Đề tài Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình sản xuất rượu gạo từ bánh men thuốc bắc

MUÏC LUÏC DANH MUÏC BAÛNG BIEÅU DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Baûng2.1: Aûnh höôûng cuûa caùc vò thuoác baéc ñeán söï phaùt trieån cuûa naám men vaø naám moác 7 Baûng2. 2: Aûnh höôûng cuûa moät soá acid ñeán hoaït ñoäng cuûa naám men 13 Baûng 2.3: Thaønh phaàn hoùa hoïc luùa gaïo 15 Baûng 2.4: Thaønh phaàn hoùa hoïc moät soá loaïi gaïo teû theo möùc ñoä cheá bieán 16 Baûng 2.5: Thaønh phaàn hoùa hoïc moät soá loaïi gaïo treân thò tröôøng 17 Baûng 4.1: Caùc chuûng vi khuaån phaân laäp ñöôïc töø baùnh men röôïu Baàu Ñaù 31 Baûng 4.2: Caùc chuûng naám men vaø naám moác phaân laäp ñöôïc töø baùnh men röôïu Baàu Ñaù 32 Baûng 4.3: Ñònh löôïng vi sinh vaät coù trong baùnh men röôïu Baàu Ñaù 32 Baûng 4.4: Khaû naêng phaân giaûi tinh boät cuûa caùc chuûng vi sinh vaät trong baùnh men röôïu Baàu Ñaù 33 Baûng 4.5: Noàng ñoä röôïu trong dòch giaám khi leân men vôùi caùc chuûng naám men phaân laäp ñöôïc 35 Baûng 4.6: Aûnh höôûng cuûa tæ leä gioáng caáy ñeán quaù trình leân men röôïu 38 Baûng 4.7: Aûnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc duøng ñoà chín gaïo ñeán quaù trình leân men röôïu 41 Baûng 4.8: AÛnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc duøng pha loaõng dòch leân men aåm ñeán quaù trình leân men röôïu 42 Baûng 4.9: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian leân men aåm ñeán quaù trình leân men röôïu 45 Baûng 4.10: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian leân men loûng ñeán quaù trình leân men röôïu 45 Baûng 4.11: Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä SO2 ñeán möùc ñoä taïp 48 Baûng 4.12: Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä SO2 sau 2 giôø xöû lyù ñeán quaù trình leân men röôïu 49 Baûng 4.13: So saùnh chaát löôïng baùnh men saûn xuaát, baùnh men thò tröôøng vaø phöông phaùp saûn xuaát tröïc tieáp baèng chuûng vi sinh vaät thuaàn khieát 51 DANH MUÏC CAÙC HÌNH Hình 2.1: Qui trình saûn xuaát baùnh men thuoác baéc theo phöông phaùp truyeàn thoáng 5 Hình 2.2: Qui trình saûn xuaát röôïu gaïo theo phöông phaùp truyeàn thoáng töø baùnh men thuoác baéc 9 Hình 2.3: Teá baøo naám men qua kính hieån vi 9 Hình 2.4: Naám men Saccharomyces ...20 Hình 2.5: Chuûng naám moác Aspergilus ....22 Hình 2.6: Chuûng naám moác Mucor .23 Hình 2.7: Vi khuaån Bacillus Subtilis 24 Hình 3.1: Sô ñoà nghieân cöùu 26 Hình 3.2: Qui trình saûn xuaát röôïu töø baùnh men thuoác baéc trong nghieân cöùu 28 Hình 3.3: Buoàng ñeám Thoma 30 Hình 4.1: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng VK1. 34 Hình 4.2: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng VK2. ..34 Hình 4.3: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng M1 34 Hình 4.4: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng M2 34 Hình 4.5: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng NM1 34 Hình 4.6: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng NM3 34 Hình 4.7: Baùnh men thaønh phaåm, saûn xuaát töø caùc chuûng gioáng phaân laäp ñöôïc vaø töø chuûng moác phoøng thí nghieäm (BM1) 37 Hình 4.8: Aûnh höôûng cuûa tæ leä baùnh men ñeán noàng ñoä röôïu trong dòch sau leân men aåm vaø dòch sau leân men loûng 39 Hình 4.9: Aûnh höôûng cuûa tæ leä baùnh men ñeán hieäu suaát leân men 39 Hình 4.10: Aûnh höôûng cuûa söï thay ñoåi tæ leä baùnh men ñeán pH dòch sau leân men aåm vaø dòch sau leân men loûng 40 Hình 4.11: Aûnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc duøng ñoà chín gaïo ñeán hieäu suaát leân men 41 Hình 4.12: AÛnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc pha vaøo dòch leân me n aåm ñeán hieäu suaát leân men 42 Hình 4.13: AÛnh höôûng cuûa thôøi gian leân men aåm vaø thôøi gian leân men loûng ñeán ñoä röôïu 46 Hình 4.14: AÛnh höôûng cuûa thôøi gian leân men aåm ñeán haøm löôïng tinh boät soùt vaø ñöôøng soùt 47 Hình 4.15: AÛnh höôûng cuûa thôøi gian leân men loûng ñeán haøm löôïng tinh boät soùt vaø ñöôøng soùt 47 Hình 4.16: Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä SO2 ñeán quaù trình hieäu suaát leân men 49 Hình 4.17: So saùnh hieäu suaát leân men cuûa 3 maãu M1, M2 vaø M2 51 Hình 4.18: Qui trình saûn xuaát röôïu gaïo duøng baùnh men thuoác baéc 52 CHÖÔNG 1 - MÔÛ ÑAÀU Coàn röôïu laø moät trong nhöõng saûn phaåm thöïc phaåm xuaát hieän sôùm nhaát vaø ñöôïc con ngöôøi söû duïng roäng raõi nhaát. Coâng ngheä saûn xuaát coàn ñaõ xuaát hieän töø khoaûng 6000 – 8000 naêm tröôùc coâng nguyeân. Tuy nhieân, maõi ñeán theá kyû XII – XIII ngöôøi ta môùi tieán haønh saûn xuaát theo qui moâ coâng nghieäp. Ban ñaàu, ñeå saûn xuaát coàn töø tinh boät, ôû chaâu AÙ, ngöôøi ta thöôøng duøng caùc loaïi baùnh men truyeàn thoáng; coøn ôû chaâu Aâu vaø chaâu Myõ, ngöôøi ta duøng cheá phaåm enzym thu nhaän ñöôïc töø malt ñeå ñöôøng hoùa. Theo thôøi gian, coâng ngheä saûn xuaát coàn röôïu ngaøy caøng ñöôïc hoaøn thieän. Töø baùnh men thuoác baéc, thuoác nam cuûa ngöôøi chaâu AÙ, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ phaân laäp ñöôïc caùc gioáng VSV thuaàn khieát coù khaû naêng ñöôøng hoùa cao vaø öùng duïng thaønh coâng trong coâng nghieäp nhö: naám Rhizopus vaø Mucor (trong phöông phaùp amylose) hay loaøi naám sôïi Aspergillus trong phöông phaùp mycomalt. Ngaøy nay, thay vì coâng ñoaïn nuoâi caáy moác, ngöôøi ta söû duïng tröïc tieáp cheá phaåm enzym coâng nghieäp trong coâng ñoaïn ñöôøng hoùa, laøm taêng hieäu suaát leân ñöôøng hoùa cuõng nhö hieäu suaát leân men raát nhieàu. Caùc phöông phaùp saûn xuaát röôïu theo qui moâ coâng nghieäp treân coù moät nhöôïc ñieåm laø yeâu caàu ñieàu kieän voâ truøng nghieâm ngaët. Trong khi ñoù, vieäc saûn xuaát röôïu gaïo theo phöông phaùp truyeàn thoáng baèng cheá phaåm baùnh men thuoác baéc khoâng ñoøi hoûi ñieàu kieän nghieâm ngaët veà vi sinh, laïi thu ñöôïc röôïu coù höông vò thôm ngon. Do ñoù, nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây coù xu höôùng quay laïi coâng ngheä leân men röôïu truyeàn thoáng. Haàu heát caùc nghieân cöùu ñeàu nhaèm naâng cao vaø oån ñònh hieäu suaát cuûa leân men truyeàn thoáng: nghieân cöùu phaân laäp, öùng duïng nhöõng chuûng gioáng ñaëc hieäu vaøo leân men röôïu truyeàn thoáng ôû Nhaät Baûn, Philipines, Trung Quoác… Trong nöôùc, hieän ñaõ coù nhieàu nghieân cöùu veà nhöõng ñaëc tính cuûa nhöõng chuûng gioáng naám men, naám moác phaân laäp töø baùnh men thuoác baéc; nghieân cöùu öùng duïng loaïi baùnh men coù boå sung hoãn hôïp naám moác trong leân men röôïu gaïo coù kieåm soaùt; nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc vò thuoác leân heä vi sinh vaät trong baùnh men… Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi muoán khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán qui trình saûn xuaát röôïu gaïo töø baùnh men thuoác baéc (do chuùng toâi saûn xuaát) theo phöông phaùp truyeàn thoáng; Choïn ra qui trình saûn xuaát ñeå thu ñöôïc röôïu coù noàng ñoä coàn cao, höông vò toát. Keát quaû thaønh coâng coù theå öùng duïng ñeå saûn xuaát röôïu trong thöïc tieãn. CHÖÔNG 2 - TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU TOÅNG QUAN VEÀ RÖÔÏU VAØ RÖÔÏU GAÏO COÅ TRUYEÀN Röôïu etylic vaø öùng duïng [10, 12, 14] Röôïu etylic (ethanol) laø moät chaát loûng khoâng maøu, trong suoát, coù vò noùng gaét vaø muøi ñaëc tröng. Coâng thöùc phaân töû laø C2H5OH, tæ troïng d20 = 0.7894, nhieät ñoä soâi ôû 760mmHg laø 780C, boác chaùy ôû 120C, hoøa tan trong nöôùc theo baát kyø tæ leä naøo. Töø xa xöa, loaøi ngöôøi ñaõ bieát saûn xuaát ra röôïu etylic (coàn) laøm ñoà uoáng vaø cho ñeán ngaøy nay, ngheà laøm röôïu – coàn vaãn ñang phaùt trieån maïnh.[12] Röôïu etylic (coàn etylic) ngoaøi coâng duïng laøm ñoà uoáng, coøn ñöôïc söû duïng cho nhieàu muïc ñích khaùc nhau: ñeå pha cheá thöùc uoáng, laøm dung moâi cho coâng nghieäp saûn xuaát nöôùc hoa; trong döôïc ñeå trích ly caùc hoaït chaát sinh hoïc; nguyeân lieäu cho caùc ngaønh coâng nghieäp khaùc nhö trong coâng nghieäp saûn xuaát acid acetic, andehyt acetic, etyl acetat vaø caùc este coù muøi thôm khaùc; trong saûn xuaát giaám aên; trong coâng nghieäp saûn xuaát cao su toång hôïp… ; laøm nhieân lieäu (chaát ñoát)… [12, 14] Tuøy tình hình phaùt trieån ôû moãi nöôùc, tyû leä coàn duøng trong caùc ngaønh raát khaùc nhau. Tuy nhieân, coàn ñöa vaøo saûn xuaát ñoà uoáng haàu nhö luoân chieám tyû leä lôùn nhaát – 40-60% löôïng coàn saûn xuaát ñöôïc. Coàn ñöôïc duøng ñeå taêng theâm noàng ñoä röôïu cuûa röôïu vang, duøng pha cheá caùc loaïi röôïu maïnh, röôïu uoáng cao ñoä nhö Whisky, Martin, Brandy, Napoleon, Rhum…[14] Coàn coøn laø nguyeân lieäu trong saûn xuaát caùc thöùc uoáng pha cheá coù coàn nhö röôïu Vodka, röôïu muøi…[10] ÔÛ moät soá nöôùc chaâu AÙ nhö Vieät Nam vaø Trung Quoác, coù doøng röôïu ngaâm thuoác ñöôïc xem laø coù taùc duïng toát ñoái vôùi cô theå: taêng söï saûng khoaùi, aên vaø nguû toát hôn, taêng söùc khoûe…[14] Phaân loaïi röôïu [12, 14, 18] Tröôùc ñaây, röôïu laø teân goïi chung chæ nhöõng hôïp chaát höõu cô coù nhoùm chöùc hydroxyt (–OH) ñính tröïc tieáp vaøo goác ankyl. Tuy nhieân, ngaøy nay röôïu thöôøng duøng ñeå chæ nhöõng thöùc uoáng coù chöùa coàn etylic (ethanol). Ethanol duøng trong saûn xuaát caùc loaïi thöùc uoáng phaûi laø coàn saûn xuaát baèng phöông phaùp leân men. Hay noùi caùch khaùc, taát caû nhöõng ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát thöùc uoáng coù coàn ñeàu döïa treân quaù trình saûn xuaát ethanol baèng con ñöôøng leân men – söû duïng caùc gioáng naám men ñeå leân men dòch chieát traùi caây, rau cuû hoaëc leân men nguõ coác ñeå chuyeån hoùa ñöôøng thaønh röôïu. [18] Coù nhieàu khoùa phaân loaïi röôïu khaùc nhau; nhöng thöôøng phaân loaïi theo noàng ñoä ethanol thaønh 3 loaïi chính: röôïu uoáng cao ñoä (röôïu maïnh) coù noàng ñoä röôïu treân 30%V, röôïu thöôøng coù noàng ñoä röôïu töø 15-30%V vaø röôïu uoáng thaáp ñoä (röôïu nheï) coù noàng ñoä döôùi 15%V. [14] Ngoaøi ra coù theå phaân loaïi theo söï khaùc nhau trong qui trình saûn xuaát – röôïu uoáng qua chöng caát vaø khoâng qua chöng caát…röôïu coù qua leân men vaø röôïu khoâng qua leân men (röôïu pha cheá nhö röôïu Vodka, röôïu muøi); theo nguoàn nguyeân lieäu – töø traùi caây, nguõ coác, ræ ñöôøng… [12] Röôïu gaïo coå truyeàn Vieät Nam [5, 6, 7, 8, 12, 14, 15, 17, 20] Vieät Nam, gioáng nhö haàu heát caùc nöôùc Ñoâng Nam AÙ khaùc, tuy naèm trong vuøng nhieät ñôùi raát ña daïng caùc loaïi traùi caây, nhöng haàu nhö khoâng thaáy doøng saûn phaåm röôïu coå truyeàn töø traùi caây. Ngoaïi tröø moät soá raát ít saûn phaåm röôïu töø traùi caây nhö röôïu Taø vaït cuûa ngöôøi C’Tu, Quaûng Nam… thì doøng röôïu coå truyeàn Vieät Nam, vaø haàu heát caùc nöôùc Ñoâng Nam AÙ khaùc, laø röôïu gaïo, coù qua chöng caát hoaëc khoâng. Phöông phaùp chung ñeå saûn xuaát röôïu gaïo laø: söû duïng nhöõng canh tröôøng vi sinh vaät daïng boät troän vôùi gaïo ñaõ ñoà chín, ñeå leân men taïo ñöôøng (saccharifying proccess) trong vaïi mieäng roäng vaø sau ñoù chuyeån sang vaïi mieäng heïp hôn ñeå leân men taïo ethanol (alcohol fermentation). Nhöõng canh tröôøng vi sinh vaät daïng boät seõ khaùc nhau tuøy vuøng (Vieät Nam: baùnh men, Thaùi Lan: loogpang, Indonesia vaø Malaysia: ragi, Laøo: bubod, Myanma: mochikouji, Trung Quoác: laochao…), nhöng nhìn chung phöông phaùp saûn xuaát cô baûn gioáng nhau: boät gaïo troän vôùi caùc loaïi laù, rau muøi, thaûo döôïc, hoaëc göøng… vaø baùnh men gioáng, ñònh hình daïng vieân, uû, hong khoâ vaø ñeå daønh duøng daàn. [8, 17, 20] Röôïu coå truyeàn Vieät Nam raát ña daïng. Moãi vuøng, mieàn ñeàu coù nhöõng saûn phaåm ñaëc tröng rieâng vaø ñeàu raát noåi tieáng: röôïu ñeá Laøng Vaân – Haø Baéc, röôïu Baàu Ñaù – Bình Ñònh, röôïu Goø Ñen – Long An (caùc saûn phaåm qua chöng caát); röôïu caàn Taây Baéc, Taây Nguyeân, röôïu neáp than ôû mieàn Nam (caùc saûn phaåm khoâng qua chöng caát)… [8, 12, 15] Cheá phaåm baùnh men duøng saûn xuaát röôïu cuõng raát ña daïng vaø ñoäc ñaùo, phaân thaønh hai loaïi chính men laù vaø men thuoác baéc. Tuøy moãi ñòa phöông coù theå duøng nhöõng baøi laù, baøi thuoác baéc khaùc nhau. Muøi vò röôïu thaønh phaåm phuï thuoäc raát nhieàu vaøo caùc loaïi laù, caùc vò thuoác vaø soá löôïng duøng trong baùnh men. Men thuoác baéc coù theå duøng baøi 6 vò, 8 vò hay 10 vò… Men laù ôû vuøng Taây Ngheä An duøng nhieàu loaïi laù: laù mít, laù mía, laù nhaân traàn, laù queá… Trong khi men laù ôû Taây Nguyeân duøng chæ moät, hai hoaëc ba thöù laù: caây ‘ñooøng’, caây ‘me-khaø-zuùt’ (teân caùc loaïi caây cuûa ngöôøi Taây Nguyeân)…, duøng caû thaân caây vaø laù caây. [12] Trong khuoân khoå luaän vaên, chuùng toâi chæ tieán haønh nghieân cöùu vôùi doøng röôïu qua chöng caát raát phoå bieán trong daân gian, coøn goïi laø röôïu ñeá hay röôïu traéng, söû duïng cheá phaåm baùnh men thuoác baéc ñeå leân men töø gaïo. Giôùi thieäu baùnh men thuoác baéc vaø qui trình saûn xuaát baùnh men thuoác baéc theo phöông phaùp truyeàn thoáng [5, 6, 7, 8, 14, 17] Baùnh men thuoác baéc laø moät loaïi men röôïu ñöôïc saûn xuaát thuû coâng taïi Vieät Nam. Moãi ñòa phöông vaø moãi daân toäc coù phöông phaùp saûn xuaát rieâng. Trong cheá phaåm baùnh men thuoác baéc chöùa nhieàu gioáng vi sinh vaät thuoäc vi khuaån, naám men vaø naám moác (naám sôïi). Thöïc chaát, men thuoác baéc laø canh tröôøng khoâng thuaàn khieát cuûa heä vi sinh vaät coù khaû naêng sinh tröôûng toång hôïp heä enzym ñöôøng hoùa vaø leân men röôïu. Nguyeân lieäu chính ñeå saûn xuaát baùnh men thuoác baéc laø: boät gaïo, men gioáng vaø caùc vò thuoác baéc. Qui trình saûn xuaát theo phöông phaùp truyeàn thoáng nhö sau: Nöôùc Taïo hình Gaïo Laøm saïch Laøm aåm Ngaâm nöôùc Ñeå raùo Troän men Xay thaønh boät Nghieàn mòn Baùnh men gioáng Nöôùc Nghieàn mòn Thuoác baéc UÛ Baùnh men röôïu Hong khoâ Hình 2.1: Qui trình saûn xuaát baùnh men thuoác baéc theo phöông phaùp truyeàn thoáng Thuyeát minh quy trình Nguyeân lieäu laøm baùnh men thuoác baéc Baùnh men söû duïng trong saûn xuaát röôïu truyeàn thoáng laø boät gaïo aåm troän vôùi baùnh men gioáng giaõ nhoû. Ñeå traùnh söï nhieãm caùc VSV laï khoâng mong muoán, khi laøm baùnh men, ngöôøi ta boå sung caùc vò thuoác baéc thu ñöôïc men thuoác baéc. Men thuoác baéc: boät thuoác baéc nghieàn nhoû troän vôùi boät gaïo aåm vaø boät baùnh men gioáng nghieàn nhoû. Laøm baùnh men Gaïo sau khi xay thaønh boät ñöôïc nhaøo troän ñeàu vôùi boät thuoác baéc vaø men gioáng ñaõ ñöôïc nghieàn nhuyeãn, theo tæ leä nhaát ñònh. Sau ñoù ñònh hình thaønh daïng vieân, ñaët vaøo caùc khay coù loùt traáu vaø uû trong thôøi gian thích hôïp ñeå heä vi sinh vaät trong baùnh men phaùt trieån vaø nôû xoáp. Khi baùnh men nôû xoáp, naám moác moïc ñeàu vaø baét ñaàu coù muøi röôïu thì tieán haønh hong khoâ. Baùnh men thaønh phaåm ñöôïc baûo quaûn ñeå duøng daàn. Löu yù hoãn hôïp boät tröôùc khi taïo hình neân coù ñoä aåm vöøa phaûi, khoâng khoâ quaù cuõng khoâng nhaõo quaù, thích hôïp nhaát laø khoaûng 50-55%. Nhieät ñoä uû khoaûng 30-35oC laø toát. Nhieät ñoä hong khoâng quaù 35oC. Vieäc saûn xuaát baùnh men theo phöông phaùp coå truyeàn coù nhöõng öu vaø nhöôïc ñieåm nhaát ñònh. Öu ñieåm: khoâng caàn gioáng vi sinh vaät thuaàn khieát, khoâng ñoøi hoûi kó thuaät cao, vaø khoâng caàn nhieàu voán ñaàu tö. Tuy nhieân chaát löôïng baùnh men keùm vì coù nhieàu taïp khuaån daãn ñeán chaát löôïng baùnh men cuõng khoâng oån ñònh vaø hieäu suaát leân men khoâng cao. Ngaøy nay, cuøng vôùi nhöõng tieán boä trong phaân laäp, nhaân gioáng, kyõ thuaät saûn xuaát baùnh men coù thay ñoåi: thay vì söû duïng baùnh men goác ñeå saûn xuaát baùnh men, ngöôøi ta duøng tröïc tieáp chuûng vi sinh vaät thuaàn khieát ñeå saûn xuaát baùnh men; hoaëc vaãn duøng baùnh men goác nhöng boå sung theâm nhöõng gioáng thuaàn khieát, coù hoaït löïc cao ñeå taêng chaát löôïng cuûa baùnh men thaønh phaåm. Aûnh höôûng cuûa caùc vò thuoác baéc ñeán chaát löôïng baùnh men thaønh phaåm [5, 6, 8, 14] Moãi vò thuoác baéc ñeàu chöùa nhieàu chaát khaùc nhau. Ñeán nay ngaønh ñoâng y vaãn chöa xaùc ñònh heát caùc chaát naøy, nhöng coù theå taïm chia thaønh 3 nhoùm: Nhoùm chaát coù giaù trò dinh döôõng ñoái vôùi caùc vi sinh vaät goàm: protein, glucid, lipid, vitamin, chaát khoaùng vaø caùc chaát kích thích sinh tröôûng; Nhoùm chaát coù taùc duïng döôïc lyù saùt truøng: caùc tinh chaát nhöïa, alcaloid vaø caùc glucozid. Chính nhoùm chaát naøy giuùp haïn cheá nhieãm caùc vi sinh vaät khoâng mong muoán töø moâi tröôøng ngoaøi trong quaù trình leân men; vaø nhoùm chaát xô, chaát maøu, … khoâng coù taùc duïng saùt truøng cuõng khoâng coù giaù trò dinh döôõng. [6, 14] Aûnh höôûng cuï theå cuûa caùc vò thuoác baéc ñeán söï phaùt trieån cuûa naám men, naám moác cuõng ñaõ ñöôïc moät soá nhaø khoa hoïc nghieân cöùu. Keát quaû nhö sau:[5] Baûng2.1: Aûnh höôûng cuûa caùc vò thuoác baéc ñeán söï phaùt trieån cuûa naám men vaø naám moác Teân vò thuoác S. cerevisiae Naám moác Teá baøo (x106) K(*) mg K(*) Ñoái chöùng Nhuïc ñaäu khaáu Nhuïc queá Baïch truaät Thaûo quaû Cam thaûo Baïc haø Teá taân Uaát kim Khung cuøng Tieåu hoài Phoøng phong Thaïch cao Taân lang Moäc höông Ñinh höông Thieán nieân kieän Traàn bì Baïch chæ Hoaøng baù Hoaøng lieân 76 139.5 138.1 130.5 125.5 125.5 125.5 125.0 114.5 114.5 114.5 108.0 108.0 107.5 107.0 105.5 101.2 101.0 74.5 70.0 65.0 1.0 1.85 1.80 1.70 1.60 1.60 1.60 1.60 1.50 1.50 1.50 1.40 1.40 1.40 1.35 1.32 1.30 1.25 0.95 0.90 0.80 9.4 14.6 14.6 14.6 14.1 12.3 11.5 13.0 14.6 13.0 13.0 12.3 12.3 12.2 10.1 13.0 10.1 11.5 8.80 9.50 8.50 1.0 1.50 1.50 1.50 1.45 1.30 1.20 1.40 1.50 1.40 1.40 1.30 1.30 1.30 1.10 1.40 1.10 1.20 0.90 1.00 0.90 (*) Ñaïi löôïng K laø tæ soá giöõa soá löôïng teá baøo naám men trong bình thí nghieäm coù dòch chieát vò thuoác vôùi soá löôïng teá baøo naám men trong bình ñoái chöùng (bình khoâng coù dòch chieát cuûa caùc vò thuoác). Neáu K > 1: vò thuoác coù taùc duïng kích thích söï sinh tröôûng cuûa vi sinh vaät. K = 1: vò thuoác khoâng coù taùc duïng kích thích hay öùc cheá söï sinh tröôûng cuûa vi sinh vaät. K < 1: vò thuoác coù taùc duïng öùc cheá söï sinh tröôûng cuûa vi sinh vaät. Do ñoù caùc vò thuoác baéc vöøa coù tính khaùng khuaån, giuùp giaûm söï taïp nhieãm caùc loaøi vi sinh vaät khoâng mong muoán trong saûn xuaát, ñoàng thôøi coøn coù taùc duïng kích thích söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa caùc heä vi sinh vaät chính trong baùnh men. Ngoaøi ra, ña soá caùc vò thuoác baéc ñeàu coù muøi thôm. Caùc hôïp chaát thôm naøy coù theå phaûn öùng vôùi nhau vaø vôùi nhöõng hôïp chaát khaùc, taïo ra nhöõng hôïp chaát môùi. Keát quaû taïo ra muøi vò raát ñaëc tröng cho röôïu coå truyeàn. [6, 14] Thöïc teá, trong saûn xuaát ngöôøi ta thöôøng duøng keát hôïp nhieàu vò thuoác khaùc nhau. Ngöôøi ta coù theå duøng caùc baøi thuoác baéc ñaày ñuû goàm 24 vò, nhöng thöôøng chæ söû duïng 8 – 10 vò.[8] Haàu heát caùc baøi thuoác baéc trong thí nghieäm ñeàu ñöôïc xaây döïng töø keát quaû cuûa baøi nghieân cöùu treân. Ví duï veà moät soá baøi thuoác baéc ñöôïc söû duïng trong saûn xuaát cheá phaåm baùnh men thuoác baéc nhö sau:[5, 8] + Baøi 10 vò Baéc: 1-Nhuïc ñaäu khaáu 3g 6-Baïc haø 2g 2-Baïch truaät 2g 7-Teá taân 3g 3-Nhuïc queá 2g 8-Uaát kim 2g 4-Thaûo quaû 2g 9-Tieåu hoài 2g 5-Cam thaûo 2g 10-Khung cuøng 2g + Baøi 8 vò Baéc: 1-Nhuïc ñaäu khaáu 3g 5-Cam thaûo 3g 2-Baïch truaät 2g 6-Baïc haø 2g 3-Nhuïc queá 2g 7-Teá taân 3g 4-Thaûo quaû 3g 8-Tieåu hoài 3g + Baøi 6 vò Baéc: 1-Nhuïc ñaäu khaáu 5g 4-Cam thaûo 3g 2-Nhuïc queá 3g 5-Teá taân 3g 3-Thaûo quaû 3g 6-Tieåu hoài 3g Theo chöùng minh ôû caùc ñeà taøi tröôùc, baøi thuoác baéc 8 vò laø thích hôïp nhaát ñeå saøn xuaát baùnh men thuoác baéc. Tyû leä thuoác baéc vaø boät gaïo thöôøng laø 1:10, coù theå thay ñoåi. Qui trình saûn xuaát röôïu gaïo theo phöông phaùp truyeàn thoáng töø baùnh men thuoác baéc [8, 22] Nöôùc Leân men loûng Gaïo Laøm saïch Leân men aåm Naáu Troän men Laøm nguoäi Nghieàn mòn Baùnh men Nöôùc Chöng caát Röôïu traéng Hoaøn thieän Hình 2.2: Qui trình saûn xuaát röôïu gaïo theo phöông phaùp truyeàn thoáng töø baùnh men thuoác baéc Thuyeát minh quy trình Nguyeân lieäu Trong saûn xuaát röôïu truyeàn thoáng ôû nöôùc ta, gaïo laø nguyeân lieäu thöôøng duøng nhaát. Röôïu naáu töø caùc loaïi gaïo khaùc nhau seõ cho chaát löôïng khaùc nhau. Theo kinh nghieäm, röôïu naáu töø gaïo neáp laø ngon nhaát – khi uoáng röôïu cho caûm giaùc eâm noàng, thôm, vò ngoït. Gaïo xaùt doái coøn nhieàu caùm hoaëc caùc loaïi gaïo cuõ ít nhöïa cho hieäu suaát saûn xuaát cao vaø deã laøm. Nguyeân lieäu coù theå ñem nghieàn ñeå taêng hieäu suaát thuûy phaân trong quaù trình naáu nguyeân lieäu. Naáu nguyeân lieäu Muïc ñích cuûa quaù trình naáu nguyeân lieäu laø nhaèm phaù vôõ maøng teá baøo cuûa tinh boät, chuyeån tinh boät thaønh traïng thaùi hoøa tan trong dung dòch – hoà hoùa tinh boät. Khi ñun nguyeân lieäu vôùi nöôùc, seõ xaûy ra caùc hieän töôïng tröông nôû, hoøa tan caùc chaát keát dính giöõa teá baøo (pectin, tinh boät, pentozan…), daãn ñeán laøm giaûm ñoä beàn cô hoïc cuûa nguyeân lieäu. Ôû nhieät ñoä khoaûng 140-150oC thaønh teá baøo seõ bò phaù vôõ, caùc haït tinh boät seõ taùch ra vaø hoøa tan vaøo dung dòch. Troän men Nguyeân lieäu sau khi naáu ñöôïc taûi ra nong, maønh saïch, ñeå nguoäi ñeán 30-35oC thì raéc boät men vaøo, troän ñeàu. Tæ leä boät men so vôùi löôïng gaïo khoaûng 2.5–5% khoái löôïng. Leân men aåm Quaù trình leân men aåm chính laø quaù trình taïo ñieàu kieän cho enzym amylase cuûa naám moác, vi khuaån xuùc taùc thuûy phaân tinh boät. Côm ñaõ troän men ñöôïc ñem uû trong 5–10 giôø ñeå moác moïc ñeàu caû khoái côm; sau ñoù vun thaønh ñoáng, phuû kín baèng vaûi vaø giöõ ôû nôi thoaùng maùt (nhieät ñoä 28–32oC) trong 2–3 ngaøy. Muïc ñích cuûa quaù trình naøy laø taïo ñieàu kieän cho naám moác vaø vi khuaån phaùt trieån, tieát ra enzym ñöôøng hoùa tinh boät. Trong giai ñoaïn naøy, naám men cuõng baét ñaàu phaùt trieån vaø chuyeån hoùa moät ít ñöôøng thaønh röôïu. Leân men loûng Quaù trình leân men loûng: naám men söû duïng ñöôøng taïo ra ñeå leân men röôïu. Khi côm uû coù muøi thôm nheï cuûa röôïu, aên thaáy ngoït, coù hôi cay vò cuûa röôïu thì chuyeån sang uû trong chum vaïi kín vôùi nöôùc saïch theo tæ leä gaïo:nöôùc = 1:2–3. Thôøi gian uû loûng (leân men loûng) khoaûng 2–3 ngaøy. Côm röôïu uû trong ñieàu kieän kín, naám moác ngöøng phaùt trieån nhöng enzym taïo thaønh vaãn tieáp tuïc thuûy phaân tinh boät. trong giai ñoaïn naøy, naám men phaùt trieån maïnh nhôø löôïng oxi hoøa tan trong nöôùc vaø löôïng ñöôøng taïo thaønh, sau ñoù chuyeån sang leân men röôïu. Chöng caát Keát thuùc quaù trình leân men loûng, côm röôïu ñöôïc ñem chöng caát, thu ñöôïc röôïu traéng truyeàn thoáng. Röôïu truyeàn thoáng chæ qua chöng caát thuû coâng neân thöôøng vaãn coøn ñuïc. Caùc bieán ñoåi trong quaù trình leân men [8] Sinh hoïc Trong giai ñoaïn leân men, coù söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät, xaûy ra ñaàu quaù trình leân men. Trong ñoù, vi khuaån phaùt trieån nhanh, taïo thaønh moät soá acid höõu cô, laøm giaûm pH moâi tröôøng. pH moâi tröôøng giaûm, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho naám moác phaùt trieån. Song song ñoù, caùc loaøi naám men cuõng baét ñaàu phaùt trieån nhöng yeáu hôn. Caùc loaøi naám men chæ phaùt trieån maïnh trong giai ñoaïn ñöôøng ñöôïc taïo thaønh, hay cuoái giai ñoaïn naám moác phaùt trieån. Vieäc phaân ra moät caùch roõ raøng caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa vi khuaån, naám men vaø naám moác laø raát khoù vì thöïc teá caùc loaøi naøy phaùt trieån gaàn nhö ñoàng thôøi, chæ khaùc nhau veà möùc ñoä ôû cuøng moät thôøi ñieåm. Hoùa sinh Trong quaù trình leân men röôïu, xaûy ra ba quaù trình sinh hoùa cô baûn: Quaù trình chuyeån ñöôøng vaø caùc thaønh phaàn khaùc thaønh acid höõu cô: coù hai quaù trình taïo acid höõu cô cô baûn laø: Quaù trình taïo acid acetic. Quaù trình taïo acid lactic. Quaù trình taïo acid lactic maïnh hôn. Tuy nhieân, caû hai quaù trình ñeàu xaûy ra yeáu vì giai ñoaïn ñaàu, löôïng ñöôøng taïo ra khoâng cao. Quaù trình chuyeån hoùa tinh boät thaønh ñöôøng: Do söï phaùt trieån cuûa naám moác vaø naám men Endomycopsis, tinh boät ñöôïc chuyeån thaønh ñöôøng. Caùc loaøi naám men vaø naám moác naøy trong quaù trình phaùt trieån taïo ra raát nhieàu enzym amylase vaø glucoseamylase. Caùc enzym naøy laø enzym caûm öùng, neân nguyeân lieäu laø loaïi chöùa nhieàu tinh boät seõ kích thích quaù trình sinh toång hôïp raát maïnh meõ. Glucose taïo ra trong quaù trình thuûy phaân tinh boät, bình thöôøng seõ öùc cheá ngöôïc laïi phaûn öùng thuûy phaân. Nhöng ôû ñaây löôïng ñöôøng glucose taïo thaønh haàu nhö seõ ñöôïc chuyeån hoùa thaønh coàn hoaëc phuïc vuï cho sinh saûn vaø phaùt trieån cuûa VSV, do ñoù, cô cheá kìm haõm ngöôïc cuûa glucose thöôøng khoâng xaûy ra. Quaù trình chuyeån hoùa ñöôøng thaønh coàn: Quaù trình naøy ñöôïc thöïc hieän bôûi: Saccharomyces sp., Mucor vaø Rhizopus sp., Endomycopsis sp. Trong ñoù Saccharomyces ñoùng vai troø cô baûn. Saûn xuaát röôïu trong coâng nghieäp: hai giai ñoaïn ñöôøng hoùa vaø röôïu hoùa taùch rôøi nhau. Ngöôïc laïi trong saûn xuaát röôïu thuû coâng, hai khaâu naøy xaûy ra gaàn nhö ñoàng thôøi. Nhö ñaõ ñeà caäp ôû treân, vì men gioáng laø hoãn hôïp cuûa caû naám men, naám moác vaø vi khuaån neân khi raéc men vaøo caùc nguoàn tinh boät ñeå leân men, thì tröôùc tieân naám moác phaùt trieån, sinh ra caùc enzym ñöôøng hoùa chuyeån tinh boät thaønh ñöôøng (glucose, fructose, maltose…). Löôïng ñöôøng taïo ra ñöôïc naám men söû duïng ñeå phaùt trieån taêng sinh khoái vaø trong ñieàu kieän yeám khí thì söû duïng ñeå leân men röôïu. Song song vôùi quaù trình naøy laø caùc quaù trình chuyeån hoùa ñöôøng vaø caùc acid höõu cô thaønh caùc saûn phaåm phuï khaùc. Coù moät ñieåm caàn löu yù laø, taát caû caùc quaù trình chuyeån hoùa naøy xaûy ra xen keõ nhau, hoã trôï nhau vaø cuoái cuøng saûn phaåm taïo ra khoâng chæ coù coàn vaø nöôùc maø laø moät hoãn hôïp caùc thaønh phaàn khaùc nhau. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men Aûnh höôûng cuûa tyû leä, chaát löôïng gioáng caáy ÔÛ ñaây laø tæ leä vaø chaát löôïng baùnh men cho vaøo. Neáu löôïng baùnh men cho vaøo ít thì löôïng vi sinh vaät khoâng ñuû ñeå thöïc hieän caùc quaù trình chuyeån hoùa, hieäu suaát thaáp. Ngöôïc laïi, neáu cho quaù nhieàu thì nguoàn dinh döôõng khoâng ñuû cung caáp cho heä vi sinh vaät phaùt trieån, daãn ñeán söï öùc cheá laãn nhau laøm giaûm hieäu suaát leân men. Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng Haøm löôïng ñöôøng thuaän lôïi cho naám men leân men laø 10-15%, maëc duø naám men vaãn coù theå leân men ñöôïc ôû noàng ñoä ñöôøng 25-30% nhöng chaäm. Noàng ñoä ñöôøng cao seõ taïo aùp suaát thaåm thaáu lôùn leân teá baøo naám men, öùc cheá naám men, thôøi gian leân men keùo daøi, ñöôøng khoâng ñöôïc söû duïng trieät ñeå. Ngöôïc laïi, noàng ñoä ñöôøng loaõng thì khoâng coù lôïi veà kinh teá vaø hieäu suaát leân men cuõng khoâng cao. Aûnh höôûng cuûa pH Trong ñieàu kieän leân men röôïu, pH toái öu ñeå taïo ethanol laø 4.5-5.0. Ñoái vôùi dòch ñöôøng töø nguyeân lieäu thöôøng khoáng cheá ôû pH = 4.8-5.2 nhaèm taïo ñieàu kieän cho amylase tieáp tuïc chuyeån hoùa tinh boät vaø dextrin thaønh ñöôøng leân men ñöôïc. Tuy nhieân, löu yù khi nhaân gioáng naám men, ngöôøi ta thöôøng khoáng cheá pH = 3.8-4.0 ñeå haïn cheá vi sinh vaät taïp nhieãm. Ñeán khi naám men ñaõ phaùt trieån, ñuû maïnh ñeå laán aùt vi khuaån taïp thì naâng pH ñeán toái öu ñeå naám men phaùt trieån nhanh hôn. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä Moãi vi sinh vaät ñeàu coù nhieät ñoä toái öu cho quaù trình phaùt trieån cuûa chuùng. Nhieät ñoä toái öu cho naám men Saccharomyces khoaûng 28-32oC. ÔÛ nhieät ñoä thaáp hôn, naám men seõ leân men toát hôn vaø trieät ñeå hôn nhôø thôøi gian leân men cuõng keùo daøi; tuy nhieân thöïc teá neân xem xeùt vaán ñeà chi phí ñeå laøm laïnh vaø oån ñònh nhieät. ÔÛ nhieät ñoä cao, 35-38oC naám men daïi vaø caùc vi sinh vaät taïp nhieãm phaùt trieån maïnh, deã nhieãm vi khuaån lactic hôn, hoaït tính cuûa naám men cuõng giaûm nhanh maëc duø thôøi gian leân men ngaén hôn. Aûnh höôûng cuûa suïc khí Vieäc suïc khí vaøo dòch ñöôøng seõ giuùp cho naám men phaùt trieån nhanh hôn. Tuy nhieân, vieäc dö oxy seõ laøm taêng sinh khoái, giaûm hieäu suaát leân men. Vì vaäy, thöïc tieãn saûn xuaát, ngöôøi ta chæ suc moät löôïng nhoû oxy ban ñaàu, ñuû ñeå ñaûm baûo cho sinh tröôûng phaùt trieån vaø leân men cuûa naám men. Aûnh höôûng cuûa SO2 SO2 laø hoùa chaát ñöôïc cho pheùp söû duïng trong saûn xuaát röôïu vaø röôïu vang ôû haàu heát caùc nöôùc treân theá giôùi. SO2 coù taùc duïng laøm giaûm hoaëc tieâu dieät caùc loaïi vi khuaån taïp nhieãm coù haïi trong quaù trình leân men. Lieàu löôïng thöôøng duøng trong saûn xuaát laø 0.02% vì naám men coù khaû naêng chòu ñöôïc noàng ñoä SO2 0.02-0.025%. duøng nhieàu co theå öùc cheá caû hoaït ñoäng cuûa naám men. Caùc hoùa chaát thöôøng duøng laø natri sunfit Na2S2O5 vaø kali sunfit K2S2O5. Aûnh höôûng cuûa caùc hoùa chaát vaø chaát saùt truøng Trong ñieàu kieän saûn xuaát, thöôøng phaûi duøng caùc chaát saùt truøng ñeå haïn cheá söï taïp nhieãm. Coù theå duøng nhieàu loaïi hoùa chaát khaùc nhau: clorua voâi, formalin, hay fluosilicat natri… vôùi noàng ñoä thích hôïp sao cho haïn cheá ñöôïc söï phaùt trieån cuûa taïp khuaån vaø khoâng aûnh höôûng xaáu ñeán hoaït ñoäng cuûa naám men. Khi duøng formalin hay fluosilicat natri, noàng ñoä khoâng vöôït quaù 0.02% so vôùi dòch leân men. Khi duøng acid, coù theå tham khaûo baûng döôùi ñaây: Baûng 2.2: Aûnh höôûng cuûa moät soá acid ñeán hoaït ñoäng cuûa naám men [14] Acid Noàng ñoä Thôøi gian tieâu dieät (giôø) Laøm ngöøng sinh tröôûng Tieâu dieät % mol/l % mol/l Clohydric Sunfuric Photphoric Acetic Lactic 0.14 0.39 0.30 0.75 0.90 0.038 0.039 0.031 0.125 0.100 0.72 1.30 2.00 3.00 3.00 0.195 0.132 0.204 0.500 0.333 0.45 2.04 1.28 1.25 1.27 TOÅNG QUAN VEÀ CAÂY LUÙA Nguoàn goác, phaân loaïi [17] Nguoàn goác thöïc vaät [2] Caây luùa thuoäc hoï hoøa thaûo (Gramineae), chi Oryza. Trong chi Oryza coù nhieàu loaøi, soáng 1 naêm hoaëc nhieàu naêm, trong ñoù chæ coù 2 loaøi troàng laø Oryza Sativa vaø Oryza Glaberrima. Oryza Sativa phoå bieán ôû chaâu Aù, chieám ñaïi boä phaän dieän tích troàng luùa, coù nhieàu gioáng coù ñaëc tính toát cho naêng suaát cao. Oryza Glaberrima: haït nhoû, naêng suaát thaáp, chæ troàng treân dieän tích nhoû ôû Taây Phi. Loaøi luùa troàng ôû chaâu AÙ (Oryza Sativa) coù 3 loaøi chính: luùa Japonica vuøng oân ñôùi, luùa Japonica vuøng nhieät ñôùi vaø luùa Indica vuøng nhieät ñôùi. Caây luùa ôû Ñoâng Döông phaùt trieån theo hai höôùng: töø Laøo theo soâng Cöûu Long ñi xuoáng phöông nam coù ñaëc tính cuûa luùa Japonica nhieät ñôùi; doïc bôø bieån Ñoâng coù ñaëc tính cuûa luùa Indica. Vì vaäy, Vieät Nam vôùi khí haäu nhieät ñôùi, vaø vôùi heä sinh thaùi cuûa thaûo moäc ña daïng, coù caû caây luùa Indica vaø caây luùa Japonica nhieät ñôùi. [2] Phaân loaïi [18] Coù nhieàu khoùa phaân loaïi khaùc nhau: phaân theo muøa vuï, theo ñieàu kieän sinh thaùi, theo thôøi gian sinh tröôûng vaø thu hoaïch trong naêm, theo ñieàu kieän töôùi… Tuy nhieân, thoâng thöôøng, luùa ñöôïc phaân thaønh 2 loaïi chính theo chaát löôïng vaø hình daùng haït: luùa teû vaø luùa neáp. Luùa teû vaø luùa neáp khaùc nhau laø do caáu taïo vaø thaønh phaàn tinh boät… Luùa teû coù thaønh phaàn tinh boät chuû yeáu laø amyloza, caùc phaân töû coù caáu taïo maïch ngang (lieân keát 1-4). Luùa neáp coù thaønh phaàn chuû yeáu laø amylopeptin, ngoaøi maïch ngang coøn coù caáu taïo maïch doïc (lieân keát 1-6). Coù theå duøng phaûn öùng ñaëc tröng cuûa tinh boät vôùi Iodua kali (KI) ñeå phaân bieät 2 loaïi naøy: amyloza keát hôïp vôùi KI coù maøu xanh tím, coøn amylopeptin keát hôïp vôùi KI coù maøu naâu ñoû. Ngöôøi ta cho raèng luùa neáp laø do luùa teû bieán dò maø thaønh. Trong thöïc teá troàng troït, neáu khoâng coù ñieàu kieän phuø hôïp hoaëc ñöôïc boài duïc thích ñaùng thì phaåm chaát caùc loaïi luùa neáp (nhö ñoä deûo, höông vò) seõ bò suy giaûm. Chuùng ta coù nhieàu gioáng neáp quyù ñòa phöông nhö quyùt, neáp caùi hoa vaøng, neáp caåm… caàn ñöôïc quan taâm trong kyõ thuaät noâng hoïc nhaèm gìn giöõ nguoàn taøi nguyeân quyù, ñoäc ñaùo cuûa Vieät Nam.[18] Caáu taïo haït [2] Luùa gaïo goàm voû traáu 20% vaø phaàn gaïo thoâ 80%. Voû traáu: thaønh phaàn chuû yeáu laø hemicellulose, lignin khoâng coù giaù trò dinh döôõng neân trong quaù trình cheá bieán ñöôïc taùch boû (caøng trieät ñeå caøng toát). Phaàn gaïo thoâ goàm: Caùm: goàm lôùp bieåu bì, quaû bì vaø chuûng bì; chieám 3% khoái löôïng haït gaïo thoâ. Lôùp bieåu bì (voû quaû): deã daøng taùch ra trong quaù trình xaùt traéng gaïo. Quaû bì (voû haït): laø moät lôùp teá baøo moûng chöùa nhieàu chaát beùo vaø protein vaù ít tinh boät. Lôùp chuûng bì (nucellus) quyeát ñònh maøu saéc haït. Maàm: goàm coù phoâi maàm, phoâi reã vaø truï phoâi ôû giöõa phaàn döôùi cuûa haït; chieám 4% khoái löôïng. Trong phoâi chöùa nhieàu chaát dinh döôõng protein, lipid, moät soá glucid hoøa tan vaø moät löôïng lôùn vitamin cuøng enzym cuûa haït. Trong saûn xuaát gaïo vaø boät gaïo, phoâi caàn ñöôïc taùch trieät ñeå vì haøm löôïng chaát beùo trong phoâi cao, deã bò oxi hoùa laøm giaûm chaát löôïng saûn phaåm. Noäi nhuõ: goàm lôùp aleuron vaø phoâi nhuõ tích tuï tinh boät; chieám 93%. Laø thaønh phaàn chuû yeáu cuûa haït – nôi döï tröõ dinh döôõng cuûa haït. Thaønh phaàn chuû yeáu laø tinh boät vaø protein; ngoaøi ra coøn coù moät löôïng nhoû chaát beùo, vitamin vaø khoaùng. Baûng 2.3: Thaønh phaàn hoùa hoïc luùa gaïo [2,18] Thaønh phaàn Tinh boät Chaát xô Protein Lipid Tro Caùc chaát khaùc Noäi nhuõ 90.2 0.4 7.8 0.5 0.6 0.4 Maàm 2.4 3.5 20.2 21.6 7.9 44.4 Caùm 16.0 10.7 15.2 20.1 9.6 28.4 Tinh boät: laø nguoàn goác chuû yeáu cung caáp calo. Giaù trò nhieät löôïng cuûa luùa laø 3594 calo, so vôùi luùa mì laø 3610 calo; ñoä ñoàng hoùa ñaït ñeán 95.9%. Tinh boät gaïo coù hình ña giaùc, kích thöôùc nhoû, thay ñoåi trong khoaûng 2-10 mm. Kích thöôùc trung bình cuûa tinh boät gaïo so vôùi kích thöôùc tinh boät cuûa caùc loaïi haït khaùc nhö sau: tinh boät gaïo < ngoâ < ñaïi maïch < luùa mì < yeán maïch < saén < khoai taây. Haït tinh boät gaïo coù kích thöôùc nhoû vaø naèm saùt nhau neân quaù trình hoà hoùa seõ khoù khaên hôn, nhieät ñoä hoà hoùa khoaûng 70-80oC, cao hôn so vôùi tinh boät khoai taây: 55–65oC; tinh boät saén: 60-70oC…[14] Tinh boät coù 2 loaïi: Amylose coù caáu taïo maïch thaúng vaø amylopectin coù caáu taïo maïch nhaùnh. Tyû leä thaønh phaàn amylose vaø amylopectin lieân quan ñeán ñoä deûo cuûa haït. [18] Caùc loaïi gaïo VN coù haøm löôïng amylose thay ñoåi töø 15-35%…[14] Caù bieät coù gioáng leân ñeán 54% (Leâ Doaõn Dieân vaø CTV, 1995). Neáu haït coù 10-18% amylose thì gaïo meàm, deûo; töø 25-30% thì gaïo cöùng. Gaïo neáp coù nhieàu amylopectin neân thöôøng deûo hôn gaïo teû. Protein: Tyû leä chieám khoaûng 6-8%, thaáp hôn so vôùi luùa mì vaø caùc loaïi khaùc. Caùc gioáng luùa VN coù löôïng protein thaáp nhaát 5.25%, cao nhaát 12.84%, phaàn lôùn trong khoaûng 7-8%. Luùa neáp coù löôïng protein cao hôn teû, luùa chieâm cuõng coù löôïng protein cao. Protein trong gaïo goàm albumin 5%, globulin 10%, prolamin (oryzin) 5%, glutelin (oryzenin) 80%. Lipit: haøm löôïng nhoû; phaân boá chuû yeáu ôû lôùp voû gaïo vaø phoâi neân deã maát trong quaù trình cheá bieán gaïo: neáu ôû gaïo laø 2.02% thì ôû gaïo giaõ chæ coøn 0.52%. Chuû yeáu laø acid beùo khoâng no: oleic 42.3%, linoleic 30.6%, palmitic 15.5%. [2] Vitamin: Trong luùa gaïo ngoaøi caùc chaát dinh döôõng treân, coøn coù moät löôïng lôùn caùc vitamin ñaëc bieät laø caùc loaïi vitamin B nhö B1, B2, B6, PP… Löôïng vitamin B1 laø 0.45 mg/100 haït (trong ñoù phaân boá ôû phoâi 47%, voû caùm 34.5% trong haït gaïo chæ coù 3.8%) so vôùi luùa mì laø 0.52 mg vaø ngoâ laø 0.49% mg.[18] Baûng 2.4: Thaønh phaàn hoùa hoïc moät soá loaïi gaïo teû theo möùc ñoä cheá bieán [2] Thaønh phaàn Ñôn vò Teân goïi Gaïo teû giaõ Gaïo teû maùy Gaïo taùm Gaïo taùm ñoà Nöôùc % 13.8 13.5 12.6 11.9 Protein % 7.6 7.5 5.8 6.7 Lipid % 1.3 1.0 0.9 1.2 Glucid % 74.2 75.0 78.3 77.8 Cellulose % 0.7 0.4 0.5 0.5 Tro % 0.9 0.8 0.4 0.9 Ca mg 35.5 29.6 27.6 31.7 Fe mg 2.2 1.3 - - Vit B1 mg 0.12 0.1 0.1 0.15 Vit B2 mg 0.04 0.03 - - Vit PP mg 1.9 1.6 - - Baûng 2.5: Thaønh phaàn hoùa hoïc moät soá loaïi gaïo treân thò tröôøng [13] Loaïi gaïo Thaønh phaàn chính Tính chaát naáu gaïo Protein (%) Tinh boät (%) Amylose (%) Thôøi gian haáp toái thieåu ñeå côm chín (phuùt) Ñoä aåm haït côm (%) Taøi nguyeân 6.0 72.9 22.3 35 63.7 Thôm Ñaøi Loan 6.2 72.8 16.3 30 61.8 IR64 7.6 71.0 22.4 35 63.5 GIÔÙI THIEÄU VEÀ HEÄ VI SINH VAÄT TRONG BAÙNH MEN THUOÁC BAÉC [1, 8, 14, 17, 24] Nhö ñaõ ñeà caäp ôû 2.1.3.1, thöïc chaát baùnh men thuoác baéc laø canh tröôøng khoâng thuaàn khieát cuûa heä vi sinh vaät coù khaû naêng sinh tröôûng toång hôïp heä enzym ñöôøng hoùa vaø leân men röôïu, noùi caùch khaùc heä vi sinh vaät trong baùnh men raát ña daïng. Trong ñoù, coù 3 loaøi phoå bieán nhaát, coù soá löôïng ñoâng nhaát vaø vai troø quan troïng nhaát: naám men, naám moác vaø vi khuaån. Caùc keát quaû nghieân cöùu khoa hoïc cho thaáy giaù trò pH baùnh men Vieät Nam trong khoaûng 5.76, ñoä aåm khoaûng 13.6%, haøm löôïng vi sinh vaät trong baùnh men töông öùng laø: vi khuaån 2.6x106, naám moác 3.4x106, naám men 5.8x107 cfu/gam baùnh men. Trong toång soá 119 vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc thì coù 53 teá baøo naám moác, 51 teá baøo naám men vaø 15 teá baøo vi khuaån. Caùc chuûng naám moác xaùc ñònh ñöôïc: Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Mucor circinilloides, Amylomyces rouxii… vaø caùc chuûng naám men thöôøng gaëp: Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Sacchromycopsis fibuligera, Pichia anomala vaø Candidas sp. [17] Naám men [1, 8, 24] Naám men laø nhoùm vi sinh vaät coù caáu taïo ñôn baøo vaø nhaân chuaån (eukaryote) thöôøng sinh saûn baèng caùch naûy choài. Hình daïng naám raát phong phuù phuï thuoäc vaøo gioáng loaøi, noù coù theá daïng hình caàu, hình tröùng hay hình baàu duïc, hình tam giaùc… Ñoái vôùi naám men trong quaù trình hoaït ñoäng soáng, chuùng ñoàng hoùa caùc monosacarit trong ñieàu kieän yeám khí, thaûi ra moâi tröôøng xung quanh saûn phaåm dò hoùa laø röôïu etylic vaø khí cacbonic nhôø taùc duïng cuûa moät phöùc heä caùc enzym. Ñaây laø moät trong nhöõng ñaëc tröng quan troïng cuûa naám men ñaõ ñöôïc nhaân daân ta öùng duïng töø laâu dôøi ñeå saûn xuaát röôïu baèng baùnh men thuoác baéc. Ñaëc ñieåm hình thaùi, dinh döôõng chung cuûa naám men [1] Phaân loaïi Trong giôùi naám, naám men ôû vaøo 2 nhoùm phaân loaïi khaùc nhau. Moät soá naám men coù khaû naêng hình thaønh baøo töû tuùi ñöôïc xeáp vaøo lôùp naám tuùi. Nhöõng naám men coøn laïi khoâng coù khaû naêng hình thaønh baøo töûû tuùi, ñöôïc xeáp vaøo lôùp naám baát toaøn. Caáu taïo teá baøo naám men Teá baøo naám men coù caáu taïo phöùc taïp vaø ñöôïc chia thaønh 2 phaàn chính: voû teá baøo vaø phaàn trong noäi teá baøo (voû vaø protoplasma) Caùc thaønh phaàn caáu taïo teá baøo naám men töø ngoaøi vaøo trong nhö sau: Voû teá baøo (hay thaønh teá baøo): coù caáu taïo goàm 3 lôùp: lôùp ngoaøi laø maøng nhaün goàm chuû yeáu lypoproteid, lôùp tieáp theo chöùa phöùc hôïp manan protein, lôùp trong cuøng caáu taïo töø nhöõng goác glucan goàm 94% glucose vaø khoaûng 6% hexoamin. Voû trong cuûa teá baøo laø maøng teá baøo chaát raát moûng daøy khoaûng 8nm vaø cuõng goàm 3 lôùp ñöôïc caáu taïo töø phospholipid, sterol vaø protein. Teá baøo chaát cytoplasma (coøn goïi laø nguyeân sinh chaát) laø heä thoáng keo naèm ngoaøi nhaân khaùc vôùi nucleoplasma laø heä thoáng keo naèm ngoaøi nhaân. Cytoplasma vaø nucleoplasma coù teân goïi chung laø protoplasma. Teá baøo chaát chöùa nhaân vaø caùc cô quan con khaùc. Nhaân teá baøo ñöôïc bao boïc bôûi moät maøng nhaân, beân trong chöùa nucleoplasma trong suoát vaø caùc cromosome caáu taïo töø protid, acid dezoxyribonucleic, acid ribonucleic vaø caùc enzym. Caùc cô quan khaùc nhö ty theå, ribosome, khoâng baøo, haït volutum,… Söï sinh saûn cuûa naám men Naám men coù nhieàu hình thöùc sinh soâi naûy nôû khaùc nhau, phaân thaønh : Sinh saûn voâ tính: naûy choài, phaân caét, sinh saûn baèng baøo töû. Sinh saûn höõu tính. Trong ñoù, naûy choài laø hình thöùc sinh saûn phoå bieán nhaát ôû naám men. Khi moät choài xuaát hieän caùc enzym thuûy phaân seõ phaân giaûi phaàn polisaccharic cuûa thaønh teá baøo, laøm choài chui ra khoûi teá baøo meï. Vaät chaát môùi ñöôïc toång hôïp seõ huy ñoäng ñeán choài vaø laøm choài phình to daàn leân, khi ñoù seõ xuaát hieän vaùch ngaên giöõa choài vaø teá baøo meï. Khi teá baøo choài taùch khoûi teá baøo meï ôû choã taùch ra coøn giöõ laïi moät veát seïo cuûa choài, treân teá baøo con cuõng mang moät veát seïo. Hình 2.3: Teá baøo naám men qua kính hieån vi Ñaëc ñieåm cuûa naám men trong baùnh men thuoác baéc [8, 24] Trong moãi gam baùnh men coù töø vaøi chuïc trieäu ñeán vaøi traêm trieäu teá baøo naám men. Goàm 2 chi khaùc nhau: Endomycopsis (chuû yeáu laø Endo. Fibuligenes). Saccharomyces (chuû yeáu laø S. cerevisiae). Endo. Fibuligenes laø loaøi naám men raát giaøu enzym amylase, glucoamylase. Do ñoù vöøa coù khaû naêng röôïu hoùa vöøa coù khaû naêng ñöôøng hoùa. Saccharomyces cerevisiae coù khaû naêng leân men raát nhieàu loaïi ñöôøng khaùc nhau nhö glucose, saccharose, maltose, fructose, raffinose, galactose. Chuùng coù khaû naêng leân men ñöôïc ôû nhieät ñoä cao (khoaûng töø 36-40oC). Chòu ñöôïc acid. Theo nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây [24], naám men trong baùnh men röôïu gaïo cuûa Vieät Nam coù theå phaùt trieån treân moâi tröôøng coù haøm löôïng glucose töông ñoái cao (20% w/v), taïo thaønh 8.8% w/v ethanol. Ñieàu kieän leân men toái öu laø ôû 280C trong 4 ngaøy. Tyû leä gioáng caáy laø 5.5 log cfu/ml. (Ñieàu kieän ñöôøng hoùa toát nhaát: uû ôû 340C trong 2 ngaøy. Tæ leä gioáng caáy: 5 log cfu/g gaïo chín). Ñaëc bieät caùc chuûng naám men trong baùnh men thuoác baéc coù khaû naêng chòu ñöôïc thuoác saùt truøng Na2SiF6 vôùi noàng ñoä 0.02-0.025%. Ñaëc ñieåm naøy raát thuaän lôïi cho leân men khi caàn söû duïng thuoác saùt truøng. Ñaëc ñieåm quan troïng hôn heát laø loaøi naám men naøy coù khaû naêng leân men caùc loaïi nguyeân lieäu raát khaùc nhau nhö gaïo, ngoâ, khoai, saén vôùi löôïng ñöôøng trong dung dòch töø 12-14%; coù khi 16-18%. Noàng ñoä röôïu trong dòch leân men laø 10-12%. Nhieät ñoä leân men thích hôïp laø 28-320C. Hình 2.4: Naám men Saccharomyces Ngoaøi hai chi naám men treân, trong baùnh men thuoác baéc coøn thaáy nhieàu loaïi naám men daïi khaùc nhau. Chuùng vöøa coù khaû naêng thuûy phaân tinh boät, vöøa coù khaû naêng chuyeån ñöôøng thaønh coàn, tuy nhieân söï chuyeån hoùa naøy coøn raát thaáp. Ñieàu ñaëc bieät laø caùc loaøi naám men daïi naøy chòu nhieät ñoä raát cao, coù khi leân tôùi 60-65oC vaø chòu ñöôïc chaát saùt truøng ôû noàng ñoä 0.05-1%. Naám moác [1, 8] Ñaëc ñieåm hình thaùi, dinh döôõng chung cuûa naám moác [1] Naám moác laø teân chung ñeå chæ moät soá ñaïi dieän naám sôïi, khoâng phaûi laø naám men cuõng khoâng phaûi laø naám lôùn coù muõ nhö naám rôm hay caùc loaøi naám aên khaùc. Naám moác raát phoå bieán trong thieân nhieân, chuû yeáu laø trong ñaát vaø voû caây. Coù nhieàu gioáng vaø loaøi naám moác khaùc nhau nhöng phaàn lôùn ñeàu coù caáu taïo sôïi vaø mang ñính baøo töû. Cho ñeán baây giôø ngöôøi ta nhaän thaáy raèng naám laø moät giôùi rieâng khoâng phaûi thuoäc ñoäng vaät cuõng khoâng thuoäc thöïc vaät vì khi quan saùt, ta thaáy naám coù moät soá ñaëc ñieåm sau: naám khoâng coù dieäp luïc toá, khoâng coù khaû naêng töï toång hôïp caùc chaát dinh döôõng cho baûn thaân. Chuùng chæ phaùt trieån ñöôïc treân nhöõng thöùc aên höõu cô ñaõ coù saün. Laø loaïi vi sinh vaät phaùt trieån thaønh theå sôïi phaân nhaùnh. Nhöõng sôïi phaân nhaùnh naøy phaùt trieån thaønh töøng ñaùm chaèng chòt, ngöôøi ta goïi laø khuaån ty hay heä sôïi naám khi phaùt trieån treân moâi tröôøng ñaëc. Khuaån ty ñöôïc phaân ra thaønh 2 loaïi: khuaån ty cô chaát hay khuaån ty dinh döôõng aên saâu vaøo cô chaát huùt chaát dinh döôõng töø moâi tröôøng nuoâi cô theå; vaø khuaån ty khí sinh moïc ra ngoaøi beà maët cô chaát, töø nhöõng sôïi naám seõ moïc ra caùc baøo töû vaø trôû thaønh cô quan sinh saûn sau naøy. Naám moác phaân loaïi theo hai caùch. Neáu xeùt veà caáu taïo thì goàm 2 loaïi: heä sôïi naám coù vaùch ngaên hoaëc khoâng coù vaùch ngaên. Neáu xeùt veà caáu taïo cô quan sinh saûn coù theå phaân ra laøm 2 loaïi: baøo töû kín vaø baøo töû hôû. Phaàn lôùn caùc loaøi naám moác heä sôïi coù vaùch ngaên, vì vaäy chuùng laø loaïi vi sinh vaät coù caáu taïo ña baøo, ôû moät soá loaøi naám baäc thaáp heä sôïi khoâng coù vaùch ngaên, toaøn boä khuaån ty coi nhö moät teá baøo phaân nhaùnh (ôû caùc gioáng Mucor, Rhizopus, Absidia,…) Caáu taïo teá baøo naám moác khoâng khaùc vôùi teá baøo vi khuaån vaø naám men, nhöng coù moät hoaëc ñoâi khi vaøi nhaân ñònh hình. Phöông phaùp sinh tröôûng raát khaùc nhau ñoái vôùi caùc gioáng, loaøi. Baøo töû cuûa loaøi Aspergillus khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi seõ phaùt trieån taïo nhieàu sôïi vaø phaân nhaùnh ñan cheùo nhau thaønh mixen. Töø ñaây moïc leân nhöõng sôïi hình kim mang treân ñaàu nhöõng baøo töû. Caùc baøo töû coù theå mang nhieàu maøu saéc khaùc nhau: vaøng, xanh, luïc, ñoû, ñen hoaëc naâu v.v… Ví duï baøo töû cuûa Asp.awamori, usamii, niger coù maøu ñen hoaëc naâu, coøn baøo töû Asp.oryzae coù maøu vaøng hoaëc maøu vaøng luïc v.v… Hình 2.5: Chuûng naám moác Aspergilus Ñaëc ñieåm naám moác trong baùnh men thuoác baéc [8] Trong baùnh men thuoác baéc coù nhieàu loaøi naám moác phaùt trieån thuoäc Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus. Soá loaïi naám moác phuï thuoäc vaøo caùc yeáu toá nhö: nhieät ñoä, ñòa phöông nôi saûn xuaát baùnh men; nhöng trong ñoù, Mucor vaø Rhizopus thaáy phaùt trieån nhieàu hôn caû. Loaøi Mucor, ñaëc bieät laø Mucor rouxxi coù nhieàu ñaëc tính quyù nhö khaû naêng chòu nhieät ñoä cao (32-35oC). Chuùng vöøa coù khaû naêng ñöôøng hoùa vöøa coù khaû naêng röôïu hoùa. Hình 2.6: Chuûng naám moác Mucor Vi khuaån[1, 8, 14] Ñaëc ñieåm hình thaùi, dinh döôõng chung cuûa vi khuaån [1] Vi khuaån coù nhieàu hình thaùi, kích thöôùc vaø caùch saép xeáp khaùc nhau. Ñöôøng kính cuûa phaàn lôùn vi khuaån khoaûng 0,2 – 2,0mm, chieàu daøi cô theå khoaûng 2,0 – 8,0mm. Nhöõng hình daïng chuû yeáu cuûa vi khuaån laø hình caàu, hình que, hình daáu phaåy, hình xoaén, hình coù cuoáng, hình coù sôïi… Caáu taïo teá baøo vi khuaån: Thaønh teá baøo: laø caáu truùc lôùp ngoaøi cuøng, coù ñoä raéc chaéc nhaát ñònh coù khaû naêng baûo veä teá baøo trong ñieàu kieän baát lôïi. Maøng teá baøo: caáu taïo bôûi 2 lôùp photpholipid vaø caùc protein naèm phía trong, phía ngoaøi hay xuyeân qua maøng. Teá baøo chaát: laø vuøng dòch theå ôû daïng keo chöùa caùc chaát hoøa tan trong suoát vaø caùc haït nhö riboxom, goàm khoaûng 80% nöôùc. Theå nhaân: nhaân nguyeân thuûy chöa coù maøng nhaân, chæ moät nhieãm saéc theå. Tieân mao: laø nhöõng sôïi loâng daøi, uoán khuùc moïc ôû maët ngoaøi moät soá vi khuaån giuùp chuùng coù theå chuyeån ñoäng trong moâi tröôøng loûng. Ñaëc ñieåm vi khuaån trong baùnh men thuoác baéc [8,14] Trong baùnh men thuoác baéc, thaáy coù nhieàu loaøi vi khuaån phaùt trieån. Tröôùc ñaây chuû yeáu laø vi khuaån lactic vaø acetic. Caùc loaøi vi khuaån naøy thöôøng laøm chua moâi tröôøng. Thôøi gian ñaàu quaù trình leân men, quaù trình naøy xaûy ra laø coù lôïi vì pH moâi tröôøng do chuùng taïo ra seõ thích hôïp cho naám men vaø naám sôïi phaùt trieån. Tuy nhieân pH xuoáng quaù thaáp laïi aûnh höôûng xaáu cho quaù trình leân men. Maët khaùc trong giai ñoaïn sau, neáu dòch leân men coù oxy thì vi khuaån acetic seõ oxy hoùa röôïu thaønh acid acetic, laøm giaûm löôïng coàn taïo thaønh; khoâng coù lôïi. Ngaøy nay, baèng phaân laäp, ngöôøi ta thu ñöôïc vaø boå sung vaøo cheá phaåm baùnh men nhieàu chuûng gioáng vi khuaån coù khaû naêng chuyeån hoùa tinh boät thaønh ñöôøng: B. subtilis, B. diastaticus… [14] Hình 2.7: Vi khuaån Bacillus Subtilis CHÖÔNG 3: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU NGUYEÂN LIEÄU Nguyeân lieäu chính Gaïo: söû duïng loaïi gaïo Taøi Nguyeân nôû xoáp, ñöôïc mua moät laàn taïi chôï Baø Chieåu. Yeâu caàu kó thuaät: gaïo traéng, khoâng aåm moác, khoâng coù coân truøng, khoâng moái moït, khoâng coù taïp chaát laï (caùt, saïn…). Nguyeân lieäu phuï - Baùnh men gioáng: söû duïng baùnh men röôïu Baàu Ñaù, thu thaäp ôû Bình Ñònh. - Chuûng gioáng naám moác Mucor cuûa phoøng thí nghieäm. - Caùc vò thuoác baéc: söû duïng baøi thuoác 8 vò baéc: 1-Nhuïc ñaäu khaáu 3g 5-Cam thaûo 3g 2-Baïch truaät 2g 6-Baïc haø 2g 3-Nhuïc queá 2g 7-Teá taân 3g 4-Thaûo quaû 3g 8-Tieåu hoài 3g - Nöôùc: söû duïng nöôùc saïch cuûa phoøng thí nghieäm. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Muïc ñích cuûa quaù trình nghieân cöùu Caùc phöông phaùp saûn xuaát röôïu theo qui moâ coâng nghieäp: phöông phaùp amylose, mycomalt, hay duøng cheá phaåm enzym… yeâu caàu ñieàu kieän voâ truøng nghieâm ngaët, chæ thích hôïp cho qui moâ lôùn, hieän ñaïi. Trong khi ñoù, vieäc saûn xuaát röôïu gaïo theo phöông phaùp truyeàn thoáng baèng cheá phaåm baùnh men thuoác baéc khoâng ñoøi hoûi ñieàu kieän nghieâm ngaët veà vi sinh, thieát bò ñôn giaûn, deã thöïc hieän, laïi thu ñöôïc röôïu coù höông vò thôm ngon. Do ñoù vôùi ñeà taøi naøy chuùng toâi tieán haønh saûn xuaát baùnh men thuoác baéc, sau ñoù tieán haønh khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán qui trình saûn xuaát röôïu gaïo töø baùnh men ñaõ saûn xuaát. Töø ñoù tieán tôùi hoaøn thieän qui trình ñeå thu ñöôïc röôïu coù noàng ñoä coàn cao, coù theå öùng duïng saûn xuaát röôïu qui moâ vöøa vaø nhoû. Sô ñoà nghieân cöùu Toång quan taøi lieäu, löïa choïn baùnh men Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình saûn xuaát röôïu gaïo baèng cheá phaåm baùnh men ñaõ laøm Keát luaän vaø kieán nghò Phaân laäp, ñònh löôïng, vi sinh vaät trong baùnh men Saûn xuaát baùnh men töø chuûng gioáng ñaõ choïn vaø chuûng Mucor cuûa phoøng thí nghieäm Löïa choïn chuûng gioáng vaø giöõ gioáng Hình 3.1: Sô ñoà nghieân cöùu Toång quan taøi lieäu, löïa choïn loaïi baùnh men Trong giai ñoaïn naøy, chuùng toâi tìm hieåu veà nguyeân lieäu, phöông phaùp vaø caùc hoùa chaát caàn thieát ñeå tieán haønh thí nghieäm. Ñoàng thôøi chuùng toâi thu thaäp, toång hôïp, so saùnh caùc keát quaû nghieân cöùu coù lieân quan ñeán quaù trình saûn xuaát röôïu gaïo theo phöông phaùp truyeàn thoáng. Phaân laäp, ñònh löôïng vi sinh vaät trong baùnh men Chuùng toâi tieán haønh phaân laäp, ñònh tính sô boä heä vi sinh vaät coù trong maãu baùnh men. Ñoàng thôøi tieán haønh ñònh löôïng ñeå xaùc ñònh tæ leä vi khuaån, naám moác vaø naám men coù trong baùnh men. Löïa choïn chuûng gioáng vaø giöõ gioáng Xaùc ñònh khaû naêng phaân giaûi tinh boät cuûa nhöõng chuûng gioáng phaân laäp ñöôïc, xem xet choïn ra chuûng gioáng toát nhaát. Sau ñoù, tieán haønh laøm moâi tröôøng thích hôïp ñeå giöõ nhöõng gioáng ñaõ choïn, duøng cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Saûn xuaát baùnh men töø nhöõng chuûng gioáng ñöôïc choïn Tieán haønh saûn xuaát baùnh men töø nhöõng chuûng gioáng ñöôïc löïa choïn, ñoàng thôøi boå sung chuûng gioáng moác Mucor cuûa phoøng thí nghieäm. Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình saûn xuaát röôïu gaïo Söû duïng baùnh men vöøa saûn xuaát, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa moät soá yeáu toá ñeán quaù trình saûn xuaát röôïu gaïo vôùi haøm muïc tieâu laø noàng ñoä ethanol trong röôïu thaønh phaåm: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa tæ leä men gioáng: Giöõ coá ñònh caùc thoâng soá neâu treân, thay ñoåi tæ leä men gioáng duøng leân men ñeå xaùc ñònh tæ leä thích hôïp. Haøm muïc tieâu: noàng ñoä ethanol taïo thaønh. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc cho vaøo tröôùc leân men aåm vaø sau leân men aåm: Thôøi gian leân men aåm, thôøi gian leân men loûng, tæ leä men gioáng vöøa choïn seõ söû duïng trong thí nghieäm naøy ñeå khaûo saùt haøm aåm tröôùc leân men aåm vaø löôïng nöôùc cho vaøo ñeå leân men loûng. Haøm muïc tieâu: noàng ñoä ethanol taïo thaønh. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian leân men aåm vaø thôøi gian leân men loûng: Vôùi tæ leä gioáng thích hôïp vöøa choïn ñöôïc ôû thí nghieäm treân, tieán haønh leân men röôïu vôùi thôøi gian leân men aåm vaø thôøi gian leân men loûng laàn löôït thay ñoåi. Giöõ coá ñònh caùc thoâng soá coøn laïi. Haøm muïc tieâu: noàng ñoä ethanol taïo thaønh. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa SO2 cho vaøo sau leân men aåm: Sau quaù trình leân men aåm, tieán haønh sunfit hoùa dòch thu ñöôïc, khaûo saùt söï aûnh höôûng ñeán noàng ñoä ethanol vaø ñoä chua cuûa saûn phaåm. Qui trình saûn xuaát röôïu töø baùnh men thuoác baéc trong nghieân cöùu Boät gaïo Nghieàn mòn Thuoác baéc Nöôùc Taïo hình Laøm aåm Troän men Nghieàn mòn UÛ Baùnh men röôïu Hong khoâ Baùnh men gioáng Nghieàn mòn Nöôùc Nöôùc Leân men loûng Gaïo Laøm saïch Leân men aåm Naáu Troän men Laøm nguoäi Chöng caát Röôïu traéng Hoaøn thieän Hình 3.2: Qui trình saûn xuaát röôïu töø baùnh men thuoác baéc trong nghieân cöùu Thuyeát minh qui trình: caùc quaù trình saûn xuaát töông töï caùc quaù trình ñaõ trình baøy ôû chöông 2 (2.3.1.1 trang 5 vaø 2.3.1.2 trang 8). Caùc phöông phaùp phaân tích Caùc phöông phaùp vi sinh [11] Phaân laäp vi sinh vaät: söû duïng phöông phaùp daøn ñeàu vi sinh vaät. Nguyeân lí: moät löôïng nhoû vi sinh vaät ñaõ ñöôïc pha loaõng tröôùc ñöôïc daøn ñeàu leân treân beà maët hoäp peptri coù chöùa moâi tröôøng dinh döôõng thích hôïp. Tieán haønh: moâi tröôøng agar noùng chaûy ñöôïc ñoå vaøo hoäp peptri voâ khuaån, ñeå cho ñaëc laïi. Duøng pipet huùt 0.1ml dung dòch hoãn hôïp vi sinh vaät caàn phaân laäp ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau cho vaøo caùc hoäp peptri chöùa moâi tröôøng agar ôû treân; sau ñoù duøng que trang voâ khuaån daøn ñeàu ra khaép beà maët. Laät ngöôïc hoäp peptri ñeå nuoâi trong tuû aám ôû 350C. Sau khoaûng 48 giôø, taùch rôøi caùc khuaån laïc treân moâi tröôøng ñaëc. Ñònh löôïng vi sinh vaät: duøng hai phöông phaùp: Phöông phaùp ñoå hoäp Nguyeân lí: caáy moät theå tích xaùc ñònh maãu huyeàn phuø vi sinh vaät leân moâi tröôøng thaïch trong hoäp peptri. Moâi tröôøng ñöôïc choïn coù cô chaát ñaëc hieäu cho loaøi vi sinhv aät caàn ñònh löôïng. Sau moät khoaûng thôøi gian nuoâi caáy, ñeám soá khuaån laïc phaùt trieån treân caùc moâi tröôøng vaø döïa vaøo tæ leä pha loaõng cuøng theå tích ban ñaàu ñem caáy ñeå suy ra soá löôïng khuaån laïc coù trong 1ml maãu. Neáu loaøi vi sinh vaät laø ñôn baøo, daïng rieâng leõ, coù theå xem moãi khuaån laïc laø keát quaû cuûa söï phaùt trieån töø moät teá baøo. Tieán haønh: duøng 3 moâi tröôøng sau ñeå ñònh löôïng naám men, naám moác vaø vi khuaån töông öùng. Moâi tröôøng cho naám men: moâi tröôøng thaïch malt. Dòch chieát malt 80Bx: 1 lít Agar: 20g Moâi tröôøng cho vi khuaån: thaïch thòt – peptone. Cao thòt: 10g Peptone: 10g NaCl: 5g Agar: 20g Nöôùc caát: 1 lít. Moâi tröôøng cho naám moác: thaïch Czapec. Saccharose: 30g Agar: 18 – 20g Dung dòch A: 50ml Dung dòch B: 50ml Dung dòch A: - NaNO3 40g Dung dòch B: - K2HPO4 20g - KCl 10g - Nöôùc caát 1 lít - MgSO4.7H2O 10g - FeSO4 0.2g - Nöôùc caát 1 lít Caùc moâi tröôøng ñeàu ñöôïc tieät truøng ôû 1210C, 15 phuùt. Phöông phaùp ñeám soá teá baøo vi sinh vaät baèng buoàng ñeám: Duøng buoàng ñeám Thoma xaùc ñònh nhanh soá vi khuaån vaø naám men sau nhaân gioáng. Caáu taïo buoàng ñeám Thoma: laø moät phieán kính daøy hình chöõ nhaät, coù ñuïc caùc raõnh sonh song, chia beà maët thaønh 3 khoang A, B, C. Chieàu cao khoang B thaáp hôn khoang A vaø C moät ñoaïn h. Giaù trò h ñöôïc goïi laø chieàu cao buoàng ñeám. Khoang B ñöôïc chia thaønh hai khoang nhoû B1 vaø B2 nhôø moät raõnh ñuïc song song vôùi chieàu daøi cuûa beà maët buoàng ñeám. Treân moãi khoang nhoû, ngöôøi ta keû caùc löôùi ñeám (hình veõ). Löôùi ñeám cuûa buoàng ñeám Thoma goàm 16 oâ vuoâng lôùn vaø trong moãi oâ vuoâng lôùn laïi ñöôïc thaønh 16 oâ vuoâng nhoû hôn. A C B2 h B1 Hình3.3: Buoàng ñeám Thoma. Caùch thöïc hieän: duøng laù kính ñaäy leân löôùi ñeám, duøng ngoùn tay eùp chaët vaøo beà maët hai khoang A vaø C. Duøng pipet cho maãu ñaõ pha loaõng vaøo meùp giöõa khoang B vaø laù kính. Chuù yù traùnh taïo boït khí vaø traùnh ñeå maãu rôi xuoáng raõnh caùc buoàng ñeám. Sau 3-5 phuùt, ñeám soá teá baøo vi sinh vaät baèng kính hieån vi (ñoä phoùng ñaïi: 400 laàn). Giöõ gioáng vi sinh vaät: Chuaån bò oáng thaïch nghieâng chöùa moâi tröôøng agar ñoâng ñaëc. Caáy chuyeàn vi sinh vaät sang oáng nghieäm vaø ñeå moät thôøi gian ôû nhieät ñoä toái öu cho vi sinh vaät phaùt trieån. Sau ñoù ñem baûo quaûn ôû nhieät ñoä laïnh (khoaûng 40C). Phöông phaùp xaùc ñònh khaû naêng thuûy phaân tinh boät: Xaùc ñònh baèng ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät cuûa caùc chuûng treân moâi tröôøng thaïch ñóa coù chöùa tinh boät Cho 1-2 ml nöôùc voâ khuaån vaøo oáng gioáng chöùa vi sinh vaät, laéc nheï, duøng que caáy ñieåm chaám nheï vaøo dòch. Ñaët hoäp petri chöùa moâi tröôøng ñeå uùp, caáy 1 ñieåm vaøo giöõa hoäp. Nuoâi trong tuû taïi nhieät ñoä phoøng, quan saùt sau 3 ngaøy, cho dòch lugol vaøo thöû, chuûng naøo coù voøng phaân giaûi tinh boät chöùng toû coù enzym amilaza thuûy phaân tinh boät; ñoàng thôøi döïa vaøo ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät vaø ñöôøng kính khuaån laïc ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzym Dung dòch lugol ñöôïc pha nhö sau: hoøa 2g KI trong 5ml nöôùc caát cho tan heát, sau ñoù cho theâm 1g I2 vaøo, sau ñoù cho nöôùc caát ñeán ñuû 300ml, laéc ñeàu. Caùc phöông phaùp hoùa lí Xaùc ñònh ñoä aåm: Duøng maùy ño ñoä aåm SCALTEC SM 01. Xaùc ñònh pH: Duøng maùy ño pH MP220-METTLER TOLEDO. Xaùc ñònh noàng ñoä chaát khoâ: Duøng khuùc xaï keá (Bx). Xaùc ñònh ñoä röôïu: Duøng phöông phaùp chöng caát vaø ño tyû troïng. Xaùc ñònh noàng ñoä röôïu trong dòch giaám sau leân men: Bình tyû troïng ñem saáy khoâ, laøm nguoäi trong bình huùt aåm, caân ñöôïc khoái löôïng m0. Cho nöôùc caát 200C vaøo bình, caân ñöôïc khoái löôïng m1. Duøng bình ñònh möùc laáy 100ml dòch giaám chín cho vaøo bình caàu coù dung tích khoaûng 500ml. Traùng bình ñònh möùc baèng nöôùc caát vaø ñònh möùc ñeán 100ml, cho vaøo bình caàu. Tieán haønh chöng caát, thu » 100ml dòch caát thì ngöng. Giöõ nhieät ñoä dòch caát ôû 200C trong 15 phuùt vaø ñònh möùc thaønh 100ml cuõng baèng nöôùc caát 200C. cho dòch caát 200C vaøo bình tyû troïng, caân ñöôïc khoái löôïng m2. Tính tyû soá: , tra phuï luïc cuûa taøi lieäu [14], xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä röôïu. Xaùc ñònh noàng ñoä röôïu trong heøm sau leân men aåm: caân 100g heøm sau leân men aåm cho vaøo bình caàu. Cho theâm 100ml nöôùc caát roài tieán haønh chöng caát. Caùc böôùc khaùc tieán haønh töông töï nhö treân. Xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng khöû Xaùc ñònh ñöôøng khöû baèng phöông phaùp quang phoå haáp thu: Nguyeân taéc döïa treân phaûn öùng taïo maøu giöõa ñöôøng khöû vôùi thuoác thöû dinitro salycilic (DNS): 3 C6H12O6 + (NO2)2C6H2(COOH)OH + 4NaOH ® (NO2)2C6H2(COONa)OH + 3 C5H11COONa + 3 H2O Cöôøng ñoä maøu tæ leä thuaän vôùi noàng ñoä ñöôøng khöû trong moät phaïm vi nhaát ñònh. Döïa theo ñoà thò ñöôøng chuaån cuûa glucose tinh khieát vôùi thuoác thöû suy ra haøm löôïng ñöôøng khöû trong maãu nghieân cöùu. Hoùa chaát söû duïng NaOH raén, Natri kali tartrat raén vaø glucose chuaån daïng raén do Trung Quoác saûn xuaát; acid DNS (2,4 – dinitro salycilic) raén do Merk saûn xuaát. Phöông phaùp pha thuoác thöû Hoøa tan 1g DNS trong 20ml dung dòch NaOH 1.6M. Hoøa tan 30g muoái Natri kali tartrat trong 50ml nöôùc caát. Hoøa tan hai dung dòch treân vaøo nhau vaø khuaáy ñeàu cho ñeán khi DNS tan hoaøn toaøn, ñònh möùc thaønh 100ml. Baûo quaûn trong loï saãm maøu ôû nhieät ñoä ôû nhieät ñoä thaáp, töø 5-100C. Thôøi gian baûo quaûn khoâng quaù 2 tuaàn. Xaây döïng ñöôøng chuaån Chuaån bò dung dòch chuaån glucose 0.1%. Chuaån bò daõy oáng nghieäm theo baûng sau (ml): STT Maãu traéng 1 2 3 4 5 Dd glucose 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Nöôùc caát 3 2.8 2.6 2.4 2.2 2 Thuoác thöû DNS 1 1 1 1 1 1 Ñun caùch thuûy caùc oáng maãu chuaån vaø maãu traéng ôû 1000C trong 5 phuùt. Sau ñoù, laøm nguoäi ñeán nhieät ñoä thöôøng. Ño ñoä haáp thu OD ôû böôùc soùng 540nm. Veõ ñoà thò OD = f(C), ta coù ñöôøng chuaån glucose. Xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng khöû trong maãu Pha loaõng maãu ñeán noàng ñoä thích hôïp sao cho noàng ñoä ñöôøng khöû cuûa maãu naèm trongkhoaûng noàng ñoä cuûa ñöôøng chuaån. Tieán haønh ño nhö caùc böôùc ôû treân. Xaùc ñònh noàng ñoä ñöôøng khöû x (g/l) trong maãu pha loaõng baèng phöông phaùp noäi suy töø ñöôøng chuaån. Haøm löôïng ñöôøng khöû X (g/l) trong maãu ban ñaàu laø: X (g/l) = x * f Trong ñoù: f laø heä soá pha loaõng. Xaùc ñònh haøm löôïng tinh boät Laáy 50ml dòch giaám chín, 50ml nöôùc caát vaø 6ml HCl ñaäm ñaëc cho vaøo bình tam giaùc 250. Noái bình vôùi oáng sinh haøn khí, ñun caùch thuûy trong 2 giôø. Laøm nguoäi ñeán nhieät ñoä phoøng. Trung hoøa baèng NaOH 10% cho ñeán khi giaáy quì coù maøu xanh lô. Chuyeån vaøo bình ñònh möùc 250ml vaø ñònh möùc baèng nöôùc caát, loïc. Tieán haønh ño noàng ñoä ñöôøng khöû baèng phöông phaùp DNS, sau ñoù tính laïi haøm löôïng tinh boät soùt CHÖÔNG 4 - KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Chuûng gioáng baùnh men laø moät trong yeáu toá cöïc kyø quan troïng quyeát ñònh chaát löôïng röôïu, noàng ñoä röôïu. Vieäc löïa choïn loaïi baùnh men gioáng laø böôùc ñaàu tieân voâ cuøng caàn thieát. Trong nghieân cöùu tröôùc ñaõ khaûo saùt 6 loaïi baùnh men gioáng thu thaäp töø 6 ñòa phöông khaùc nhau treân thò tröôøng (Long Xuyeân – Vónh Long – Caàn Giuoäc – Goø Ñen – Bình Ñònh – Haø Noäi). Keát quaû thí nghieäm choïn ñöôïc baùnh men röôïu Baàu Ñaù cuûa Bình Ñònh laø maãu baùnh men cho hieäu suaát leân men cao nhaát, ñoàng thôøi röôïu caát ñöôïc coù höông vò toát nhaát. Do ñoù, chuùng toâi chæ tieán haønh caùc thí nghieäm vôùi maãu baùnh men röôïu cuûa Bình Ñònh nhö ñaõ choïn. KHAÛO SAÙT HEÄ VI SINH VAÄT TRONG BAÙNH MEN Phaân laäp vaø ñònh löôïng heä vi sinh vaät trong baùnh men Ñaàu tieân chuùng toâi tieàn haønh phaân laäp vaø ñònh löôïng laïi heä vi sinh vaät trong baùnh men. Söû duïng caùc moâi tröôøng toái öu cho vi khuaån, naám moác vaø naám men ( 3.2.1 trang 27), chuùng toâi tieán haønh phaân laäp heä vi sinh vaät trong baùnh men thaønh nhöõng khuaån laïc rieâng bieät, sau ñoù tieán haønh laøm tieâu baûn vaø quan saùt döôùi kính hieån vi. Keát quaû thu ñöôïc nhö sau: Baûng 4.1: Caùc chuûng vi khuaån phaân laäp ñöôïc töø baùnh men röôïu Baàu Ñaù Khuaån laïc Hình daïng teá baøo Chuûng vi sinh vaät Kí hieäu Hình daïng VK1 Ñoám traéng ngaø, hình hoa, vieàn raêng cöa, beà maët coù khía troøn Hình que Vi khuaån VK2 Ñoám troøn nhoû, vaøng, nhaün Hình caàu Vi khuaån VK3 Ñoám vaøng ñaäm, beà maët goàm nhieàu sôïi chuïm laïi Hình caàu Vi khuaån VK4 Ñoám traéng hôi troøn, nhaün ôû taâm, beà vuøng rìa nhaên Hình caàu Vi khuaån VK5 Ñoám daøi maøu vaøng Hình caàu Vi khuaån VK6 Ñoám troøn maøu traéng ngaø, vieàn raêng cöa Hình oval Vi khuaån VK7 Ñoám traéng nhoû, treân beà maët coù khía Hình que Vi khuaån Baûng 4.2: Caùc chuûng naám men vaø naám moác phaân laäp ñöôïc töø baùnh men röôïu Baàu Ñaù Khuaån laïc Hình daïng teá baøo Chuûng vi sinh vaät Kí hieäu Hình daïng M1 Ñoám coù loâng tô traéng mòn, baøo töû taïo thaønh maøu ñen Baøo töû kín, sôïi ñôn baøo, cuoáng ñôn baøo Naám moác M2 Ñoám coù loâng tô, baøo töû taïo thaønh maøu xaùm ñen Baøo töû hôû, sôïi ña baøo, cuoáng ñôn baøo Naám moác M3 Ñoám traéng, moïc lan roäng, coù loâng tô löa thöa, baøo töø maøu xaùm ñen Baøo töû hôû, sôïi ña baøo, cuoáng ñôn baøo Naám moác M4 Ñoám traéng, heä sôïi daøi, thaúng ñöùng Baøo töû kín, sôïi ñôn baøo, cuoáng ñôn baøo Naám moác NM1 Ñoám troøn traéng ngaø, nhaün, kích thöôùc vöøa Hình troøn Naám men NM2 Ñoám traéng beà maët nhaün, kích thöôùc lôùn. Hình tröùng Naám men NM3 Ñoám traéng hôi daøi, töông ñoái lôùn Hình troøn Naám men NM4 Ñoám troøn traéng nhoû li ti, nhaün Hình hôi daøi, kích thöôùc nhoû Naám men NM5 Ñoám troøn, maøu cam, nhaün Hình troøn Naám men Song song vôùi quaù trình phaân laäp, chuùng toâi tieán haønh ñònh löôïng giaùn tieáp baèng phöông phaùp ñoå hoäp. Keát quaû nhö sau: Baûng 4.3: Ñònh löôïng vi sinh vaät coù trong baùnh men röôïu Baàu Ñaù Chuûng vi sinh vaät Soá löôïng (x108 teá baøo /g) Tæ leä so vôùi toång soá vi sinh vaät coù trong baùnh men (%) Vi khuaån 6.9 33.83 Naám moác 0.8 3.92 Naám men 12.7 62.25 Toång soá vi sinh vaät 20.4 Qua keát quaû naøy, chuùng toâi nhaän thaáy: Trong maãu baùnh men thuoác baéc, coù ñaày ñuû caû ba heä vi sinh vaät naám men, naám moác vaø vi khuaån. Maët khaùc, vôùi moãi heä, ñeàu coù nhieàu loaøi khaùc nhau (baûng 4.1 vaø 4.2) Naám men chieám soá löôïng lôùn nhaát trong toång soá vi sinh vaät. Tæ leä naám moác haàu nhö khoâng ñaùng keå. Nhö vaäy, trong baùnh men ñaõ choïn, naám moác khoâng ñoùng vai troø chuû ñaïo trong quaù trình ñöôøng hoùa. Ñieàu naøy chöùng toû, quaù trình ñöôøng hoùa coù theå laø do vi khuaån vaø naám men thöïc hieän. Do ñoù, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt khaû naêng phaân giaûi tinh boät cuûa caùc chuûng vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc. Töø ñoù seõ choïn ra chuûng toát nhaát ñeå tieán haønh saûn xuaát baùnh men. Khaûo saùt khaû naêng phaân giaûi tinh boät cuûa vi sinh vaät trong baùnh men: Töø caùc chuûng vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc, chuùng toâi tieán haønh xaùc ñònh khaû naêng phaân giaûi tinh boät cuûa chuùng baèng phöông phaùp caáy ñieåm ôû taâm hoäp peptri chöùa moâi tröôøng thaïch Sapuc. Sau 3 ngaøy, duøng thuoác thöû Lugol nhoû vaøo caùc hoäp ñeå xaùc ñònh ñöôøng kính voøng thuûy phaân. Ñöôøng kính voøng thuûy phaân caøng lôùn chöùng toû chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng phaân giaûi tinh boät toát. Keát quaû nhö sau: Baûng 4.4: Khaû naêng phaân giaûi tinh boät cuûa caùc chuûng vi sinh vaät trong baùnh men röôïu Baàu Ñaù Chuûng vi sinh vaät Soá ngaøy nuoâi Ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät (cm) VK1 VK2 VK3 VK4 VK5 VK6 VK7 3 3 3 3 3 3 3 2.5 2.5 1,5 1,5 0 1,0 0 M1 M2 M3 M4 3 3 3 3 2.0 2.0 2.0 1.5 NM1 NM2 NM3 NM4 NM5 3 3 3 3 3 1,5 1,0 0 0 0 Hình 4.1: Voøng phaân giaûi tinh boät Hình 4.2: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng VK1 cuûa chuûng VK2 Hình 4.3: Voøng phaân giaûi tinh boät Hình 4.4: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng M1 cuûa chuûng M2 Hình 4.5: Voøng phaân giaûi tinh boät Hình 4.6: Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa chuûng NM1 cuûa chuûng NM3 Nhaän xeùt: Caùc chuûng vi khuaån VK1, VK2 cho khaû naêng phaân giaûi tinh boät toát, caùc chuûng coøn laïi phaân giaûi tinh boät keùm hôn; chuûng VK5 vaø VK7 khoâng coù khaû naêng phaân giaûi tinh boät. Caû 4 chuûng naám moác ñeàu cho khaû naêng phaân giaûi tinh boät töông ñoái. Khaû naêng phaân giaûi tinh boät cuûa caùc chuûng naám men keùm nhaát, voøng phaân giaûi khaù nhoû; caùc chuûng NM2, NM3, NM4 khoâng coù khaû naêng phaân giaûi tinh boät. Tuy naám moác coù khaû naêng phaân giaûi töông ñoái toát, nhöng vaãn keùm hôn vi khuaån; hôn nöõa nhö ñaõ noùi ôû treân, trong baùnh men naám moác chieám tæ leä raát thaáp (baûng 4.3), do ñoù naám moác khoâng ñoùng vai troø quan troïng trong quaù trình ñöôøng hoùa tinh boät khi söû duïng baùnh men. Vì vaäy, chuùng toâi quyeát ñònh khoâng söû duïng caùc chuûng moác naøy trong caùc quaù trình nghieân cöùu tieáp theo. Hai chuûng vi khuaån VK1 vaø VK2 coù khaû naêng phaân giaûi tinh boät toát neân chuùng toâi choïn hai chuûng naøy giöõ laïi cho caùc nghieân cöùu tieáp theo. Ñoái vôùi caùc chuûng naám men, chuùng toâi seõ tieáp tuïc khaûo saùt khaû naêng leân men röôïu cuûa moãi chuûng. Khaûo saùt khaû naêng leân men röôïu cuûa caùc chuûng naám men phaân laäp ñöôïc Chuùng toâi duøng caùc chuûng naám men phaân laäp ñöôïc vaø tieán haønh leân men röôïu; caùc ñieàu kieän nhö sau: Dòch thuûy phaân tinh boät vôùi noàng ñoä: 120Bx. Giaù trò pH: 4.5. Nhieät ñoä leân men: 30 – 320C. Thôøi gian leân men: 72 giôø. Sau ñoù tieán haønh ñem chöng caát vaø xaùc ñònh ñoä röôïu. Keát quaû nhö sau: Baûng 4.5: Noàng ñoä röôïu trong dòch giaám khi leân men vôùi caùc chuûng naám men phaân laäp ñöôïc Chuûng naám men phaân laäp ñöôïc Ñoä röôïu (%V) NM1 8.36 NM2 7.00 NM3 8.85 NM4 6.77 NM5 7.08 Chuùng toâi nhaän thaáy: khi leân men trong nhöõng ñieàu kieän gioáng nhau, 2 chuûng NM1 vaø NM3 cho ñoä röôïu trong dòch giaám thu ñöôïc laø cao nhaát, chöùng toû khaû naêng leân men röôïu laø cao nhaát.ba chuûng coøn laïi ñeàu cho khaû naêng leân men keùm hôn haún. Vì vaäy, döïa vaøo keát quaû kieåm tra khaû naêng leân men röôïu, chuùng toâi quyeát ñònh choïn 2 chuûng NM1 vaø NM3 cho nhöõng nghieân cöùu tieáp theo. Nhö vaäy toång coäng, qua hai thí nghieäm khaûo saùt khaû naêng ñöôøng hoùa vaø röôïu hoùa cuûa caùc chuûng vi sinh vaät, chuùng toâi choïn ñöôïc 4 chuûng VK1, VK2, NM1 vaø NM3 vaø seõ tieán haønh giöõ gioáng cho nhöõng nghieân cöùu tieáp theo. Giöõ gioáng vi sinh vaät Qua quaù trình phaân laäp caùc chuûng vi sinh vaät ñöôïc töø baùnh men röôïu Baàu Ñaù, vaø khaûo saùt hoaït tính ôû treân, keát quaû chuùng toâi choïn ra 4 chuûng vi sinh vaät: VK1, VK2, NM1 vaø NM3 theo chuùng toâi ñaùnh giaù laø thích hôïp nhaát cho vieäc saûn xuaát baùnh men thuoác baéc. Chuùng toâi tieán haønh laøm moâi tröôøng giöõ gioáng ñeå saûn xuaát baùnh men cho nhöõng nghieân cöùu tieáp theo nhö (3.2.3.1 trang 28). Saûn xuaát baùnh men thuoác baéc töø nhöõng chuûng phaân laäp ñöôïc vaø töø chuûng naám moác phoøng thí nghieäm Sau khi löïa choïn caùc chuûng gioáng thích hôïp töø nhöõng chuûng phaân laäp ñöôïc, chuùng toâi tieán haønh saûn xuaát baùnh men thuoác baéc vôùi caùc thoâng soá ñaõ coù töø nghieân cöùu tröôùc ñeå saûn xuaát baùnh men cho chaát löôïng toát. Caùc thoâng soá nhö sau: Nguyeân lieäu: boät gaïo, baøi thuoác baéc 8 vò (3.1.2 trang 22). Ñoä aåm nguyeân lieäu: 47 – 50 %. Tyû leä gioáng: vi khuaån: 3.107 teá baøo/100g baùnh men. Naám moác phoøng thí nghieäm: 6.106 teá baøo/100g baùnh men. Naám men: 6.107 teá baøo/100g baùnh men. Tyû leä thuoác baéc: 4% so vôùi khoái löôïng gaïo. Thôøi gian uû baùnh men: 2 ngaøy. Nhieät ñoä uû: 28 – 300C. Vôùi caùc thoâng soá treân, chuùng toâi saûn xuaát ñöôïc baùnh men BM1. song song ñoù, chuùng toâi saûn xuaát baùnh men BM2 cuõng vôùi caùc thoâng soá nhö treân nhöng khoâng boå sung chuûng moác phoøng thí nghieäm. Caùch laøm baùnh men: saûn xuaát theo qui trình ôû 2.1.3.1 (hình 2.1 trang 4) Boät gaïo ñöôïc nhaøo troän ñeàu vôùi boät thuoác baéc. Caáy caùc chuûng vi sinh vaät daïng dòch huyeàn phuø theo tæ leä treân. Sau ñoù theâm nöôùc saïch ñeå taïo aåm cho hoãn hôïp. Löu yù hoãn hôïp boät khoâng khoâ quaù cuõng khoâng nhaõo quaù, ñoä aåm thích hôïp nhaát vaøo khoaûng 50%. Ñònh hình thaønh daïng vieân, ñaët vaøo caùc khay coù loùt traáu vaø uû trong 2 ngaøy ñeå heä vi sinh vaät trong baùnh men phaùt trieån vaø nôû xoáp. Khi baùnh men nôû xoáp, naám moác moïc ñeàu vaø baét ñaàu coù muøi röôïu thì tieán haønh hong khoâ. Nhieät ñoä hong khoâng quaù 35oC, hong khoâ khoaûng 3 ngaøy thì ñöôïc. Nhaän xeùt: So saùnh baùnh men saûn xuaát coù boå sung chuûng moác phoøng thí nghieäm (BM1) vaø baùnh men saûn xuaát töø caùc chuûng phaân laäp ñöôïc, khoâng boå sung theâm chuûng moác (BM2), chuùng toâi nhaän thaáy: baùnh men BM1 nôû xoáp hôn, muøi thôm caùc vò thuoác baéc roõ, muøi röôïu ñaëc tröng hôn. Do ñoù, baùnh men saûn xuaát ñöôïc (BM1) seõ duøng cho caùc nghieân cöùu tieáp theo, ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá khaùc nhau ñeán quaù trình leân men röôïu. Keát quaû naøy hoaøn toaøn phuø hôïp vôùi keát quaû cuûa quaù trình nghieân cöùu tröôùc ñaõ thu ñöôïc. Keát quaû ñöôïc baùnh men thaønh phaåm nhö hình sau: Hình 4.7: Baùnh men thaønh phaåm, saûn xuaát töø caùc chuûng gioáng phaân laäp ñöôïc vaø töø chuûng moác phoøng thí nghieäm (BM1) KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA TÆ LEÄ MEN GIOÁNG Trong thí nghieäm naøy, ñeå xaùc ñònh tæ leä baùnh men toái öu cho quaù trình leân men röôïu, chuùng toâi tieán haønh leân men röôïu vôùi tæ leä baùnh men khaùc nhau: 2, 4, 6, 8, 10% khoái löôïng. Caùc ñieàu kieän khaùc ñöôïc giöõ coá ñònh: Khoái löôïng gaïo: 100 gam. Löôïng nöôùc duøng laøm chín gaïo: 150ml. Nhieät ñoä leân men: nhieät ñoä thöôøng. Thôøi gian leân men aåm: 2 ngaøy. Thôøi gian leân men loûng: 3 ngaøy. Tæ leä nöôùc duøng pha loaõng sau leân men aåm: 200ml. Röôïu sau khi leân men ñöôïc chöng caát vaø xaùc ñònh ñoä röôïu baèng phöông phaùp tæ troïng. Keát quaû thí nghieäm thu ñöôïc theå hieän trong baûng: Baûng 4.6: Aûnh höôûng cuûa tæ leä gioáng caáy ñeán quaù trình leân men röôïu Tæ leä gioáng caáy (% khoái löôïng) Bx pH Haøm löôïng ethanol trong dòch leân men (%V) Hieäu suaát leân men (%) Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng 2 10 5.0 4.12 3.93 5.16 9.34 67.66 4 16 5.0 4.20 4.05 7.55 10. 67 77.30 6 12.5 5.0 4.09 3.87 8.03 10.26 74.33 8 11.5 5.0 3.90 3.70 7.71 9.59 69.47 10 9.5 5.0 3.83 3.35 7.47 8.93 64.69 Döïa vaøo keát quaû thí nghieäm chuùng toâi nhaän thaáy: khi taêng tæ leä baùnh men gioáng töø 2% leân 4% so vôùi khoái löôïng gaïo ban ñaàu, noàng ñoä ethanol trong dòch giaám taêng. Tuy nhieân khi tieáp tuïc taêng tyû leä baùnh men lôùn hôn 4% so vôùi khoái löôïng gaïo, thì noàng ñoä röôïu trong dòch giaám thu ñöôïc giaûm daàn. Maët khaùc nhìn vaøo ñoà thò hình 4.10, tyû leä gioáng caøng nhieàu pH dòch caøng thaáp. Caùc vi sinh vaät caïnh tranh nguoàn chaát dinh döôõng, phaùt trieån nhanh trong giai ñoaïn ñaàu, keát quaû laûm pH giaûm nhanh. Giaù trò pH thaáp seõ öùc cheá leân leân hoaït ñoäng cuûa caùc heä vi sinh vaät, keát quaû laøm giaûm hieäu suaát leân men. Hôn nöõa, vôùi cuøng khoái löôïng gaïo ban ñaàu, tæ leä baùnh men caøng taêng, haøm löôïng vi sinh vaät caøng nhieàu, do ñoù moâi tröôøng dinh döôõng seõ khoâng coøn ñuû cho heä vi sinh vaät phaùt trieån, daãn ñeán caùc loaøi caïnh tranh, öùc cheá nhau. Vì nhöõng lí do naøy, hieäu suaát leân men giaûm khi tyû leä gioáng lôùn hôn 4%. Hình 4.8: Aûnh höôûng cuûa tæ leä baùnh men ñeán noàng ñoä röôïu trong dòch sau leân men aåm vaø dòch sau leân men loûng Hình 4.9: Aûnh höôûng cuûa tæ leä baùnh men ñeán hieäu suaát leân men Hình 4.10: Aûnh höôûng cuûa söï thay ñoåi tæ leä baùnh men ñeán pH dòch sau leân men aåm vaø dòch sau leân men loûng Ngöôïc laïi, khi tæ leä gioáng thaáp, laïi khoâng ñuû soá teá baøo tham gia quaù trình trao ñoåi chaát, röôïu taïo ra thaáp. Trong khi ñoù, chaát dinh döôõng coøn nhieàu vì vi sinh vaät chöa söû duïng trieät ñeå, coäng vôùi pH thích hôïp laø ñieàu kieän lyù töôûng cho caùc vi khuaån taïp phaùt trieån, laøm pH giaûm nhanh (hình 4.10). Maët khaùc, ñieàu kieän naøy coøn thích hôïp cho quaù trình leân men giaám sinh acid acetic, goùp phaàn laøm giaûm hieäu suaát leân men. Giaù trò pH thaáp ôû caùc tæ leä gioáng caáy 2, 6, 8 vaø 10% khoâng nhöõng laøm giaûm hieäu suaát leân men maø coøn laøm röôïu thaønh phaåm coù höong vò keùm. Nhö vaäy, sau khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa tæ leä baùnh men ñeán noàng ñoä röôïu trong dòch giaám thu ñöôïc, chuùng toâi nhaän thaáy, vôùi tæ leä baùnh men laø 4% so vôùi khoái löôïng gaïo thì quaù trình leân men röôïu cho hieäu suaát cao nhaát, ñoàng thôøi röôïu chöng caát ñöôïc cuõng coù muøi vò toát nhaát. Do ñoù, chuùng toâi choïn tæ leä gioáng naøy ñeå tieán haønh caùc thí nghieäm tieáp theo. KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA HAØM AÅM CÔM ÑEÁN QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN RÖÔÏU Trong thí nghieäm naøy, ñeå xaùc ñònh ñoä aåm nguyeân lieäu toái öu cho quaù trình leân men aåm cuõng nhö quaù trình leân men röôïu noùi chung, chuùng toâi tieán haønh leân men röôïu vôùi côm coù haøm aåm khaùc nhau: tæ leä gaïo vaø nöôùc duøng laøm chín gaïo laàn löôït laø 1:1, 1:3, 1:5, 1:7 vaø 1:9. Kí hieäu caùc maãu töông öùng laø : M1, M2, M3, M4 vaø M5. Caùc ñieàu kieän khaùc ñöôïc giöõ coá ñònh: Khoái löôïng gaïo: 100 gam. Löôïng cheá phaåm baùnh men söû duïng: 4g. Nhieät ñoä leân men: nhieät ñoä thöôøng. Thôøi gian leân men aåm 2 ngaøy. Thôøi gian leân men loûng: 3 ngaøy. Tæ leä nöôùc duøng pha loaõng sau leân men aåm laàn löôït: 200, 100ml cho maãu M1 vaø M2. Caùc maãu coøn laïi khoâng pha nöôùc. Röôïu sau khi leân men ñöôïc chöng caát vaø xaùc ñònh ñoä röôïu baèng phöông phaùp tæ troïng. Keát quaû thí nghieäm thu ñöôïc theå hieän trong baûng: Baûng 4.7: Aûnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc duøng ñoà chín gaïo ñeán quaù trình leân men röôïu Maãu Bx Löôïng ethanol sau leân men aåm (ml/100g) Löôïng ethanol sau leân men loûng (ml/100g) Hieäu suaát leân men (%) Sau leân men aåm Sau leân men loûng M1 15.0 5.0 8.28 35.06 66.83 M2 14.0 5.0 35.04 40.19 76.61 M3 10.5 5.0 35.75 39.35 75.01 M4 6.5 4.0 34.04 37.02 70.57 Döïa vaøo keát quaû trong baûng bieåu vaø hình 4.11, chuùng toâi nhaän thaáy: trong quaù trình leân men aåm, khi haøm aåm côm taêng daàn (tæ leä nöôùc/gaïo taêng töø 1 ñeán 3) hieäu suaát leân men röôïu taêng nhanh. Tuy nhieân, vôùi tæ leä nöôùc/gaïo taêng cao hôn, hieäu suaát leân men röôïu khoâng taêng nöõa maø ngöôïc laïi, coù xu höôùng giaûm daàn. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: trong baùnh men chuùng toâi saûn xuaát, heä vi khuaån vaø naám moác ñeàu coù khaû naêng ñöôøng hoùa tinh boät. Naám moác phaùt trieån toái öu trong moâi tröôøng coù haøm aåm töông ñoái, khoaûng 55 – 65%; haøm aåm quaù thaáp seõ öùc cheá söï sinh tröôûng, phaùt trieån cuõng nhö söï sinh toång hôïp heä enzym amylase cuûa naám moác. Do ñoù ôû maãu M1, hieäu suaát ñöôøng hoùa seõ khoâng cao, daãn ñeán hieäu suaát leân men giaûm. Hình 4.11: Aûnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc duøng ñoà chín gaïo ñeán hieäu suaát leân men Trong khi ñoù, ôû caùc maãu M3, M4 tuy hieäu suaát ñöôøng hoùa cao nhöng noàng ñoä dòch loaõng (ôû maãu M4, noàng ñoä chaát khoâ chæ khoaûng 6.50Bx sau 2 ngaøy leân men aåm). Vôùi noâng ñoä loaõng nhö vaäy, tuy naám men vaãn coù khaû naêng leân men ñöôïc nhöng khoâng toái öu. Do ñoù, caùc heä vi sinh vaät taïp seõ coù ñieàu kieän toát ñeå phaùt trieån. Caùc vi sinh vaät taïp nhieãm naøy seõõ caïnh tranh chaát dinh döôõng vôùi naám men; hoaëc söû duïng chính löôïng ethanol taïo thaønh trong dòch giaám ñeå laøm nguoàn dinh döôõng… Keát quaû laøm giaûm hieäu suaát leân men. Dòch leân men coù muøi laï, chua. Ngoaøi ra, noàng ñoä quaù loaõng coù theå laøm taêng toån thaát trong baõ röôïu vaø nöôùc thaûi, ñieàu naøy cuõng goùp phaàn laøm giaûm hieäu suaát leân men. Nhö vaäy, chæ coù maãu M2 cho hieäu suaát ñöôøng hoùa toát, noàng ñoä chaát khoâ cuûa dòch sau leân men aåm naèm trong khoaûng toái öu cho naám men leân men röôïu vaø keát quaû cuõng cho hieäu suaát leân men toát nhaát (baûng 4.6 vaø hình 4.11). Do ñoù chuùng toâi choïn tæ leä nöôùc duøng ñoà chín gaïo ôû maãu M2 (tyû leä 1:3) ñeå söû duïng cho caùc thí nghieäm tieáp theo. KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA TÆ LEÄ NÖÔÙC BOÅ SUNG VAØO DÒCH LEÂN MEN SAU QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN AÅM Trong thí nghieäm naøy, ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa söï thay ñoåi löôïng nöôùc cho vaøo dòch leân men sau leân men aåm, chuùng toâi tieán haønh leân men röôïu vôùi caùc thoâng soá coá ñònh nhö sau: Khoái löôïng gaïo: 100 gam. Löôïng nöôùc duøng laøm chín gaïo: 300ml. Löôïng cheá phaåm baùnh men söû duïng: 4g. Nhieät ñoä leân men: nhieät ñoä thöôøng. Thôøi gian leân men aåm: 2 ngaøy. Thôøi gian leân men loûng: 3 ngaøy. Rieâng tæ leä nöôùc duøng pha loaõng sau leân men aåm chuùng toâi thay ñoåi laàn löôït theo tæ leä: 0, 1, 2 vaø 3 so vôùi khoái löôïng gaïo. Caùc maãu ñöôïc kí hieäu töông öùng laø M1, M2, M3 vaø M4. Röôïu sau khi leân men ñöôïc chöng caát vaø xaùc ñònh ñoä röôïu baèng phöông phaùp tæ troïng. Keát quaû thí nghieäm thu ñöôïc theå hieän trong baûng: Baûng 4.8: AÛnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc duøng pha loaõng dòch leân men aåm ñeán quaù trình leân men röôïu Maãàu Bx Haøm löôïng ethanol trong dòch giaám (%V) Hieäu suaát leân men (%) Sau leân men aåm Sau leân men loûng M1 18 5.5 11.77 75.17 M2 14 5.0 10.26 76.05 M3 10 5.0 9.51 74.95 M4 6.5 5.0 7.08 70.19 Döïa vaøo keát quaû thí nghieäm chuùng toâi nhaän thaáy: vôùi tæ leä nöôùc pha vaøo dòch leân men aåm laø 1:1 so vôùi khoái löôïng gaïo thì hieäu suaát leân men cao nhaát (76.05%). Vôùi tæ leä nöôùc taêng daàn (1:2 vaø 1:3) hieäu suaát leân men giaûm daàn; vôùi tæ leä nöôùc 1:3 thì hieäu suaát leân men khaù thaáp (70.19%). Coøn khi khoâng pha loaõng, hieäu suaát leân men khaù cao, nhöng vaãn thaáp hôn maãu M2 (pha loaõng vôùi tæ leä 1:1). Hình 4.12: AÛnh höôûng cuûa tæ leä nöôùc pha vaøo dòch leân men aåm ñeán hieäu suaát leân men Nguyeân nhaân laø vì, khi khoâng pha loaõng, moâi tröôøng ñaëc vaø noàng ñoä chaát khoâ töông öùng cao (18oBx), ôû khoaûng noàng ñoä naøy quaù trình leân men ñaõ bò öùc cheá moät phaàn, vaø hieäu suaát leân men vaãn thaáp hôn so vôùi maãu M1 tuy noàng ñoä röôïu caát ñöôïc cao. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do vôùi cuøng moät tæ leä men gioáng, thì ôû noàng ñoä chaát khoâ loaõng hôn (140Bx) naám men seõ söû duïng nguoàn chaát dinh döôõng trieät ñeå vaø hieäu quaû hôn. Vôùi noàng ñoä chaát khoâ cao hôn, moâi tröôøng ñaëc, röôïu nhanh choùng tích tuï, ñoä röôïu trong dòch giaám taêng, daãn ñeán öùc cheá quaù trình leân men; thôøi gian leân men keùo daøi hoaëc deã daãn ñeán toån thaát; keát quaû seõ laøm giaûm hieäu suaát leân men (hình 4.12). Khi löôïng nöôùc duøng pha loaõng dòch leân men aåm taêng daàn, noàng ñoä chaát khoâ loaõng; vaø ôû noàng ñoä loaõng tuy naám men vaãn coù khaû naêng leân men ñöôïc nhöng khoâng toái öu. Maët khaùc, ñoä röôïu raát thaáp, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï phaùt trieån caùc heä vi sinh vaät taïp. Caùc vi sinh vaät taïp nhieãm naøy seõõ caïnh tranh chaát dinh döôõng vôùi naám men; hoaëc söû duïng chính löôïng ethanol taïo thaønh trong dòch giaám ñeå laøm nguoàn dinh döôõng… Keát quaû laøm giaûm hieäu suaát leân men. Hôn nöõa, vôùi löôïng nöôùc cho vaøo dòch leân men aåm caøng cao thì dòch giaám thu ñöôïc cho chaát löôïng caûm quan khoâng toát: muøi chua khoù chòu. Nguyeân nhaân do söï nhieãm taïp caùc vi sinh vaät laï, caùc vi khuaån sinh acid… ñaõ taïo muøi chua cho dòch giaám. Nhö vaäy chuùng toâi choïn tæ leä nöôùc toái öu cho pha loaõng dòch leân men aåm laø 1:1 (maàu M2) vì vôùi tæ leä naøy hieäu suaát leân men laø cao nhaát ñoàng thôøi dòch giaám cuõng cho chaát löôïng caûm quan toát. KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA THÔØI GIAN LEÂN MEN AÅM VAØ THÔØI GIAN LEÂN MEN LOÛNG Trong thí nghieäm naøy, ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa söï thay ñoåi thôøi gian leân men ñeán noàng ñoä röôïu trong dòch giaám cuõng nhö hieäu suaát leân men, chuùng toâi tieán haønh leân men röôïu vôùi caùc thoâng soá coá ñònh nhö sau: Khoái löôïng gaïo: 100 gam. Löôïng nöôùc duøng laøm chín gaïo: 200ml. Löôïng cheá phaåm baùnh men söû duïng: 4g. Nhieät ñoä leân men: nhieät ñoä thöôøng. Tæ leä nöôùc duøng pha loaõng sau leân men aåm so vôùi khoái löôïng gaïo laø 1:1. Ñeå toái öu thôøi gian leân men aåm, chuùng toâi coá ñònh thôøi gian leân men loûng laø 3 ngaøy; coøn thôøi gian leân men aåm ñöôïc thay ñoåi laàn löôït: 2, 3, 4, 5, 6 ngaøy. Ñeå toái öu thôøi gian leân men loûng, chuùng toâi coá ñònh thôøi gian leân men aåm laø 2 ngaøy; thôøi gian leân men loûng thay ñoåi laàn löôït laø: 2, 3, 4, 5, 6 ngaøy. Röôïu sau khi leân men ñöôïc chöng caát vaø xaùc ñònh ñoä röôïu baèng phöông phaùp tæ troïng. Keát quaû thí nghieäm thu ñöôïc theå hieän trong baûng: Baûng 4.9: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian leân men aåm ñeán quaù trình leân men röôïu Soá ngaøy leân men aåm pH Bx Ethanol (ml/100g gaïo) Tinh boät soùt (g/ml) Glucose (g/ml) Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng 2 4.36 4.16 13.5 5.0 7.47 9.43 1.15 0.47 3 4.20 4.08 14.5 5.0 7.87 9.80 0.78 0.50 4 4.16 3.88 10.5 5.0 8.12 9.10 0.67 0.41 5 3.91 3.57 8.0 5.0 8.36 8.85 0.39 0.41 6 3.90 3.43 6.5 5.0 8.44 8.68 0.21 0.37 Baûng 4.10: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian leân men loûng ñeán quaù trình leân men röôïu Soá ngaøy leân men loûng pH Bx Ethanol (ml/100g gaïo) Tinh boät soùt (g/ml) Glucose (g/ml) Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng Sau leân men aåm Sau leân men loûng 2 4.20 4.13 14.0 5 7.87 9.51 0.71 0.50 3 4.20 4.09 14.0 4.5 7.87 9.76 0.56 0.45 4 4.20 3.95 14.0 4.5 7.87 9.26 0.33 0.39 5 4.20 3.78 14.0 4 7.87 9.10 0.25 0.32 6 4.20 3.68 14.0 4 7.87 9.01 0.21 0.29 Qua keát quaû thí nghieäm chuùng toâi nhaän thaáy thôøi gian leân men aåm toái öu laø 3 ngaøy. Vôùi thôøi gian leân men aåm 2 ngaøy, tuy noàng ñoä röôïu trong dòch giaám taïo thaønh cao nhöng so vôùi thôøi gian leân men aåm 3 ngaøy, noàng ñoä röôïu trong dòch giaám cuõng nhö hieäu suaát leân men ñeàu thaáp hôn. Vôùi thôøi gian leân men aåm laâu hôn (4, 5, 6 ngaøy) cuõng cho keát quaû töông töï - noàng ñoä röôïu thaáp (hình 4.13). Hình 4.13: AÛnh höôûng cuûa thôøi gian leân men aåm vaø thôøi gian leân men loûng ñeán ñoä röôïu. Vôùi thôøi gian leân men aåm 2 ngaøy, naám moác vaø vi khuaån chöa ñuû thôøi gian ñeå chuyeån hoùa heát tinh boät thaønh ñöôøng, do ñoù löôïng tinh boät soùt raát cao trong maãu chæ leân men aåm 2 ngaøy (hình 4.14). Trong khi vôùi thôøi gian leân men aåm 4, 5, 6 ngaøy tuy quaù trình ñöôøng hoùa trieâït ñeå hôn (haøm löôïng tinh boät soùt giaûm daàn theo thôøi gian leân men aåm - hình 4.14) nhöng thôøi gian naám men phaùt trieån trong ñieàu kieän hieáu khí keùo daøi, keát quaû ñeàu daãn ñeán giaûm hieäu suaát leân men röôïu. Nhö vaäy thôøi gian leân men aåm toái öu laø 3 ngaøy. Hình 4.14: AÛnh höôûng cuûa thôøi gian leân men aåm ñeán haøm löôïng tinh boät soùt vaø ñöôøng soùt. Khi thôøi gian leân men loûng keùo daøi ñoàng nghóa vôùi vieäc hieäu suaát leân men cao hôn vì naám men söû duïng trieät ñeå löôïng ñöôøng coù trong dòch leân men ñeå chuyeån hoùa thaønh röôïu. Vì theá haøm löôïng glucose trong dòch giaám sau cuøng giaûm daàn theo thôøi gian (hình 4.15). Tuy nhieân, sau moät thôøi gian khi noàng ñoä chaát khoâ giaûm ñeán möùc giôùi haïn, quaù trình leân men ngöøng, do ñoù vieäc keùo daøi thôøi gian leân men khoâng ñem laïi hieäu quaû. Ngöôïc laïi, theo thôøi gian löôïng vi sinh vaät taïp nhieãm taêng daàn, chuùng coù theå söû duïng ethanol nhö moät nguoàn chaát dinh döôõng, laøm giaûm noàng ñoä röôïu trong dòch giaám sau cuøng. Do ñoù khi thôøi gian leân men loûng laø 2 ngaøy hoaëc 4, 5, 6 ngaøy ñeàu cho noàng ñoä trong dòch giaám thaáp hôn khi leân men loûng 3 ngaøy. Hình 4.15: AÛnh höôûng cuûa thôøi gian leân men loûng ñeán haøm löôïng tinh boät soùt vaø ñöôøng soùt. Moät vaán ñeà khaùc chuùng toâi nhaän thaáy laø chaát löôïng caûm quan dòch giaám giaûm daàn theo thôøi gian leân men. Nhö ñaõ giaûi thích do coù söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa heä vi sinh vaät taïp, taïo ra nhöõng hôïp chaát muøi khoù chòu, ñaëc bieät laø muøi chua do haøm löôïng lôùn caùc acid höõu cô ñaõ laøm giaûm chaát löôïng röôïu thaønh phaåm. Vì nhöõng lyù do naøy chuùng toâi quyeát ñònh choïn thôøi gian leân men aåm toái öu cho quaù trình saûn xuaát röôïu gaïo theo phöông phaùp truyeàn thoáng laø 3 ngaøy vaø thôøi gian leân men loûng toái öu cuõng laø 3 ngaøy. Chuùng toâi seõ duøng caùc thoâng soá naøy ñeå tieán haønh khaûo saùt yeáu toá tieáp theo. KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA SO2 CHO VAØO SAU LEÂN MEN AÅM Trong thí nghieäm naøy, ñeå nghieân cöùu vieäc söû duïng SO2 xöû lyù dòch sau leân men aåm, chuùng toâi tieán haønh leân men röôïu vôùi caùc thoâng soá coá ñònh nhö sau: Khoái löôïng gaïo: 100 gam. Löôïng nöôùc duøng laøm chín gaïo: 200ml. Löôïng cheá phaåm baùnh men söû duïng: 4g. Nhieät ñoä leân men: nhieät ñoä thöôøng. Thôøi gian leân men aåm: 3 ngaøy. Thôøi gian leân men loûng: 2 ngaøy. Sau leân men aåm, duøng 50ml nöôùc ñöôïc xöû lyù SO2 vôùi caùc noàng ñoä khaùc nhau: 0, 1, 2, 3 0/000 khoái löôïng treân theå tích dòch giaám cho vaøo dòch. Quan saùt söï taïp nhieãm vi sinh vaät döôùi kính hieån vi sau 1 giôø, 2 giôø vaø 3 giôø. Keát quaû nhö sau: Baûng 4.11: Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä SO2 ñeán möùc ñoä taïp nhieãm Noàng ñoä SO2 (0/000) Möùc ñoä taïp nhieãm sau 1 giôø Möùc ñoä taïp nhieãm sau 2 giôø Möùc ñoä taïp nhieãm sau 3 giôø 0 + + + + + + + + + 1 + + + + + + 2 + + + – 3 – – – Ghi chuù möùc ñoä taïp nhieãm (quan saùt treân kính hieån vi sau 3 giôø xöû lyù SO2): + + + : cao + +: trung bình + : thaáp – : khoâng taïp nhieãm Chuùng toâi nhaän thaáy: khi khoâng xöû lyù SO2, soá löôïng vi sinh vaät taïp raát nhieàu sau 3 giôø quan saùt. Khi xöû lyù vôùi noàng ñoä SO2 10/000 soá löôïng vi sinh vaät taïp nhieãm coù giaûm theo thôøi gian nhöng vaãn coøn nhieàu. Vôùi noàng ñoä SO2 20/000 soá löôïng vi sinh vaät taïp nhieãm giaûm haún, do ñoù laøm taêng hieäu suaát leân men. Tuy nhieân, neáu thôøi gian xöû lyù quaù laâu (3giôø), thì khoâng nhöõng vi sinh vaät taïp khoâng coøn maø soá löôïng naám men cuõng giaûm. Ñeán noàng ñoä SO2 30/000 thì khoâng nhöõng vi sinh vaät taïp nhieãm bò tieâu dieät hoaøn maø caû naám men cuõng bò öùc cheá ngay ôû giôø xöû lyù ñaàu tieân. Vôùi keát quaû quan saùt treân, chuùng toâi sau ñoù tieán haønh caát röôïu ñoái vôùi nhöõng maãu ñöôïc xöû lyù SO2 sau 2 giôø vaø xaùc ñònh ñoä röôïu baèng phöông phaùp tæ troïng. Keát quaû thí nghieäm thu ñöôïc theå hieän trong baûng: Baûng 4.12: Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä SO2 sau 2 giôø xöû lyù ñeán quaù trình leân men röôïu Noàng ñoä SO2 (0/000) Noàng ñoä röôïu (%V) Hieäu suaát leân men (%) 0 9.51 76.12 1 9.92 77.73 2 10.67 79.77 3 9.26 70.49 Hình 4.16: Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä SO2 ñeán quaù trình hieäu suaát leân men Keát quaû phaân tích cho thaáy, maãu ñöôïc xöû lyù SO2 vôùi noàng ñoä 20/000 cho hieäu suaát leân men cao nhaát (hình 4.16). Nhö vaäy chöùng toû, vieäc xöû lí dòch sau leân men aåm baèng SO2 vôùi noàng ñoä 20/000 laø coù hieäu quaû. SO2 ñaõ coù taùc duïng haïn cheá löôïng vi sinh vaät taïp nhieãm khoâng mong muoán vaøo quaù trình saûn xuaát, trong khi naám men vaãn coøn hoaït ñoäng toát, chuyeån hoùa trieät ñeå ñöôøng thaønh röôïu, giaûm löôïng röôïu toån thaát, laøm taêng hieäu suaát leân men. Tuy nhieân vôùi noàâng ñoä SO2 cao hôn, hieäu suaát leân men giaûm ñoàng thôøi höông vò cuõng keùm ñi: vôùi noàng ñoä 30/000, hieäu suaát leân men coøn thaáp hôn caû maãu khoâng xöû lyù SO2. Nguyeân nhaân laø do haøm löôïng SO2 quaù cao ñaõ öùc cheá leân caû heä naám men cuûa baùnh men. Do ñoù chuùng toâi quyeát ñònh choïn noàng ñoä xöû lyù SO2 thích hôïp laø 20/000 vôùi thôøi gian xöû lyù laø 2 giôø. Sau 2 giôø, dòch leân men aåm seõ ñöôïc pha loaõng ñeå tieán haønhleân men loûng. Vôùi nhöõng thoâng soá ñaõ löïa choïn qua caùc thí nghieäm, chuùng toâi tieán haønh saûn xuaát thöû röôïu töø baùnh men vaø töø caùc chuûng vi sinh vaät thuaàn khieát phaân laäp ñöôïc. TIEÁN HAØNH SAÛN XUAÁT THÖÛ RÖÔÏU TÖØ BAÙNH MEN VAØ CAÙC CHUÛNG VI SINH VAÄT PHAÂN LAÄP ÑÖÔÏC Chuùng toâi tieán haønh leân men röôïu vôùi caùc thoâng soá nhö sau: Khoái löôïng gaïo: 1 kg. Löôïng nöôùc duøng laøm chín gaïo: 2lít. Löôïng cheá phaåm baùnh men söû duïng: 40g. Löôïng nöôùc duøng pha loaõng dòch sau leân men aåm: 1 lít. Nhieät ñoä leân men: nhieät ñoä thöôøng. Thôøi gian leân men aåm: 3 ngaøy. Thôøi gian leân men loûng: 3 ngaøy. Dòch sau leân men aåm ñöôïc xöû lyù SO2 vôùi noàng ñoä xöû lyù: 20/000 khoái löôïng treân theå tích dòch giaám. Thôøi gian xöû lyù: 2 giôø. Chuùng toâi leân men röôïu vôùi 3 maãu: Maãu 1 (M1): leân men röôïu töø maãu baùnh men treân thò tröôøng ñaõ choïn. Maãu 2 (M2): leân men röôïu duøng baùnh men saûn xuaát töø caùc chuûng gioáng phaân laäp ñöôïc vaø chuûng moác cuûa phoøng thí nghieäm. Maãu 3 (M3): leân men röôïu töø chuûng vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc vaø chuûng moác cuûa phoøng thí nghieäm. Tæ leä gioáng caáy: theo ñuùng tyû leä vi sinh vaät coù trong baùnh men chuùng toâi saûn xuaát (baùnh men söû duïng trong maãu M2). Caùc vò thuoác baéc cuõng ñöôïc cho vaøo vôùi tæ leä töông öùng (1.6g). Röôïu sau khi leân men ñöôïc chöng caát vaø xaùc ñònh ñoä röôïu baèng phöông phaùp tæ troïng. Keát quaû thí nghieäm thu ñöôïc theå hieän trong baûng 4.13 döôùi ñaây. Baûng 4.13: So saùnh chaát löôïng baùnh men saûn xuaát, baùnh men thò tröôøng vaø phöông phaùp saûn xuaát tröïc tieáp baèng chuûng vi sinh vaät thuaàn khieát Maãu Ñaùnh giaù caûm quan röôïu sau chöng caát Ñoä röôïu (%V) Hieäu suaát leân men (%) M1 Muøi thôm cuûa caùc vò thuoác baéc yeáu 9.26 74.14 M2 Thôm caùc vò thuoác baéc roõ reät 10.01 80.03 M3 Coù muøi thôm caùc vò thuoác baéc nhöng yeáu 9.84 79.79 Keát quaû cho thaáy, baùnh men thuoác baéc do chuùng toâi saûn xuaát, coù boå sung chuûng moác cuûa phoøng thí nghieäm seõ laøm taêng hieäu suaát leân men so vôùi baùnh men treân thò tröôøng (baûng 4.13 vaø hình 4.17). Vôùi maãu M3, duøng tröïc tieáp caùc chuûng vi sinh vaät vaø tieán haønh leân men trong ñieàu kieän voâ truøng (thay vì saûn xuaát baùnh men), chuùng toâi thu ñöôïc röôïu coù noàng ñoä vaø hieäu suaát leân men töông ñöông vôùi maãu M2. Tuy nhieân, nhö ñaõ ñeà caäp, yeâu caàu veà ñieàu kieän leân men voâ truøng nghieâm ngaët laø moät khoù khaên lôùn vaø toán chi phí. Trong khi ñoù, röôïu thu ñöôïc ôû maãu M2 laïi coù höông vò toát hôn. Vì vaäy, chuùng toâi öu tieân choïn maãu baùnh men M2. Hình 4.17: So saùnh hieäu suaát leân men cuûa 3 maãu M1, M2 vaø M2 XAÂY DÖÏNG QUI TRÌNH SAÛN XUAÁT RÖÔÏU GAÏO TÖØ BAÙNH MEN THUOÁC BAÉC PHOØNG THÍ NGHIEÄM Sau khi tieán haønh saûn xuaát thöû röôïu töø baùnh men thuoác baécKeát quaû sau cuøng, chuùng toâi choïn ñöôïc qui trình saûn xuaát nhö sau (hình 4.18): Thôøi gian: 3 ngaøy Nhieät ñoäthöôøng Thôøi gian: 3 ngaøy Nhieät ñoäthöôøng Leân men loûng Gaïo Laøm saïch Leân men aåm Naáu Troän men Laøm nguoäi Nöôùc Chöng caát Röôïu traéng Hoaøn thieän Tæ leä 3:1 Baùnh men thuoác baéc PTN Tæ leä 4% SO2 Noàng ñoä:2o/ooo Xöû lyù SO2 Nöôùc Tæ leä 1:1 Thôøi gian: 2 giôø Nghieàn mòn Hình 4.18: Qui trình saûn xuaát röôïu gaïo duøng baùnh men thuoác baéc CHÖÔNG 5 - KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ KEÁT LUAÄN Qua quaù trình nghieân cöùu thöïc nghieäm, chuùng toâi ñaõ thu ñöôïc nhöõng keát quaû nhö sau: Phaân laäp vaø löïa choïn ñöôïc 4 chuûng vi sinh vaät ñeå tieán haønh saûn xuaát baùnh men: VK1, VK2, NM1 vaø NM3. Saûn xuaát ñöôïc baùnh men thuoác baéc cho chaát löôïng toát töø 5 chuûng treân, ñoàng thôøi coù boå sung theâm chuûng moác Mucor cuûa phoøng thí nghieäm. Tæ leä phoái cheá cho 100g baùnh men nhö sau: VK1 + VK2: 3.107 teá baøo. NM1 + NM3: 6.107 teá baøo. Naám moác: 6.106 teá baøo. Tæ leä caùc vò thuoác baéc: 4%. Tìm ra ñöôïc qui trình leân men röôïu töø baùnh men thuoác baéc ñaõ saûn xuaát vôùi caùc thoâng soá nhö sau: + Tæ leä nöôùc duøng laøm chín gaïo: 3:1 so vôùi khoái löôïng gaïo. + Tæ leä cheá phaåm baùnh men g: 4% khoái löôïng so vôùi khoái löôïng gaïo + Tæ leä nöôùc duøng pha loaõng dòch sau leân men aåm: 1:1 so vôùi khoái löôïng gaïo. + Nhieät ñoä leân men: nhieät ñoä thöôøng. + Thôøi gian leân men aåm: 3 ngaøy. + Thôøi gian leân men loûng: 3 ngaøy. + Dòch sau leân men aåm ñöôïc xöû lyù SO2 vôùi noàng ñoä xöû lyù: 20/000 khoái löôïng treân theå tích dòch giaám. Thôøi gian xöû lyù: 2 giôø. Qua quaù trình nghieân cöùu thöïc nghieäm chuùng toâi cuõng nhaän thaáy, so vôùi qui trình saûn xuaát röôïu töø caùc chuûng vi sinh vaät thuaàn khieát theo caùc phöông phaùp coâng nghieäp, thì vieäc saûn xuaát röôïu töø baùnh men thuoác baéc theo phöông phaùp truyeàn thoáng coù nhöõng öu ñieåm sau: Quy trình ñôn giaûn, deã laøm, khoâng ñoøi hoûi kó thuaät hay trình ñoä tay ngheà cao. Thieát bò ñôn giaûn. Vieäc baûo quaûn, vaän chuyeån baùnh men trong quaù trình saûn xuaát cuõng raát tieän lôïi vaø deã daøng. Röôïu thu ñöôïc vöøa coù ñoä röôïu cao vöøa coù höông vò thôm ngon, ñaëc tröng maø röôïu saûn xuaát trong coâng nghieäp khoâng coù ñöôïc. Tuy nhieân, vì saûn xuaát vaø cöng caát theo phöông phaùp thuû coâng neân röôïu thu ñöôïc khoâng trong suoát hoaøn toaøn vaø coøn nhieàu taïp chaát trong röôïu thaønh phaåm. Röôïu thu ñöôïc ôû ñaây chæ laø röôïu thoâ, coù theå duøng uoáng tröïc tieáp ñöôïc, hoaëc coù theå duøng cho nhieàu muïc ñích khaùc (nhö ñaõ trình baøy ôû 2.3.1). KIEÁN NGHÒ Vì thôøi gian coù haïn neân chuùng toâi chöa tieán haønh toái öu hoùa qui trình saûn xuaát röôïu töø baùnh men chuùng toâi saûn xuaát. Do ñoù höôùng nghieân cöùu tieáp theo chuùng toâi ñeà nghò laø: khaûo saùt theâm caùc yeáu toá aûnh höôûng khaùc ñeán quaù trình leân men röôïu (söï boå sung theâm caùc chaát dinh döôõng khaùc vaøo quaù trình leân men) ñoàng thôøi toái öu hoùa qui trình saûn xuaát röôïu ñeå coù theå öùng duïng vaøo thöïc tieãn saûn xuaát. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Nguyeãn Laân Duõng, Vi sinh vaät hoïc, NXB giaùo duïc, 2002. Buøi Huy Ñaùp, Caây luùa Vieät Nam, NXB KH-KT, Tp.HCM, 1980. Traàn Vaên Ñaït, Tieán trình phaùt trieån saûn xuaát luùa gaïo taïi Vieät Nam töø thôøi nguyeân thuûy ñeán hieän ñaïi, NXB Noâng Nghieäp, 2002. Vuõ Coâng Haäu, Troàng caây aên quaû ôû Vieät Nam, NXB Noâng nghieäp, Haø Noäi, 1983. Nguyeãn Vaên Hieäu, Nghieân cöùu caùc vò thuoác baéc vaø thuoác nam trong cheá phaåm baùnh men coå truyeàn, Taïp chí noâng nghieäp vaø coâng nghieäp thöïc phaåm, 343 (1-1991). Ñoã Taát Lôïi, Nhöõng caây thuoác vaø vò thuoác Vieät Nam, NXB khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi, 2001. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä vi sinh, Taäp 2 – VSV hoïc coâng nghieäp, NXB Ñaïi hoïc quoác gia, Tp.HCM, 2002. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä vi sinh, Taäp 3 – Thöïc phaåm leân men truyeàn thoáng, NXB Ñaïi hoïc quoác gia, Tp.HCM, 2002. Leâ Thanh Mai, Caùc phöông phaùp phaân tích ngaønh coâng ngheä leân men, NXB khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi, 2005. Leâ Vaên Vieät Maãn, Coâng ngheä saûn xuaát thöùc uoáng, NXB Ñaïi hoïc quoác gia, Tp.HCM, 2006. Leâ Vaên Vieät Maãn, Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm, NXB Ñaïi hoïc quoác gia, Tp.HCM, 2006. Löông Ñöùc Phaåm, Naám men coâng nghieäp, NXB khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Tp.HCM, 2005. Phan Huy Thaønh, Nghieân cöùu moät soá daïng saûn phaåm côm aên lieàn, Luaän vaên thaïc só – Ñaïi hoïc Baùch Khoa Tp.HCM, 2005. Nguyeãn Ñình Thöôûng, Coâng ngheä saûn xuaát vaø kieåm tra coàn etylic, NXB khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi, 2002. Leâ Ngoïc Tuù, Hoùa sinh coâng nghieäp, NXB khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi, 1998. A.C.Lee & Y.Fujio, Microflora of banh men, a fermentation starter from Vietnam, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 15, 1999, p. 51-55. A.H.Rose, Alcoholic beverages, V.1, Acedamic Press, London, New York, San Francisco, 1977. Gerard J.Tortora, Microbiology, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Carlifornia, 1997. M.Kozaki, P. Lisdiyanti, , Rice wine in Southeast Asia countries: Thailand, Laos, Vietnam and Myanmar, Tokyo University of Agriculture, Japan, 2002. M.U.Oriji, The use of starter culture to produce ‘pito’, a Nigerian alcoholic beverage, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 19, 2003, p 736-773. N.T.P.Dung, Characteristic of some traditional Vietnamese starch based rice wine fermentation starters (men), World Journal of Microbiology & Biotechnology, ISSN 1573-0972, 2004, p. 51-55. N.T.P.Dung, Development of defined mixed-culture fungal fermantation starter granulate for controlled production of rice wine, Innovative Food Science & Emerging Technologies, Vol 6, Issue 4, 2005, p.429 – 441. N.T.P.Dung, Funtionality of selected strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine, Food Microbiology, Vol 23, 2006, p.331 – 340.