Đề tài Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm Rhizoctonia solani Kuhn

1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Rhizoctonia solani Kuhn là một loài nấm phổ biến trong đất, có địa bàn phân bố rộng khắp thế giới. Nấm gây hại trên các giai đoạn phát triển của cây từ tiền nảy mầm đến trổ bông, tạo tán và ở tất cả các bộ phận của cây từ rễ đến trái. Nấm này là nguyên nhân gây bệnh đốm vằn trên lúa. Ngoài ra, nấm này còn là nguyên nhân gây thối hạt giống làm thối thân, thối rễ, thối trái và gây bệnh cháy lá ở rất nhiều cây trồng thuộc các họ thực vật khác nhau. Ở nước ta, điều kiện khí hậu và tập quán canh tác rất thích hợp cho nấm Rhizoctonia solani tồn lưu, phát triển và gây bệnh. Bệnh đốm vằn hại lúa do nấm này gây ra được đánh giá là một bệnh nguy hiểm, làm giảm năng suất lúa một cách nghiêm trọng ở các tỉnh phía Nam. Nấm này cũng được xem là một tác nhân quan trọng gây ra bệnh chết cây con cho bông vải thuốc là và nhiều loại rau đậu. Hiểu biết về lịch sử đời sống của nấm gây bệnh cây là quan trọng trong việc phát triển các chiến lược thích hợp để quản lí bệnh do chúng gây ra. Nghiên cứu trên thế giới đã công bố về sự đa dạng di truyền và mối quan hệ trong và giữa các quần thể nấm R. solani từ nhiều cây trồng và nhiều vùng địa lí khác nhau. Tuy nhiên các nghiên cứu về vấn đề này ở nước ta còn rất ít. Khả năng sử dụng các kỹ thuật phân tử để phân tích sự đa dạng di truyền giữa các dòng phân lập của nấm R. solani đã được chứng minh (Kuninaga và ctv, 1997; Matsumoto và ctv, 1996; Liu và Sinclair, 1992; O’Brien, 1994; Boysen và ctv, 1996). Các kỹ thuật như lai DNA/DNA, RFLP, RAPD, Southern blot đã phân chia các dòng phân lập R. solani thành các nhóm riêng biệt về mặt di truyền. Trong đó có kỹ thuật đọc trình tự DNA dường như cung cấp số liệu tốt nhất cho việc nhận biết về sự biến động di truyền trong và giữa các quần thể R. solani. Từ những nhận định trên, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, chúng tôi tiến hành đề tài :”Bƣớc đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm Rhizoctonia solani Kuhn”. 2 1.2. Mục đích Bổ sung thêm thông tin về quần thể nấm R. solani ở nước ta làm cơ sở cho việc phát triển các chương trình lai tạo thích hợp cho các vùng sinh thái riêng biệt. 1.3. Yêu cầu  Thu thập các mẫu thực vật bệnh ở nhiều tỉnh và phân lập nấm R. solani.  Nuôi cấy sinh khối các dòng nấm đã phân lập được.  Li trích DNA các dòng nấm trên.  Tiến hành phản ứng PCR với DNA vừa li trích trên vùng ITS của rDNA sử dụng hai mồi (primer) ITS4 và ITS5.  Đọc trình tự vùng rDNA – ITS với hai primer ITS1 và ITS4. 1.4. Giới hạn đề tài Việc đọc trình tự vùng rDNA – ITS của nấm R. solani chỉ được thực hiện trên 2 dòng nấm đại diện. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani 2.1.1. Vị trí phân loại Nấm Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia Sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi Imperfecti, giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris, thuộc lớp nấm Basidomycetes. Đây là nhóm nấm lớn, phân bố rộng, kí sinh không chuyên tính có phổ kí chủ rộng (Carling và ctv, 1992). Hiện nay, chưa thấy công bố giai đoạn hữu tính của nấm này ở Việt Nam. Nấm gây bệnh chủ yếu dưới dạng vô tính là Rhizoctonia solani. 2.1.2. Đặc điểm hình thái của nấm Rhizoctonia solani Nấm R. solani có dạng sợi dài, tạo hạch và không sinh bào tử. Sợi nấm trong mô tế bào khi còn non không có màu, khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt. Sợi nấm đa bào, phân nhánh tương đối thẳng góc với sợi nấm chính. Chỗ phân nhánh hơi thắt nhỏ lại. Sợi nấm trưởng thành có đường kính từ 8 – 12µm (Nguyễn Việt Long, 2001). Nấm tạo hạch trên cây kí chủ, hạch không đều, có hình tròn dẹt ở phía dưới, khi còn non có màu trắng, khi già có màu nâu đậm. Bề mặt của hạch thô và có nhiều lổ nhỏ li ti. Hạch nấm có thể ít hay nhiều, nhỏ hay lớn tùy thuộc vào các dòng nấm khác nhau. Bào tử hậu của nấm rất ít khi gặp, chỉ phát sinh khi có độ ẩm khá cao. Sinh sản hữu tính tạo đảm đơn bào tử. Ở nước ta, nấm R. solani sinh trưởng và phát triển chủ yếu dưới dạng sợi và hạch nấm, chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (Nguyễn Việt Long, 2001). 2.1.3. Đặc điểm sinh lí Nấm R. solani phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ từ 27 – 300C và có khoảng pH thích hợp là 2,5 – 7,8 nhưng nấm hoạt động mạnh nhất trong khoảng pH từ 5,4 – 6,7. Ở nhiệt độ 28 – 300C hạch nấm hình thành nhiều nhất. Dòng nấm có hạch càng lớn thì có độc tính càng cao. Trên đồng ruộng, hạch nấm tồn tại rất lâu trong đất, đây là nguồn gây bệnh chủ yếu. Hạch nấm có thể nảy mầm ở 16 – 30 0C, khuẩn ty phát triển ở nhiệt độ là 21 – 4 38 0C và ẩm độ cao 95 – 96%. Nấm R. solani sống tốt trên cả 3 loại đất: thịt pha cát, đất thịt mùn và đất sét pha cát. Hạch nấm có thể chịu ngập trong 96 giờ mà không giảm sức sống nếu như giữ khô từ 24 – 168 giờ sau khi ngập. Tuy nhiên, nếu thời gian ngập kéo dài hơn 168 giờ sẽ làm mất khả năng sống sót và sự ngập nước cũng làm giảm tiềm năng lây bệnh từ hạch nấm nằm trong nước (Nguyễn Việt Long, 2001). Nấm R. solani lây lan chủ yếu bằng hạch nấm qua cỏ dại, qua rơm rạ và hạch rơi rụng từ vụ trước. Các hạch nấm này gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành sợi nấm và gây bệnh trở lại. Ngoài ra, nấm có thể lưu tồn trong thân, xác bã thực vật và cả trong đất. Nấm cũng có thể lan truyền bệnh bằng các sợi nấm còn tồn tại trong gốc rạ hoặc các lá bị bệnh sau khi thu hoạch. Sự lan truyền của hạch nấm cũng có thể do các dòng nước cuốn đi, do mưa hoặc các dòng nước trên đồng ruộng. Các hạch nấm này gặp các cây kí chủ thích hợp sẽ bám vào và phát triển (Papavizas và ctv, 1957). Trong phòng thí nghiệm, nấm R. solanni có thể mọc tốt trên nhiều loại môi trường khác nhau như PDA, PGA, PGB, không đòi hỏi môi trường chuyên biệt. Nhưng nấm này phát triển tốt nhất trên môi trường PGA. Nấm phát triển rất nhanh, khoảng 3 – 4 ngày là đầy đĩa petri và hạch nấm bắt đầu hình thành. Sợi nấm lúc đầu màu trắng trong nhưng khoảng 2 – 3 ngày sau sợi nấm chuyển thành màu nâu. Ban đầu, hạch nấm nhỏ li ti và có màu trắng. Hạch thường mọc rải rác khắp đĩa, nhưng một số dòng nấm thì hạch mọc rời và cũng có dòng, hạch mọc thành từng mảng liên kết nhau. Sau 2 – 3 ngày, hạch nấm lớn dần và chuyển thành màu nâu đậm. Trên môi trường nuôi cấy, hạch nấm có kích thước lớn hơn hạch nấm trong điều kiện tự nhiên. Nấm R. solani có thể lưu giữ được ở nhiệt độ phòng từ 6 – 12 tháng trong ống nghiệm chứa môi trường PGA. 2.1.4. Phổ kí chủ của nấm Rhizoctonia solani Nấm R. solani là nấm đa thực bán kí sinh điển hình, có phổ kí chủ rộng. Nấm này có thể xâm nhiễm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Có khoảng 200 loài thực vật bao gồm cây lương thực, cây hoa màu, cây công nghiệp và các loại cỏ khác nhau bị nấm này gây hại. Nấm R. solani xuất hiện khắp nơi trên thế giới và gây thiệt hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Nấm R. solani có khả năng gây bệnh trên rất nhiều loại cây khác nhau, gây bệnh bao gồm rất nhiều loại cây như: lúa, ngô (bắp), các cây họ đậu, lục bình, rau 5 muống,…Theo Gangopadyay và Chaksabarti (1982) thì nấm Rhizoctonia solani là loại đa kí chủ gây hại trên hầu hết các cây trồng thuộc 32 họ và trên 20 loại cỏ thuộc 11 họ thực vật khác nhau. Nấm này còn gây bệnh chết rạp cây con và lở cổ rễ tr0ên cà phê, trà, thối cổ rễ ở cây chuối, đậu phọng, gây cháy lá trên dưa chuột và bầu bí, gây lở cổ rễ bông vải, héo vàng khoai tây (Nguyễn Việt Long, 2001). 2.1.5. Sự xâm nhiễm và khả năng gây bệnh R. solani xâm nhập vào kí chủ và gây bệnh mạnh nhất trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao 25 – 30 0C, ẩm độ khoảng 95%. Nấm xâm nhập vào mô qua khí khổng hoặc xuyên trực tiếp qua lớp cutin, qua vết thương cơ giới hoặc trực tiếp qua biểu bì. Nấm thường hình thành tản lây nhiễm trước khi xâm nhập vào mô cây để hấp thu chất dinh dưỡng và làm chết cây. 2.2. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 2.2.1. Giới thiệu kĩ thuật PCR Kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction), được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử. Việc phát minh ra máy thermocycler (máy chu trình nhiệt tự động) và sử dụng enzyme Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR là một bước phát triển cực kì quan trọng trong các thí nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Trong phản ứng PCR, các mạch đơn mới được tổng hợp lại được làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới của chu kì tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần sự tham gia của primer tạo các 3’ -OH tự do. Các nucleotide được gắn vào vị trí nhóm -OH kéo dài tạo thành mạch mới (Khuất Hữu Thanh, 2003). 2.2.2. Qui trình Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước và thường xảy ra trong khoảng 25 – 45 chu kì với các giai đoạn như sau: giai đoạn biến tính, giai đoạn lai, giai đoạn kéo dài. 2.2.2.1. Biến tính (denature) Phân tử DNA được làm biến tính (denaturation) ở nhiệt độ cao là khoảng 940C – 96 0 C trong thời gian là 30 giây đến 1 phút. Ở giai đoạn này các phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới. 6 2.2.2.2. Giai đoạn lai (annealing) Nhiệt độ đựơc hạ thấp cho phép các mồi (primer) bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này phụ thuộc vào nhiệt nóng chảy của mồi (primer). Thời gian của giai đoạn này là 30 giây đến 1 phút. 2.2.2.3. Kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng đến 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường từ 30 giây đến vài phút tùy thuộc vào kích thước của trình tự DNA cần khuếch đại. Sau vài chục chu kì thì số lượng DNA khuếch đại tăng theo hàm số mũ như sau: M = m.2 n Trong đó: M: số lượng DNA cần tổng hợp. m: là số lượng DNA ban đầu n: là số chu kì phản ứng. Trong quá trình PCR ở những chu kì cuối nhiệt độ cần tăng lên 1 – 20C. Do về sau, lượng primer giảm và lượng khuôn tăng lên, mặt khác enzyme taq polymerase hoạt động yếu dần do tác động của nhiệt độ. Vì vậy, nhiệt độ tăng ở các chu kì cuối nhằm làm tăng hiệu quả tổng hợp DNA. 2.2.3. Các thành phần ảnh hƣởng đến phản ứng PCR Để thực hiện phản ứng PCR, trong dung dịch phản ứng phải có các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA, bao gồm :  iTaq DNA polymerase buffer  DNA khuôn (template)  Enzyme iTaq DNA polimerase  mồi (primer)  dNTP’s 2.2.3.1. DNA khuôn (template) DNA khuôn sau khi li trích và tinh sạch thì dùng được cho phản ứng PCR. Khi dùng để khuếch đại vùng mục tiêu từ DNA, số lượng DNA được tính trên cơ sở mol hay nanogram (ng). Phép tính này giúp chúng ta xác định lượng DNA cần phải có, số 7 chu kì để tổng hợp ra DNA với số lượng mong nuốn. Thông thường người ta sử dụng lượng DNA từ 10 – 100ng cho một phản ứng PCR có thể tích từ 25µl – 50µl. Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn DNA khuôn hoàn toàn tinh sạch. Khi các đoạn khuôn còn lẫn protein, hiệu quả PCR giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003). 2.2.3.2. Enzyme Trong phản ứng PCR, người ta sử dụng enzyme Taq DNA polymerase. Đây là một enzyme chịu nhiệt. Enzyme này được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng là Thermus aquaticus (Taq). Taq polymerase có những đặc điểm như: hồi phục sau khi chịu tác động của nhiệt, enzyme này hoạt động tốt ở nhiệt độ cao và có tính ổn định nhiệt cao. Nhiệt độ tối hảo đối với enzyme Taq trong phản ứng sinh tổng hợp DNA là khoảng 70 – 720C. Enzyme này cho phép chúng ta tổng hợp dây DNA mới có tính lấp đi lấp lại nhiều lần. Nồng độ của enzyme DNA polymerase cũng đóng một vai trò quyết định trong phản ứng PCR. Thông thường, nồng độ enzyme được khuyến cáo sử dụng là từ 1 – 2,5U cho một phản ứng từ 25µl – 50µl. Nếu như nồng độ Taq quá cao những sản phẩm không chuyên tính sẽ xuất hiện và làm sai lệch kết quả. Nếu như lượng Taq quá thấp thì sẽ không đủ số lượng để xúc tác tạo ra sản phẩm theo mong muốn. 2.2.3.3. Mồi (primer) Trong PCR chuẩn cần có một cặp primer. Sự khuếch đại chuyên biệt nào đối với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tùy thuộc vào primer tương ứng. Có hai loại primer trong phản ứng PCR chuẩn, đó là primer xuôi (forward primer) và primer ngược (reserve primer). Primer xuôi bắt cặp và gắn vào đầu 3’ của mạch khuôn 5’ – 3’, primer ngược bắt cặp và bổ sung gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’ – 5’. Đối với primer hai yếu tố chính ảnh hưởng tới nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn là chiều dài của primer và thành phần G, C trong cấu tạo của primer. Nhiệt độ tác động ở đầu dây đơn được tính như sau: Tm = 2x(A+T)+4x(G+C). Trong cấu trúc primer thông thường thì có khoảng 15 – 30 nucleotide. Primer có nhiều G và C thì số lượng nucleotide ít đi còn khoảng 18 – 20 nucleotide (Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999). Khi chọn primer thì nhiệt độ nóng chảy (Tm) của hai primer chênh lệch nhau không quá lớn. Trình tự DNA cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai primer không 8 nên quá lớn, thường không quá 1 kilobase (kb) (dẫn theo Khuất Hữu Thanh, 2003). Trong hầu hết các ứng dụng PCR thì có nồng độ hai primer bằng nhau. Người ta khuyến khích sử dụng nồng độ của mỗi primer là khoảng từ 1 – 25pmol cho một phản ứng từ 25µl – 50µl (dẫn theo Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.4. Ion magnesium (Mg 2+ ) Một trong những nhân tố ảnh hưởng lớn tới phản ứng PCR trong dung dịch đệm là ion Mg2+. Kết quả của phản ứng sẽ tốt nếu như ta cho vào dung dịch phản ứng một nồng dộ Mg2+ tối hảo. Nống độ của Mg2+ có ảnh hưởng đến các quá trình như: Quá trình annealing của primer. Ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzyme Taq DNA polymerase. Mg2+ là tác nhân kích họat enzyme Taq hoạt động. Mặt khác, Taq polymerase rất nhạy cảm với với ion Mg2+ . Môi trường cho phản ứng PCR có tính chất ion như vậy nên dung dịch đệm trở nên rất năng động. Do đó, nồng độ ion Mg2+ trong dung dịch đệm cao hay thấp đều ảnh hưởng rất khác nhau trong phản ứng PCR. Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm cho dây đôi DNA ổn định hơn, làm sự biến tính và tách DNA từ sợi đôi thành sợi đơn giảm, kết quả là sản phẩm PCR ít đi. Lượng dư Mg2+ sẽ làm cho hiện tượng annealing không chuyên tính xảy ra, quá trình bắt cặp ở những vị trí không đúng sẽ xảy ra và cho ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng lớn, nhưng độ chuyên tính thấp. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá thấp, nó sẽ làm xấu đi quá trình extension (kéo dài chuỗi mã đối lập với dây gốc). Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu của ion Mg 2+ nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR. 2.2.4. Ứng dụng của kĩ thuật PCR PCR có ứng dụng cực kì rộng trong công nghệ sinh học hiện đại. Theo nguyên tắc trên , đã có nhiều bổ sung để đưa PCR phục vụ nhiều mục tiêu khác nhau, trong nhiều lĩnh vực khác nhau.  Ứng dụng trong di truyền PCR dùng để nhân bản vô tính DNA với số lượng lớn. PCR là công cụ đắc lực cho việc lập bản đồ gen của sinh vật. Phương pháp này được gọi là phân tích DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên (Random amplified polymorphism DNA, RAPD). Trong phương pháp RAPD, PCR được thực hiện với 9 các primer ngẫu nhiên (random primer). Kết quả là tạo ra một số đoạn DNA có chiều dài khác nhau, đặc trưng cho mỗi loài, thậm chí mỗi cá thể. So sánh điện di sản phẩm PCR của nhiều dòng có đặc tính khác nhau trong cùng loài với nhiều primer khác nhau có thể giúp xác định bản đồ gen của sinh vật (Nguyễn Văn Uyển,1995).  Ứng dụng nhận dạng ở mức phân tử Do RAPD cho kết quả đặc trưng cho từng cá thể, có thể sử dụng kết quả của RAPD để nhận dạng, giống như lấy dấu vân tay trong nhận dạng người. Ngoài các ứng dụng trong hình sự, PCR hiện nay được dùng để phân loại thực vật, xác định mối quan hệ của chúng một cách chính xác (Nguyễn Văn Uyển,1995).  Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh PCR có ưu điểm là rất nhạy, với một hay nhiều cặp primer ta có thể xác định được sinh vật gây bệnh thông qua các đặc trưng về gen của chúng (Nguyễn Văn Uyển,1995). 2.3. Đọc trình tự (sequencing) 2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật sequencing Kỹ thuật sequencing là kỹ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA chuyên tính nào đó. Những kỹ thuật sequencing cũng chỉ mới được hoàn thiện trong những năm gần đây. Các công trình đầu tiên được công bố của Maxam va Gilbert (1977), Sanger và cộng tác viên (1977). Do đó phương pháp sequencing có tên là phương pháp Maxam và Gilbert, hoặc Sanger. Nhưng trong hơn 20 năm qua, kỹ thuật này được cải tiến rất nhiều với sự trợ giúp của máy vi tính, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của PCR, kỹ thuật điện di. Vì vậy, kỹ thuật sequencing trở thành công cụ rất mạnh và hiệu quả làm nền tảng phân tích genome (Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.3.2. Các phƣơng pháp sequencing 2.3.2.1. Phƣơng pháp Maxam và Gilbert (phƣơng pháp hóa học) Phương pháp hóa học dựa trên cơ sở phân cắt hóa học tại vị trí đặc biệt của base tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu, hình thành một loạt phân tử đánh dấu tận cùng bằng một base. Trình tự của DNA đó được đọc từ kết quả của ladder (thang chuẩn) còn gọi là sequence ladder. Phương pháp này còn được gọi là phương pháp kết 10 thúc theo chuỗi, xác định base nào đó từng điểm cuối cùng trong chuỗi mã, cứ như vậy làm cho 3 base còn lại. Phương pháp thực hiện gồm 3 bước chính Bước 1: chuỗi DNA cần đọc trình tự được đánh dấu phóng xạ ở đầu 5’-P bằng P 32 . Một dây đơn oligonucleotide có đánh dấu phóng xạ được chia thành 4 phản ứng. Trong mỗi 4 phản ứng, oligonucleotide có một đầu cố định và một đầu có phân tử A, T, G và C. Sản phảm của mỗi phản ứng được điện di trên gel polyacrylamide có độ phân giải cao. Chụp gel ảnh của DNA theo phương pháp phóng xạ tự ghi. Các mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ được xử lí theo 4 nhóm phản ứng như sau: Nhóm thứ nhất xử lí các mạch đơn DNA bằng dimethylsulphate ở pH=8 làm đứt mạch đơn tại G. Nhóm thứ hai xử lí mạch đơn DNA bằng acid có pH=2 gây đứt mạch đơn tại A và G. Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch đơn tại C và T. Nhóm phản ứng thứ tư xử lí mạch đơn DNA bằng hidrazin với nồng độ muối NaCl 1,5M làm cho mạch đơn bị đứt tại C. 11 Hình 1: Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert Ưu điểm của phương pháp  Trình tự có thể được xác định trên cơ sở bản đồ giới hạn (restriction).  Trình tự có thể xác định được rất gần với vị trí đánh dấu. Khuyết điểm của phương pháp:  Trình tự nhận được thường rất ít.  Các phản ứng xảy ra chậm và độ tin cậy thấp.  Phản ứng đòi hỏi nhiều hóa chất có tính chất ngẫu nhiên.  Hóa chất sử dụng cho phương pháp này rất độc hại cho người. 2.3.2.2. Phƣơng pháp đọc chuỗi mã Sanger Sanger và cộng sự đã phát minh phương pháp giải trình tự bằng enzyme hay còn gọi là phương pháp dideoxynucleotide (1977). Nguyên tắc cơ bản của phương pháp dideoxynucleotide dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí đầu 3’-OH, khi 5’- xử lí với hoá chất để cắt đứt tại vị trí các base đặc biệt. 4 tubes G-rxn A>G -rxn T>C -rxn C-rxn 5’- 5’- 5’- C C T A G ddNTP Reaction Mix 3’ G C A T T C C A T A G G 5’ chuỗi đánh dấu (P32) C C 12 gặp các nucleotide không có nhóm –OH (dideoxynucleotide) thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp một các ngẫu nhiên. Thành phần của phản ứng sequencing cũng gần giống như thành phần trong một phản ứng PCR gồm 1 primer, Taq polymerase, dung dich đệm, DNA khuôn và phần khác là dideoxynucleotide. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ. Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn DNA dài ngắn khác nhau một nucleotide, nhờ điện di trên gel polyacrylamide mà ta có thể phân biệt các đoạn này. Hình 2: Lược đồ phương pháp đọc trình tự của Sanger ống phản ứng T C T A G ddNTP Reaction Mix Phãng x¹ tù ghi sîi AND ®¬n tæng hîp trong mçi èng ph¶n øng. dATP dCTP dTTP dGTP ddATP ống phản ứng A ống phản ứng C ống phản ứng G dATP dCTP dTTP dGTP ddCTP dATP dCTP dTTP dGTP ddGTP dATP dCTP dTTP dGTP ddTTP đoạn DNA cần giải trình tự 3’ sản phẩm CCTATGGAATGC Primer sequencing * * * * * 13 Hình 3: Lược đồ công thức của dNTP và ddNTP A: dNTP B: ddNTP 2.4. Vùng ITS (internal transcribed spacer) của rDNA (ribosomal deoxynucleotide acide) Hình 4: Lược đồ đoạn ITS – rDNA và các primer Trình tự của rDNA được dùng để nghiên cứu rất nhiều về mối quan hệ di truyền của nhiều dòng nấm. Đối với nấm R. solani, rDNA có chứa các trình tự của các ribosome 18S; 5,8S; 28S và các vùng ITS nằm xen kẽ giữa các trình tự rDNA đó. Vùng ITS này đã được nghiên cứu rất nhiều bằng kỹ thuật PCR, RFLP và kỹ thuật đọc trình tự (Kuninaga và ctv, 1997). Vùng ITS lặp lại rất nhiều lần trong hệ gen của nấm. Trình tự của các vùng ITS này có tính bảo toàn cao, đây là những vị trí rất thuận lợi ITS1F ITS5 ITS1 18S 5,8S 28S ITS1 ITS2 ITS3 ITS2 ITS4 ITS4B dNTP H H O H Base ddNTP O (P)-(P)-(P)- Base Khi một ddNTP mới được thêm vào để kéo dài chuỗi DNA thì sẽ không thêm vào được vì không có nhóm –OH. OH (P)-(P)-(P)- (A) (B) 14 cho việc thiết kế các primer cho phản ứng PCR, RAPD, đọc trình tự. Nhưng cũng có những vùng biến động rất lớn, đặc điểm này thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng nấm khác nhau bằng kỹ thuật RFLP. Ở nấm R. solani sự đa dạng di truyền có liên quan nhiều tới trình tự của các đoạn ITS. Khi các dòng nấm gần giống nhau về mặt di truyền thì chúng càng giống nhau về trình tự của các đoạn ITS. 2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về sự đa dang di truyền của nấm Rhizoctoniac solani 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc Nguyễn Thị Nghiêm (1997), bằng phương pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR với 2 primer riệng biệt ERIC1 và ERIC2 đã phân chia 137 dòng nấm Rhizoctonia solani Kuhn thu thập ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau. 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc Kuninaga và ctv (1997), đã phân tích trình tự của rDNA chứa những vùng ITS và 5,8S rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa 45 dòng nấm R. Solani đại diện cho các nhóm liên hợp khác nhau. Kết quả của họ cho thấy trình tự rDNA 5,8S thì hoàn toàn bảo toàn trong khi trình tự của các vùng ITS lại có sự biến động cao giữa các dòng. Trình tự của các vùng ITS giữa các dòng trong cùng một nhóm phụ có tỉ lệ tương đồng là 96%. Đối với các dòng thuộc các nhóm phụ khác nhau trong cùng nhóm liên hợp thì tỉ lệ này là 66 – 100%. Đối với các dòng thuộc các nhóm liên hợp khác nhau thì tỉ lệ này là 55 – 96 %. Marianne và ctv (1996), đã thực hiện phản ứng PCR trên vùng ITS và 5,8S rDNA của rDNA và đọc trình tự vùng này đối với 10 dòng nấm Rhizoctonia solani gồm 9 dòng nấm thuộc nhóm tiếp hợp AG4 và 1 dòng nấm thuộc nhóm tiếp hợp AG1. Ông cho rằng 5,8S rDNA thì bảo toàn và hai vùng ITS thì có sự khác nhau giữa các dòng nấm. Dựa vào kết quả đọc trình tự trên ông đã chia các 9 dòng nấm trong nhóm AG4 thành 3 nhóm phụ. Matsumoto và ctv (1996) đã dùng kỹ thuật RFLP dựa trên đoạn 28S rDNA cũng đã xác định sự đa dạng di truyền giữa các nhóm tiếp hợp khác nhau. Khi cắt enzyme giới hạn HpaII đối với các dòng thuộc nhóm phụ AG-2- 15 1và AG-2-2 thì không có sự khác biệt về vị trí giới hạn trong đoạn DNA này. Nhưng cắt bằng enzyme HhaI thì có sự khác biệt về vị trí giới hạn trong đoạn DNA này giữa các nhóm phụ AG-2-2-IIIB và AG-2-2-IV. Ngoài ra, khi cắt bằng enzyme BamHI, HhaI và HpaI đối với các dòng nấm AG-HG-I, HG-II của nhóm AG4 thí cũng thấy có sự khác biệt. Schneider và ctv (1997) đã thực hiện phản ứng PCR trên vùng ITS – rDNA với 2 primer ITS1 và ITS4 đối với các dòng nấm Rhizoctonia solani phân lập trên cây hoa tulip. Ông cho rằng ông thu được là các đoạn DNA có kích thước từ 645 – 740 bp. 16 PHẦN III PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu  Địa điểm:  Phòng thực tập bệnh cây bộ môn bảo vệ thực vật, khoa Nông Học Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.  Trung tâm phân tích thí nghiệm Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.  Thời gian: từ tháng 3 – 2005 đến tháng 8 – 2005. 3.2. Phƣơng pháp 3.2.1. Lấy mẫu và phân lập Thu thập mẫu lúa bệnh khô vằn ở một số tỉnh phía nam như: Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, … Thu thập các mẫu lúa có triệu chứng bệnh đốm vằn do nấm R.solani gây ra. Sau khi lấy về cắt mẫu nhỏ ra khoảng 1 – 2mm chọn những nơi tiếp giáp giữa phần bệnh và phần không bệnh. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch, sau đó rửa với cồn 700 trong 1 phút. Rửa với nước vô trùng cho sạch cồn và tiếp tục rửa với dung dịch NaOCl 0,5% trong 1 phút. Rửa lại với nước vô trùng 3 lần cho sạch NaOCl (Hsiang và Dean, 2001). Làm khô mẫu trong giấy thấm đã được sấy diệt khuẩn. Cấy mẫu đã xử lí vào đĩa petri có chứa môi trường agar nước. Khi xuất hiện các sợi nấm thì cắt đầu sợi nấm và chuyển lên môi trường PGA (potato glucose agar). 3.2.2. Môi trƣờng phân lập và cấy nấm R. solani  Môi trường phân lập nấm R. solani chọn môi trường WA (water agar) Thành phần trong một lit môi trường gồm có: 18 g agar Nước cất vừa đủ 1lit  Nuôi cấy nấm trên môi trường PGA (potato glucose agar) 17 Trong 1 lit môi trường có: 20g glucose 200g khoai tây 18g agar 1 lit nước cất 3.2.3. Nuôi thu sinh khối Nuôi thu sinh khối trong môi trường lỏng PGB (potato glucose broth) không có agar. Nấm dược nuôi cấy lắc trong máy lắc định ôn ở 280C trong vòng 3 – 4 ngày thì thu sinh khối được. Làm sạch khối sợi nấm và để khô chuẩn bị cho quá trình li trích DNA. 3.2.4. Li trích DNA Chúng tôi li trích theo hai qui trình.  Qui trình 1 ( Lee và Taylor, 1990)  Bước 1: Nghiền mịn khối sợi nấm trong nitơ lỏng  Bước 2: cho bột nấm đã nghiền trong nitơ lỏng vào eppendorf 1.5ml và cho thêm 600-700µl dung dịch li trích (200mM HCl pH=8,5; 250mM NaCl, 25mM EDTA và SDS 0,5%) lắc đều.  Bước 3: Ủ trong 1h ở nhiệt độ là 650C.  Bước 4 : thêm vào ống 600 µl hỗn hợp dung dịch phenol:chloroform:isoamyl với tỉ lệ 25:24:1 đã cân bằng, lắc đều.  Bước 5 : li tâm 14000g/15phút  Bước 6 : thu 400 µl lấy phần nước ở trên và chuyển vào eppendorf mới.  Bước 7: cho vào 0.03V(6 µl) amonium acetate 5M và 100µl isopropanol.  Bước 8 : li tâm 14000g/5phút.  Bước 9 : đổ bỏ dung dịch nổi ở trên thu lấy cặn.  Bước 10 : rửa cặn với ethanol 70% lạnh 3 lần.  Bước 11 : làm khô ta thu được cặn DNA.  Bước 12: hòa tan cặn DNA trong dung dịch TE 1X, thu được dung dịch DNA. 18  Qui trình 2: chúng tôi có cải tiến thêm 3 bước mới vào qui trình 1, sau bước 6. Từ bước 1 – 6 như qui trình 1  Bước 7 : cho thêm 400µl hỗn hợp dung dịch chloroform:isoamyl (24:1).  Bước 8: li tâm 14000g/15phút.  Bước 9: hút lấy 200µl dung dịch nổi chuyển sang eppendorf mới. Các bước còn lại tương tự qui trình 1. Đo nồng độ DNA bằng phƣơng pháp đo OD Phương pháp này giúp chúng tôi có thể xác định tương đối chính xác nồng độ DNA và làm cơ sở để pha loãng mẫu cho phản ứng PCR. Khi thực hiện đo OD, tỉ lệ pha loãng DNA : buffer là 1 : 100. Công thức tính nồng độ DNA : Nồng độ DNA ban đầu = (-36 x A280 +62,9 x A260) x 100 (ng/µl) Trong đó A280 : bước sóng 280nm A 260: bước sóng 260 nm 3.2.5. Phản ứng PCR Phản ứng được thực hiện với các primer ITS4 và ITS5 cho vùng ITS của rDNA (White và ctv, 1999). Trình tự của primer ITS 4: 5’- TCCTCCGCTTATTATTGATATGC- 3’ Trình tự của primer ITS5: 5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3’ Sản phẩm sau khi khuếch đại có kích thước khoảng 700 – 800bp. Thể tích của mỗi phản ứng là 25µl. 19 Bảng 1. Thành phần của phản ứng PCR Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích 1 phản ứng PCR buffer 10X 1X 2,5μl MgCl2 50mM 1,5mM 0,75μl dNTP 2mM 0,16mM 2μl primer 25μM 1μM 1μl Taq DNA polymerase 1U 0,04U 1μl DNA khuôn 50 – 100 ng 1μl Nước Vừa đủ 25 μl Qui trình phản ứng được đặt vào máy điều nhiệt tuần hoàn với chu kì như sau: Bảng 2. Qui trinh nhiệt của phản ứng PCR Các bước Nhiệt độ Thời gian Biến tính (denature) 940C 3 phút Số chu kì lặp lại 30 chu kì Tách đoạn DNA 940C 1 phút Bắt cặp (Anealing) 560C 45giây Kéo dài (extension) 720C 1 phút Kéo dài 720C 7 phút 3.2.6. Sequencing các dòng nấm với 2 primer ITS1 và ITS4 Trình tự của các primer ITS1 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’. ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTATTGATATGC- 3’. Trước khi đọc trình tự DNA thì sản phẩm PCR cần phải được tinh sạch. Thành phần một phản ứng  Bigdye 2,5X 2 l 20  Bigdye buffer 5X 1 l  Sản phẩm PCR 3 –10 ng 1 l  Primer 3,2 pmol 1 l  Nước 5 l Trong bigdye bao gồm cả enzyme kéo dài mẫu Trong bigdye buffer bao gồm cả dNTP, ddNTP Qui trình chạy chu kì (cycle) như sau:  960C 1 phút  960C 10 giây  500C 5 giây  600C 4 phút Lặp lại 25 chu kỳ. Sau khi chạy chu kì (cycle) thì cần phải tinh sạch sản phẩm để thực hiện phản ứng đọc sequencing. Qui trình thực hiện như sau:  Thêm vào 2,5 l EDTA 125mM mỗi ống eppendorf phản ứng.  Thêm vào 30 l ethanol 100% vào mỗi eppendorf, đảo nhẹ.  Để ở nhiệt độ phòng 15 phút.  Ly tâm 12000 vòng 30 phút, 40C  Loại bỏ dịch trong  Cho 30 l ethanol 70% vào mỗi eppendorf  Li tâm 12000 vòng, 20 phút, 40C  Hút bỏ dịch trong và để khô Qui trình biến tính  Cho vào mỗi eppendorf 10 l Hidi  Biến tính ở 950C trong 2 phút  Đưa nhanh vào đá  Sau đó cho 10 l mẫu này vào máy giải trình tự. 21 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập mẫu Chúng tôi đã phân lập được 20 dòng nấm R. solani từ các mẫu thực vật bệnh và sử dụng 20 dòng nấm này để nghiên cứu. Bảng 3. Danh sách các dòng nấm Rhizoctonia solani được sử dụng trong nghiên cứu. Stt Tên dòng nấm Kí chủ Nơi lấy mẫu 1 CX-8 Cải xanh Tp. HCM 2 SR-650 Sầu riêng Bình Dương 3 L-74 Lúa Trà Vinh 4 XL-76 Xà lách An Giang 5 BV-62-03 Bông vải Bình Thuận 6 L-67 Lúa Đồng Tháp 7 RM-61 Rau muống Đồng Nai 8 CB-63 Cải Bắp Lâm Đồng 9 LB-73 Lục bình Tiền Giang 10 L-71-04 Lúa Cần Thơ 11 L-71-05 Lúa Cần Thơ 12 LB-70 Lục bình Vĩnh Long 13 L-67-04 Lúa Đồng Tháp 14 B-61 Bắp Đồng Nai 15 L-61 Lúa Đồng Nai 16 L-73 Lúa Tiền Giang 17 L-74 Lúa Trà Vinh 18 CP-50-02 Cà phê Dắc Lắc 19 ĐX-61 Đậu xanh Đồng Nai 20 CLV-72 Cỏ lồng vực Long An 22 4.2. Li trích DNA Theo qui trình li trích của Lee và Taylor (1990), chúng tôi thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Qui trình này không sử dụng RNase nên không loại bỏ được RNA. DNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả diện di cho thấy DNA tổng số của các dòng nấm R. solani có xuất hiện và rõ nhưng chạy thành vệt dài (hình 5). Điều này cho thấy DNA tổng số li trích theo qui trình này còn chứa nhiều tạp chất, chưa được sạch. Hình 5. Ảnh điện di DNA tổng số của các dòngnấm R. solani li trích theo qui trình của Lee và Taylor chưa xử lí RNAse. Để phản ứng PCR dược tối ưu thì sản phẩm DNA li trích cần phải tương đối sạch các tạp chất. Khi DNA khuôn còn lẫn protein, hiệu quả của phản ứng PCR giảm tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Vì vậy, để có DNA khuôn tinh sạch hơn, chúng tôi đã cải tiến qui trình của Lee và Taylor bằng cách lặp lại khâu khử bỏ protein và các thành phần không mong muốn khác trong mẫu phân tích. Cụ thể là sau bước 6 của qui trình Lee và Taylor chúng tôi thêm các bước sau: Từ bước 1 – 6 giống qui trình Lee và Taylor.  Bước 7 : cho thêm 400µl hỗn hợp dung dịch chloroform:isoamyl (24:1).  Bước 8: li tâm 14000g/15phút. DNA tổng số 23  Bước 9: hút lấy 200µl dung dịch nổi chuyển sang eppendorf mới.  Các bước còn lại giống qui trình Lee và Taylor. Với qui trình tách chiết này, DNA tổng số nhận được sau khi điện di trên agarose 0,8%, kết quả cho thấy : DNA tổng số theo qui trình này ít kéo thành vệt dài hơn, chứng tỏ DNA tổng số tương đối sạch hơn, thích hợp cho phản ứng PCR hơn (hình 6). Vì vậy, chúng tôi sử dụng qui trình Lee và Taylor cải tiến để tách chiết DNA tổng số của các dòng nấm R. Solani. DNA tổng số thu được từ qui trình tách chiết này sẽ được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo. Hình 6 . Ảnh diện di DNA tổng số của các dòng nấm R. Solani li trích theo qui trinh của Lee và Taylor cải tiến, chưa xử lí RNAse. Khi dùng để khuếch đại vùng mục tiêu từ DNA bằng phản ứng PCR, lượng DNA được sử dụng thường khoảng từ 10 – 100ng cho một phản ứng. Nếu lượng DNA sử dụng quá ít thì sẽ không đủ số lượng khuôn DNA cho quá trình tổng hợp. Kết quả là sản phẩm PCR rất ít không đủ số lượng mong muốn. Còn nếu số lượng DNA khuôn qú nhiều thì sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ không mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Nhưng DNA tổng số li trích được có hàm lượng rất lớn. Vì vậy, cần pha loãng chúng trước khi thực hiện phản ứng PCR. DNA tổng số 24 Chúng tôi dựa vào kết quả đo OD để pha loãng DNA tổng số đến mức thích hợp (hình 7). Hình 7. Ảnh diện di DNA tồng số sau khi pha loãng chuẩn bị cho phản ứng PCR 4.3. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. Solani với hai primer ITS4 và ITS5 Sử dụng 2 primer ITS4 và ITS5 do White và ctv (1991) thiết kế cho vùng ITS của rDNA (gồm ITS1-5,8S-ITS2), sản phẩm sản phẩm khuếch đại được dự kiến có kích thước khoảng 700bp. Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR được thực hiện với 10 – 100ng DNA, 1X DNA polymerase buffer, 1,5 mM MgCl2, 1µM cho mỗi primer ITS4 và ITS5, 1U Taq DNA polymerase (hình 8). DNA tổng số pha loãng 25 Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR với nồng độ primer là 1µM (1pmol/µl) Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy có 1 băng (band) chính kích thước 700bp và 1 băng phụ kích thước khoảng 100bp. Sự tồn tại của băng phụ là do dư nhiều primer trong thành phần phản ứng PCR. Lượng primer dư này sẽ tự polymer với nhau tạo thành băng phụ trên kết quả điện di. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện lại phản ứng PCR với lượng primer giảm xuống còn 0,4µM các thành phần khác trong phản ứng không thay đổi. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% cho thấy như ở hình 9. Sản phẩm PCR Băng phụ 700bp 26 Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm PCR có nồng độ primer là 0,4µM (0,4pmol/µl). Sản phẩm PCR có nồng độ primer 0,4µM (0,4pmol/µl) không còn thấy sản phẩm phụ nữa. Như vậy, với thành phần phản ứng PCR là 10 – 100ng DNA, 1X DNA polymerase buffer, 1,5 mM MgCl2, 0,4µM cho mỗi primer ITS4 và ITS5, 1U Taq DNA polymerase, vùng rDNA-ITS đã được khuếch đại thành công. Sản phẩm có kích thước khoảng 700bp. 4.4 Đọc trình tự trực tiếp đoạn rDNA-ITS với 2 primer ITS1 và ITS4 Trong điều kiện giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ tiến hành đọc trình tự của 2 dòng nấm BV-62-03 và SR-650. Trước khi tiến hành đọc trình tự, sản phẩm PCR được làm tinh bằng kit Quantum Prep Freeze “N Squeeze DNA gel Extraction Spin Column của Bio- rad để tinh sạch. Qui trình tinh sạch sản phẩm gồm có các bước chính như sau:  Cắt phần gel có mang vạch DNA đích.  Băm nhỏ băng DNA đó thành từng lát nhỏ và cho vào lọc của kit và cho lọc này vào eppendorf.  Ủ cả eppendorf này ở -200C trong 5 phút.  Li tâm 13000 vòng trong 3 phút ở nhiệt độ phòng.  Thu phần dịch DNA ở dưới eppendorf. Sản phẩm PCR 700bp 27 Sản phẩm PCR đã làm tinh được đọc trình tự với 2 primer ITS1 và ITS4 (White và ctv, 1991) bằng máy đọc trình tự DNA ABI 3100 của hãng Applied Biosystem theo qui trình mô tả ở mục 3.2.6 Kết quả cho thấy với cả 2 dòng BV-62-03 và SR-650, trình tự thu được phần lớnchỉ xuất hiện chữ N nên không thể xác định được trình tự (hình 10,11). Với kết quả này, chúng tôi cho rằng sản phẩm PCR đã tinh sạch này không thích hợp cho việc đọc trình tự. Do qui trình tinh sạch này chỉ li tâm nên có thể chưa loại bỏ được hoàn toàn chất loading dye trong quá trình điện di và ethidium bromide trong quá trình nhuộm. Hai loại hóa chất này có thể ngăn cản sự tổng hợp chuỗi đơn DNA trong quá trình chạy chu kì. Mặt khác, ethidium bromide cũng có thể phát sáng nhất định nên làm nhiễu sóng trong quá trình phân tích trình tự. Như vậy, kit tinh sạch của Bio-rad mà chúng tôi đã sử dụng để tinh sạch DNA có thể là không phù hợp cho quá trình đọc trình tự. Vì vậy, chúng tôi thử sử dụng một kit khác để làm tinh sạch mẫu. Chúng tôi sử dụng kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” của công ty Amersham để tinh sạch. Qui trình tinh sạch gồm các bước chính sau:  Cắt band DNA từ gel sau khi điện di, băm gel thành từng lát nhỏ.  Cho gel vào eppendorf.  Thêm 10μl capture buffer vào cho mỗi 10mg gel.  Ủ trong nhiệt độ 600C trong 15 phút cho đến khi gel tan hết.  Sau khi gel tan hết thì li tâm lạnh thu mẫu.  Chuyển mẫu đã thu được vào cột GFX , ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút.  Li tâm 10000 vòng 30giây.  Bỏ nước dưới eppendorf, đặt cột GFX vào eppendorf khác.  Thêm 500μl wash buffer và li tâm 30 giây.  Chuyển cột GFX vào tip khác.  Thêm 50 μl elution buffer, nhỏ từ từ trên cột.  Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng 1 phút.  Li tâm 10000 vòng 1 phút thu mẫu DNA đã được tinh sạch. 28 Hình 10. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 29 Hình 11. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 30 Với sản phẩm PCR đã làm tinh sạch theoqui trình trên, chng1 tôi tiến hành đọc trình tự trực tiếp vùng rDDNA-ITS của 2 dòng SR-650 và BV-62-03 sử dụng 2 primer ITS1 và ITS4. 4.4.1. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-63-02 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 đã đọc được là 361bp. Trình tự như sau: gggaatttaa ttgaatttta ttaatagagg agtagaacgt tgtagctgcg ccatttttct ggcaatgtgc ataatctctc tttcatacac acacccctgt gcacctgtga gacatctaca aggtcatttt agagaaattt gggcaagtgt ggagcttcat tgcaaaactt ttccctcctt ctcttggctt ttgctgtcta ttccactcac atacaaactc tattaaatat aaaacgaatg taattgatgt aacgcatcta atactaagtt tcaacaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaaaacgc acgaactgca agagtaatga aaatgaaatt catgaatcat tttttcttta a Với primer ITS4, vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 đã đọc được là 312bp. Trình tự như sau: gtttcgccgg ggtagtccta cctgatttga gatcagatca taaggatgta ttttgtccaa gtcaaatcga ctattagaag cggttcgtct tgcatttacc ttggccacct ttttacagtg tcctcagcga tagataactt atcacgccga gtggaaccaa gcataacact tagagatcca gctaataaac atatacgcgc agggtgtgaa actgcaaagt actccaaaac caaagtaaga gaccagttga attaacatta ggtttacttt gagacacccc ctgaactcaa aaggtatgtt ccaggaaagg ag Do 2 chuỗi DNA đã đọc được là quá ngắn nên chúng tôi không xác định được trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03. 4.4.2. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 đã đọc được là 602bp. Trình tự như sau: ggggaattat tgtatttatt accgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacattc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag tcacaaggtc attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatactaag tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcggaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgctccttgg tattccttgg agcatgcctg tttgagtatc ctgaaatctt caaagtaaac cttttgttaa ttcaatcggt ctcttacttt ggttttggag gtctttgcag tttcacaccc tgctcctctt tgtttattag ctggatctct aagtgttatg cttggttcca 31 ctcggcgtga taagttatct atcgctgaga cactgtaaaa aggtggccat tgtatatgca ag Với primer ITS4, vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 đã đọc được là 566bp. Trình tự như sau: gtttttcacg ggggagatcc tacctgattt gagatcagat cataaaaatg tattttgtc caagtcaagt cgactattag aagcggttcg tcttgcattt accttggcca cctttttac agtgtcctca gcgatagata acttatcacg ccgagtggaa ccaagcataa cacttagag atccagctaa taaacaaaga ggcgcagggt gtgaaactgc aaagacctcc aaaaccaaa gtaagagacc gattgaatta acaaaaggtt tactttgaag atttcatgat actcaaaca ggcatgctcc aaggaatacc aaggagcgca aggtgcgttc aaagattcga tgattcact Gaattctgca attcacatta cttatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgcgagagt caagagatcc gttgttgaaa cttagtatta gatgcgttac atcaattaca ttcgtttta aatttaatag agtttgtatg ttaattgagt agacagcaaa agccaagaaa ggaggattt atttttttta atgaaactcc cccttg Sau đó chúng tôi so trình tự của 2 chuỗi DNA đã đọc được thì thu được trình tự của vùng rDNA-ITS là 468bp. Trình tự như sau: caagtgtgga gcttcattgc aaaacttttc cctccttctc ttggcttttg ctgtctactc aattaacata caaactctat taaatttaaa acgaatgtaa ttgatgtaac gcatctaata ctaagtttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcgctc cttggtattc cttggagcat gcctgtttga gtatcatgaa atcttcaaag taaacctttt gttaattcaa tcggtctctt actttggttt tggaggtctt tgcagtttca caccctgctc ctctttgttt attagctgga tctctaagtg ttatgcttgg ttccactcgg cgtgataagt tatctatcgc tgaggacact gtaaaaaggt ggccaaggta aatgcaag Trên website ( chúng tôi so sánh trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 với trình tự vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani có mã số sau: AB122134 AG-IA 670 bp AB122126 AG1-ID 694 bp AB122124 AG2-1 669 bp AB122143 AG -4 672 bp AB122142 AG1-IC 651 bp Qua nhiều kết quả chúng tôi nhận thấy vùng rDNA-ITS của dòng nấm mang số hiệu AB122126 thuộc nhóm tiếp hợp AG1-ID là phù hợp nhất với trình tự 32 vùng rDNA-ITS đọc được của dòng SR-650. Tỉ lệ tương đồng trình tự đoạn rDNA- ITS đã đọc được 468bp của dòng SR650 và AB122126 là 100%. Trình tự đoạn rDNA-ITS của dòng nấm mang mã số AB1221126 là: 1 aaggatcatt attgaattta ttaatgagga gtagagttgt agctggccat ttttctggca 61 atgtgcacac tcttctcttt catccacaca cccctgtgca cctgtgagac agttacaagg 121 tcattttgga gtttggg{caa gtgtggagct tcattgcaaa acttttccct ccttctcttg 181 gcttttgctg tctactcaat taacatacaa actctattaa atttaaaacg aatgtaattg 241 atgtaacgca tctaatacta agtttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag 301 aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 361 gaacgcacct tgcgctcctt ggtattcctt ggagcatgcc tgtttgagta tcatgaaatc 421 ttcaaagtaa accttttgtt aattcaatcg gtctcttact ttggttttgg aggtctttgc 481 agtttcacac cctgctcctc tttgtttatt agctggatct ctaagtgtta tgcttggttc 541 cactcggcgt gataagttat ctatcgctga ggacactgta aaaaggtggc caaggtaaat 601 gcaag}acgaa ccgcttctaa tagtccattg acttggacaa aatacatttt tatgatctga 661 tctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac ttaa Trong dấu {}là đoạn DNA tương đồng kết quả đọc được của dòng SR-650 với dòng nấm mang mã số AB122126. Đoạn tương đồng này từ vị trí nucleotide 137 đến vị trí 605 dối với dòng nấm có mã số AB122126. Đoạn này có 468 nucleotide. CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment SR650 ------------------------------------------------------------ AB122126 AAGGATCATTATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA SR650 ------------------------------------------------------------ AB122126 ATGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGG SR650 -----------------CAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG AB122126 TCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG ******************************************* SR650 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG AB122126 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG 33 ************************************************************ SR650 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG AB122126 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG ************************************************************ SR650 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT AB122126 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT ************************************************************ SR650 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC AB122126 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC ************************************************************ SR650 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC AB122126 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC ************************************************************ SR650 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC AB122126 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC ************************************************************ SR650 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT AB122126 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT ************************************************************ SR650 GCAAG------------------------------------------------------- AB122126 GCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCATTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCTGA ***** SR650 ---------------------------------- AB122126 TCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA Dấu * biểu thị trình tự của dòng SR-650 với trình tự của AB122126 khớp với nhau. Như vậy, kết quả đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR được làm tinh sạch bằng kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” của công ty Amersham đã cho kết quả tốt hơn so với sử dụng kit Quantum Prep Freeze “N Squeeze DNA gel Extraction Spin Column” của BioRad. Tuy nhiên, với cùng 1 kit làm tinh sạch (của Amersham) và qui trình đọc trình tự, vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 chi đọc được 1 đoạn ngắn. điều này cho thấy qui trình đọc trình tự với máy đọc trình tự DNA ABI 3100 của hãng Applied Biosystem có thể là chưa hoàn thiện nên kết quả không ổn định. 34 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận  Cải thiện được qui trình li trích DNA của nấm R. solani bằng cách thêm một khâu khử protein. DNA tổng số thu được có thể sử dụng cho phản ứng PCR mà không cần xử lí RNase.  Chọn được thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani.  Bước đầu đã đọc được trình tự vùng rDNA-ITS của nấm R. solani . 5.2.Đề nghị  Hoàn thiện qui trình đọc trình tự để có kết quả đọc trình tự tốt hơn.  Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nhiều dòng nấm để có thể đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể nấm này. 35 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của một số mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp kĩ sư Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Đình Huyên, 1999. Những điều cơ bản của kĩ thuật di truyền. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Việt Long, 2001. Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa ở Đồng Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 5. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen. Nhà xuất bản Khoa Học và Kĩ Thuật, Hà Nội. 6. Nguyễn Văn Uyển, 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. Tiếng Anh 7. Banniza. S., Sy. A. A., Bridbe. P. D., Simons .S. A. and Holderness. M., 1999. Characterization of populations of Rhizoctonia solani in Paddy Rice Fields in Cote d’Ivoire. Phytopathology 89: 414 – 420. 36 8. Boysen. M., Borjia. M., Moral. C., Salazar. O., and Rubio. V., 1996. Identification at strain level of Rhizoctonia solani AG4 isolates by direct sequence or asymmetric PCR products of the ITS region. Curr. Genet. 29: 174 – 1811. 9. Butler, E. E., and Bracker, C. E, 1970. Morphology and cytology of Rhizoctonia solani. Pages 32 – 51 in J. R. Pameter, Jr.,ed. Rhizotonia solani, Biology and Pathology. University of California Press, Berkeley. 255pp. 10. Carling. D. E. and Sumner. D. R., 1992. Rhizoctonia. Pages 157 – 165 in: Method for reseach on soilborne phytopathogenic fungi. L. L. Songton, J. D. Mihail and Rush (eds). APS, St. Paul, Minnesota. 11. Hsiang. T., and Dean .J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizotonia solani isolates from Poa annua. International turgrass society research journal 9: 674 – 678. 12. Kuninaga. S., Natsuaki. T., Takeuchi. T., and Yokosawa. R., 1997. Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizotonia solani. Curr. Genet. 32: 237 – 243. 13. Lee. S. B., and Taylor. J. W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spore. In: Weising. K., Nybom. H., Wolff. K., and Meyer. W., 1995, DNA fingerfrinting in plants and fungi. CRC Rress, Coca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, pages 70-71. 14. Liu. Z. L., and Sinclair, J. B, 1992. Genetic diversity of Rhizotonia solani anastomosis group 2. Phytopathology. 82: 778 – 787. 15. Matsumoto. M., Furuya. N., Takanami. Y. and Matsuyama. N., (1996). RFLP analysis of PCR – amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience 37: 351 – 326. 16. O’brain P. A., 1998. Molecular markers in Australian isolates of Rhizoctonia solani. Mycol. Res. 98: 665 – 671. 17. Papavizas, G. C., 1957. Colonization and Growth of Rhizoctonia solani in Soil. Crops Research Divesion. Pages 108 – 122. 37 18. Schneider. J. H. M, Ssalazar. O., Rubio. V. and Keijer. J., 1997. Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS r DNA polymorphism and pectic Zymograms. European Journal of Plant Pathology. 103: 607 – 622. 19. Sneh. B., Burpee. L., Ogoshi. A . Identification of Rhizoctonia solani Species. The American Phytopathological society. Pages 67 – 75. 20. Vilgalys, S. and Gonzales, D., 1989. Ribosomal DNA restriction Fragment length polymorphisms in Rhizoctonia solani. Phyopathology 80; 151 – 158. 21. Weising. K., Nybom. H., Wolff. K., and Meyer. W,. DNA Fingerprinting in Plants and Fungi. Methology. Pages 192 – 200. 22. White, T. J., Burns. T., Lee. S., and Taylor. L., 1991. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic. Pages 315 – 322 in . M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White (ed.) PCR Protocol. A guide to method and appliffiaction. Academic Press, New York. 3. Internet 23. 24. 25. 26. 27. 38 PHẦN VII PHỤ LỤC Phụ lục.1. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 với ITS4 39 Phụ lục.2. Đọc trình tựvùng rDNA-ITScủa dòng SR-650 với ITS1 40 Phụ lục.3. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 với ITS1 41 Phụ lục.4. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 với ITS4.