Đề tài Các phương pháp định lượng protein

Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 1 Muïc luïc LÔØI NOÙI ÑAÀU ............................................................................................................... 3 I. TOÅNG QUAN: ....................................................................................................... 4 1. CAÁU TAÏO PHAÂN TÖÛ PROTEIN: ............................................................................ 4 1.1. Caáu truùc baäc 1: ........................................................................................ 4 1.2. Caáu truùc baäc 2: ........................................................................................ 5 1.3. Caáu truùc baäc 3: ........................................................................................ 6 1.4. Caáu truùc baäc 4: ........................................................................................ 6 II. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP ÑÒNH LÖÔÏNG PROTEIN ........................................... 7 1. ÑÒNH LÖÔÏNG NITÔ TOÅNG SOÁ BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP KJELDAHL ........................... 7 1.1. Ñònh löôïng Nitô toång soá theo phöông phaùp Kjeldahl ............................... 7 1.2. Ñònh löôïng nitô phi Protein: .................................................................. 12 1.3. Ñònh löôïng Protein trong nguyeân lieäu: .................................................. 13 2. ÑÒNH LÖÔÏNG PROTEIN BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP SO MAØU ...................................... 13 2.1. Ñònh löôïng Protein theo phöông phaùp Biure. ........................................ 13 2.2. Ñònh löôïng Protein baèng phöông phaùp Lowry (Biure caûi tieán): ............ 16 2.3. Ñònh löôïng Protein theo phöông phaùp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G - 250): .................................................................................................... 19 3. ÑÒNH LÖÔÏNG PROTEIN BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP DUØNG BICINCHONINIC ACID (BCA): ................................................................................................................... 22 3.1. Nguyeân taéc: ............................................................................................ 22 3.2. Caùch tieán haønh: ..................................................................................... 22 3.3. Tính keát quaû: .......................................................................................... 22 3.4. Đoä nhaïy vaø khaû naêng öùng duïng: ............................................................ 22 4. ÑÒNH LÖÔÏNG PROTEIN BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP QUANG PHOÅ ................................ 23 4.1. Nguyeân taéc: ............................................................................................ 23 Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 2 4.2. Caùch tieán haønh: ..................................................................................... 23 4.3. Tính keát quaû: .......................................................................................... 24 4.4. Ñoä nhaïy vaø khaû naêng öùng duïng: ............................................................ 24 5. PHÖÔNG PHAÙP HUYØNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): ........................ 25 5.1. Nguyeân taéc: ............................................................................................ 25 5.2. Ñoä nhaïy vaø khaû naêng öùng duïng: ............................................................ 25 6. PHÖÔNG PHAÙP ÑÒNH LÖÔÏNG AMONIAC ............................................................ 25 6.1. Nguyeân taéc: ............................................................................................ 25 6.2. Caùch tieán haønh: ..................................................................................... 26 6.3. Tính keát quaû: .......................................................................................... 27 6.4. Khaû naêng öùng duïng: .............................................................................. 27 7. PHÖÔNG PHAÙP DUMAS: .................................................................................. 27 7.1. Nguyeân taéc: ............................................................................................ 28 7.2. Thieát bò: ................................................................................................. 28 7.3. Caùch tieán haønh: ..................................................................................... 29 8. PHÖÔNG PHAÙP PRM (PYROGALLOL RED MOLYBDATE): ................................ 31 8.1. Nguyeân taéc: ............................................................................................ 31 8.2. Duïng cuï: ................................................................................................ 32 8.3. Tieán haønh:.............................................................................................. 32 III. SO SAÙNH MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP ÑÒNH LÖÔÏNG PROTEIN ................ 33 1. SO SAÙNH MAÃU BIA COÙ VAØ KHOÂNG QUA THAÅM TÍCH ......................................... 33 1. KEÁT LUAÄN ...................................................................................................... 33 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO .......................................................................................... 34 Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 3 LÔØØI NOÙÙI ÑAÀÀU Protein laø thaønh phaàn khoâng theå thieáu cuûa taát caû caùc cô theå sinh vaät, noù ñöôïc caáu taïo töø nhieàu nguyeân toá: C, H, O, N… Chuû yeáu bao goàm caùc L-axit amin keát hôïp vôùi nhau baèng caùc lieân keát peptid. Tæ leä phaàn traêm khoái löôïng caùc nguyeân toá naøy trong phaân töû Protein nhö sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoaøi caùc nguyeân toá treân moät soá protein coøn chöùa moät löôïng raát ít caùc nguyeân toá khaùc nhö P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… (Saùch Hoùa sinh coâng nghieäp- Leâ Ngoïc Tuù- NXB khoa hoïc vaø kó thuaät HN, trang 94) Protein coù ñaëc tính ñaëc thuø cao cho töøng loaøi, töøng cô quan moâ cuûa cuøng moät caù theå. Protein raát ña daïng veà caáu truùc vaø chöùc naêng cuûa cô theå soáng. Trong moâ vaø teá baøo cuûa caùc sinh vaät cuõng nhö trong thaønh phaàn Protein (chaát ñaïm) toàn taïi ôû nhieàu daïng khaùc nhau nhö: ñaïm höõu cô, ñaïm voâ cô, ñaïm Protein (comoniac hoaëc muoái amonium). Ñeå xaùc ñònh ñöôïc chuùng hieän nay coù nhieàu phöông phaùp tuøy theo ñoái töôïng khaûo xaùc vaø tuøy theo chieàu höôùng muoán khaûo xaùc, ngöôøi ta aùp duïng töøng phöông phaùp thích hôïp coù theå truïc tieáp hoaëc giaùn tieáp. Seminar naøy seõ trình baøy moät soá phöông phaùp duøng ñeå ñònh löôïng Protein, cuøng vôùi moät soá löu yù khi söû duïng töøng phöông phaùp cuï theå. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 4 I. Toåång quan: 1. Caááu taïïo phaâân töûû Protein: Taát caû caùc protein ñeàu chöùa caùc nguyeân toá C, O, N, H, moät soá coøn chöùa moät löôïng nhoû S. Tæ leä phaàn traêm khoái löông caùc nguyeân toá naøy trong phaân töû protein nhö sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoaøi caùc nguyeân toá treân moät soá protein coøn chöùa moät löôïng raát ít caùc nguyeân toá khaùc nhö P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… Protein coù thaønh phaàn phöùc taïp vaø coù nhieàu baät caáu truùc khaùc nhau, noåi baät caáu truùc coù caáu truùc vaø chöùc naêng khaùc nhau vaø giöõ vai troø raát quan troïng ñoái vôùi taát caû caùc cô theå sinh vaät. Caáu truùc protein ñöôïc chia thaønh 4 baäc: 1, 2, 3, 4 1.1. Caááu truùùc baääc 1: Laø trình töï saép xeáp caùc goác acid amin trong maïch polypeptide. Caáu truùc naøy ñöôïc giöõ vöõng nhôø lieân keát peptide (lieân keát ñoàng hoaù trò) O O + H3N – CH – C + + H3N – CH – C R1 O - R2 O O O + H3N – CH – C – NH – CH – C + H2O R1 R2 O – Lieân keát peptide H H H O H H H O H – HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – R1 O R2 H R3 O R4 H R5 Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 5 1.2. Caááu truùùc baääc 2: Laø töông taùc khoâng gian giöõa caùc goác acid amin ôû gaàn nhau trong maïch polypeptide. Noùi caùch khaùc noù laø khoâng gian cuïc boä cuûa töøng phaàn trong maïch polypeptide. Caáu truùc ñöôïc laøm beàn chuû yeáu nhôø lieân keát Hidro ñöôïc taïo thaønh giöõa caùc lieân keát peptide ôû gaàn nhau caùch nhau khoaûng xaùc ñònh. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 6 1.3. Caááu truùùc baääc 3: Töông taùc khoâng gian giöõa caùc goác acid amin ôû xa nhau trong maïch polypeptide, laø daïng cuoän laïi trong khoâng gian cuûa maïch polypeptide (hình daïng chung cuûa chuoãi polypeptide). Trong nhieàu protein hình caàu coù chöùa caùc goác Cys, söï taïo thaønh caùc lieân keát disunfua giöõa caùc goác Cys ôû xa nhau trong maïch polypeptide, laøm cho maïch bò cuoän laïi ñaùng keå. Caùc lieân keát khaùc nhö lieân keát Vandecvan,lieân keát tónh ñieän, lieân keát hidro giöõa caùc maïch beân cuûa caùc goác acid amin … ñeàu tham gia laøm beàn caáu truùc baäc 3. Keát quaû nguyeân cöùu nhieàu protein cho thaáy chính trình töï saép xeáp caùc goác acid amin trong chuoãi polypeptide chöùa nhöõng thoâng tin caàn thieát ñeå hình thaønh caáu truùc baäc 3. 1.4. Caááu truùùc baääc 4: Ñoái vôùi caùc phaân töû protein bao goàm 2 hay nhieàu chuoãi polypeptide hình caàu, töông taùc khoâng gian giöõa caùc chuoãi trong phaân töû goïi laø caáu truùc baäc 4. Moãi chuoãi Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 7 polypeptide goïi laø”phaàn döôùi ñôn vò ” chuùng gaén vôùi nhau nhôø lieân keát hidro, löïc Vandecvan giöõa caùc nhoùm phaân boá treân beà maët cuûa caùc “phaàn döôùi ñôn vò”. II. Caùùc phöông phaùùp ñònh löôïïng protein 1. Ñònh löôïïng nitô toåång soáá baèèng phöông phaùùp Kjeldahl Theo nguyeân taéc Protein ñöôïc ñònh löôïng baèng caùch xaùc ñònh löôïng nitô toång soá vaø keát quaû nhaân vôùi 6.25, nhö theá nghóa laø coi Protein luoân chöùa 16% laø nitô (vì trong phaân töû Protein thì haøm löôïng nitô töông ñoái cao vaø khaù oån ñònh khoaûng 15 – 17%). Trong thöïc teá beân caïnh Protein thaät coøn coù caùc chaát höõu cô khaùc coù chöùa nitô nhö: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric….Caùc chaát naøy goïi laø nitô phi Protein. Vì vaäy trong tröôøng hôïp naøy caàn phaûi xaùc ñònh nitô toång soá vaø nitô phi Protein sau ñoù xaùc ñònh nitô Protein. Nitô toång soá = Nitô protein + Nitô phi protein  Nitô protein = Nitô toång soá – Nitô phi protein 1.1. Ñònh löôïïng Nitô toåång soáá theo phöông phaùùp Kjeldahl Nguyeâân taééc: Quaù trình goàm 2 giai ñoaïn:  Giai ñoaïn voâ cô hoùa: (quaù trình tieán haønh trong tuû hotte) Ôû nhieät ñoä cao vaø döôùi taùc duïng cuûa H2SO4 thì caùc hôïp chaát coù chöùa nitô seõ bò phaân huûy vaø bò oxi hoùa ñeán CO2 vaø H2O , coøn nitô chuyeån thaønh amoniac (NH3) roài keát hôïp vôùi H2SO4 taïo thaønh muoái amoni sulphate  Giai ñoaïn caát ñaïm: (quaù trình xaûy ra trong maùy caát ñaïm) Sau khi voâ cô hoùa ta ñuoåi NH3 ra khoûi dunh dòch baèng NaOH. (NH4)2SO4 + NaOH  Na2SO4 + NH3 + H2O Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 8 Löôïng NH3 sinh ra ñöôïc loâi cuoán baèng maùy Parmas vaø ñöôïc daãn ñeán moät erlen coù chöùa moät löôïng thöøa H2SO4 ñaõ bieát chính xaùc noàng ñoä. Luùc naøy NH3 seõ taùc duïng vôùi H2SO4 chuyeån thaønh (NH4)2SO4 . NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 + H2SO4 dö Sau ñoù ñi chuaån ñoä löôïng H2SO4 coøn laïi baèng dung dòch NaOH qua ñoù tính ñöôïc löôïng nitô coù trong maãu. NaOH + H2SO4  Na2SO4 + H2O Caùùch tieáán haøønh: Nguyeân lieäu, hoùa chaát, thieát bò:  Nguyeân lieäu: caùc maãu caàn xaùc ñònh haøm löôïng Protein, neáu nguyeân lieäu khoâ caàn ñöôïc saáy khoâ tuyeät ñoái (105 o C, trong 30 phuùt).  Hoùa chaát: hoãn hôïp xuùc taùc K2SO4/CuSO4 (9:1), H2SO4 ñaëc, H2SO4 0,01N, H3PO3 2%, NaOH 0,01N, nöôùc caát voâ ñaïm , coàn 96 o , acid tricloacetic (TCA), thuoác thöû ñoû metyl.  Thieát bò: beáp ñun, maùy caát ñaïm Parmas Warger. (chen hình vaøo) Quaù trình ñöôïc thöïc hieän qua caùc böôùc.  Böôùc 1: voâ cô hoùa maãu (ñöôïc tieán haønh trong töû hotte ñeå traùnh khí ñoäc SO2, CO2). Neáu maãu khoâ thì caân 0,1 -0,3g maãu roài duøng moät oáng giaáy (khoâng tro) cuoän troøn cho maãu caån thaän vaøo taän ñaùy bình Kjeldahl, theâm vaøo ñoù vaøi gioït nöôùc caát voâ ñaïm ñeå thaám öôùc boät. Neáu maãu laø chaát loûng thì duøng pipet laáy 2 – 5 ml,neáu nöôùc quaû hoäp thì neân laáy 10 – 20ml. tieáp tuïc cho 0,5g hoãn hôïp xuùc taùcK2SO4/CuSO4 (hoaëc selen, hay H2O2 30%, hay HCLO4 70%) vaø 10ml H2SO4 ñaëc. Ñeå bình Kjeldahl treân beáp ñieän ñaët trong tuû hotte vaø ñun cho ñeán khi dung dòch trôû neân trong suoát vaø coù maøu xanh da trôøi nhaït laø ñöôïc. Laáy ra ñeå nguoäi. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 9 Chuyeån sang bình ñònh möùc 100ml, traùng bình Kjeldahl nhieàu laàn baèng nöôùc caát voâ ñaïm vaø ñònh möùc ñeán vaïch ñònh möùc.  Böôùc 2: Caát ñaïm Sô ñoà maùy caát ñaïm Röûa maùy: cho vaøo bình A khoaûng 3/2 theå tích bình, ñun soâi bình vaø môû nöôùc vaøo oáng laøm laïnh D, caû 3 khoùa ñieàu ñoùng, sau ñoù cho leân phieåu C moät ít nöôùc caát (khoaûng 10 ml) vaø cho chaûy xuoáng bình B roài khoùa van 2 laïi. Hôi nöôùc cuûa bình A seõ töø töø qua erlen E, cöù ñeå nhö vaäy cho ñeán khi ôû E coù khoaûng 5ml nöôùc. Ngaét ñieän ôû bình A, hôi nöôùc trong maùy seõ nguoäi laïi,laøm giaûm aùp xuaát ôû A vaø B do ñoù nöôùc trong bình B seõ ruùt qua G. khi nöôùc ruùt heát, theâm nöôùc vaøo phieãu C vaø môû van 2 cho nöôùc chaûy vaøo B, keá ñoù nöôùc seõ ruùt qua G. ta coù theå laøm nhö vaäy vaøi laàn. Neáu nöôùc ôû bình G ñaày thì môû van 3 cho nöôùc ruùt ñi. Khoùa van 3 vaø 2 laïi. Caát ñaïm: laáy vaøo erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dòch H2SO4 0,01N vaø 3 gioït thuoác thöû meâtyl ñoû, dung dòch coù maøu tím ñoû. Ñaët bình höùng sao cho ñaàu muùt cuûa oángsinh haøn D ngaäp trong dung dòch H2SO4 0,01N cuûa erlen E Huùt 10ml dung dòch ñaõ voâ cô hoùa vaø ñaõ pha loaõng cho leân phieãu C. ñun soâi bình A, môû van 2 ñeå dung dòch naøy chaûy töø töø xuoáng B, ñoùng van 2 laïi. Ñoå nöôùc caát vaøo vaø traùng C, cuõng môû van 2 thaät nheï nhaøng ñeå nöôùc chaûy töø töø xuoáng B töøng Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 10 gioït cho ñeán khi möïc nöôùc trong C xuoáng gaàn saùt tôùi van 2 thì khoùa van 2 laïi. Röûa C moät laàn nöõa vôùi thao taùc töông töï nhö treân. Theâm vaøo phieãu C 10ml NaOH ñaäm ñaëc. Môû van 2 töø töø ñeå cho NaOH chaûy xuoáng C töøng gioït moät. Neáu nöôùc trong B traøo maïnh quaù thì khoùa van 2 laïi, roài tieáp tuïc cho chaûy töø töø ñeán khi NaOH chaûy gaàn heát xuoáng B. Traùng phieãu C hai laàn vôùi moät ít nöôùc caát, chæ cho nöôùc chaûy xuoáng gaàn saùt tôùi keïp 2 maø thoâi. Quaù trình keát thuùc sau khoaûng 25 phuùt sau ñoù haï erlen E xuoáng sao cho ñaàu muùt cuûa oáng sinh haøn naèm rong khoâng khí, ñun tieáp 3 phuùt nöõa. Röûa ñaàu nhoïn cuûa oáng laøm laïnh D baèng moät tia nöôùc cuûa bình xòt. Laáy erlen E ra roài röûa laïi maùy vaøi laàn nhö treân roài chuaån ñoä löôïng H2SO4 thöøa baèng dung dòch chuaån NaOH 0,01N.  Böôùc 3: chuaån ñoä Löôïng H2SO4 coøn dö trong bình E ñöôïc chuaån ñoä baèng NaOH 0,01N. quaù trình chuaån ñoä keát thuùc khi dung dòch chuyeån töø ñoû sang maøu nhaït. Xaùc ñònh heä soá hieäu chænh x: laáy 3 erlen cho vaøo moãi erlen 20ml H2SO4 0,01N vaø vaøi gioït ñoû metyl. Sau ñoù chuaån ñoä bôûi NaOH 0,01N laáy giaù trò trung bình cuûa 3 laàn chuaån ñoä Tính keáát quaûû: Heä soá hieän chænh x seõ ñöôïc tính theo coâng thöùc sau: x laø tæ soá giöõa theå tích H2SO4 0,01N vaø theå tích NaOH tieâu toán khi chuaån ñoä. Hay laø tæ soá giöõa noàng ñoä thöïc teá vaø noàng ñoä tinh toaùn cuaû NaOH. Haøm löôïng nitô trong maãu ñöôïctinh1 theo coâng thöùc: X=  0 1 * *0,0014*100*100 10* v v x m  Trong ñoù: X: % khoái löôïng nitô trong maãu Vo: soá ml H2SO4 ñem haáp thuï NH3 V1: soá ml NaOH 0,01N tieâu toán khi khi chuaån ñoä H2SO4 thöøa Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 11 m: khoái löôïng maãu ñem voâ cô hoùa 0,0014: löôïng gam nitô öùng vôùi 1ml H2SO4 0,1N Neáu laø maãu loûng: N/l=   41 1000 14* * *10 *o m v v x v  Trong ñoù: Vm laø theå tích maãu *Ghi chuù: Neáu chuaån ñoä tröïc tieáp vôùi heä chuaån H2SO4 – H3BO3 Söû duïng heä chuaån H2SO4 – H3BO3 ñeå xaùc ñònh haøm löôïng nitô tieän lôïi vaø traùnh ñöôïc nhöõng sai soá veà söï thay ñoåi noàng ñoä ñöông löôïng cuûa kieàm hoaëc khoâng khí. Caùch tieán haønh:  Nguyeân lieäu vaø hoùa chaát: H3BO3 2%, thuoác thöû Tarshiro, H2SO4 0,01N, caùc hoùa chaát duøng cho vieäc voâ cô hoùa maãu vaø caát ñaïm. Cho vaøo bình höùng 2ml H3BO3 2%, theâm moät ít nöôùc caát sao cho dd H3BO3 ngaäp ñaàu muùt cuûa oáng sinh haøn. Trong bình höùng, dd H3BO3 töï phaân li: H3BO3  HBO2 + H2O Khi caát ñaïm NH3 bò kieàm ñaåy khoûi (NH4)2SO4 theo heä thoáng sinh haøn vaøo bình höùng, phaûn öùng vôùi HBO2 : NH4OH + HBO2  NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - laø moät bazô maïnh laøm dd cuûa bình höùng chuyeån töø maøu tím ñoû sang maøu xanh laù maï. Löôïng BO2 - ñöôïc taïo thaønh töông ñöông löôïng NH3 bò ñaåy ra trong quaù trình caát ñaïm. Xaùc ñònh löôïng BO2 - baèng caùch ñoä ngöôïc vôùi H2SO4 0,01N. Giai ñoaïn chuaån ñoä keát thuùc khi dung dòch chuyeån töø maøu xanh laù maï sang maøu tím ñoû. BO2 - + H +  HBO2 Tính keát quaû: Haøm löôïng N%(mg N trong 100g maãu) seõ ñöôïc tính theo coâng thöùc sau: Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 12 *0,14 *100 (%) * t m V V N V m  Trong ñoù: Vt – löôïng H2SO4 0,01N ñeå chuaån ñoä BO2 - (ml) V – soá mol dd maãu pha loaõng (100ml). Vm – soá ml dd maãu caát ñaïm. m – troïng löôïng maãu ñem voâ cô hoùa (mg). 0,14 – soá mg N töông ñöông 1ml H2SO4 0,01N. 1.2. Ñònh löôïïng nitô phi Protein: Nguyeâân taééc: Duøng caùc dung moâi thích hôïp ñeå chieát ruùt taát caû caùc daïng nitô phi Protein. Tuy nhieân trong dòch chieát vaãn coøn laãn moät vaøi loaïi Protein. Vì vaäy caàn duøng caùc chaát keát tuûa ñeå taùch rieâng phaàn Protein hoøa tan trong quaù trình chieát ruùt. Keát tuûa Protein coù theå tieán haønh theo nhieàu caùch nhö: Aceton, muoái kim loaïi naëng, acid, thaåm tích ñoái nöôùc … Nhöng thoâng duïng nhaát laø duøng caùc chaát keát tuûa sau: TCA 10 – 20% (acidtricloacetic), Pb(CH3COO)2 10 – 15%, CuSO4 10% trong hoån hoäp vôùi NaOH 10% vôùi tæ leä 1:1. Loïc keát tuûa Protein, röûa keát tuûa nhieàu laàn ta ñöôïc dung dòch phi Protein. Voâ cô hoùa dung dòch, caát ñaïm… töông töï ñònh löôïng nitô toång soá. Caùùch tieáán haøønh: Nguyeân lieäu: caùc maãu caàn ñöôïc xaùc ñònh haøm löôïng phi Protein Hoùa chaát: coàn 70 o vaø caùc chaát caàn cho vieäc ñònh löôïng Protein theo phöông phaùp Kjeldahl. Caân chính xaùc 5 – 10g maãu nguyeân lieäu ñaõ nghieàn nhuyeãn, cho vaøo coái söù hay thuûy tinh, nghieàn laãn vôùi etanol 70 o (tæ leä theå tích : nguyeân lieäu laø 1:4 neáu maãu töôi vaø 1:8 neáu maãu khoâ). Nghieàn trong 20 phuùt, sau ñoù ñeå ngaâm khoaûng 40 – 80 Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 13 phuùt vaø khuaáy lieân tuïc. Loïc taùch baõ hay ly taâm 5000 voøng/phuùt, sau ñoù ñoå phaàn baõ vaøo moät becher 250ml coøn phaàn baõ laáy ra coái chieát laïi baèng coàn 70 o moät laàn nöõa theo tæ leä 1:4 vaø nhieàu laàn baèng nöôùc caát voâ ñaïm cho ñeán khi nöôùc chieát khoâng coøn phaûn öùng vôùi thuoác thöû ninhydrin. Doàn taát caû caùc dòch chieát laïi vaø ñem keát tuûa Protein, sau ñoù ñem loïc trong ñoù caën chöùa nitô Protein, coøn dòch loïc chöùa nitô phi Protein. Ñem voâ cô hoùa dòch loïc vaø tieán haønh xaùc ñònh haøm löôïng ni tô theo phöông phaùp Kjeldahl. 1.3. Ñònh löôïïng Protein trong nguyeâân lieääu: Coù theå tieán haønh theo 2 caùch sau: caùch 1: xaùc ñònh tröïc tieáp Xaùc ñònh haøm löôïng ni tô toång soá theo phöông phaùp Kjeldahl sau ñoù laáy keát quaû nhaân vôùi 6,25. Protein = Nitô Protein * 6,25 Caùch 2: xaùc ñònh giaùn tieáp Nitô toång soá = Nitô Protein + Nitô phi Protein Ta xaùc ñònh nitô toång soá theo phöông phaùp Kjeldahl vaø nitô phi Protein sau ñoù tính nitô Protein. Nitô Protein = Nitô toång soá - Nitô phi Protein  Protein = Nitô Protein * 6,25 2. Ñònh löôïïng Protein baèèng phöông phaùùp so maøøu 2.1. Ñònh löôïïng Protein theo phöông phaùùp Biure. Nguyeâân taééc: Döïa vaøo phaûn öùng taïo maøu giöõa Protein vaø Cu 2+ trong moâi tröôøng kieàm taïo phaûn öùng maøu xanh tím coù ñoä haáp thu cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 540nm Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 14 Hình : Phaûn öùng Biure Cöôøng ñoä maøu cuûa phaûn öùng tæ leä thuaän vôùi löôïng Cu vaø soá löôïng lieân keát peptid trong chuoãi Polypeptid. Caùùch tieáán haøønh: Chuaån bò nguyeân lieäu vaø hoùa chaát: dung dòch Albumin tieâu chuaån 1% Chuaån bò thuoác thöû Biure: Caân chính xaùc 1,5g CuSO4 6g Tartrat Kilium vaø Natrium 500ml nöôùc caát Cho vaøo bình laéc cho tan hoaøn toaøn vaø ñònh möùc ñeán 1000ml Laäp ñoà thò chuaån: Laáy 6 oáng nghieäm ñaùnh soá töø 1 ñeán 6 vaø cho vaøo ñoù caùc chaát theo baûng sau: Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 15 STT Protein1%(ml) H2O(ml) Noàng ñoä Protein (mg/ml) Thuoác thöû Biure (ml) OD 1 0,0 1,0 0 5 2 0,2 0,8 2 5 3 0,4 0,6 4 5 4 0,6 0,4 6 5 5 0,8 0,2 8 5 6 1,0 0,0 10 5 Baûng 3: laäp ñoà thò chuaån noàng ñoä Protein Laéc ñeàu caùc oáng nghieäm vaø ñeå yeân trong 30 phuùt ôû nhieät ñoä phoøng. Ñem ño ñoä haáp thu cuûa caùc oáng ôû böôùc soùng 540nm vaø ghi nhaän maät ñoä quang. Chuaån bò dung dòch nghieân cöùu. Cho vaøo oáng nghieäm 1ml dung dòch nghieân cöùu vaø 4ml thuoác thöû Biure laéc ñeàu vaø ñeå yeân trong 30 phuùt ôû nhieät ñoä phoøng. Sau ñoù ñem ño maät ñoä quang ôû böôùc soùng 540nm. Ghi nhaän maät ñoä quang. Tính toaùùn: Laäp ñoà thò chuaån cuûa caùc oáng nghieäm töø 26. Trò soá maät ñoä quang cuûa caùc oáng nghieäm töø 26 baèng maät ñoä maät ñoä quang cuûa caùc oáng nghieäm töø 26 ñaõ ñöôïc ño ôû treân tröø cho maät ñoä quang cuûa oáng 1. Sau ñoù laäp ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa maät ñoä quang theo noàng ñoä Protein chuaån. Töông töï ñoä haáp thu thaät söï cuûa Protein coù trong oáng thí nghieäm laø trò soá maät ñoä quang cuûa oáng thí nghieäm tröø oáng ñoái chöùng. Sau ñoù ñoái chieáu vaøo ñöôøng cong maãu suy ra löôøng Protein coù trong maãu thí nghieäm. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 16 Ñoää nhaïïy vaøø khaûû naêêng öùùng duïïng: Phöông phaùp naøy nhaïy hôn phöông phaùp Lowry nhöng khoâng baèng phöông phaùp Bradford vì noù ñöôïc söû duïng ñoái vôùi maãu nghieân cöùu coù khoái löôïng Protein töông ñoái lôùn 20 – 2,000µg/ml. 2.2. Ñònh löôïïng Protein baèèng phöông phaùùp Lowry (Biure caûûi tieáán): Nguyeâân taééc: Döïa vaøo phaûn öùng maøu cuûa Protein vaø thuoác thöû Folin. Phöông phaùp naøy söû duïng phoái hôïp phaûn öùng Biure vaø phaûn öùng vôùi thuoác thöû Folin taùc duïng leân goác tyrosin, tryptophan, hystidin, ñeå taïo phöùc maøu xanh ñaëc tröng coù ñoä haáp thu cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 750nm vaø döïa vaøo ñöôøng chuaån Protein ñeå töø ñoù dònh löôïng haøm löôïng Protein. Cöôøng ñoä maøu tæ leä vôùi noàng ñoä Protein. Hình : Phaûn öùng Lowry Tieáán haøønh Chuaån bò nguyeân lieäu, hoùa chaát, thieát bò  Dung dòch Protein chuaån coù 10 – 100 µg Protein/1ml  Dung dòch nghieân cöùu coù 50 - 300 µg Protein/1ml Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 17  Dung dòch chuaån: Albumin 0,1%, thöôøng laø huyeát thanh boø (BSA – bovine serum albumin). Hoùa chaát : pha  Dung dòch A : Na2CO3 2% hoøa trong NaOH 0,1N  Dung dòch B : CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dòch natri citrat 1%  Dung dòch C : hoãn hôïp dung dòch A vaø dung dòch B vôùi tæ leä 49:1  Dung dòch Folin Caùch pha dung dòch Folin: Pha trong bình caàu coù V= 2l Caân 100g natri tungstat (natri wonframat (Na2WO4.2H2O) vaø 25g natri molypdate ( Na2MoO4.2H2O). Theâm vaøo ñoù 700ml nöôùc caát vaø 50ml acid orto phosphoric 85% ( H3PO4) .Khuaáy cho tan vaø theâm vaøo ñoù 100ml HCl ñaäm ñaëc vaø tinh khieát roài tieáp tuïc khuaáy. Ñun soâi hoãn hôïp coù oáng sinh haøn laøm laïnh hoài löu trong 10h. Sau khi ñun hoài löu theâm vaøo ñoù 150g lithium sulfat ( Li2SO4.H2O) tinh khieát. Khuaáy cho ñeán khi tan hoaøn toaøn roài cho vaøo ñoù 5 – 10 ml nöôùc Brom khuaáy ñeàu vaø ñun soâi ôû tuû hotte 15 phuùt ñeå ñuoåi löôïng Brom thöøa. Dung dòch phaûi coù maøu vaøng, neáu dung dòch coù maøu xanh thì phaûi xöû lyù vôùi Brom laàn thöù 2 sau khi laøm nguoäi dung dòch ôû nhieät ñoä thöôøng. Ñeå vaøo bình ñònh möùc 1l vaø ñònh möùc ñeán vaïch. Coù theå loïc neáu dung dòch khoâng trong. Ñöïng trong chai thuûy tinh nuùt nhaùm coù maøu naâu, caát giöõ ôû nôi laïnh, sau 2 – 3 thaùng, dung dòch chuyeån sang maøu xanh thì theâm vaøi gioït Brom vaø ñun soâi 15 phuùt dung dòch laïi coù maøu vaøng trôû laïi. Tröôùc khi duøng phaûi pha loaõng thuoác thöû baèng nöôùc caát ñeán noàng ñoä 0,5N. Thieát bò : maùy so maøu quang ñieän. Tieán haønh: Chuaån bò maãu thí nghieäm nghieân cöùu: Cho vaøo oáng nghieäm 1ml dung dòch maãu ,theâm vaøo oáng nghieäm 4ml dung dòch C, laéc ñeàu, ñeå yeân trong 10 phuùt ôû nhieät ñoä phoøng. Sau ñoù theâm 0,5ml thuoác thöû Folin, laéc ñeàu vaø ñeå yeân trong 30 – 90 phuùt, luùc naøy dung dòch seõ chuyeån töø Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 18 maøu vaøng sang maøu xanh. Sau ñoù ñem ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 750nm vaø ghi nhaän maät ñoä quang hoïc cuûa dung dòch nghieân cöùu Thöïc hieän töông töï vôùi 1 oáng ñoái chöùng baèng caùch thay 1ml dung dòch maãu baèng 1ml nöôùc caát. Laäp ñoà thò chuaån Laáy 6 oáng nghieäm ñaùnh soá töø 1 ñeán 6 vaø cho vaøo ñoù caùc chaát theo baûng sau: Oáng soá Protein 0,1% (ml) Nöôùc caát (ml) Noàng ñoä Protein (mg/ml) Dung dòch C (ml) Thuoác thöû Folin (ml) OD 1 0,0 10 0 2 0,5 2 0,5 9,5 50 2 0,5 3 1,0 9,0 100 2 0,5 4 1,5 8,5 150 2 0,5 5 2,0 8,0 200 2 0,5 6 2,5 7,5 250 2 0,5 Baûng 1: laäp ñoà thò noàng ñoä Protein Trình töï vaø thao taùc töông töï nhö phaàn dung dòch thí nghieäm. Sau ñoù ñem ño ñoä haáp thu cuûa caùc oáng ôû böôùc soùng 750nm. Töø ñoù xaây döïng ñoà thò chuaån. Tính toaùùn: Töø baûng treân khi laäp ñoàá thò thì ta laáy trò soá maät ñoä quang caùc oáng töø 2 – 6 tröø ñi maät ñoä quang cuûa oáng 1. Ñoù chính laø ñoä haáp thu thöïc söï cuûa dung dòch Protein chuaån, töø ñoù ta laäp ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa maät ñoä quang theo noàng ñoä Protein chuaån. Vôùi truïc hoaønh laø noàng ñoä Protein vaø truïc tung laø maät ñoä quang. Töông töï ñoä haáp thu thaät söï cuûa Protein coù trong oáng thí nghieäm laø trò soá maät ñoä quang cuûa oáng thí nghieäm tröø oáng ñoái chöùng. Sau ñoù ñoái chieáu vaøo ñöôøng cong maãu suy ra löôøng Protein coù trong maãu thí nghieäm. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 19 Ñoää nhaïïy vaøø khaûû naêêng öùùng duïïng: Phöông phaùp Lowry coù ñoä nhaïy töông ñoái cao cho pheùp xaùc ñònh dung dòch maãu chöùa vaøi chuïc µg Protein thöôøng nhaïy caûm trong khoaûng töø 5 – 2,000mg Protein. Tuy nhieân phöông phaùp naøy khoâng duøng ñeå ñònh löôïng caùc Protein khoâng chöùa acid amin voøng thôm nhö gelatin, ñoái vôùi nhöõng hôïp chaát coù chöùa ion kali thì taïo keát tuûa aûnh höôûng ñeán keát quaû. 2.3. Ñònh löôïïng Protein theo phöông phaùùp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G - 250): Nguyeâân taééc: Döïa phaûn öùng maøu cuûa Protein vôùi xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G - 250) vaø caû khaû naêng haáp thuï aùnh saùng ôû böôùc soùng 595nm. Trong moâi tröôøng axit Coomassie Brilliant Blue G - 250 lieân keát chaët cheõ vôùi Protein, töông taùc vôùi caû nhoùm kî nöôùc vaø caùc nhoùm mang ñieän tích döông treân phaân töû Protein laøm dung dòch coù maøu xanh. Cöôøng ñoä maøu tæ leä vôùi noàng ñoä Protein trong dung dòch. Döïa vaøo ñöôøng chuaån cuûa Protein suy ra haøm löôïng Protein trong maãu. Phaûn öùng cho maøu Coomassie Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 20 Tieáán haøønh: Hoùa chaát: Chuaån bò dung dòch maãu Protein caàn xaùc ñònh. Dung dòch Albumin chuaån 1mg/ml Caùch pha dung dòch Albumin: Caân chính xaùc 10mg Albumin pha trong 1ml nöôùc caát laéc ñeàu cho tan heát vaø giöõ ôû 20 o C. Khi duøng pha loaõng 100 laàn ñeå ñöôïc dung dòch Albumin 0,1mg/ml. Pha thuoác thöû Bradford: Caân 0,001g Coomassie Brilliant Blue vaø 4,7g Ethanol 99 o vaø 8,5g Acid Phosphoric 85%, ñònh möùc tôùi 100ml baèng nöôùc caát. Ñöïng trong chai coù nuùt ñaäy kín. Thieát bò: maùy ño maøu quang ñieän. Tieán haønh: Laäp ñoà thò chuaån: Laáy 6 oáng nghieäm ñaùnh soá töø 1 ñeán 6 vaø cho vaøo ñoù caùc chaát theo baûng sau: Oáng soá Dung dòch Albumin 0.1mg/ml (ml) Nöôùc caát (ml) Noàng ñoä Albumin (µg) Thuoác thöû Bradford (ml) 1 0 1 0 5 2 0,1 0,9 10 5 3 0,2 0,8 20 5 4 0,3 0,7 30 5 5 0,4 0,6 40 5 6 0,5 0,5 50 5 Baûng 2: laäp ñoà thò chuaån dung dòch Albumin Laéc ñieàu vaø ñeå yeân moät luùc sau ñoù ñem ño ñoä haáp thu cuûa caùc oáng ôû böôùc soùng 595nm. Töø ñoù xaây döïng ñoà thò chuaån. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 21 Chuaån bò oáng thí nghieäm: OÁng thí nghieäm: 0,1ml dd Protein + 5ml dd Bradford OÁng ñoái chöùng: 0,1ml nöôùc caát + 5ml dd Bradford (Coù theå thay nöôùc caát baèng NaCl 0,15M) Ñem ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 595nm vaø ghi nhaän maät ñoä quang (maät ñoä quang phaûi naèm trong khoaûng cuûa ñöôøng chuaån). Tính toaùùn. Töø baûng treân thì oáng 1 laø oáng ñoái chöùng ,vì vaäy khi laäp ñoàá thò thì ta laáy trò soá maät ñoä quang caùc oáng töø 2 – 6 tröø ñi maät ñoä quang cuûa oáng 1. Ñoù chính laø ñoä haáp thu thöïc söï cuûa dung dòch Protein chuaån,töø ñoù ta laäp ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa maät ñoä quang theo noàng ñoä Protein chuaån. Vôùi truïc hoaønh laø noàng ñoä Protein vaø truïc tung laø maät ñoä quang. Töông töï ñoä haáp thu thaät söï cuûa Protein coù trong oáng thí nghieäm laø trò soá maät ñoä quang cuûa oáng thí nghieäm tröø oáng ñoái chöùng. Sau ñoù ñoái chieáu vaøo ñöôøng cong maãu suy ra löôïng Protein coù trong maãu thí nghieäm. Ñoää nhaïïy vaøø khaûû naêêng öùùng duïïng Phöông phaùp naøy duøng cho Protein tan trong nöôùc, phaûn öùng xaûy ra ôû nhieät ñoä phoøng. Phöông phaùp naøy nhaïy hôn 2-3 laàn so vôùi phöông phaùp Lowry, nhanh vaø ñôn giaûn hôn nhieàu vì noù cho pheùp xaùc ñònh tôùi vaøi µg protein/ml. ñoàng thôøi laøm giaûm aûnh höôûng cuûa muoái, ñeäm, caùc chaát khöû…Tuy nhieân phöông phaùp naøy khoâng duøng vôùi nhöõng chaát coù chöùa surfactants vì gaây ra keát tuûa cuûa caùc chaát phaûn öùng. Nhöõng chaát coù tính kieàm maïnh laøm taêng maät ñoä quang gaây sai leäch keát quaû. Maøu Coomassie laøm baån cuvet thaïch anh neân chæ duøng cuvet thuûy tinh ñeå ño maät ñoä quang. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 22 3. Ñònh löôïïng Protein baèèng phöông phaùùp duøøng Bicinchoninic Acid (BCA): 3.1. Nguyeâân taééc: Döïa vaøo phaûn öùng giöõa Protein vaø thuoác thöû BCA trong moâi tröôøng kieàm taïo maøu ñoû tía (tím), coù ñoä haáp thu cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 562nm. Hình : Phaûn öùng cho axit bincinchoninic (BCA) Ñaàu tieân Protein seõ khöû Cu 2+ thaønh Cu + vaø taïo thaønh phöùc coù maøu xanh trong moâi tröôøng kieàm. Sau ñoù hai phaân töû BCA seõ keát hôïp vôùi Cu + ñöôïc taïo ra ôû treân cho maøu ñoû tía (tím) vaø coù ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 562nm. 3.2. Caùùch tieáán haøønh: Caùch tieán haønh cuõng töông töï phöông phaùp Biure nhöng chæ thay thuoác thöû Biure thaønh thuoác thöû BCA. 3.3. Tính keáát quaûû: Caùch tính keát quaû cuõng töông töï phöông phaùp Biure. 3.4. Đoää nhaïïy vaøø khaûû naêêng öùùng duïïng: Phöông phaùp naøy nhaïy gaáp 100 laàn so vôùi phöông phaùp Biure. Noù phaùt hieän Protein töông ñoái lôùn 20 – 2,000µg. Nhöng ñoái vôùi những taïp chaát coù haøm löôïng Cu Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 23 duø ít cuõng baét maøu vôùi BCA laøm aûnh höôûng ñeán keát quaû vaø nhöõng hôïp chaát höõu cơ trong phaân töû coù caùc aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan cuõng baét maøu vôùi BCA laøm aûnh höôûng ñeán keát quaû. 4. Ñònh löôïïng Protein baèèng phöông phaùùp quang phoåå 4.1. Nguyeâân taééc: Döïa vaøo söï haáp thuï tia cöïc tím ôû böôùc soùng 280nm cuûa Protein. Caùc Protein haáp thuï tia cöïc tím cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 280nm do caùc acidamin Tryptophan, Tyrosin vaø moät phaàn laø Phenylalanin. Söï haáp thu ôû böôùc soùng 280nm cuûa chuùng cuõng thay ñoåi tuøy loaïi Protein nhöng heä soá taéc ño ñöôïc cho moãi Protein cho pheùp tính noàng ñoä cuûa Protein tinh saïch (heä soá taéc laø ñoä haáp thuï cuûa dd Protein 1% vôùi ñöôøng truyeàn soùng qua 1cm). Protein Heä soá taét Protein Heä soá taét Protein Heä soá taét IgG 13,6 Chuoãi γ 13,7 Oncanavalin A 120 IgM 11,8 Chuoãi µ 13,9 Lactin Lens Calinaris 12.5 IgA 13,2 Chuoãi  12,3 BSA 6.7 IgD 15,3 Chuoãi nheï 12,3 Baûng 3: Heä soá taét cuûa caùc loaïi Protein lieân quan vôùi heä mieãn dòch ôû böôùc soùng 280nm 4.2. Caùùch tieáán haøønh: Nguyeân lieäu: Dung dòch Protein ñeå ño, ñeäm hoøa tan Protein Thieát bò: Maùy ño quang phoå UV coù Cuvet thaïch anh ñöôøng truyeàn soùng laø 1cm Quaù trình goàm caùc böôùc sau: Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 24 Böôùc 1: Ly taâm maãu ñeå loaïi boû caùc phaân töû hoaëc phöùc hôïp khaùc coù trong theå huyeàn phuø. Laáy dòch noåi ñeå xaùc ñònh maät ñoä quang hoïc. Böôùc 2: Chænh maùy quang phoå ôû böôùc soùng 280nm vaø ñieàu chænh ñoä haáp thuï veà 0 vôùi cuvet chöùa ñeäm. Böôùc 3: Ño maãu vaø ñoïc ñoä haáp thuï cuûa maãu. Neáu giaù trò thu ñöôïc > 2,0 thì pha loaõng maãu (1/5 hoaëc 1/10) hoaëc ñöôøng saùng truyeàn ngaén hôn (2mm) cho ñeán khi soá ñoïc ñöôïc naèm trong khoaûng 0,5 ñeán 1,5. Böôùc 4: Laëp laïi böôùc 2 vaø 3 ôû böôùc soùng 260nm. Böôùc 5: Tính tæ soá haáp thuï 260nm/280nm. Tæ soá naøy neân nhoû hôn 0,6. Neáu lôùn hôn 0,6 thì Protein khoâng saïch coù laãn caùc taïp chaát khaùc ñaëc bieät vôùi acid nucleic. 4.3. Tính keáát quaûû: Noàng ñoä Protein = ñoä haáp thuï ôû 280nm heä soá taét ôû 280nm Vôùi moät hoãn hôïp caùc Protein hoaëc vôùi baát kyø moät loaïi Protein naøo maø khoâng bieát heä soá taéc thì tính nhö sau: Noàng ñoä Protein = (1,55 x Ñoä haáp thuï ôû 280nm) – (0,77 x Ñoä haáp thuï ôû 260nm) Ñôn vò: mg/ml Coù theå phoûng ñoaùn löôïng acid nucleic döïa vaøo (ñoä haáp thu ôû 280nm/ñoä haáp thu ôû 260nm). 4.4. Ñoää nhaïïy vaøø khaûû naêêng öùùng duïïng: Ñaây laø phöông phaùp ñôn giaûn nhaát ñeå ño noàng ñoä Protein trong dung dòch. Phöông phaùp naøy khoâng duøng ñöôïc cho caùc dung dòch coù noàng ñoä Protein thaáp (döôùi 0,05- 0,1 mg/ml) hoaëc khi coù maët nhieàu chaát khaùc maø haáp thuï cuøng vuøng cöïc tím (ví duï: ñeäm, acid nucleic vaø moät soá chaát beùo) hoaëc khi Protein ôû trong dung dòch huyeàn phuø. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 25 So vôùi phöông phaùp so maøu thì phöông phaùp naøy ñôn giaûn hôn, nhanh hôn, maãu duøng laïi thöôøng oån ñònh hoùa phaàn lôùn Protein. 5. Phöông phaùùp huyøønh quang O-Phthalaldehyde (OPA): 5.1. Nguyeâân taééc: Döïa vaøo phaûn öùng giöõa O-Phthalaldehyde (OPA) vôùi caùc amin coù maët trong chuỗi polypeptide (töø ñaàu ñeán cuoái maïch keå caû chính vaø phuï). Phaûn öùng xaûy ra nhanh trong söï coù maët cuûa mercaptoethanol taïo saûn phaåm huyønh quang coù maøu xanh vaø haáp thuï cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 340nm -450nm. 5.2. Ñoää nhaïïy vaøø khaûû naêêng öùùng duïïng: Ñoä nhaïy raát cao ñaït tôùi 50ng/ml. Coù theå phaùt hieän ra ñuùng ñaén peptide thaäm chí nhoû. Phöông phaùp naøy söû duïng cho nhöõng chaát khoâng chöùa caùc amin khaùc vôùi caùc amin trong chuoãi polypeptide. 6. Phöông phaùùp ñònh löôïïng amoniac 6.1. Nguyeâân taééc: Trong nguyeân lieäu chöùa nitô thöôøng chöùa moät loaïi nitô naèm döôùi daïng voâ cô (muoái ammonium hay nhöõng amin deã bay hôi ). Ñaây laø daïng nitô taïo thaønh do söï phaân huûy cuûa protein (bò leân men thoái hoaëc trong quaù trình khöû carbonxyl cuûa amino acid). Nhöõng loaïi nitô naøy thöôøng coù tính kieàm yeáu, vì vaäy khi cho taùc duïng vôùi MgO thì nhöõng loaïi nitô noùi treân seõ bò ñuoåi ra khoûi dung dòch, neân chuùng seõ ñöôïc loâi cuoán theo hôi nöôùc qua moät bình ñöïng löôïng thöøa axit. Sau ñoù ñem ñònh phaân löôïng axit dö, cho pheùp ta xaùc ñònh ñöôïc loaïi nitô naøy. 2(NH4) + + Mg(OH)2 2NH3 + 2H20 + Mg 2+ 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 26 6.2. Caùùch tieáán haøønh: Hoaù chaát :  Dung dòch H2SO4 0,1N  DD NaOH 0,1N  DD alizarin natri sunfonat 1% trong nöôùc  Daàu parafin hay coàn octylic  Thieát bò : maùy caáy ammoniac Tieán haønh : Böôùc 1 : Röûa maùy Cho nöôùc caát vaøo bình A khoaûng 2/3 theå tích bình, 5 gioït chæ thò alizarin natri sunfonat, vaø cho H2SO4 0,1N töøng gioït moät ñeán khi dung dòch chuyeån sang vaøng. Cho nöôùc trong bình B khoaûng ½ theå tích bình, laép nguoàn nöôùc laøm laïnh vaøo oáng sinh haøn, ñun soâi caû 2 bình A vaø B. caát keùo hôi nöôùc cho ñeán khi hôi nöôùc chaûy ra trung tính. Böôùc 2 : Caát ñaïm Caân hoaëc laáy moät löôïng chính xaùc m(g) hay Vmaãu(ml) thöïc phaåm, cho vaøo bình B vôùi nöôùc trung tính ñaõ caát keùo hôi nöôùc ñeå röûa maùy ôû treân, sau ñoù cho theâm 0,5ml chæ thò maøu. Cho MgO boät vaøo tôùi khi coù phaûn öùng kieàm roõ reät (maøu tím). Ñeå traùnh boït suûi phoàng leân, cho theâm vaøo gioït daàu paraffin hay coàn octylic. Ñun soâi, hôi nöôùc töø Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 27 bình A qua bình B keùo NH3 theo khi qua oáng sinh haøn seõ ñoïng laïi, rôi xuoáng, bình chuaån ñoä D ñaõ ñöïng saün nöôùc trung tính, chæ thò maøu vaø V(ml) H2SO4 thaønh (NH4)2SO4.H2SO4 thöøa seõ ñöôïc chuaån ñoä baèng NaOH 0,1N. 6.3. Tính keáát quaûû: Haøm löôïng NH3 trong 100g thöïc phaåm 1,7*( )*100 1000* xv v m  Hoaëc trong 1000ml thöïc phaåm: 1,7*( )x m v v v  Trong ñoù: V : theå tích H2SO4 0,1N cho vaøo bình chuaån ñoä. Vx : theå tích NaOH O,1N duøng ñeå chuaå ñoä H2SO4 thöøa M : khoái löôïng maãu duøng ñeå ñònh löôïng Vm : theå tích maãu laáy ñeå ñònh löôïng. 6.4. Khaûû naêêng öùùng duïïng: Khi xaùc ñònh löôïng ammoniac trong thöïc phaåm, moät maët seõ xaùc ñònh ñoä hö hoûng cuûa thöïc phaåm, moät maët ñaùnh giaù giaù trò protein, acid amin trong thöïc phaåm. 7. Phöông phaùùp Dumas: Dumas laø moät phöông phaùp ñònh löôïng ñeå xaùc ñònh löôïng nito trong moät chaát döïa treân moät trong caùc phöông phaùp ñaàu tieân ñöôïc moâ taû cuûa Jean- Baptiste Dumas. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 28 7.1. Nguyeâân taééc: Phöông phaùp Dumas duøng ñeå xaùc ñònh löôïng protein thoâ. Quy trình duøng moät thieát bò loø ñieän ñun noùng maãu phaân tích ñeán 600 0 C trong moät loø phaûn öùng ñöôïc bòt kín vôùi söï hieän dieän cuûa oxy. Haøm löôïng Nito cuûa khí ñoát sau ñoù ñöôïc dod baèng caùch duøng maùy doø daãn nhieät. Moãi laàn xaùc ñònh chæ caàn khoaûng thôøi gian ngaén (2 phuùt). 7.2. Thieáát bò: Thieát bò phaân tích ñaïm theo phöông phaùp Dumas nhö sau: Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 29 Thoâng tin veà thieát bò:  Model: NDA 70 laø thieát bò môùi nhaát cuûa Velp- Italy.  Thieát nò ñöôïc thieát keá bao goàm boä laáy maãu töï ñoäng leân tôùi 116 vò trí, khoái löôïng maãu lôùn nhaát laø 1g.  Detetor: loaïi Detector ñoä daãn TCD töï ñoäng chuaån.  Ñoä laëp RSD: nhoû hôn 0.1 % ñoái vôùi maãu chuaån EDTA (9.57%).  Recovery: 99.5%  Giôùi haïn cuûa Detector: 0.01 mgN.  Khí söû duïng: He vaø O2.  Ñoä tinh khieát cuûa khí He: treân 99.999% (grade 5.0).  Ñoä tinh khieát cuûa khí O2; treân 99.999% (grade 5.0).  Maùy neùn khí hoaëc Nitro gen: hoaëc khoâng daàu vaø nöôùc, ñoä tinh khieát: treân 99.6%.  Aùp suaát khí He: 3 Bar.  Aùp suaát khí O2: 3 Bar.  Aùp suaát khí neùn: 4 Bar.  Coå giao dieän: USB. RS 232.  Coâng suaát ñieän: 1400 W.  Nguoàn ñieän söû duïng: 230V/50Hz.  Troïng löôïng maùy: 55kg.  Kích thöôùc maùy 710x 51x 410mm (710x685x410mm vôùi boä laáy maãu töï ñoäng). 7.3. Caùùch tieáán haøønh: Maãu phaân tích ñöôïc keát daïng vieân, ñoát chaùy ôû nhieät ñoä cao, trong cuøng thôøi gian, quaù trình xuùc taùc ñöôïc dieãn ra bôûi vieäc khí oxy taïi aùp suaát khí quyeån. Khí chaùy sinh ra goàm CO2, H2O, NOx, ñöôïc ñöa qua loø thaáp hôn nôi maø khí NOx chuyeån Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 30 thaønh khí N2. Hôi aåm H2O vaø CO2 ñöôïc taùch rieâng bôûi caùc boä phaän haáp thuï, thaønh phaàn khí N2 seõ ñöôïc ño baèng Detector ñoä daãn TCD. Taát caû quaù trình ñoù chæ dieãn ra trong thôøi gian raát ngaén. Döïa vaøo haøm löôïng Nito ta coù theå xaùc ñònh haøm löôïng proten nhö sau: Nito toång= nito protein+ nito phi protein. Trong caùc nguyeân lieäu sinh hoc do haøm löôïng nito phi protein nhoû vaø vieäc taùc rieâng raát phöùc taïp neân ngöôøi ta tính haøm löôïng protein theo Nito toång vaø goïi laø protein thoâ hay protein toång. Protein (%)= Nito (%) x 6.25. Rieâng nguõ coác vaø ñaäu coù heä soá chuyeån ñoåi laø 5.7. Söõa laø 6.15. Keát quaû xeùt nghieäm theo phöông phaùp Dumas vaø Kjeldahl cho 21 maãu thòt cho keát quaû nhö sau: Mẫu Phương pháp Dumas Phương pháp Kjeldahl Dumas vs Kjeldahl Trung bình (%N m/m) Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên (%) Trung bình (%N m/m) Độ lệch chuẩn Hệ số biến thiên (%) 1 3.184 0.075 2.36 3.176 0.040 1.26 0.008 2 2.736 0.084 3.07 2.756 0.075 2.72 -0.020 3 2.402 0.069 2.87 2.419 0.052 2.15 -0.017 4 1.967 0.094 4.78 2.001 0.040 2.00 -0.034 5 1.682 0.044 2.62 1.688 0.024 1.42 -0.006 6 3.365 0.089 2.64 3.360 0.068 2.02 0.005 7 2.846 0.081 2.85 2.811 0.061 2.17 0.035 8 2.359 0.067 2.84 2.372 0.068 2.87 -0.013 9 1.844 0.044 2.39 1.855 0.035 1.89 -0.011 10 1.483 0.078 5.26 1.493 0.031 2.08 -0.010 11 3.958 0.048 1.21 3.924 0.058 1.48 0.034 12 3.442 0.062 1.80 3.432 0.041 1.19 0.010 Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 31 13 2.966 0.067 2.26 2.947 0.047 1.59 0.019 14 2.411 0.055 2.28 2.395 0.032 1.34 0.016 15 2.151 0.051 2.37 2.129 0.029 1.36 0.022 16 3.121 0.079 2.53 3.100 0.052 1.68 0.021 17 2.765 0.063 2.28 2.734 0.074 2.71 0.031 18 2.467 0.070 2.84 2.466 0.049 1.99 0.001 19 2.178 0.064 2.94 2.175 0.089 4.09 0.003 20 1.873 0.049 2.62 1.864 0.051 2.74 0.009 Nguồn: M Thompson et al. Meat Science 2004; 68:631-4. Tính trung bình heä soá bieán thieân cuûa phöông phaùp Dumas laø 2.7% vaø Kjeldahl laø 2.1%. Tính trung bình ñoä khaùc bieät ño löôøng giöõa hai phöông phaùp raát thaáp (chæ khoaûng 0.2%). 8. Phöông phaùùp PRM (Pyrogallol Red Molybdate): 8.1. Nguyeâân taééc: Pyrogallol red seõ keát hôïp vôùi molybdate ñeå taïo thaønh hoãn hôïp coù maøu hoàng (pink) haáp thuï ôû böôùc soùng 470nm.. Phöùc Pyrogallol molybdate coù haáp thu ôû böôùc soùng 604nm, vaø chuyeån sang maøu tím ñen khi phaûn öùng vôùi Protein döôùi taùc duïng cuûa acid. Baèng caùch ño ñoä haáp thuï bôûi maùy ño ôû 600nm, löôïng protein coù theå ñöôïc xaùc ñònh vôùi abumin maùu boø chuaån. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 32 8.2. Duïïng cuïï:  Oáng nghieäm.  Pipet hay micropipet.  Quang phoå keá, maùy so maøu quang phoå, sieâu ñóa ñoïc ñöôïc trang bò vôùi boä phaän loïc khoaûng 600nm. 8.3. Tieáán haøønh:  Dung dich protein ñöôïc pha loaõng cuøng vôùi hoãn hôïp maøu PRM (pyrogallol red molybdate) taïo thaønh dung dòch ñeäm (ñieàu chænh bôûi nöôùc) (theo baûng), sau ñoù cho vaøo oáng nghieäm vaø sieâu ñóa loïc ñeå tieán haønh thí nghieäm (tieán haønh laøm maãu traéng ñeå kieåm nghieäm).  Ñaët hoãn hôïp ôû nhieät ñoä phoøng khoaûng 20 phuùt.  Ño hoãn hôïp ôû böôùc soùng haáp thuï A600 nm bôûi maùy quang phoå, maùy so maøu hay sieâu ñóa ñoïc trong 1h. Phöông phaùp naøy döïa treân töông taùc maøu cuûa protein vôùi caùc tính chaát ñaëc tröng cuûa phöùc heä PRM vôùi moät giôùi haïn haøm löôïng protein. Caên cöù vaøo söï hình thaønh phöùc heä, maøu seõ chuyeån töø hoàng sang tía ñen (dark purple). Phöông phaùp naøy höõu duïng, ñôn giaûn, reû tieàn vì phöùc maøu ít haáp thuï ñaëc bieät vaø ít phaûn öùng vôùi caùc chaát khaùc ngoøai protein, coù thao taùc ñôn giaûn so vôùi caùc phöông phaùp khaùc. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 33 III. So saùùnh moäät soáá phöông phaùùp ñònh löôïïng protein 1. So saùùnh maããu bia coùù vaøø khoââng qua thaååm tích Haøm löôïng Protein trong bia (mg/ml) 1. Keáát luaään Caùc phöông phaùp khaùc nhau cho keát quaû khoâng gioáng nhau. Haøng naêm treân theá giôùi saûn xuaát khoaûng 4 tyû taân thöïc phaåm coù protien vaø vì vaäy soá löôïng thöïc phaåm caàn phaûi phaân tích protein laø raát lôùn. Vì vaäy ngöôøi ta vaãn khoâng ngöøng nghieân cöùu caûi thieän phöông phaùp phaân tích protein sao cho nhanh choùng, chính xaùc vaø reû. Caùc phöông phaùp ñònh löôïng protein. GVHD: TS. Traàn Thò Bích Lam 34 TAØØI LIEÄÄU THAM KHAÛÛO [1]. Phaïm Thò Traân Chaâu, Hoùa sinh ñaïi cöông, NXB Ñaïi Hoïc Sö Phaïm. [2]. Phaïm Thò Traân Chaâu, Nguyeãn Thò Hieàn, Phuøng Gia Töôøng, Thöïc haønh hoùa sinh hoïc, NXB Giaùo Duïc (1997). [3] Phaïm Thò Traân Chaâu, taïp chí sinh hoïc, taäp 9, 1981. [4]. Phaïm Thò Aùnh Hoàng, kyõ thuaät sinh hoùa, NXB Ñaïi Hoïc Quoác Gia TPHCM. [5]. Phaïm Thò Aùnh Hoàng, Nguyeãn Thò Huyeân, Traàn Myõ Quang, thöïc taäp sinh hoùa cô sôû, tuû saùch Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân TPHCM. [6]. TS. Leâ Thò Thanh Mai, Giaùo trình thöïc taäp sinh hoùa. [7]. Nguyeãn Vaên Muøi, thöïc haønh hoùa sinh hoïc, NXB khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi (2001). [8]. PGS. TS. Ñoàng Thò Thanh Thu, Giaùo Trình Sinh Hoùa Cô Baûn. [9] Vaxcrixenxki.P, Kyõ Thuaät Phoøng Thí Nghieäm – Phaàn I, NXB Ñaïi Hoïc Vaø Trung Hoïc Chuyeân Nghieäp. [10] Caùc Wedsite www. Proteomics-Protein Assays.htm www. Page Protein Assays,pg.htm www. Biochemistry-Protein-the chemistry of Protein www. Biophysical. chemistry G4170 Protein Visualization.htm