tùy theo độ ổn định của gel và các cấu tử cần chiết tách mà lựa chọn dung dịch đệm có pH thích hợp. Thông thường, đối với gel dextran và polyacrylamide, pH ổn định trong khoảng 1 – 10. Gel agarose ổn định trong giới hạn pH 4 – 10.  Thể tích mẫu: Thể tích mẫu chiếm khoảng 1 – 5% thể tích cột.  Tốc độ dòng chảy qua gel: Thông thường, đối với gel kích thước nhỏ, có thể điều chỉnh tốc độ chảy lên đến 15 – 25 ml/giờ.  Phương pháp thực hiện Dùng cột sắc ký nhồi chất mang là sephadex tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Chất nào có phân tử lượng lớn không bị mắc kẹt trong các lỗ rây của cột nhồi sẽ chạy ra trước ta thu được nhưng phân đoạn đầu tiên và ngược lại những chất có phân tử lượng nhỏ nhất sẽ chạy ra sau cùng. Từ đây, ta thu được ta thu được các phân đoạn khác nhau. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 29  Thiết bị Hiện nay, người ta thường sử dụng gel sephadex làm vật liệu nhồi cột. Sephadex là tên thương mại của một loại polysaccharide có nguồn gốc từ vi sinh vật – có bản chất là dextran. Trong đó, các phân tử được liên kết với nhau thông qua các liên kết ngang nhờ tác dụng của epichlorohydrin tạo thành các "rây phân tử". Số liên kết ngang càng nhiều thì kích thước lỗ rây sẽ càng nhỏ. Sephadex khi ngâm trong nước sẽ hình thành nên mạng lưới gel ba chiều. Các loại sephadex hiện nay chỉ trương nở trong nước và một vài dung môi phân cực nhưng không trương trong methanol, ethanol, acid acetic. Sephadex không tương tác với các ion do nó trung hòa về điện. Nếu bị oxy hóa mạnh trong các dung dịch thì cấu trúc gel sẽ bị phá vỡ, còn trong trong dung dịch acid mạnh thì các glucoside trong gel sẽ bị thủy phân. Hình 4.7.2.1: Sự phân tách các phân tử protein – enzyme bằng kỹ thuật sắc ký ái lực Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 30  Một số hiện tượng cần chú ý khi tiến hành lọc gel  Hiện tượng hấp phụ (adsorption effect): Là hiện tượng có thể gặp trong quá trình lọc gel. Sự hấp phụ một phần có thể gây ra sự trễ (delay) trong quá trình phân tách một phân tử protein nào đó. Sự hấp phụ có thể xem gần giống như tính chất trao đổi ion (ion exchange character) mà khi đó có thể tránh bằng cách sử dụng dung dịch đệm có lực ion lớn.  Hiện tượng chảy rối (turbulent flow): Là hiện tượng xảy ra khi dòng dung dịch đệm – mẫu di chuyển từ một vùng không gian hẹp giữa các hạt gel đến vùng không gian lớn hơn. Hiện tượng này luôn xảy ra trong quá trình sắc ký. Chỉ có thể giảm bớt hiện tượng chảy rối bằng cách giảm tốc độ chảy của dung dịch rửa giải hoặc sử dụng hạt gel có kích thước nhỏ hơn.  Hiện tượng không ổn định do trọng lực (gravitational instability): Hiện tượng này xuất hiện khi mẫu được đưa vào ở vị trí phía trên cột. Hệ quả của nó làm giảm khả năng khuếch tán của protein vào hạt gel, từ đó, khả năng phân tách protein trong hỗn hợp cũng bị giảm. Có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách tiếp mẫu từ dưới lên và giảm kích thước hạt gel.  Đánh giá hiệu quả quá trình tinh sạch: Đánh giá hoạt tính riêng của chế phẩm: Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme chủ yếu dựa vào lượng tinh bột bị thủy phân hay lượng đường khử tạo thành, sau đây là một số phương pháp để xác định hoạt độ của enzyme amylase:  Phương pháp Wolhgemuth: Nguyên tắc: xác định lượng enzyme ít nhất có thể thủy phân 1mg tinh bột đến các sản phẩm không màu với iod.  Phương pháp Heinkel: Nguyên tắc: xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sơ xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp với dung dịch iod. Đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 300C.  Phương pháp Rukhliadeva Geriacheva: Nguyên tắc: amylase có khả năng thủy phân tinh bột tạo thành các dextrin có khối lượng phân tử khác nhau, khi cho tác dụng với iod, chúng sẽ tạo màu, đo cường độ màu tạo thành ta tính được hoạt độ của amylase. Đơn vị hoạt độ của amylase là lượng enzyme xúc tác thủy phân được 1g tinh bột tạo thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 31  Phương pháp Smith và Rose: Nguyên tắc: hoạt tính α – amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức tinh bột – iod trước và sau thủy phân. Mật độ quang của phức tinh bột – iod được đo ở bước sóng 595nm trên máy quang phổ. Một đơn vị hoạt tính α – amylase là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 10mg tinh bột trong thời gian 1 phút ở 500C và pH 5.6.  Phương pháp Gratreva: Nguyên tắc: đơn vị hoạt độ amylase là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa 1g tinh bột thành glucose sau 1 giờ. Hoạt độ amylase được tính bằng số đơn vị trên 1ml môi trường hoặc 1g chế phẩm.  Phương pháp Nelson: Nguyên tắc: dưới tác dụng của amylase, tinh bột bị thủy phân tạo ra dextrin và đường khử. Vì vậy, sự tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Để định lượng đường khử tạo thành có thể dung nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp Nelson, Berrand, Luff – Schoorla cả tiến, Granxianof, … Nguyên tắc chung: lợi dụng tính chất khử của nhóm – CHO trong phân tử đường khi tác dụng với các chất khác nhau hay phản ứng với dung dịch đồng hóa trị II tạo thành kết tủa Cu2O. Hòa tan kết tủa Cu2O bằng các chất khác nhau và định lượng Cu để suy ra lượng đường. Ở đây ta sử dụng phương pháp Nelson. Hòa tan kết tủa Cu2O trong thuốc thử arseno – molybden sẽ nhận được màu xanh da trời. So màu ở máy so màu thường bước sóng 660nm, đối chiếu đồ thị tiêu chuẩn để tính lượng đường. Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme mà trong 30 phút ở 300C có thể phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương đương 1 micromol glucose.  Phương pháp xác định hoạt tính glucoamylase: Nguyên tắc: ta sẽ xác định hoạt tính của enzyme dựa vào cường độ màu với iod khi đo ở bước sóng 520nm. Hoạt tính glucoamylase được biểu thị bằng lượng glucose giải phóng bởi enzyme trong 1 phút ở 400C từ 1g tinh bột. Xác định độ tinh sạch của enzyme: bằng phương pháp điện di Điện di trên gel Sodium dodecyl sulfate – polyacryamide 10% (SDS PAGE) được thực hiện theo phương pháp của Laemmli (Tipton 1992) trên thiết bị điện di APLELEX với nguồn Electronforesis power supply ST 1006T. Mẫu chạy điện di phải giữ trong điều kiện -200 – 10C. Các hóa chất điện di được cung cấp bởi hãng Bioad, Mỹ. Gel sau khi chạy điện di được nhuộm màu với Coomassie blue G250. Hoạt tính amylase của các vạch isoform được xác định sau khi làm hồi lại hoạt tính theo phương Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 32 pháp của Lark và Springhorn. Gel sau khi chạy điện di có thể được chụp ảnh hoặc được sấy bằng cách ngâm trong dung dịch sấy gel và giữ ở giữa hai lớp celophan. 4.8 Sấy  Mục đích  Chế biến: Tạo sản phẩm dạng bột. Bảo quản: Quá trình sấy làm giảm hàm ẩm, từ đó ức chế vi sinh vật.  Những biến đổi trong quá trình sấy  Biến đổi vật lý: Thay đổi khối lượng riêng, tỷ trọng.  Biến đổi hóa học: Độ ẩm giảm.  Biến đổi hóa lý: Nước bay hơi, hỗn hợp chuyển sang pha rắn.  Thiết bị  Thiết bị sấy phun có đáy hình nón Hình 4.8.1: Thiết bị sấy phun đáy hình nón Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 33 o Cấu tạo – hoạt động của thiết bị: - Vỏ trụ 9 có đáy hình nón để tháo bột khô. - Dung dịch đẩy vào sấy bị phun ra nhờ cơ cấu ly tâm 13 có đĩa 10. - Tác nhân sấy đưa vào phần trên của thiết bị theo ống dẫn 7. Ở cuối ống dẫn 7 lắp cơ cấu phun hình nón 8. Nhờ cơ cấu 8, tạo ra dòng xoáy của khí đưa vào. Các giọt sản phẩm được phun bằng đĩa bị bao phủ bởi dòng không khí và chuyển xuống dưới. - Ẩm được bốc hơi, các phần tử bột nhỏ còn lại lắng xuống ở đáy hình nón và tháo đến cơ cấu 1 để chuyển sản phẩm vào hệ băng tải khí động học. - Để tẩy sạch các tiểu phần của sản phẩm bám trên tường, lắp máy rung 17. Tác nhân sấy bị thải có mang theo các tiểu phần nhỏ của sản phẩm ra khỏi thiết bị sấy qua ống dẫn 2 vào xyclon để tách bột. - Để khảo sát bên trong, có xe nâng 4, nguồn chiếu sáng 6 và cửa 5. Tấm ngăn máy sấy 11 có các van bảo hiểm ở dạng các đĩa chồng nhau và dạng đường ống 12 để xả khí sấy khi tăng áp suất đáng kể. - Đĩa phun 10 quay với tốc độ 10000 vòng/phút từ động cơ qua hộp giảm tốc. - Để bôi trơn cơ cấu phun, ở phần trên của thiết bị có lắp cơ cấu cơ học và bộ lọc mỡ 14. Vô lăng điện 15 dùng để nâng cơ cấu phun. - Để tránh cháy sản phẩm trong máy sấy, người ta đặt các cơ cấu bảo hiểm 3 và 18. o Ưu điểm: - Thời gian sấy ngắn. - Nhiệt độ của vật liệu sấy thấp: Vì sấy quá nhanh, nhiệt độ của vật liệu trong suốt chu kỳ sấy không vượt quá nhiệt độ của ẩm bốc hơi (60 – 700C) và thấp hơn nhiều so với nhiệt độ của tác nhân sấy. - Sản phẩm nhận được ở dạng bột nhỏ không cần phải nghiền lại và có độ hòa tan lớn. - Thiết bị có ít khe hở, do đó hạn chế không khí nhiễm bẩn đi qua các khe hở. o Nhược điểm: - Kích thước của buồng sấy tương đối lớn. - Cấu tạo thiết bị phức tạp: cơ cấu phun, hệ thống thu hồi bụi và tháo dỡ sản phẩm. o Thông số công nghệ: - Thiết bị có năng suất ẩm bốc hơi 1500 – 3500 kg/giờ. - Độ ẩm của sản phẩm: <5%. - Nhiệt độ khí đầu vào: 150 – 2500C. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 34 5. CHẾ PHẨM AMYLASE 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp  Trong sản xuất bánh mì:  Khả năng dextrin hóa: không được dưới 2000 hoạt độ/g đối với chế phẩm khô.  Khả năng đường hóa: không được dưới 150 đơn vị hoạt độ/g đối với chế phẩm khô.  Khả năng phân giải protein: không được dưới 7 đơn vị hoạt độ/g đối với chế phẩm khô.  Độ nhiễm trong chế phẩm amiloirizin: không quá 150 bào tử.  Trong sản xuất bia:  Chế phẩm enzyme không ảnh hưởng đến hương vị của bia, sự tạo bọt và độ ổn định của bọt.  Chế phẩm chứa enzyme đều bền nhiệt trong quá trình nấu, nhiệt độ 45 – 700C.  Trong chế phẩm, để tạo pH tối ưu thì phải có mặt của photphatase acid, pH tối ưu c ác enzyme trong chế phẩm trong khoảng 5.5 – 5.7.  Trong sản xuất rượu:  Chế phẩm không cần độ tinh khiết, thường là phức hệ nhiều enzym.  Trong sản zuất rượu vang, để tránh hiện tượng mất màu đỏ trong rượu vang đỏ và vang trắng khỏi bị màu hung, hoạt độ enzyme oxy hóa trong chế phẩm không được cao hơn 0.1 đv/mg acid ascorbic trong 1 phút đối với 1g chế phẩm ở 300C.  Để xử lý dịch nho và nho nghiền trên dây chuyền sản xuất, chỉ có thể dùng các enzyme có hoạt độ cao (12000 đv/g) hoặc các chế phẩm enzyme không tan.  Giai đoạn dịch hóa và dextrin hóa nhanh trong khoảng 60 – 950C không tích tụ nhiều glucid phân tử và acid amin các chế phẩm cần có hoạt lực dịch hóa và dextrin hóa α – amylase cao với nhiệt độ tối ưu khá cao và không chứa protease, β – glucanase.  Giai đoạn đường hóa có tinh bột chế phẩm có hàm lượng đầy đủ glucoamylase và α – amylase để đạt được thủy phân sâu và đúng thời hạn tinh bột đến đường lên men.  Nhiệt độ tối ưu chế phẩm nằm trong khoảng 55 – 620C (nhiệt độ đường hóa), đồng thời các chế phẩm phải giữ hoạt lực đầy đủ ở 30oC.  Trong sản xuất nước quả rượu và trái cây: Các chế phẩm enzyme được dùng trong sàn xuất nước quả, rượu trái cây không chứa các enzyme oxy hóa: peroxidase, catalase, polyphenoloxidase, sẽ làm biến màu nước quả và nhiều khi làm giảm tính chất cảm quan.  Trong công nghiệp dệt và giấy:  Các chế phẩm enzym trong công nghiệp dệt, giấy phải có tính chịu được nhiệt độ cao như enzyme vi khuẩn, dễ nhuộm tẩy vải, … Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 35  Trong công nghiệp thường dùng chế phẩm amylase dịch đặc có nồng độ chất khô lớn hơn 50%.  Trong chăn nuôi: Trong chăn nuôi, các chế phẩm được dùng riêng rẽ hay phối hợp các enzyme khác với liều lượng nhỏ từ 0.01 – 0.3% lượng thức ăn.  Trong y học: Các chế phẩm enzyme được dùng trong y học ở dạng bột màu trắng, tinh khiết, có hoạt độ cao. 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme  Chế phẩm enzyme thô (dạng lỏng): Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Chế phẩm enzyme thô.  Chế phẩm enzyme kỹ thuật (dạng bột): - Là chế phẩm thô được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa một vài enzyme chủ yếu. - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Sấy → Chế phẩm enzyme kỹ thuật.  Chế phẩm enzyme tinh khiết: - Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô. - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Kết tủa → Sấy → Chế phẩm enzyme tinh khiết (mức độ tinh khiết không cao). - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Tinh sạch bằng các phương pháp sắc ký (lọc gel/trao đổi ion/hấp phụ) → Sấy → Chế phẩm enzyme tinh khiết (mức độ tinh khiết cao). 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại  Chế phẩm α – amylase Hình 5.3.1: Chế phẩm α – amylase chịu nhiệt dạng lỏng Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 36  Nguồn gốc – Phạm vi ứng dụng của sản phẩm: o Được tạo thành từ loài Bacillus subtillis bằng phương pháp lên men chìm. o Tùy theo mức độ chất lượng khác nhau mà nó có thể được ứng dụng trong thực phẩm hoặc trong các ngành công nghiệp khác. o Được sử dụng rông rãi nhất là trong các lĩnh vực của chế biến tinh bột, cồn, acid hữu cơ, dệt và lên men.  Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm: o Chỉ tiêu vật lý: Trạng thái vật lý: chất lỏng có cặn lắng nhẹ. Khối lượng riêng: 1.02 – 1.35g/ml. Nhiệt độ: 65 – 900C. o Chỉ tiêu hóa học: pH: 5.5 – 7.0 o Chỉ tiêu hóa sinh: Hoạt tính enzyme: 3,000U/ml. o Chỉ tiêu cảm quan: Màu nâu nhạt. Mùi: có mùi lên men bình thường.  Các thông tin khác: o Điều kiện bảo quản: Sản phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ thấp, tránh xa nơi có nhiệt độ cao. o Thời hạn sử dụng: 3 tháng ở nhiệt độ 250C: hoạt độ còn ≥ 90%. o Liều lượng: 6 – 8U/g nguyên liệu chứa amylose. o Tính an toàn: Tiếp xúc với enzyme có thể dẫn đến sự nhạy cảm và có thể là nguyên nhân gây ra dị ứng đối với những cơ quan nhạy cảm trong cơ thể. Sự tiếp xúc lâu có thể là nguyên nhân gây ngứa cho da ở trẻ em, ảnh hưởng đến mắt, mũi. Khi bị dính nên rửa ngay lập tức, rửa bằng nước, và hỏi ý kiến bác sĩ. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 37 Hình 5.3.2: Chế phẩm α – amylase chịu nhiệt dạng bột Thông tin về sản phẩm:  Liquimax là loại α – amylase công nghiệp để thủy phân cho dịch lỏng ngô, lúa mì và các ngũ cốc khác. Đây là bước đầu tiên trong sản xuất ethanol từ ngũ cốc. Loại α – amylase chịu nhiệt này được làm từ giống tốt nhất của Bacillus licheniformis bằng phương pháp lên men bề sâu.  Đây là sản phẩm có tính kháng nhiệt khá tốt và có thể thích nghi ở điều kiện pH thấp. Nó có ứng dụng rộng rãi cho các dạng lỏng trong công nghiệp tạo ra mật tinh bột, cồn, bia, lactic acid, citric acid …và trong công nghiệp dệt  Sản phẩm được lựa chọn rộng rãi cho chất lỏng trong công nghiệp như đường từ tinh bột, cồn, bia, acid lactic, acid citric,… và trong công nghiệp dệt.  Chế phẩm glucoamylase Hình 5.3.3: Chế phẩm glucoamylase Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 38  Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm: Chế phẩm glucoamylase được phân thành hai loại: dạng lỏng và dạng rắn. o Chỉ tiêu vật lý: Trạng thái vật lý: lỏng hoặc rắn. Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 58 – 600C. o Chỉ tiêu hóa học: pH hoạt động tối ưu: 4. o Chỉ tiêu hóa sinh: Chế phẩm dạng rắn: 150,000 U/g. Chế phẩm dạng lỏng: 100,000 U/ml; 120,000U/ml; 130,000U/ml.  Các thông tin khác: Chế phẩm dạng rắn: 20 kg/túi. Chế phẩm dạng lỏng: 25 kg/thùng. Phạm vi sử dụng: là tác nhân đường hóa trong quá trình sản xuất cồn, rượu bia, calci lactate. 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 6.1. α – amylase Bacillus subtilis c s ư m hơn so v rửa trôi ăng . dẫn đến khuôn quan trọng . Zoe Konsoula Bacillus subtilis trong khuôn gel calcium algenate α – amylase theo từng mẻ. α – amylase .   : Tryp , NaCl, 2, Bovine serum albumin. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 39  t Bacillus subtilis . E. Litopoulou – α – amylase enzyme thủy .   Bacillus subtilis 40 0 24 giờ Luria Bertani 1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) 0.5% (w/v) NaCl. (4500 vòng/phút thí nghiệm tế bào .  nh đ trong 12.5mL (0.16% (w/v) trọng của gel). 3.5% (w/v) CaCl2 một inate hóa 2, tạo 35µ 2+ .  Tối ưu hóa các đặc tính của khuôn 2% (w/v) sodium alginate, 3.5% (w/v) CaCl2 , 3.2% (w/v trọng lượng ướt 2 .  Lên men (%, w/v) o NaCl: 0.01 o (NH4)2SO4: 0.02 o MgSO4.7H2O: 0.005 o CaCl2: 0.0075 o Tryptone: 2 : : 400C. : 36 giờ. 2 quá trình lên men đươc tiếp tục. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 40  : ỷ α – amylase : = Cimm /Cfree :  ng α – amylase .  α – amylase . c : (%) = 100x(Cx /C1) :  α – amylase .  - . Phương pháp phân tích hoạt tính của amylase α – amylase 0.1M dung dịch 100 0 C. bovine serum albumin kết tinh.  Kết quả Bacillus subtilis 135 0 n . Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 41 Hình 6.1.1: Động học của quá trình sản xuất α – amylase ngoại bào b i tế bào tự do (A) và tế bào cố định trong khuôn gel calcium alginate (B). Hoạt tính của amylase trong canh trường ( ), nồng độ tế bào trong canh trường (▲) và tế bào trong khuôn gel (×) α – amylase trên cả Bacillus subtilis d 22 22 8 giờ 1.9mg/ml canh trườ Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 42 (H 22 , động học của ịnh lại khác 12 giờ 4mg/ml nồng độ . 30 giờ (h 22B). Hơn , do tỷ 5mg/ml algenate gel tương đươn 1.25mg/ml nồng độ , người ta xác định được nồng độ 0.2mg/ml. 22 α – amylase . Kỹ α – amylase 2. α – amylase 48 giờ , nhưng cách thức hai 24 giờ ia 30 giờ. Sau 36 giờ (9.34 U/ml/giờ 90% (3.7 U/ml/giờ a loài Bacillus .  , t Bacillus subtilis α – amylase nồng độ . Bacillus subtilis nồng độ ủa khuôn gel, trong . C Bacillus subtilis , đ α – amylase nhiều lần mà Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 43 vẫn đạt hiệu quả cao trong quá trình lên men α – amylase. 6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải trong công nghiệp thực phẩm Công nghiệp chế biến thức ăn và bia thải ra một lượng lớn nước thải có chỉ số COD (biểu thị nhu cầu oxy hóa học: số mg oxy cần dùng để oxy hóa toàn bộ lượng chất ô nhiễm có trong 1 lít nước thải bằng phản ứng hóa học) và BOD (biểu thị nhu cầu oxy sinh học: số mg oxy mà vi sinh vật cần dùng để oxy hóa toàn bộ lượng chất ô nhiễm dễ bi phân hủy sinh học có trong 1 lít nước thải) khá cao. Nguồn nước thải chưa qua xử lý từ nhà máy bia có chỉ số BOD vào khoảng 500 – 2600mg/L, COD 780 – 3500mg/L, và nguồn nước thải chưa qua xử lý từ nhà máy chế biến thịt có chỉ số BOD 600 – 3000mg/L, COD 800 –400mg/L thề hiện một vấn đề môi trường nghiêm trọng ở Santiago de Cuba. Do đó, cần thiết phải có những kỹ thuật công nghệ xử lý những nguồn nước thải này. Khả năng lọc sạch chất thải từ công nghiệp thực phẩm, bằng việc sử dụng chúng như là cơ chất cho những công nghệ hóa sinh có tiềm năng lợi ích kinh tế, đã từng được biết đến trước đây. Chất thải qua quy trình xử lý Mussel có thể sử dụng để sản xuất protein đơn bào (single cell protein) và quá trình phân giải với sự ổn định cao từ các giống Aspergillus. Xử lý vi sinh những nguồn thải này là một phương pháp hiệu quả để làm hạ chỉ số COD khoảng hơn 90%. Giống Aspergillus sản xuất rất nhiều lọai enzyme ngoại bào, trong đó amylase là enzyme rất quan trọng trong công nghiệp. Amylase không chỉ được sử dụng trong quá trình lên men, mà còn được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, cũng như công nghiệp giấy và vải sợi. Dựa vào sự có sẵn của những nguồn nước thải rất lớn với giá thấp từ các nhà mày bia và chế biến thịt của Santiago de Cuba, việc sử dụng những nguồn này như là môi trường gieo trồng cho các quá trình sản xuất vi sinh, có thể cung cấp một nguyên liệu đầu vào rẻ tiền cho một quy trình sản xuất chi phí thấp, với thuận lợi là khả năng làm giảm chỉ số COD hiệu quả. Tuy nhiên, chưa có một thông tin nào về việc sử dụng những nguồn thải từ các nhà máy bia và chế biến thịt cho sản xuất các lọai enzyme công nghiệp bằng nấm mốc Aspergillus niger. C.F. Gonzalez xác định khả năng ứng dụng cả hai nguồn nước thải từ nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt ở Santiago de Cuba cho sản xuất amylase từ chủng Aspergillus niger UO – 1 trong điều kiện môi trường nuôi cấy bề sâu. Những ảnh hưởng của mức tinh bột ban đầu và nguồn nitơ trong quá trình sản xuất enzyme amylase được nghiên cứu. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và ion kim lọai lên tính ổn định của enzyme amylase cũng được tìm hiểu. Thêm vào đó, xác định mức độ giảm chỉ số COD trong cả hai nguồn nước thải sau quá trình xử lý vi sinh. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 44  Nguyên liệu và phương pháp  Hệ vi sinh vật: Chủng Aspergillus niger UO – 1 được nuôi trong các ống thạch nghiêng chứa dextrose khoai tây ở 40C.  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men : o Glucose: 20g/L o (NH4)2SO4: 6.6g/L o KH2PO4 : 3.5g/L o FeSO4.7H2O: 0.15g/L o MgSO4.7H2O: 0.1g/L o MnCl2.2H2O: 0.45g/L o Mycological peptone: 3.0g/L : pH 6.8. ở 300C. : 48 giờ. : 220vòng/phút. Nước thải từ nhà máy bia và từ nhà máy chế biến thịt, được sử dụng như là cơ chất của môi trường nuôi cấy. Cả hai nguồn nước thải được ly tâm ở 12,000g/15 phút để loại bỏ tạp chất. 6.2.1: COD 3.4g/L Đường 1.98g/L Nitơ 0.095g/L Phospho 0.034 g/L COD 3.0g/L Đường 1.82 g/L Nitơ 0.172 g/L Phospho 0.028 g/L Môi trường sản xuất được lấy từ những chất bề mặt với hàm lượng dinh dưỡng: NaCl 5g/L KH2PO4 3.5g/L FeSO4.7H2O 0.15g/L MgSO4.7H2O 0.12g/L Giống cấy 3.0g/L (NH4)2SO4 6.6 g/L CaCO3 8.0g/L. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 45 Để nghiên cứu những ảnh hưởng ban đầu của tinh bột trong việc sản xuất amylase, môi trường được bổ sung tinh bột khoai tây hòa tan để thu được môi trường với hàm lượng tinh bột ban đầu 10, 20, 30 và 40 g/L. Môi trường không có tinh bột được dùng để điều khiển, môi trường được điều chỉnh pH 6.0 và tiệt trùng ở 1210C trong 15phút, tiêm giống với 2% giống cấy và ủ ở 300C trong 88 giờ. Tất cả giống được nuôi cấy chìm trong erlen 250ml với 50ml môi trường sản xuất được lắc 200 vòng/phút, dùng 8 lọ trong mỗi loạt lên men . Mẫu cấy mỗi ống thí nghiệm được thu nhận sau 12 giờ. Khối Mycelial thu được bằng giấy lọc, rửa dưới vòi nước nhỏ và sấy ở 1050C. Giấy lọc được dùng để thực hiện phân tích (độ pH, mức độ sinh tổng hợp enzyme, hàm lượng đường tổng, nitơ tổng, phospho tổng và chỉ số COD). Sự phân tích chỉ số COD được thực hiện trên giấy lọc ở mỗi quá trình lên men, sử dụng phương pháp so màu reflux.  Phân tích hoạt tính của amylase Hoạt tính amylase tổng (TAA) được xác định theo Murado (1993): trộn lẫn 80µl môi trường giấy – lọc với 400µl citrate – phosphate 0.15M, điều kiện pH 5.0 và 4% bột hoà tan trước khi bảo quản ở 400 C trong 15 phút, sau đó ủ ở 40o C trong 10 phút để các phản ứng xảy ra. Phản ứng được dừng lại khi thêm 480µl acid dinitrosalicylic, lượng glucose giải phóng được xác định bởi phản ứng với 3, 5 – dinitrosalicylic (Bernfeld, 1951). Một đơn vị hoạt động amylase được xác định bởi số lượng enzyme chuyển hóa 1mg/mL đường khử (xem như glucose) trong điều kiện phân tích.  Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt động của amylase Mẫu được ủ với mỗi hỗn hợp ở 30 phút trong những điều kiện nhiệt độ và độ pH tối ưu được xác định trong phân tích trước đây. Sau khi ủ, hoạt tính còn lại được xác định bởi sự phân tích enzyme tương ứng. Hoạt tính enzyme dư được biểu thị như một phần trăm của hoạt động trong những mẫu kiểm tra không có chất phản ứng (Aquino, Jorge, Terenzi & Polizeli, 2003). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Những dữ liệu được phân tích bởi sự phân tích độ biến thiên (ANOVA) trên SPSS 8.0 Windows.  Kết quả Sản xuất amylase trong môi trường nước thải từ nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt bổ sung tinh bột. Thời gian sinh trưởng, độ pH, đường tổng và enzyme của quá trình được 24. Mức độ sinh tổng hợp enzyme amylase tùy thuộc vào nồng độ tinh bột ban đầu trong môi trường nuôi cấy (hình 24 ). Với nồng độ tinh bột ban đầu cao (40g tinh bột/l) trong môi trường tối ưu cho sự phát triển của tế bào, hàm lượng amylase đạt cực đại trong môi trường nước thải từ nhà máy bia (70.29 EU/ml) cao hơn so với trong môi trường nước thải từ nhà máy chế biến thịt (60.12 EU/ml). Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 46 Trong thời gian lên men, pH ban đầu giảm từ 6.0 xuống còn 4.0 sau 24 giờ, sau đó tăng đến xấp xỉ 7.4 (48 giờ ). Nồng độ đường tổng, nitơ tổng và phospho tổng giảm trong thời gian lên men, trong khi đó sinh khối và mức độ sinh tổng hợp enzyme tăng. Môi trường nuôi cấy bổ sung 40g tinh bột/l có chỉ số COD là 0.24g/L, thấp hơn so với môi trường nuôi cấy có nồng độ tinh bột ban đầu ít hơn. Điều này cho thấy rằng ít nhất 92 – 93% COD ban đầu được loại từ nước thải nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt. Hình 6.2.1: Thời gian sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của chủng Aspergillus niger UO – 1 với cơ chất từ nước thải của nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt cùng đường tổng ở các nồng độ khác nhau ((d)0,(s) 10, (h) 20; (n) 30; (�) 40g/L). TS: đường tổng; TAA: hoạt tính phân giải tổng; PA: hoạt tính protease; Nt: nitơ tổng; P: phosphor tổng. Canh trường được giữ ở 300C trong 88 giờ với vận tốc lắc đảo là 200 vòng/phút Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 47  Kết luận , việc sử dụng nước thải từ nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt làm môi trường nuôi cấy cho sản xuất quy mô lớn amylase từ chủng Aspergillus niger UO – 1, góp phần bảo vệ môi trường thông qua việc xử lý nguồn nước thải của các nhà máy . Tuy nhiên, những nghiên cứu dựa vào việc sử dụng các nguồn carbon từ cám lúa mì, cám gạo, vỏ hạt gạo, cám ngô, …cho sự sản xuất amylase là thiết yếu. 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Bạch Tuyết (chủ biên), Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. 2. Lê Ngọc Tú (chủ biên), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 2004. 3. Lê Văn Hòang, Các quá trình & thiết bị công nghệ sinh học trong công nghiệp, Nhà Xuất Bản Khoa Học Kỹ Thuật, 2004. 4. Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống – tập 1 – Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004. 5. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Công nghệ enzym, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004. 6. PTS. Nguyễn Đức Lượng – Nguyễn Chúc – Lê Văn Việt Mẫn, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa TP. HCM. 7. A. S. Grandison and M. J. Lewis, Separation Process in the Food and Biotechnology Industries, published by Woodhead Publishing Limited, Abington Hall, Abington, Cambridge CB1 6AH, England, 1996. 8. Mark C. Porter, Handbook of Industrial Membrane Technology, published in the United States of America by Noyes Publications, 1990. 9. Richard W. Baker, Membrane technology and applications, published by McGraw – Hill, 2000. 10. Sliva E. M and Shang Tian Yang (1998), Production of Amylases from rice by state fermentation in a Gas- solic spouted- bed bioriator, Biotechnology ang progress 14, pp. 580- 587. 11. Smith and Rose (1996), Biological Chemistry 179 (2), pp. 53- 58. 12. Tipton K.F. 1992, Principle of enzyme assay and kinetic studies, pp. 1- 53, Enzyme assays, Oxford University Pres, New Yord.