Đề tài Áp dụng kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-Hydroxylase – Trần Vân Khánh

TCNCYH 117 (1) - 2019 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 14/8/2018 Ngày được chấp thuận: 22/10/2018 ÁP DỤNG KỸ THUẬT MLPA TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN XÓA ĐOẠN GEN CYP21A2 GÂY BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21-HYDROXYLASE Trần Vân Khánh1, Vũ Chí Dũng1,2, Trần Huy Thịnh1, Lương Hoàng Long1, Lê Thị Phương1, Ngô Thị Thu Hương1, Tạ Thành Văn1 1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên do đột biến gen CYP21A2 trong đó đột biến xóa đoạn được phát hiện chiếm tỉ lệ 20 - 25%. Kỹ thuật MLPA là kỹ thuật thường được áp dụng với hiệu quả và độ chính xác cao. Kỹ thuật MLPA được áp dụng để xác định đột biến xóa đoạn trên 102 bệnh nhân. Kết quả cho thấy 35/102 (34,3%) bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2. Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến được phát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 - 5,6%. Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến xóa đoạn, gen CYP21A2, MLPA I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-Hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, do khiếm khuyết một phần hoặc hoàn toàn của một trong số các enzym tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận, gây bệnh cảnh lâm sàng là cơn suy thượng thận cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ trai [1; 2]. Các nghiên cứu đã cho thấy 95% ca mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh có nguyên nhân do đột biến gen CYP21A2, là gen quy định tổng hợp cho enzym 21-Hydroxylase [3; 4]. Cho đến nay, nhiều dạng đột biến đã được phát hiện trong đó đột biến xóa đoạn chiếm 20 - 25%, đột biến điểm chiếm 70 - 75% [5]. Tùy từng dạng đột biến gen CYP21A2, các kỹ thuật khác nhau sẽ được sử dụng để xác định đột biến. Kỹ thuật Southern blotting, PCR và MLPA thường được dùng để xác định đột biến xóa đoạn gen [6]. Những bệnh nhân không xác định được đột biến xóa đoạn sẽ được tiến hành giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 để xác định đột biến điểm [7]. Kỹ thuật đầu tiên được ứng dụng để xác định đột biến xóa đoạn là Southern blotting, tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là thời gian thực hiện lâu và cần sử dụng phóng xạ. Hiện nay, phương pháp thường được sử dụng để xác định đột biến xóa đoạn là MLPA, phương pháp này đảm bảo được độ chính xác cao, thời gian thực hiện nhanh và có thể xác định được toàn bộ các dạng đột biến xóa đoạn gen [8]. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Xác định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 trên bệnh tăng sản thượng thận 2 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương. 1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Trẻ gái: có nam hóa được phát hiện khi sinh hoặc nam hóa sau sinh, tăng trưởng sớm chiều cao và tuổi xương. - Trẻ trai: dậy thì sớm giả, tăng sớm chiều cao và tuổi xương. - Cả hai giới: có biểu hiện mất muối những tuần đầu sau sinh: mất nước, hạ natri và clo, tăng kali huyết thanh. - Tăng 17-OHP huyết thanh vào lúc sáng sớm: Trẻ sơ sinh ≥ 1 ng/ml (bình thường < 1 ng/ ml). Sau tuổi sơ sinh: ≥ 2 ng/ml. 1.2. Tiêu chuẩn loại trừ - Loại trừ các thể tăng sản thượng thận bẩm sinh khác (được khẳng định bằng chẩn đoán phân tử) bao gồm thiếu 11 β- hydroxylase; thiếu 3β - hydroxysteroid dehydrogenase typ 2. - Loại trừ các bệnh nhân suy thượng thận bẩm sinh do các nguyên nhân khác như giảm sản thượng thận bẩm sinh, suy thượng thận bẩm sinh do suy yên. - Loại trừ các bệnh nhân nam dậy thì sớm giả và bệnh nhân nữ nam hóa do các nguyên nhân khác như u vỏ thượng thận nam hóa. 1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 1/2014 đến tháng 1/2016. Địa điểm: Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương và Trung tâm nghiên cứu Gene - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. 2. Phương pháp 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA DNA được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất cả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị ≥ 1,8 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và được sử dụng để phân tích. 2.2. Kỹ thuật MLPA Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh nhân và người lành mang gen bệnh. Thành phần của kit gồm các đầu dò (probe) để khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi đầu dò tương ứng với một vùng gen, ngoài ra còn có các đầu dò đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng để làm đối chứng và 2 đầu dò cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. Sản phẩm khuếch đại sẽ được điện di mao quản trên máy giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi đầu dò sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với đầu dò đó. Quy trình MLPA: Cho 5µl DNA cần phân tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC trong 5 phút. Nhiệt độ được chuyển về 2oC trước khi cho 3µl hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe. Hỗn hợp được ủ ở 60oC trong 16 giờ, lúc này 2 đoạn lai của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với exon đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau. Thêm 32µl hỗn hợp ligase TCNCYH 117 (1) - 2019 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC buffer, ủ ở 54oC trong 15 phút, lúc này enzym ligase nối 2 đoạn oligonucleotid của probe với nhau. Phản ứng nối sẽ chấm dứt khi tăng nhiệt độ lên 98oC trong 5 phút, hỗn hợp được giữ ở 4oC. Để khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10µl sản phẩm lai vào 30µl hỗn hợp PCR buffer, giữ ở 60oC trước khi thêm 10µl hỗn hợp PCR master vào hỗn hợp, thực hiện chu trình nhiệt sau: [95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1 phút] x 35 chu kỳ; 72oC - 20 phút; sản phẩm được bảo quản ở 4oC. Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự để phân tích kết quả. Nếu có đột biến xóa đoạn, probe không gắn được vào gen đích, do đó kết quả điện di sẽ không xuất hiện đỉnh tương ứng tại exon đột biến. Trong trường hợp bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn, đỉnh tín hiệu sẽ có chiều cao bằng một nửa chiều cao của mẫu đối chứng. 3. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh. Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 của bệnh nhân Kiểu gen Thể bệnh Dạng đột biến n % Mất toàn bộ gen (Del/Del) Mất muối Homozygous 10 28,6 Đồng hợp tử 57,2% exon 1 del/ exon 1 del Mất muối Homozygous 1 2,9 exon 1 - 2 del /exon 1 - 2 del Mất muối Homozygous 1 2,9 exon 1 - 3 del/exon 1 - 3 del Mất muối Homozygous 5 14,3 exon 1 - 8 del/exon 1 - 8 del Mất muối Homozygous 2 5,6 exon 8 del/exon 8 del Mất muối Homozygous 1 2,9 exon 1 - 6 del/exon 4 - 6 del Mất muối Heterozygous 2 5,6 Dị hợp tử 42,8% Del/exon 1 - 3 del Mất muối Heterozygous 1 2,9 Del/– Mất muối Heterozygous 7 34,3 Del/– NHĐT Heterozygous 5 Tổng cộng 35 100% Dạng đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất là đột biến đồng hợp tử với 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn từ 2,9 - 5,6% (bảng 1). 4 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Biểu đồ 1. Tỉ lệ các thể bệnh Bằng kỹ thuật MLPA, 35/102 (34,3%) bệnh nhân đã được phát hiện có đột biến xóa đoạn gene CYP21A2. Trong đó bệnh nhân thể mất muối chiếm 85,7% (30 bệnh nhân), bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần chiếm 14,3% (biểu đồ 1). Biểu đồ 2. Tỉ lệ các allele đột biến Del là allele xóa toàn bộ gen CYP21A2; (-) là allele không phát hiện được đột biến xóa đoạn Biểu đồ 2 mô tả tỉ lệ các allele đột biến trong nghiên cứu, trong đó allele xóa toàn bộ gen chiếm tỉ lệ cao nhất với 47%, tiếp đến là allele xóa đoạn exon 1 - 3 (15%), các allele xóa đoạn còn lại chiếm tỉ lệ từ 3 - 6%. Tuy nhiên, 17% allele còn lại không phát hiện được đột biến xóa đoạn. Kết quả hình 1 cho thấy chiều cao đỉnh của exon 1 và exon 3 của bệnh nhân chỉ bằng một nửa so với mẫu đối chứng trong khi đó các đỉnh khác có chiều cao giống nhau giữa mẫu bệnh và mẫu chứng. Điều đó chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3. 3% 3% 3% 3% 3% 15% 6% 0% 17% 47% 50% Del - Exon 1-3 del 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% Exon 1-8 del Exon 1 del Exon 1-2 del Exon 8 del Exon 1-6 del Exon 4-6 del TCNCYH 117 (1) - 2019 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Kết quả đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron 2 và exon 10 của gen giả CYP21A1P; Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính. Hình trên là hình ảnh tương ứng với kết quả người bình thường, hình bên dưới là hình ảnh tương ứng với kết quả của bệnh nhân bị xóa đoạn dị hợp tử exon 1 đến exon 3 gen CYP21A2. Mẫu bệnh nhân Ex3 Mẫu chứng E1P Ex1 Ex4 Ex6 E10P I2P Ex8 Ex3 Ex1 IV. BÀN LUẬN Áp dụng kỹ thuật MLPA, 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH đã được phân tích để phát hiện đột biến gen. Kết quả cho thấy 34,3% bệnh nhân được phát hiện là có đột biến xóa đoạn. Nghiên cứu đã phát hiện được 8 dạng đột biến xóa đoạn gen gồm: mất toàn bộ gen (Del), exon 1 del, exon 1 - 2 del, exon 1 - 3 del, exon 1 - 6 del, exon 1 - 8 del, exon 4 - 6 del và exon 8 del. Kết quả này phù hợp với các dạng xóa đoạn được tìm thấy trong các nghiên cứu khác trên thế giới [5; 9]. Nghiên cứu cũng xác định được 9 kiểu gen, trong đó kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3, chiếm tỉ lệ là 14,3%. Như vậy các đột biến xóa đoạn lớn chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các đột biến và tỷ lệ này cũng phù hợp với các nghiên cứu trên các chủng tộc khác nhau. Xóa đoạn lớn chiếm tỷ lệ từ 18,8% đến 45% ở các nước châu Âu bao gồm: Phần Lan, Đan Mạch, Áo, Anh, Đức, Thụy Điển, Hà Lan, các nước Đông Âu [5; 9; 10; 11]. Tỷ lệ thấp hơn các đột biến xóa đoạn lớn gặp ở các nước châu Á như Trung quốc (25,4%), Nhật Bản (12%) [12; 13]. Sự khác nhau này có thể do cỡ mẫu nghiên cứu khác nhau và có thể có yếu tố chủng tộc. Tỉ lệ đột biến xóa đoạn di hợp tử với 1 al- lele không xác định được đột biến là 34,3%. Theo quy luật di truyền của Menden, đối với bệnh lý di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, cần phải có 2 allele đột biến mới biểu hiện bệnh. Chúng tôi giả thiết allele còn lại ở các bệnh nhân này có thể là đột biến điểm. Do 6 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nghiên cứu này chỉ áp dụng kỹ thuật MLPA để xác định đột biến xóa đoạn, các đột biến nhỏ hơn như đột biến điểm thì cần phải áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen. Tương tự như vậy 67 (65,6%) bệnh nhân không phát hiện được đột biến cũng cần áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến điểm. Nghiên cứu cũng xác định được đột biến xóa đoạn đồng hợp tử gặp ở 20 bệnh nhân (57,2%) (bảng 1). Kết quả tỉ lệ đồng hợp tử phát hiện được cao hơn so với một số nghiên cứu khác. Nghiên cứu của Finkielstain GP và cộng sự tìm thấy có 21% bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử. Nghiên cứu trên các bệnh nhân Hàn Quốc cho thấy đột biến đồng hợp tử xóa đoạn chiếm tỷ lệ 43,1% [14]. Chúng tôi giả thiết cho sự khác nhau này là do trong nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ cao các ca thể cổ điển mất muối nên dẫn đến tỷ lệ cao các ca có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn lớn. Yếu tố chủng tộc cũng có thể góp phần vào sự khác biệt này. V. KẾT LUẬN Bằng việc áp dụng kỹ thuật MLPA, nghiên cứu đã phát hiện được: 35/102 (34,3%) bệnh nhân có đột biến xóa đoạn. Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,3%, tiếp đến là kiểu gen đồng hợp tử Del/Del với 28,6%, exon 1 - 3 del chiếm tỉ lệ là 14,3%, các kiểu gen còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn từ 2,9 - 5,6%. Allele đột biến có tỉ lệ cao nhất là Del với 47%, tiếp đến là exon 1 - 3 del (15%), các allele đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 3 - 6%. Lời cám ơn Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu quy trình phát hiện người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử” và sự giúp đỡ của các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Bộ môn Nhi, Trường Đại học Y Hà Nội; Khoa Nội tiết-Chuyển hóa- Di truyền,Bệnh viện Nhi Trung ương. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Merke D.P. and Bornstein S.R. (2005). Congenital adrenal hyperplasia. The Lancet, 365(9477), 2125 - 2136. 2. Gonçalves J., Friães A., and Moura L. (2007). Congenital adrenal hyperplasia: focus on the molecular basis of 21-hydroxylase defi- ciency. Expert Rev Mol Med, 9(11), 1 - 23. 3. White P.C., Tusie-Luna M.T., New M.I et al (1994). Mutations in steroid 21- hydroxylase (CYP21). Hum Mutat, 3(4), 373 - 378. 4. Wedell A., Thilén A., Ritzén E.M et al (1994). Mutational spectrum of the steroid 21- hydroxylase gene in Sweden: implications for genetic diagnosis and association with dis- ease manifestation. J Clin Endocrinol Metab, 78(5), 1145 - 1152. 5. Krone N., Arlt W (2009). Genetics of congenital adrenal hyperplasia. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 23(2), 181 - 192. 6. van der Kamp H.J.. Wit J.M (2004). Neonatal screening for congenital adrenal hy- perplasia. Eur J Endocrinol, 151(3), U71 - 75. 7. White P.C., Speiser P.W (2000). Con- genital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency. Endocr Rev, 21(3), 245 - 291. 8. Kazmi D., Bailey J., Yau M et al (2017). New developments in prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia. J Steroid Bio- chem Mol Biol, 165, 121 - 123. 9. Trapp C.M., Speiser P.W., Oberfield S.E (2011). Congenital adrenal hyperplasia: TCNCYH 117 (1) - 2019 7 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC an update in children:. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes, 18(3), 166–170. 10. Vrzalová Z., Hrubá Z., Hrabincová E.S et al (2011). Chimeric CYP21A1P/ CYP21A2 genes identified in Czech patients with congenital adrenal hyperplasia. Eur J Med Genet, 54(2), 112 - 117. 11. New M.I., Abraham M., Gonzalez B et al (2013). Genotype–phenotype correlation in 1,507 families with congenital adrenal hyper- plasia owing to 21-hydroxylase deficiency. Proc Natl Acad Sci, 110(7), 2611 - 2616. 12. Xu Z., Chen W., Merke D.P et al (2013). Comprehensive mutation analysis of the CYP21A2 gene: an efficient multistep ap- proach to the molecular diagnosis of congeni- tal adrenal hyperplasia. J Mol Diagn, 15(6), 745 - 753. 13. Asanuma A., Ohura T., Ogawa E et al (1999). Molecular analysis of Japanese pa- tients with steroid 21-hydroxylase deficiency. J Hum Genet, 44, 312 - 317. 14. Choi J.-H., Jin H.-Y., Lee B.H et al (2012). Clinical phenotype and mutation spec- trum of the CYP21A2 gene in patients with steroid 21-hydroxylase deficiency. Exp Clin Endocrinol Diabetes Off J Ger Soc Endocrinol Ger Diabetes Assoc, 120(1), 23 - 27. Summary MLPA ANALYSIS FOR MUTATION DETECTION OF CYP21A2 GENE IN PATIENTS WITH STEROID 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency is a chromosomal recessive disease commonly caused by the CYP21A2 mutation. One of the common mutations in CYP21A2 is deletion. Among all methods of identifying deletion mutations, MLPA is most commonly used. The study was conducted with the purpose of identifying gene deletion in congenital hypercholes- terolaemia due to 21-hydroxylase deficiency using the MLPA technique. Methods: 102 patients diagnosed with 21-hydroxylase-deficient CAH were analyzed by MLPA technique. Results showed that 35 out of 102 (34.3%) patients were found to have CYP21A2 deletion. Of which, patients with salt wasting phenotype accounted for 85.7%, simple virilizing phenotype accounted for 14.3%. Homozygote mutation accounted for 57.2% and heterozygous mutation accounted for 42.8%. The study identified nine mutant genotypes. The mutation with highest incidence was heterozygous deletion Del/- (34.1%), followed by Del/Del with 28.6%, and homozygous deletion of exon 1 - 3 accounted for 14.3%. The other mutations accounted for 2.9 - 5.6%. Keywords: Congenital Adreanal Hyperplasia, CYP21A2 gene, deletion, MLPA