Đề tài Bước đầu nghiên cứu loài Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) tại Đà Lạt và khảo sát khả năng tác dụng của nó trên đối tượng vi sinh vật

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả của luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi, không sao chép của ai và chưa từng được công bố dưới hình thức nào. Nội dung của luận văn có tham khảo và sử dụng tài liệu, thông tin được đăng tải trên sách, báo, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của luận văn. Sinh viên Đinh Ngọc Thanh Quỳnh LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp cùng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn cô Hoàng Thị Bình, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cô đã cho em những nhận xét và những lời khuyên bổ ích để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Khoa Trưởng đã tận tình giúp đỡ em về hướng thực nghiệm nghiên cứu vi sinh trong thời gian em thực hiện luận văn tốt nghiệp. Em xin cảm ơn các thầy cô làm việc tại Trung Tâm T.T Thư Viện đã tạo mọi điều kiện giúp em được nghiên cứu và sử dụng tài nguyên của Thư Viện trong suốt 4 năm em theo học ở trường. Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người đã ủng hộ và động viên giúp đỡ con về mọi mặt trong quá trình con thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng mình xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn, những người đã ủng hộ và giúp đỡ mình. DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH ẢNH Hình ảnh Hình 1.1: Bạch Cúc 7 Hình 1.2: Kim Cúc 9 Hình 1.3: Núc áo rau 11 Hình 3.1: Cây Núc áo rau 23 Hình 3.2: Lát cắt ngang thân 24 Hình 3.3: Lát cắt xuyên tâm 25 Hình 3.4: Biểu bì lá mặt trên và mặt dưới 26 Hình 3.5: Sơ đồ quy trình chiết bằng phương pháp Soxthlet 29 Hình 3.6: Sơ đồ quy trình chiết bằng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng 31 Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng cao chiết lên sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus 33 Hình 3.8: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng cao chiết lên sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus (ở độ pha loãng 10-5) 35 Hình 3.9: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng cao chiết lên sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus (ở độ pha loãng 10-6) 36 Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng trưởng của trực khuẩn E.coli 37 Hình 3.11: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng trưởng của trực khuẩn E.coli (ở độ pha loãng 10-7) 39 Hình 3.12: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng trưởng của trực khuẩn E.coli (ở độ pha loãng 10-8) 40 Bảng biểu Bảng 3.1: Lượng cao chiết thu được .32 Bảng 3.2: Số lượng khuẩn lạc L.acidophilus trung bình đếm được trên các đĩa ở từng nồng độ pha loãng 33 Bảng 3.3: Số lượng khuẩn lạc E.coli trung bình đếm được trên các đĩa ở từng nồng độ pha loãng . 37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT E.coli: Escherichia coli L. acidophilus: Lactobacillus acidophilus ĐC: đối chứng LB: Luria - Bertani MRS: Deman – Rogosa – Sharpe MỤC LỤC MỞ ĐẦU Điều kiện tự nhiên đã ưu đãi cho đất nước và con người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyên dược liệu nói chung. Việt Nam có khoảng 3200 loài cây thuốc khác nhau [4]. Hiện nay thuốc từ dược liệu chiếm một tỷ trọng lớn trên thị trường vì thuốc có tính năng tốt và ít gây ra các phản ứng phụ khi sử dụng. Việc nghiên cứu sàng lọc và phát triển các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính để chế biến thành thuốc thương phẩm đang rất được quan tâm. Theo Lê Đình Bích, trong giới thực vật được chia làm 2 phân giới: bậc thấp và bậc cao. Trong thực vật bậc cao có rất nhiều ngành thì ngành Ngọc lan (hạt kín) được quan tâm nhất vì ngành này trên thế giới có khoảng 250000 – 300000 loài. Tại Việt Nam có tới 9462 loài. Ngành Ngọc lan được chia làm 2 lớp: lớp hành (một lá mầm) và lớp Ngọc lan (hai lá mầm). Lớp Ngọc lan được chia làm nhiều phân lớp, trong đó phân lớp Cúc có 2 bộ thì bộ Cúc được quan tâm nhiều hơn bởi bộ này có họ Cúc là họ có số loài làm thuốc đông nhất trong giới thực vật có hoa gồm 125 chi trên 350 loài, trong đó có 51 loài thường làm thuốc. Trong 51 loài này có 18 loài vừa làm thuốc y học cổ truyền vừa làm nguyên liệu công nghiệp dược như Astiso, Hy thiêm, Thanh cao hoa vàng, Bạch truật… Rõ ràng họ Cúc là một kho tàng nghiên cứu phát triển cây thuốc [9]. Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) là một trong 51 loài hoa thuộc họ Cúc thường được dùng làm thuốc trong dân gian. Đây là một loài hoa tiềm ẩn một sức mạnh thần kì, cùng với những công dụng tuyệt vời… Từ xa xưa, cha ông ta đã biết lợi dụng vị cay, tê, nóng của loài hoa này để chữa một số bệnh thông dụng như đau răng, đau nhức xương, đau bụng, tiêu chảy, đinh râu, mụn nhọt hay để tiêu diệt côn trùng... Những bài thuốc dân gian đó vẫn được lưu truyền đến ngày nay mặc dù chưa có một công trình khoa học nào đi sâu nghiên cứu về dược tính của loài hoa này, cũng như cơ chế tác dụng của nó trên cơ thể người. Chi Spilanthes gồm các loài phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm đến vùng nhiệt đới của Bắc bán cầu. Ở Việt Nam chi này có thể có 3 hoặc 4 loài. Trong đó loài oleraceae L. mọc rải rác từ vùng đồng bằng cho tới cao nguyên. Cây ưa ẩm và hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong bãi cỏ hay nơi đất ẩm. Hằng năm cây con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, ra hoa vào cuối mùa hè, tàn lụi vào cuối thu hoặc đầu đông. Hạt loài hoa này nhỏ, phát tán gần nên trong tự nhiên thường thấy nhiều cá thể mọc gần nhau[2]. Thành phố Đà Lạt với khí hậu quanh năm ôn hòa, là thiên đường cho muôn vàn loài hoa cùng khoe sắc. Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) có thể thích nghi khá dễ dàng với điều kiện sống nơi đây. Vì thế ta có thể bắt gặp loài hoa này ở khá nhiều nơi tại Đà Lạt. Nhằm tìm hiểu sơ lược loài cây thuốc phổ biến có ở địa phương này để góp phần cho những nghiên cứu sâu hơn về sau, chúng tôi thực hiện đề tài:“Bước đầu nghiên cứu loài Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) tại Đà Lạt và khảo sát khả năng tác dụng của nó trên đối tượng vi sinh vật”. Nội dung nghiên cứu chính của đề tài bao gồm: Tìm hiểu sơ lược đặc điểm sinh học, sinh thái của loài hoa này. Xác định quy trình tách chiết cao chất có trong cây Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.). Đánh giá khả năng ứng dụng của cao chiết thông qua đánh giá mức độ ảnh hưởng của nó lên sự tăng trưởng của vi sinh vật. PHẦN MỘTTỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN CỦA KHU VỰC NGHIÊN CỨU 1.1.1. Khí hậu Đà Lạt 1.1.1.1. Chế độ nhiệt Thành phố Đà Lạt nằm trên cao nguyên LangBiang, thuộc phía Bắc tỉnh Lâm Đồng. Trải qua nhiều thời kì thay đổi hiện nay thành phố Đà Lạt có tọa độ được xác định như sau: Điểm cực Bắc: 12°04' Bắc. Điểm cực Nam: 11°52' Bắc. Điểm cực Tây: 108°20' Đông. Điểm cực Đông: 108°35' Đông[10]. Đà Lạt nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng bức, nhưng do ảnh hưởng của độ cao địa hình nên Đà Lạt thường hưởng một chế độ nhiệt ôn hòa, dịu mát quanh năm. Nhiệt độ trung bình tháng không bao giờ vượt quá 20°C, ngay cả trong những tháng nóng nhất. Tuy nhiên Đà Lạt cũng không phải là nơi có nhiệt độ trung bình tháng thấp nhất. Ngay trong các tháng mùa đông, nhiệt độ trung bình tháng vẫn là 15°C. Nhiệt độ tương đối ổn định qua các mùa, biên độ giao động nhỏ. Đây là điểm rất tiêu biểu của một chế độ khí hậu nhiệt đới thuộc vùng cao. Nằm ở độ cao 1500m, Đà Lạt có nền nhiệt độ thấp. Nhiệt độ trung bình năm là 17,9oC. Năm nóng nhất (1983) giá trị này lên tới 18,2oC và năm lạnh nhất cũng chỉ xuống 17,6oC. Ở Đà Lạt, tháng 1 là tháng lạnh nhất trong năm, nhiệt độ trung bình là 15,7oC. Từ tháng 2 trở đi nhiệt độ tăng dần và đạt giá trị lớn nhất là 19,5oC vào tháng 5. Sau đó nhiệt độ giảm dần cho đến cuối năm. Nhiệt độ thấp nhất trung bình giao động từ 11-12oC trong mùa khô và tăng đến 14-16oC trong mùa mưa. Nhiệt độ cao nhất trung bình phổ biến ở Đà Lạt là 21-23oC. Trong các tháng 2, 3 và 4, giá trị này lên đến 24-25oC. Một đặc điểm đáng chú ý trong chế độ nhiệt ở Đà Lạt là biên độ ngày đêm rất lớn. Biên độ trung bình năm là 9,0oC. Trong các tháng giữa mùa khô (1-3), biên độ rất lớn (đạt tới 12-14oC). Giữa mùa mưa, biên độ giảm (chỉ đạt 6-7oC). Đà Lạt chịu ảnh hưởng chủ yếu của hai loại gió mùa. Đó là gió mùa Đông Bắc và gió mùa Tây Nam. Thời gian thịnh hành của chúng còn được phân biệt bởi hai mùa là mùa khô và mùa mưa trong năm[11,12]. 1.1.1.2. Chế độ độ ẩm Độ ẩm tương đối của không khí trong các tháng mùa mưa ở Đà Lạt khá cao (86-91%). Tháng 7, tháng 8 và tháng 9 có độ ẩm lớn nhất (trên dưới 90%). Các mùa khô từ 75-85%. Do ảnh hưởng của gió mùa Đông Bắc nên trong các tháng 2, 3 độ ẩm xuống thấp nhất (75-79%). Trong thời kỳ này cá biệt có những ngày độ ẩm lúc 13 giờ chỉ có 7-15%. Như vậy độ ẩm của các tháng trong năm chênh lệch không lớn (16%). Biến trình năm của độ ẩm thấp nhất trung bình lúc 13 giờ cũng tương tự như độ ẩm trung bình, trị số thấp nhất rơi vào tháng 3 (40%) và cao nhất vào tháng 7, 8 (68%), biên độ năm giao động 23%[11,12]. 1.1.1.3. Lượng mưa Chế độ mưa ở Đà Lạt ôn hòa thường bắt đầu giữa tháng 4. Khi trường gió Tây Nam ổn định và mạnh lên dần từ tháng 6 thì bắt đầu xuất hiện những đợt mưa kéo dài. Những trận mưa như vậy cũng thường xảy ra khi có bão hoặc áp thấp ngoài biển Đông vì Đà Lạt là nơi khá nhạy cảm với thời tiết của cả nước. Mùa mưa ở Đà Lạt thường kết thúc vào tháng 10, đôi khi giữa tháng 11. Như vậy mùa mưa trên thành phố cao nguyên này kéo dài khoảng 6 tháng. Tháng 4 và tháng 11 được xem là thời điểm “giao mùa” giữa hai mùa mưa và nắng. Lượng mưa trong năm phân bố không đều theo thời gian. Lượng mưa trung bình của Đà Lạt vào khoảng 1800mm. Tháng 9 là tháng có lượng mưa trung bình tháng lớn nhất 300mm. Thực tế mỗi năm thời tiết diễn biến không giống nhau, nên lượng mưa hàng năm cũng biến động mạnh mẽ, khác nhiều so với số liệu trung bình[11,12]. 1.1.1.4. Chế độ ánh sáng Đà Lạt ở vào vĩ độ thấp (11o57'B) trong năm có 2 lần mặt trời đi qua thiên đỉnh vào tháng 4 và tháng 8. Độ cao mặt trời khá lớn. Tháng có độ cao mặt trời lớn nhất là tháng 4 và tháng bé nhất là tháng 12. Giờ chiếu sáng trong ngày từ tháng 4 đến tháng 9 là trên 12 giờ, những tháng khác trên dưới 11.5 giờ. Như vậy độ dài ngày giữa các mùa không chênh lệch nhau mấy và Đà Lạt thuộc vào nơi ngày ngắn. Chính vì vậy Đà Lạt chỉ thích hợp với các giống cây trồng có quang kỳ ngắn hoặc trung. Đối với những cây quang kỳ dài đưa vào Đà Lạt sẽ có hiện tượng ra hoa sớm, năng suất kém. Mặc dù tháng 4 và tháng 8 có độ cao mặt trời lớn nhất, thế nhưng không phải là tháng có tổng xạ lớn nhất. Vì từ tháng 4 trở đi đã vào mùa mưa nên tổng lượng bức xạ bị giảm. Tổng xạ đạt đến trị số cực đại trong năm vào tháng 3 (16,4 Kcal/cm2 tháng) và cực tiểu rơi vào tháng 9 (9,3 Kcal/ cm2 tháng). Biên độ năm của tổng xạ là 7,1 Kcal/ cm2. Lượng mây tổng quan trung bình năm ở Đà Lạt biến đổi nhiều qua các mùa. Từ tháng 4, tháng 5 lượng mây tăng nhanh lên cho đến tháng 7 thì đạt giá trị cực đại trong năm. Đó cũng là thời gian khí đoàn nhiệt đới Ấn Độ Dương hoạt động mạnh nhất. Lượng mây trung bình các tháng mùa mưa từ 4,5 - 6,3. Thường vào cuối tháng 10, đầu tháng 11 khi gió mùa Tây Nam hoàn toàn mất ảnh hưởng trên cao nguyên Lâm Viên thì lượng mây cũng giảm đi rõ rệt. Đặc biệt từ tháng 1 đến tháng 3 là thời gian khí đoàn cực đới hoạt động chủ yếu, lượng mây rất ít, chỉ vào khoảng 2,7 - 3,5. Giờ nắng phụ thuộc chặt chẽ và tỷ lệ nghịch với lượng mây. Chính vì vậy mà trong thời kỳ ngày dài nhất cũng không hẳn là thời kỳ có số giờ nắng trong ngày nhiều nhất. Dù tháng 6 có ngày dài nhất trong năm nhưng chỉ có 165 giờ nắng, ít hơn cả số giờ nắng của tháng 12. Nhìn chung các tháng trong mùa mưa, do lượng mây nhiều nên số giờ nắng ít, thậm chí có tháng chỉ bằng một nửa hoặc ít hơn số giờ nắng của tháng mùa khô. Tháng 7 là tháng có số giờ nắng ít nhất với 121 giờ. Sau mùa mưa, số giờ nắng tăng nhanh, đến tháng 3 là tháng có số giờ nắng nhiều nhất với 288 giờ[11,12]. 1.1.2. Thổ nhưỡng Trải qua các hoạt động địa chất lâu dài, chủ yếu là quá trình phong hóa và chịu ảnh hưởng sâu đậm của khí hậu, địa hình, hệ thực vật khu vực, trên bề mặt địa hình Đà Lạt đã hình thành một lớp phủ thổ nhưỡng với các loại đất khác nhau, mang tính đai cao rõ nét. Quá trình phong hóa tạo đất ở Đà Lạt xảy ra tương đối mạnh mẽ và trong một thời gian dài để lại lớp phong hoá dày. Theo bảng phân loại mới dùng cho bản đồ đất của Việt Nam, các loại đất Đà Lạt thuộc hai nhóm chính: nhóm đất feralit vàng đỏ phân bố ở độ cao 1000 - 1500m và nhóm mùn vàng đỏ trên núi phân bố ở độ cao 1000 - 2000m. Các nhóm khác như đất phù sa, đất than bùn, đất bồi tụ chiếm diện tích không đáng kể[11,12]. 1.2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOÀI CÂY THUỘC HỌ CÚC (ASTERACEAE) CÓ KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH VÀ HOA NÚC ÁO RAU (SPILANTHES OLERACEAE L.) 1.2.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu một số loài cây thuộc họ Cúc (Asteraceae) có khả năng chữa bệnh trên thế giới Họ Cúc (Asteraceae) bao gồm chủ yếu là các cây thân cỏ, cây bụi và một số rất ít cây thân gỗ. Cúc có khoảng 23600 loài, là một họ hoa có số loài nhiều thứ hai sau họ Lan. Hoa Cúc không chỉ chinh phục lòng người bằng hương sắc rực rỡ và tinh khiết mà nhiều loài trong họ hoa này còn là những loài thảo dược quý mang lại nhiều lợi ích cho đời sống con người. Một số loài hoa Cúc đã được nghiên cứu có công dụng chữa bệnh: Cúc hoa trắng hay Bạch cúc (Chrysanthemum morifolium R. = C.sinense): Hình 1.1: Bạch Cúc Bạch Cúc chỉ bắt đầu được mô tả vào năm 1689 và đây là loài hoa được trồng nhiều tại Hà Lan. Cây bị chìm vào quên lãng và chỉ được tái phát hiện vào năm 1789. Sau đó loài cây này được trồng và phát triển rất mạnh tại châu Âu. Năm 1753, Linnaeus đã đặt tên cho chi của cây là Chrysanthemum. Chrysanthemum morifolium ngày nay thật ra là loài được pha trộn gen ít nhất là từ 6 loài Cúc khác nhau. Các nghiên cứu dược học về Cúc trắng: Hoạt tính trên huyết áp: Các nghiên cứu tại Nhật và Trung Hoa trong thập niên 70 ghi nhận: Nước sắc, đun sôi trong 15 phút với 24-30g hoa Cúc và 24-30g hoa Kim ngân (Lonicera japonica), chia thành 4 liều và dùng uống thay trà. Nghiên cứu này được thử nghiệm trên 46 người bệnh, uống trong 3-7 ngày liên tục. Kết quả huyết áp hạ về mức bình thường ở 35% bệnh nhân, số còn lại có kết quả tốt sau 1-12 ngày dùng thuốc. Các bệnh nhân huyết áp cao và có thêm triệu chứng choáng váng được cho dùng thêm 12g lá dâu tằm (tang diệp) sắc chung. Bệnh nhân bị sơ động mạch và mỡ cao trong máu được cho uống thêm 12-24g sơn trà (Crataegus pinnatifida). Các triệu chứng như chóng mặt, choáng váng đều thuyên giảm[13]. Tác dụng trị đau tức ngực (angina pectoris): Một nghiên cứu khác tại Trung Hoa ghi nhận: Nước sắc hoa Cúc dùng với 61 trường hợp đau tức ngực cho kết quả hữu hiệu trên 80% bệnh nhân. Kết quả rất tốt với 43.3% bệnh nhân và làm thuyên giảm triệu chứng bệnh cho 36.7% các bệnh nhân bị tức ngực, hồi hộp. 45 % bệnh nhân có những thay đổi về điện tâm đồ. Một số bệnh nhân giảm được huyết áp, và tất cả bệnh nhân đều không gặp các phản ứng phụ[13]. Hoạt tính kháng sinh: Các dung dịch chiết từ lá Cúc trắng có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn như vi khuẩn Staphylococcus aureus, Beta-hemolytic Streptococcus và Shigella sonnei. Có thể dùng lá tươi, nghiền nát và đắp trực tiếp vào mụn nhọt hay vắt lấy nước thoa vào vết thương. Nghiên cứu tại Đại học Nihon (Nhật) ghi nhận các triterpinoids, trích từ hoa có hoạt tính ức chế vi khuẩn Lao Mycobacterium tuberculosis, chủng H(37) Rv ở những nồng độ tối thiểu MIC từ 4-64 microg/ml. Nghiên cứu tại Viện Khoa Học và Kỹ Thuật Quốc Gia Đại Hàn Seoul ghi nhận flavonoid glucuronide apigenin-O-beta-D-(4’’-caffeoyl) glucuronide có hoạt tính ức chế men HIV-1 integrase ở IC(50)=7.2+/- 3.4 microg /ml) và chống hoạt động của HIV trong môi trường cấy tế bào EC(50)= 41.86 +/- 1.43 microg/ml, khi cấy vác tế bào MT-4 bị nhiễm HIV-1 (IIIB) (Planta Nedica Số 69-2003)[13]. Hoạt tính trên các tế bào ung thư: Nghiên cứu tại Đại học Nihon, Tokyo (Nhật) ghi nhận 15 chất diol và triol loại pentacyclic triterpene gồm 6 loại taraxastane (faradiol, heliantriol B0, helantriol C, 22 alpha-methoxyfaradiol, arnidiol và faradiol alpha-epoxide) và 5 loại oleananes (maniladiol, erythrodiol, longispinogenin, coflodiol và heliantriol A), 2 loại ursanes (brein và uvaol), 2 loại lupanes (calenduladiol và heli antriol B2), trích từ hoa Cúc trắng, khi được thử nghiệm về tác dụng ức chế sự kích khởi sinh kháng thể siêu vi Epstein-Barr (EB-EA) gây ra bởi chất tạo u-bướu 12-O-tetradecanoylphorboil-1-acetate (nơi tế bào Raji) cho thấy các chất này có hoạt tính ức chế mạnh hơn glycyrrhetic acid (đã được xem là một chất chống u bướu). Trong số này arnidiol có hoạt tính diệt tế bào ung thư mạnh nhất , liều GI50 (liều gây ức chế 50% tăng trưởng) là < 6 microM. (Cancer letter Số 8 (March)-2002)[13]. Hoạt tính kháng viêm: Dịch chiết hoa Cúc trắng, từ phần tan trong hexane và phần tan trong chất béo, sau khi tinh khiết hóa, đã cho nhiều loại esters acid béo (gần 30 chất khác nhau) và nhiều diol, triol loại triterpene (24 hợp chất). Các hợp chất này được thử nghiệm về hoạt tính chống sưng trên loại sưng viêm ở chuột gây ra bằng 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Kết quả ghi nhận tính chất kháng viêm rất rõ với liều ID50 là 0.03-1.0mg mạnh hơn cả tác dụng của quercetin. (Journal of Agricultural and Food Chemistry Số 49-2001)[13]. Các đặc chế chứa Cúc trắng của Trung Hoa: Tại Trung Hoa, hiện có một số đặc chế được Bộ Y-Tế Cộng Hòa Nhân Dân Trung Hoa chính thức cho phép sử dụng để điều trị một số bệnh. Đặc chế Jiantangkang được dùng để trị các chứng tiểu đường không tùy thuộc vào insulin (Chung kuo Chung His I Chieh Tsa Chih Số 17-1977). Bạch cúc là một trong 7 dược thảo được dùng trong đặc chế PC-SPES để trị ung thư, cho kết quả là làm giảm rõ rệt nồng độ PSA (prostate-specific antigen), diệt được các tế bào ung thư, đồng thời làm giảm đáng kể testosterones. Trong 2 thử nghiệm, nồng độ PSA giảm hạ ngay sau 1 tháng dùng thuốc (New England Journal of Medicine Số 339-1998). Đặc chế Hua-sheng-ping phối hợp Cúc trắng, Cam thảo và Tam thất đã được dùng để trị các vết lở loét tiền ung thư[13]. Cúc hoa vàng hay Kim cúc (Chrysanthemum indicum L.): Cúc hoa vàng có nguồn gốc từ Trung Hoa, Nhật Bản, được trồng rất phổ biến tại các quốc gia Châu Á như Ấn Độ, Việt Nam. Các nghiên cứu dược học về Cúc hoa vàng: Hình 1.2: Kim Cúc Tác dụng ức chế sự sản xuất nitric oxide: Nghiên cứu tại Đại học Kyoto (Nhật) ghi nhận dịch chiết hoa Cúc vàng bằng methanol và ethyl acetate chứa các flavonoids có hoạt tính ức chế sự sản xuất nitric oxide nơi các đại thực bào kích khởi do liposaccharides, và ức chế hoạt động của men aldose-reductase (Chemical Pharmacy Bulletin (Tokyo) Số 5-2000)[13]. Khả năng trị gout: Trong trường hợp bệnh gout: men xanthine oxydase là chất xúc tác sự oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó thành acid uric. Acid uric là chất đóng vai trò quan trọng gây ra gout. Nghiên cứu tại ĐH Nam Kinh (Trung Hoa) ghi nhận dịch chiết hoa Cúc vàng bằng methanol cho thấy có tác dụng ức chế men này ở nồng độ IC50 là 22 microgram/ml (trong khi đó nồng độ allopurinol dùng làm đối chứng là 1.06 microg/ml) (Journal of Ethnopharmacology Số 73-2000)[13]. Hoạt tính kháng sinh: Các dịch chiết từ hoa cúc vàng có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của nhiều vi khuẩn (15 loại) và nấm trong đó gồm Staphylococcus aureus, Shigella spp và cả vài siêu vi trùng loại Echo[13]. Khả năng hạ huyết áp: Các chế phẩm từ hoa cúc vàng khi cho dùng uống hay chích đều làm hạ huyết áp nhanh chóng. Các chế phẩm dùng toàn cây có tác dụng độc hại hơn và hoạt tính kém hơn là trích từ hoa. Dịch chiết từ hoa ở liều 100-200mg/kg có thể gây ra hạ huyết áp nhưng không ảnh hưởng trên tim và gan (The Pharmacology of Chinese Herbs)[13]. Tác dụng trị bệnh đường hô hấp: Trong một thử nghiệm tại Nhật trên 1000 bệnh nhân về tác dụng của Cúc vàng trong việc ngừa cảm, ghi nhận những người uống nước sắc hoa cúc vàng mỗi tuần một lần, có thể giảm được 13.2% những cơn cảm lạnh (so với năm trước đó). Khi thử nghiệm trên 119 trường hợp sưng phổi kinh niên, 38% giảm được các cơn bệnh so với nhóm đối chứng[13]. Ngoài ra còn rất nhiều loài hoa khác thuộc họ Cúc (Asteraceae) có khả năng chữa bệnh đã được nghiên cứu. Nhưng tôi chỉ giới thiệu về hai loại hoa điển hình và thường gặp trên. Hình 1.3: Núc áo rau 1.2.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Hiệu ứng chống viêm của Spilanthol trên Murine – đại thực bào – điều tiết LPS – điều trị cảm ứng viêm: Khoa hóa học ứng dụng và viện công nghệ y sinh thuộc Đại học Quốc gia ChiNan, Puli, Đài Loan đã nghiên cứu hiệu ứng chống viêm của Spilanthol từ hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) trên Murine - đại thực bào - điều tiết LPS - điều trị cảm ứng viêm. Nghiên cứu này nhằm phân lập hoạt chất hoạt động Spilanthol, bằng phương pháp bioactivity - guided để cho biết ý nghĩa hoạt động chống viêm trên mô hình kích hoạt lipopolysaccharide đại thực bào Murine RAW 264,7. Cơ chế chống viêm của paracress cũng được khảo sát nghiên cứu. Chất chiết xuất từ Spilanthes oleraceae L. được thu nhận nhờ dùng dung môi ethanol 85%, căn cứ theo việc phân vùng chất lỏng chống lại hexane, chloroform, ethyl acetate, và butanol. Cao chiết bởi ethyl acetate tỏ ra rất tốt trong việc tìm ra khả năng hoạt động của chất có trong loài hoa này. Thí nghiệm được xác định bởi DPPH và ABTS tìm ra dung môi giúp chất hoạt động triệt để. Các chất chiết xuất từ dung môi là Chloroform ức chế đáng kể việc sản xuất oxit nitric (p <0,01) và Spilanthol là chất hoạt động mạnh nhất, tác dụng đến việc ức chế. Mức suy giảm LPS gây ra cảm ứng nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX-2) mRNA và hổ trợ các hoạt động biểu hiện của protein. Spilanthol ức chế sản sinh các chất tiền viêm trung gian trong quá trình phiên mã và dịch mã. Ngoài ra, các chất kích thích LPS IL-1β, IL-6 và sản phẩm TNF-α tùy thuộc vào liều giảm Spilanthol. Quá trình LPS - phosphryl hóa còn tạo ra các chất ức chế tế bào chất và nhân NF-κB AND. Kết quả nghiên cứu này cho thấy Spilathol được chiết xuất từ Spilanthes oleraceae L. có khả năng tích cực để điều chỉnh việc sản xuất các chất trung gian tiền viêm[14]. Diệt ấu trùng của muỗi: Pendse et. al . (1946), Mehra et. al . (2000), Kalyansundaram và Das (1985) và một vài công sự khác đã tiến hành nhiều nghiên cứu tìm ra công dụng của một số các hợp chất tự nhiên. Năm 1946 họ đã chứng minh được Spilanthol trong hoa Núc áo rau khi kết hợp với DDT có thể diệt được ấu trùng của muỗi Anophen. Gokhle and Bhide (1945) đã chiết xuất chất Spilanthol có trong loài hoa này. Sau đó họ tiến hành thử nghiệm trên ấu trùng muỗi Culex, Anopheles and Aede. Phần đầu hoa được thu thập chủ yếu từ vùng đồi Gour Nagar, bảo quản khô sau đó tiến hành chiết xuất. 1kg hoa được chiết xuất với khí ete ở 60-80 °C trong vòng 12 giờ. Sau đó cô đặc cho bốc hết dung môi, rửa qua bằng acetone. Hàm lượng Spilanthol thu được vào khoảng 407mg/90%kg bột hoa khô. Tiếp đó hòa 100mg trong 10ml ethanol. Trứng muỗi thu được chứa trong nước có 0.1% albumin ở 28°C,để trong chu kì sáng tối là 12/12. Lấy 25 trứng mỗi loại cho thử với 1,3,5,10 ppm của Spilanthol. Sau 24 giờ, tỉ lệ trứng sống và bị tiêu diệt được ghi nhận. Họ nhận thấy với nồng đô Spilanthol càng cao, ấu trùng muỗi bị tiêu diệt càng nhiều[15]. Chống lão hóa da: Tiến sĩ Paula Lennon (người Pháp) và Laurent Schubnel – Gattefossé qua nhiều khảo sát đã nhận thấy nhiều người ngày nay đang muốn thay đổi diện mạo của mình và họ sẵn sàng chi trả một khoản tiền lớn cho việc sửa sang sắc đẹp để thấy kết quả một cách nhanh chóng, không phải chờ đợi trong thời gian dài. Việc phẫu thuật thẫm mĩ đang ngày càng trở nên phổ biến trong giới trẻ và ngay cả những người lớn tuổi. Việc sử dụng mỹ phẩm để bôi lên da có vẻ an toàn hơn nhưng người tiêu dùng phải chờ một thời gian mới thấy sự chuyển biến rõ nét. Việc tạo ra một sản phẩm mang lại hiệu quả nhanh chóng đã thúc đẩy Gattefossé nghiên cứu ra một chất chống lão hóa an toàn và hoa Núc áo rau là đối tượng Gattefossé lựa chọn. Loài hoa này xuất hiện nhiều ở Ấn Độ Dương, phát triển quanh năm, mọc nhiều ở Châu Phi, Nam Mỹ và Châu Á. Gattefossé thu nhận loài hoa này chủ yếu từ đảo La Reunion. Một cuộc điều tra về những tính năng phi thường của loài hoa này ứng dụng trong đời sống đã được diễn ra. Qua nhiều nghiên cứu ông đã xác định được hợp chất chính có trong loài hoa này là Spilanthol. Ông đã tiến hành một cuộc thử nghiệm trên ống nghiệm và trên cơ thể người về việc chống lão hóa. Bởi vì hằng ngày chúng ta cười nói, cau mày, da mặt chúng ta chịu nhiều lực tác động nên thường để lại nhiều nếp nhăn. Tuổi càng cao những nếp nhăn này càng xuất hiện rõ hơn. Chất chiết xuất từ loài hoa này thông qua cơ chế myorelaxing làm chậm lại sự xuất hiện của những nếp nhăn. Hiệu quả: đầu tiên hoạt động myorelaxing đã được thử nghiệm trên mô hình tái tạo các cơn co thắt cơ bắp. Mô hình này dựa trên sự kết hợp giữa nơron thần kinh và cơ bắp khi vận động. Kết quả cho thấy chỉ cần 0.6% chất chiết xuất là có thể hoàn tất 1 myorelaxation. Việc tác dụng phụ thuộc vào nồng độ chất đó trong các thử nghiệm. Sau khi hoàn tất myorelaxation, môi trường nuôi cấy được rửa sạch chất chiết xuất. Các cơn co thắt cơ bắp trở lại chứng tỏ hiệu lực của chất tác dụng. Nghiên cứu lâm sàng: nghiên cứu với những bệnh nhân có vết chân chim ở đuôi mắt. Chất chiết này có thể làm mịn làn da và mờ dần các vết chân chim. Độ mịn của làn da được đánh giá bằng 1 phương pháp quang. Nó xác định được độ nhám của làn da trước và sau khi điều trị. Các thử nghiệm được tiến hành trên da của các tình nguyện viên 2 lần mỗi ngày trong 28 ngày. Trên hai nhóm người, một nhóm bôi kem có chứa 5% chất chiết, một nhóm bôi kem chứa 2% chất chiết. Độ khô ráp của da được đánh giá qua nhiều giai đoạn trong vòng 28 ngày. Kết quả cho thấy chất chiết xuất tác động một cách mạnh mẽ và ngay lập tức. Gần 75% tình nguyện viên thấy sự khác biệt rõ rệt của làn da sau khi bôi thuốc có 2% chất chiết, còn những người bôi thuốc có 5% chất chiết thì 83% người hài lòng. Các thử nghiệm đã chứng minh chất chiết xuất này có tác dụng tốt trên những làn da bị lão hóa, ngoài ra thành phần này còn an toàn, không gây ra dị ứng[16]. Kháng nấm: Viện công nghệ ở Ấn Độ đã khảo sát nồng độ khác nhau của Spilanthol chiết từ Spilanthes oleraceae L. lên hoạt động kháng nấm (nồng độ từ 0.1-.2.0mg). Đường kính của khu ức chế trong khoảng 0.1 - 2.3cm. Trong những loài nấm khác nhau được tiến hành thí nghiệm thì sự ức chế nấm giảm dần từ Fusarium oxysporium (2,3 cm) và Fusarum moniliformis. (2,1 cm) tiếp theo là Aspergillus niger (2.0) và paraciticus Aspergillus (1,8 cm)[17] 1.2.3. Giới thiệu một số bài thuốc trong y học cổ truyền có chứa hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Chữa đau nhức răng: Lấy hoa Núc áo rau đặt trực tiếp vào chỗ răng bị đau, rồi cắn nhẹ dần dần. Sau vài phút, cơn đau nhức dịu hẳn. Một ngày chúng ta làm khoảng vài lần. Có thể lấy cụm hoa phơi khô, giã nhỏ, ngâm với rượu trong vài giờ (càng lâu càng tốt), rồi ngậm, không nuốt. Có người còn dùng Núc áo rau thay thuốc tê để nhổ răng. Trong trường hợp răng bị sâu, đau nhức dữ dội, dùng cồn thuốc ngâm hoa để ngậm cũng có tác dụng tốt[18]. Chữa tê thấp, đau nhức xương, chân tay tê mỏi: Rễ Núc áo rau 5-10g, để sống hoặc tẩm rượu, sao vàng, rồi sắc hoặc hãm uống. Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác theo công thức sau:Rễ Núc áo rau 200g, rễ độc lực 200g, rễ bưởi bung 150g, rễ vú bò 150g, rễ thiên niên kiện 100g. Bốn vị đều phơi khô, thái nhỏ, sắc với hai lần nước rồi cô thành nửa lít cao. Rễ thiên niên kiện thái phiến mỏng, ngâm với nửa lít rượu 35-40° trong 10-15 ngày, sau đó lọc, trộn cao với rượu. Ngày uống hai lần, mỗi lần một chén. Có thể thêm đường cho dễ uống. Kết hợp dùng ngoài, lấy 30-50g cả cây Núc áo rau để tươi, rửa sạch, giã nhỏ, thêm ít rượu, chưng nóng, gói vào một miếng vải màn, đắp lên chỗ đau và băng lại[18]. Chữa đau bụng, đau đầu, tiêu chảy: Rễ Núc áo rau, rễ hoàng lực, rễ kim sương, rễ chanh và quả màng tang, mỗi vị 8g. Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày[18]. Chữa đinh râu: Hoa hoặc lá Núc áo rau giã nhỏ, cho vào nồi cùng với rượu đổ ngập, đun sôi trong 10-15 phút. Bắc ra, gạn rượu, để nguội. Uống khoảng một chén nhỏ, lấy bã đắp vào chỗ sưng đau[18]. Chữa mụn nhọt, lở loét: Hoa Núc áo rau 10g, giã giập, sắc với 200ml nước còn 50ml, uống làm một lần trong ngày (Hải Thượng Lãn Ông)[18]. Diệt muỗi, ruồi: Chất chiết các cụm hoa tươi của Núc áo rau dưới dạng nhũ dịch với xà phòng và hòa loãng với nước có tác dụng diệt bọ gậy của muỗi Anophen và giòi của ruồi nhà. Hoạt chất Spilanthol chiết được từ hoa cúc áo phơi khô cũng diệt được bọ gậy muỗi Anophen, muỗi Culicides và giòi ruồi nhà. Spilanthol diệt bọ gậy kém hơn thuốc DDT, nhưng nếu phối hợp hai chất này thì tác dụng sẽ tốt hơn[18]. Chữa hóc xương cá, xương gà: Lấy cụm hoa hoặc lá Núc áo rau 50g, lá mảnh cộng 50g, lá dưa chuột dại 50g, giấm thanh 20ml. Ba thứ lá dùng tươi, rửa sạch, giã nát, thêm giấm vào, trộn đều. Đợi khoảng 20 phút, vắt lấy một chén nhỏ, cho bệnh nhân vừa ngậm, vừa uống ít một làm nhiều lần[18]. Chữa cảm, sốt: Cây Núc áo rau khô 10-12g (nếu tươi thì dùng lượng gấp đôi). Sắc uống. Nếu có ho, đờm thì có thể thêm một số vị như mạch môn, thiên môn, vỏ rễ dâu[18]. PHẦN HAIĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu thuộc đề tài này là hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Đối tượng hỗ trợ trong nghiên cứu: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và trực khuẩn Escherichia coli. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu Thu hái hoa lúc còn tươi và đang nở rộ. Sau đó cắt phần cuống, chỉ giữ lại đầu hoa, đem sấy khô ở nhiệt độ từ 50-60°C. Giã nhỏ hoặc xay bằng máy, rồi cất vào túi sạch bảo quản ở điều kiện thường. 2.2.2. Định danh khoa học Sử dụng phương pháp hình thái và so sánh thực vật kết hợp với tài liệu tra cứu về thực vật, chúng tôi xác định tên thông thường, tên khoa học, họ thực vật của đối tượng nghiên cứu. 2.2.3. Phương pháp chiết Phương pháp chiết (ly trích) là phương pháp dùng dung môi để tách lấy một hay một nhóm chất từ đối tượng nghiên cứu. Phương pháp chiết bao gồm việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết. Trong đề tài này chúng tôi thực hiện chiết bằng phương pháp chiết Soxthlet (chiết nóng) và ngấm kiệt ngược dòng (chiết lạnh). Sau mỗi phân đoạn chiết tiến hành thu hồi cao chiết bằng cách chưng cách thủy để loại dung môi. Dung môi chúng tôi sử dụng cho cả hai phương pháp chiết là: cồn 98° và Chloroform. Vì hai loại dung môi này có thể hòa tan được nhiều loại chất từ phân cực yếu tới không phân cực. Nó hòa tan tốt các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực yếu khác. 2.2.3.1. Phương pháp chiết Soxthlet Phương pháp này được thực hiện bằng bộ chiết Soxthlet với hai loại dung môi là cồn 98° và Chlorofrom. Mỗi lần chiết kéo dài 4,5giờ. Hoàn lưu dung môi. Đây là phương pháp chiết nóng. Sau khi chiết, tiến hành thu cao chiết bằng cách chưng cách thủy để loại dung môi. Nguyên liệu: Đầu hoa Núc áo rau đã được phơi khô, giã nhỏ. Dung môi: tiến hành ly trích riêng với hai loại dung môi là Cồn 980 và Chloroform. Dụng cụ: Máy xay, cân. Bếp điện. Ống đong, cốc thủy tinh, phễu. Bộ chiết Soxthlet gồm: bình cầu, ống chứa mẫu, ống sinh hàn có hệ thống nước ra vào. Giấy lọc lớn để gói mẫu. Bình có nút mài để bảo quản sau khi ly trích. 2.2.3.2. Phương pháp ngấm kiệt ngược dòng Đây là phương pháp chiết lạnh, hoàn lưu dung môi. Chúng tôi cũng sử dụng hai loại dung môi là cồn 98° và Chloroform. Sau khi chiết, cũng tiến hành thu cao chiết bằng cách chưng cách thủy để loại dung môi. Nguyên liệu: Đầu hoa Núc áo rau đã được phơi khô, giã nhỏ. Dung môi: tiến hành ly trích riêng với hai loại dung môi là cồn 98° và Chloroform. Dụng cụ: Bình nút mài. Cốc đong, ống đong, phễu. Máy xay, cân. Giấy lọc loại lớn. 2.2.4. Phương pháp hình thái và giải phẫu Nguyên liệu: Thân, lá của hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Dụng cụ: Kính hiển vi với độ phóng đại x4, x10, x40, x100 có gắn máy chụp ảnh. Đĩa petri, cốc thủy tinh, bình tam giác. Đèn cồn, dao lam, lam kính, kim mũi mác. Xốp và các dụng cụ cần thiết khác. Hóa chất: Dung dịch KOH 5%. Dung dịch H2O2. Cồn 98°. Acid acetic, Carmin, Xanh Metyl, nước cất, Glycerin. Quy trình tiến hành giải phẫu: Bước 1: Chuẩn bị Lá được hái lúc còn tươi, rửa sạch, ngâm trong dung dịch KOH 5% trong vòng từ 6-7 ngày trước khi tiến hành giải phẫu. Thân cây thì được hái lúc còn tươi, rữa sạch và giải phẫu ngay sau khi hái. Bước 2: Quy trình giải phẫu Phương pháp cắt lát mỏng thực vật: Cắt một miếng xốp có mặt phẳng. Khoét ở mặt phẳng miếng xốp một khe nhỏ theo hình vật cắt, sao cho vật cắt được giữ chặt trong miếng xốp. Để mặt phẳng của lưỡi dao lam áp sát với mặt phẳng của miếng xốp gắn vật cắt, sau đó kéo chéo từ trái sang phải. Không kéo thẳng vào ngực, không day đi day lại vì sẽ làm nát miếng cắt. Sau mỗi lần cắt dùng kim mũi mác lấy vi phẫu đã cắt cho ngay vào dung dịch nước Javen. Phương pháp tách tế bào biểu bì trên lá: Lá sau khi ngâm trong dung dịch KOH 5% từ 6-7 ngày, dùng kẹp gắp ra cho vào cốc đựng dung dịch H2O2. Đun trên ngọn lửa đèn cồn khoảng 5 phút. Sau đó, cho lá vào nước để tế bào biểu bì lá tách ra. Phương pháp nhuộm màu tế bào thực vật: Vi phẫu sau khi cắt, ngâm ngay vào nước Javen trong 15-30 phút để loại hết nội dung của tế bào. Rửa sạch nước Javen bằng nước thường. Tiếp đó ngâm vào nước có pha Acid acetic trong 5 phút để loại hết nước Javen còn dính lại (Nếu không nước Javen sẽ làm mất màu của thuốc nhuộm về sau). Rửa sạch Acid acetic bằng nước thường. Nhuộm đỏ trong dung dịch Carmin khoảng 30 phút. Rửa qua bằng nước thường rồi nhuộm trong dung dịch Xanh metyl khoảng 1 phút. Rửa sạch bằng nước thường rồi làm tiêu bản quan sát trong một giọt Glicerin. Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh: Đo đếm kích thước của tế bào biểu bì, khe lỗ khí khổng, cũng như số lượng lỗ khí khổng. Quan sát các tế bào, mạch, bó mạch. - Chụp ảnh các tiêu bản. 2.2.5. Phương pháp phục hồi chủng giống và thử khả năng ức chế của cao chiết trên vi sinh vật Phục hồi chủng giống: Chủng vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh (0 – 6oC)phòng thí nghiệm. Vì vậy trước khi tiến hành nuôi cấy ta phải tiến hành phục hồi chủng giống. Cách thức phục hồi chủng giống được tiến hành như sau: Dùng que cấy đầu tròn hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu que cấy đỏ rực, sau đó hơ phần cán để khử trùng toàn bộ que cấy. Trước khi lấy huyền dịch vi khuẩn, di đầu que cấy trên thành ống nghiệm cho đầu que cấy nguội, rồi gạt lấy huyền dịch vi khuẩn. Nhẹ nhàng cấy ria trên đĩa petri có chứa môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp. Lật úp đĩa petri, bỏ vào tủ ấm, nuôi cấy ở 30°C trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành chọn các khuẩn lạc điển hình như sau: Dùng que cấy đầu tròn, sau khi hơ đỏ rực trên ngọn lửa đèn cồn, làm nguội que cấy, gạc lấy một khuẩn lạc điển hình nằm rời, rõ cho vào bình tam giác có chứa môi trường canh thang dinh dưỡng thích hợp, dùng que cấy đánh tan tế bào trên thành ống nghiệm và tiếp tục nuôi cấy ở 30°C trong 24 giờ. Từ đây ta tiến hành pha loãng dịch vi khuẩn rồi cấy lên đĩa petri có môi trường canh thang dinh dưỡng phù hợp, ta sẽ có các khuẩn lạc vi khuẩn đồng nhất, dùng làm giống. Thử khả năng ức chế: Phân thành năm lô thí nghiệm cho mỗi chủng vi sinh vật thử nghiệm như sau: Lô ĐC: Lô đối chứng chỉ nuôi riêng đối tượng vi sinh vật và có bổ sung thêm 5ml cồn 10%. Lô A1/C1: Bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật 0.1g cao chiết được chiết bằng dung môi cồn 98°. Lô A2/C2: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật 0.2g cao chiết được chiết bằng dung môi cồn 98°. Lô B1/D1: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật 0.1g cao chiết được chiết bằng dung môi Chloroform. Lô B2/D2: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật 0.2g cao chiết được chiết bằng dung môi Chloroform. Vi khuẩn sau khi đã được kích hoạt, ta chọn khuẩn lạc riêng lẻ để cấy vào cả năm lô thí nghiệm với một lượng vi khuẩn tương đương nhau Sau 24giờ nuôi cấy lắc ở tất cả các lô, tiến hành pha loãng mẫu với mật độ tế bào tương đương nhau. Sau đó cấy lên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp. Nuôi cấy ở 30°C trong 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định mật độ vi sinh vật bằng cách đếm khuẩn lạc. So sánh với lô đối chứng để đánh giá khả năng ảnh hưởng của cao chiết lên sự phát triển của vi sinh vật. 2.2.6. Phương pháp pha loãng mẫu * Đối với chủng L.acidophillus Lấy 6 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 tới 6 và cho vào mỗi ống 9ml nước muối sinh lý 0.85% . Hút lấy 1 ml huyền dịch vi khuẩn cho vào ống 1 lắc đều, được tỉ lệ pha loãng 1/10 (10-1) Tiếp theo hút lấy 1 ml ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 được tỷ lệ pha loãng 1/100 (10-2). Tiếp tục pha loãng đến 10-6. Hút lấy 0.1ml dịch tế bào ở độ pha loãng 10-5 và 10-6. Ở mỗi độ pha loãng cấy vào 2 đĩa petri có chứa môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp nuôi cấy trong tủ ấm 30°C trong 48 giờ. Đọc kết quả mật độ khuẩn lạc mọc trên các đĩa. * Đối với chủng E.coli: - Tiến hành pha loãng tương tự như đối với chủng L.acidophillus nhưng pha loãng tới 10-8. 2.2.7. Phương pháp pha loãng cao chiết Hấp khử trùng đũa thủy tinh, cốc thủy tinh 100ml. Phương pháp pha loãng cao chiết được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Cao chiết được khử trùng bằng tia UV trong vòng 30phút. Hòa cao chiết trong 0.5ml cồn 98°. Sau đó thêm 4.5ml nước. Ta được cao chiết trong cồn 10%. PHẦN BAKẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, SINH THÁI CỦA NÚC ÁO RAU (SPILANTHES OLERACEAE L.) 3.1.1. Đặc điểm về hình thái 3.1.1.1. Hình thái bên ngoài Thân: Thân có màu tía, thường mọc đứng hoặc nằm ngang ở phần gốc, thân nhẵn, đôi khi có lông nhỏ, cao từ 30-60cm, thân tương đối mềm, phân thành nhiều nhánh. Lá: Lá mọc đối, hình bầu dục hoặc bầu dục tam giác, lá dài 3-7cm, gốc hơi thuôn, đầu nhọn, mép khía răng có 3 gân chính, có 5 cặp gân phụ, cuống lá dài từ 1 – 1.5cm. Hình 3.1: Núc áo rau Hoa: Cụm hoa mọc trên một cán dài 8-10cm, thành đầu mọc vàng, mọc ở ngọn thân hoặc kẽ lá, tổng bao có lá bắc hình bầu dục nhọn đầu, đế hoa có hình nón nhọn, mào lông có 2 răng cứng, tràng hoa hình lưỡi thường không rõ, tràng hoa ống hình bầu dục, bao phấn có phần phụ hình tam giác, hơi có tai ở gốc, bầu gân bầu dục có lông. Hoa đầu có độc ở chót nhánh, thường ở nơi chẻ hai của nhánh, cọng tương đối ngắn 1.5-2 cm, hoa đầu rộng 8 mm. 3.1.1.2. Hình thái giải phẫu Để nghiên cứu cấu trúc giải phẫu của hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) chúng tôi thực hiện các lát cắt ngang, cắt xuyên tâm trên thân và tách biểu bì mặt trên, mặt dưới lá. Cấu trúc giải phẫu thân 3 4 1 2 Hình 3.2: Lát cắt ngang thân 1. Mô dày 2. Mô mềm 3. Libe 4. Gỗ Trên lát cắt ngang của thân, chúng tôi nhận thấy ở những phần thân già, gần rễ thân rỗng. Ở những phần thân gần ngọn, cấu trúc thân đặc hơn. Các tế bào mô mềm xếp khít nhau, không có khoảng gian bào. Quan sát toàn lát cắt, chúng tôi nhận thấy loài cây này có 12 bó mạch. Số lượng bó mạch ít chứng tỏ cây thích hợp sống trong điều kiện ẩm, không cần nhiều mạch để dẫn truyền nước. 2 1 3 4 Hình 3.3: Lát cắt xuyên tâm 1. Mô dày 2. Mô mềm 3. Libe 4. Gỗ Trên lát cắt xuyên tâm của thân, chúng tôi nhận thấy sau lớp mô dày là một lớp tế bào mô mềm. Tiếp sau là Phloem (Libe), sau lớp Libe là Xylem (gỗ). Phần quản bào của Xylem có dạng vòng xoắn ốc. Dạng vòng xoắn ốc khá tiến hoá, dễ dàng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng lên nuôi cây. 1 2 Cấu trúc giải phẫu lá: Hình 3.4: Biểu bì lá mặt trên và mặt dưới 1. Lỗ khí khổng 2. Tế bào biểu bì lượn sóng Sau khi tách biểu bì mặt trên và mặt dưới của lá, chúng tôi nhận thấy các tế bào biểu bì mặt trên và mặt dưới của lá có hình dạng và kích thước thay đổi tùy theo vị trí khác nhau. Các tế bào biểu bì thuộc dạng dị bào hay có vách giao tầng lượn sóng. Sự uốn lượn là kết quả của quá trình kéo căng trong thời gian phân hóa của lá hay do sự hóa rắn của lớp cutin đang phân hóa tạo ra. Mặt trên và dưới của lá đều có các tế bào khí khổng. Tuy nhiên mật độ tế bào khí khổng mặt trên ít hơn mặt dưới của lá. Các lỗ khí khổng được cấu tạo bởi hai tế bào hình hạt đậu hay hình thận úp ngược vào nhau, hai tế bào này có độ dày màng tế bào không đều. Các tế bào lỗ khí có chứa lục lạp, nhờ đó mà nó thực hiện được quá trình đóng mở của khe lỗ khí. Kích thước trung bình các tế bào lỗ khí vào khoảng 45 x 65µm, chiều dài khe lỗ khí khoảng 60 - 70µm, chiều rộng khe khoảng 40 - 50µm. Mật độ phân bố của lỗ khí trên biểu bì mặt dưới của lá Núc áo rau trung bình là 39 tế bào khí khổng trên 1mm2. Mật độ phân bố của lỗ khí trên biểu bì mặt trên của lá thì trung bình là 13 tế bào khí khổng trên 1mm2. Mật độ khí khổng nhiều chứng tỏ tuy là cây ưa bóng nhưng cây vẫn có thể thích nghi được trong điều kiện sống nhiều ánh sáng. 3.1.2. Đặc điểm sinh thái Chúng tôi đã tiến hành thu mẫu tại một số địa điểm như Langbiang, ven đường Trần Phú, ven khuôn viên trường Đại học Đà Lạt. Tại những nơi thu mẫu, chúng tôi nhận thấy loài hoa này phân bố theo nhóm, các nhóm phân bố trong tự nhiên cách nhau không xa. Cây sinh trưởng tốt trong điều kiện ẩm, hơi chịu bóng, cây thường mọc lẫn vào bãi cỏ hoặc những nơi đất ẩm.Cây có tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ thích nghi với điều kiện tại Đà Lạt. 3.2. XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT CAO CHẤT CÓ TRONG CÂY NÚC ÁO RAU (SPILANTHES OLERACEAE L.) 3.2.1. Quy trình tách chiết cao chất có trong cây Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) bằng phương pháp chiết Soxthlet Quy trình tách chiết cao chất có trong hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.): Bước 1: Chuẩn bị mẫu Hoa rửa sạch, phơi khô. Cho vào cối xay nhỏ. Đem cân. Cho vào giấy lọc lớn gói lại. Bước 2: Tiến hành tách chiết Cân 50g hoa tươi (tương đương với 13g hoa khô) đã giã nhỏ gói vào giấy lọc lớn. Đẩy mẫu vào ống chứa mẫu của hệ thống chiết Soxthlet. Đong 400ml dung môi (cồn 98° hoặc Chloroform) cho vào ống chứa mẫu ngâm trong 30 phút, phần còn lại đổ vào bình cầu. Đặt bình cầu lên bếp điện, lắp ống chứa mẫu và ống sinh hàn. Bật bếp và mở hệ thống nước. Tiến hành ly chiết trong 4,5giờ. Sau đó cứ tiến hành các bước như trên nhưng thay mẫu hoa mới, vẫn sử dụng dung môi cũ. Lặp lại 4 lần cho mỗi loại dung môi. Bước 3: Cô đặc dịch chiết Thu hồi cao chiết cho vào các cốc đong lớn rồi chưng cất trên bếp cách thủy trong thời gian khoảng 6.5 – 7giờ. Khi thấy dịch chiết là chất sệt thì đem xuống, đậy giấy bạc và bào quản ở nhiệt độ thường. Sơ đồ quy trình: Nguyên liệu (50g hoa tươi hay 13g hoa khô) Bảo quản trong cốc đong đậy bằng giấy bạc Xay nhỏ Gói vào giấy lọc Thu dịch chiết Chiết bằng 400 ml cồn 98° hay Chloroform trong hệ thống chiết Soxthlet Thu cao chiết Rửa sạch 4.5 giờ Chưng trên bếp cách thủy 6.5-7 giờ Hình 3.5: Sơ đồ quy trình chiết bằng phương pháp Soxthlet Giải thích quy trình: Mục đích rửa sạch hoa là để loại bỏ bụi bẩn. Chúng tôi xay nhỏ hoa để tạo điều kiện cho dung môi dễ dàng thấm vào hoa, hòa tan được nhiều nhất lượng chất cần chiết có trong hoa. Giúp hiệu quả tách chiết đạt kết quả cao nhất. Mục đích gói mẫu vào giấy lọc nhằm giảm cặn bã lẫn vào dịch chiết. Thời gian cho mỗi giai đoạn chiết là 4.5giờ nhằm mục đích tạo điều kiện cho dung môi thấm dễ dàng vào mẫu và hòa tan được tối đa lượng chất cần chiết có trong mẫu. Việc tách chiết được lặp lại 4 lần nhằm tăng hiệu quả tách chiết và tăng tính đậm đặc cho cao chất được chiết. 3.2.2. Quy trình tách chiết cao chất có trong cây Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) bằng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng Quy trình tách chiết cao chất có trong hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.): Bước 1: Chuẩn bị mẫu Hoa rửa sạch, phơi khô. Cho vào cối xay nhỏ. Đem cân. Cho vào giấy lọc lớn gói lại. Bước 2: Tiến hành tách chiết Đầu tiên cân hoa đã phơi khô, giã nát (50g hoa tươi hay 13g hoa khô) gói vào giấy lọc loại lớn, bỏ vào bình, đong 400ml dung môi (cồn 98° hoặc Chloroform) đổ vào bình. Đậy kín nắp. Ngâm hoa trong vòng 48 giờ. Sau đó thu dung môi, lấy bã hoa đó cho vào bình thứ 2, đong 400ml dung môi mới (cồn 98° hoặc Chloroform) đổ vào bình. Đậy kín nắp. Ngâm hoa trong vòng 48 giờ. Sau đó bỏ bã hoa, lấy dung môi. Cho 1 lượng hoa khác vào dung môi đó. Cứ tiếp tục như thế cho tới khi thay hoa 4 lần và thu được 4 dung môi. Bước 3: Cô đặc dịch chiết Thu hồi dịch chiết cho vào các cốc đong lớn rồi chưng cất trên bếp cách thủy từ 6.5 – 7giờ. Khi thấy dịch chiết là chất sệt thì đem xuống, đậy giấy bạc và bào quản ở nhiệt độ thường. Sơ đồ quy trình: Hình 3.6: Sơ đồ quy trình chiết bằng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng Giải thích quy trình: Mục đích rửa sạch hoa để loại bỏ bụi bẩn. Chúng tôi xay nhỏ hoa để tạo điều kiện cho dung môi dễ dàng thấm vào hoa, hòa tan được nhiều nhất lượng chất cần chiết có trong hoa. Giúp hiệu quả tách chiết đạt kết quả cao nhất. Mục đích gói mẫu vào giấy lọc nhằm giảm cặn bã lẫn vào dịch chiết. Thời gian cho mỗi giai đoạn chiết là 48giờ nhằm mục đích tạo điều kiện cho dung môi thấm dễ dàng vào mẫu và hòa ta được tối đa lượng chất cần chiết có trong mẫu. Thời gian này dài hơn phương pháp chiết Soxthlet vì đây là phương pháp chiết lạnh.Việc tách chiết được thay 4 lần hoa và 4 lần dung môi nhằm tăng hiệu quả tách chiết và tăng tính đậm đặc cho cao chất được chiết. Nhận xét: Qua kết quả nghiên cứu bước đầu, chúng tôi nhận thấy có thể sử dụng 2 phương pháp chiết nóng (Soxthlet) và chiết lạnh (ngấm kiệt ngược dòng) để thu cao chất từ cây Núc áo rau. Tuy nhiên, nếu sử dụng dung môi Chlorofom thì dùng phương pháp chiết lạnh đạt hiệu quả tốt hơn, nhưng nếu sử dụng dung môi cồn 980 thì sử dụng phương pháp chiết Soxthlet cho hiệu quả tách chiết tốt hơn. Bảng 3.1: Lượng cao chiết thu được Dung môi Phương pháp chiết Soxthlet Ngấm kiệt ngược dòng Chloroform 2.82g 3.19g Cồn 98° 6.2g 5.89g 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CAO CHIẾT THÔNG QUA ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 3.3.1. Đánh giá khả năng ứng dụng của cao chiết thông qua đánh giá mức độ ảnh hưởng của nó lên sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus Sau 24 giờ nuôi cấy 5 lô thí nghiệm. Chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu tới nồng độ 10-5 và 10-6 và sau đó cấy lên môi trường thạch LB. Ở mỗi nồng độ, chúng tôi cấy 2 đĩa. Sau đó chúng tôi nuôi ở tủ ấm 30°C trong 48 giờ. Chúng tôi đếm được lượng khuẩn lạc trung bình như sau: Bảng 3.2: Bảng số lượng khuẩn lạc L.acidophilus trung bình đếm được trên các đĩa ở từng nồng độ. Nồng độ Lượng khuẩn lạc đếm được trên các lô thí nghiệm ĐC A1 A2 B1 B2 10-5 265 32 21 75 16 10-6 134 8 4 19 5 Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng cao chiết lên sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus (lô A1, A2) (lô A1, A2) (lô B1, B2) (lô B1, B2) Lô A1/B1 Lô A2/B2 tăng trưởng của vi khuẩn L. acidophilus Nhận xét: Dựa vào biểu đồ trên, chúng tôi nhận thấy khi môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm lượng cao chiết từ hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) thì vi khuẩn L.acidophilus kém phát triển hơn so với lô đối chứng. Ngoài ra, khi tăng lượng cao chiết lên thì mức độ tăng trưởng của vi khuẩn cũng giảm xuống. Điều này chứng tỏ cao chiết từ loài hoa này có ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus. Vì lượng khuẩn lạc mọc không đều và do thời gian nghiên cứu còn hạn chế nên chúng tôi không thể đánh giá cao chiết từ dung môi nào ức chế sự phát triển của vi khuẩn L.acidophilus tốt hơn. Hình 3.8: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng cao chiết lên sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus (ở độ pha loãng 10-5) ĐC A1 B1 A2 B2 Hình 3.9: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng cao chiết lên sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus (ở độ pha loãng 10-6) ĐC A1 B1 A2 B2 3.3.2. Đánh giá khả năng ứng dụng của cao chiết thông qua đánh giá mức độ ảnh hưởng của nó lên sự phát triển của trực khuẩn Escherichia coli Sau 24 giờ nuôi cấy 5 lô thí nghiệm. Chúng tôi tiến hành pha loãng dịch vi khuẩn tới nồng độ 10-7 và 10-8 và sau đó cấy lên môi trường thạch MRS. Ở mỗi nồng độ pha loãng, chúng tôi cấy lên 2 đĩa. Sau đó, chúng tôi nuôi ở tủ ấm 30°C trong 48 giờ. Chúng tôi đếm được lượng khuẩn lạc trung bình như sau: Bảng 3.3: Số lượng khuẩn lạc E.coli trung bình đếm được trên các đĩa ở từng nồng độ. Nồng độ Lượng khuẩn lạc đếm được trên các lô ĐC C1 C2 D1 D2 10-7 560 363 176 459 112 10-8 86 56 21 22 6 (lô C1, C2) (lô C1, C2) (lô D1, D2) (lô D1, D2) Lô C1/D1 Lô C2/D2 Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng trưởng của trực khuẩn E.coli tăng trưởng của trực khuẩn E.coli Nhận xét: Từ bảng kết quả trên, chúng tôi nhận thấy khi môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm lượng cao chiết từ hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) thì trực khuẩn E.coli kém phát triển hơn so với lô đối chứng. Ngoài ra, khi tăng lượng cao chiết lên thì mức độ phát triển của trực khuẩn cũng giảm xuống. Điều này chứng tỏ cao chiết từ loài hoa này có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn E.coli. Vì lượng khuẩn lạc mọc không đều và do thời gian nghiên cứu còn hạn chế nên chúng tôi không thể đánh giá cao chiết từ dung môi nào ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.coli tốt hơn. Hình 3.11: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng trưởng của trực khuẩn E.coli (ở độ pha loãng 10-7) ĐC C1 D1 C2 D2 Hình 3.12: Hình ảnh thể hiện sự ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng trưởng của trực khuẩn E.coli (ở độ pha loãng 10-8) ĐC C1 D1 C2 D2 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút ra được một số kết luận sau: Núc áo rau có danh pháp khoa học là Spilanthes oleraceae L., thuộc họ Cúc (Asteraceae), chi Spilanthes và loài oleraceae L. Các tên gọi khác như Cúc áo hoa vàng, nụ áo vàng, cỏ the, nút áo, cuống trầm, cúc lác, phắc khát, cỏ nhả hàn… Đây là loài cây ưa ẩm, chịu bóng, sinh trưởng phát triển nhanh. Bước đầu xây dựng được hai quy trình chiết cao chất có trong hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) bằng phương pháp chiết Soxthlet (chiết nóng) và ngấm kiệt ngược dòng (chiết lạnh). Sử dụng dung môi Chlorofom thì dùng phương pháp chiết lạnh đạt hiệu quả tốt hơn, nhưng nếu sử dụng dung môi cồn 98o thì sử dụng phương pháp chiết Soxthlet cho hiệu quả tách chiết tốt hơn. Cao chiết của hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) có tác động ức chế đến sự tăng trưởng của vi khuẩn L.acidophilus (Gram (+)) và trực khuẩn E.coli (Gram (-)).Trong đó, ức chế tốt hơn đối với vi khuẩn L.acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+). 2. Kiến nghị Cần có những nghiên cứu tiếp theo để tìm hiểu cụ thể, chi tiết hơn về đặc điểm sinh học, sinh thái và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) Tiếp tục tiến hành những thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết hoa Núc áo rau (Spilanthes oleraceae L.) lên sự phát triển của những vi sinh vật khác với dải nồng độ cao chiết lớn hơn để đánh giá cụ thể, rõ ràng hơn tác dụng của cao chiết, từ đó có hướng ứng dụng phù hợp. Tiến hành trồng có quy mô để thu hoa với số lượng lớn làm nguồn nguyên liệu. TÀI LIỆU THAM KHẢO Sách: Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, Hoàng Huỳnh Hoa, Thực vật học, NXB Hà Nội (2007) Đỗ Huy Bích, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội (2006) Hoàng Thị Bình, Bài giảng tóm tắt môn hóa thực vật (2010) Võ Văn Chi, Cây thuốc trị bệnh thông dụng, NXB Thanh Hóa Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ (1999) Katherine Esau, Giải phẫu thực vật, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội (1980) Trần Công Khánh, Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội (1981) Nguyễn Xuân Thành, Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành, Nhà xuất bản nông nghiệp (2007) Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, Hoàng Huỳnh Hoa, Thực vật học, NXB Hà Nội (2007) Trang web: PHỤ LỤC Môi trường LB (Lauria Broth) theo (Sambrook etal 1989) Trypton: 10g Yeast extract: 5g NaCl: 8g pH: 7.2 Nước: 1Lít Môi trường MRS Casein peptone: 10g Meat extract: 10g Yeast extract: 5g Glucose: 20g Tween 80: 1g K2HPO4: 2g CH3COONa: 5g Citrate amonium: 2g MgSO4.7H2O: 0.2g MnSO4.H2O: 0.05g pH: 6.2 – 6.5 Agar: 17g Nước: 1Lít