Đề tài Ảnh hưởng của áp suất cao đến hệ enzyme trong sữa

1 1. Giới thiệu enzyme trong sữa: Năm 1881, lần đầu tiên Arnold phát hiện sự có mặt của enzyme trong sữa bò. Enzyme đầu tiên được tìm thấy trong sữa là lactoperoxydase. Đến nay hàng trăm nghiên cứu công bố hơn 60 enzyme khác nhau đã tìm thấy trong sữa. Chúng do tuyến vú tiết ra hoặc do các VSV trong sữa tổng hợp nên. Enzyme là những chất xúc tác phản ứng, có bản chất là protein. Sự có mặt của các enzyme trong sữa là nguyên nhân gây biến đổi thành phần hoá học của sữa trong quá trình bảo quản, từ đó làm giảm chất lượng hoặc làm hư hỏng sữa. Tuy nhiên, một số enzyme có trong sữa như lactoperoxydase, lysozyme có vai trò kháng khuẩn. Chúng tham gia vào việc ổn định chất lượng sữa tươi trong quá trinh bảo quản trước khi chế biến. Người ta sử dụng phương pháp định tính thông qua việc phát hiện sự có mặt một vài enzyme trong sữa và xem đó là một chỉ tiêu để đánh giá chất lượng sữa. Dưới đây , xin giới thiệu khái quát về một số enzyme quan trọng trong sữa bò. 1.1.Lactoperoxydase: Enzyme này luôn có trong sữa động vật, nó do tuyến vú tiết ra. Tuy nhiên, vi khuẩn leucocyte cũng có thể tổng hợp được lactoperoxydase. Enzyme xúc tác phản ứng chuyển hoá oxy từ hydrogen peroxide (H2O2) đến các chất oxy hoá khác. Đây là một metallo enzyme, nó có chứa sắt (Fe) trong phân tử. Phân tử lượng enzyme là 82.000Da. Enzyme có pH tối thích là 6.8. Theo Luquet (1985), hàm lượng trung bình lactoperoxydase trong sữa là 30mg/l. Trong sữa non, hàm lượng enzyme thường cao hơn. Khi đun nóng sữa đến 80oC trong vài giây, lactoperoxydase sẽ bị vô hoạt. 1.2.Lipase: Người ta tìm thấy một hệ enzyme lipase trong sữa bò. Chúng xúc tác thuỷ phân liên kết ester trong triglyceride và giải phóng ra các acid béo tự do. Trong sữa, một số lipase hấp phụ lên màng bao xung quanh các hạt cầu béo, một số khác được tìm thấy trong plasma, chúng liên kết với các micelle của casein. Enzyme lipase quan trọng nhất trong sữa được kí hiệu là mLPL (milk Lipo Protein Lipase), là một glycoprotein gồm hai tiểu phần. Phân tử lượng của tiểu phần là 50.000Da. Enzyme có giá trị pH tối ưu là 8,9. Hàm lượng mLPL trong sữa chỉ khoảng 1÷2mg/l , nó chỉ xúc tác thuỷ phân liên kết ester trong cơ chất glycerid ở dạng nhũ tương tại bề mặt tiếp xúc pha giữa chất béo và nước. Các enzyme lipase khác xúc tác thuỷ phân các ester hoà tan và không nhũ hoá. Sự thuỷ phân triglyceride làm tích luỹ các acid béo tự do trong sữa. Quá trình phân giải tiếp các acid béo này làm cho sữa có mùi ôi khét và mùi kim loại. 1.3.Phosphatase: Các phosphatase tìm thấy trong sữa chủ yếu thuộc về nhóm phosphomonoesterase. Chúng xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết ester giữa acid phosphoric và glycerin. Một số nghiên cứu đã tìm thấy sự có mặt của ATPase và pyrophosphatase trong màng protein bao xung quanh các hạt cầu béo. Có 2 dạng phosphomonoesterase trong sữa: phophatase kiềm và phosphotase acid. 2 1.3.1.Phosphatase kiềm: Enzyme có pH tối thích là 9,6. Enzyme này được hoạt hoá bởi Mg2+, Mn2+ và bị vô hoạt bởi Zn2+, Be2+, I2. Có khoảng 30÷40% lượng enzyme được phân bố trong các hạt cầu béo, phần còn lại ở dưới dạng lipoprotein. Một trong những tính chất đặc trưng của phosphatase kiềm là khả năng tái hoạt hoá của nó. Sau quá trình thanh trùng, nếu ta kiểm tra mẫu sữa thì không phát hiện thấy hoạt tính phosphatase kiềm. Tuy nhiên, sau thời gian bảo quản, trong sữa sẽ xuất hiện trở lại hoạt tính của enzyme này. Người ta gọi đây là hiện tượng tái hoạt hoá của phosphatase kiềm và đến nay vẫn chưa tìm được lời giải thích rõ ràng về hiện tượng này. Để tránh hiện tượng tái hoạt hoá cùa phosphatase kiềm, ta cần làm lạnh nhanh sữa sau quá trình thanh trùng và bảo quản sữa ở nhiệt độ thấp (2oC). Một nghiên cứu cho rằng, sự có mặt của ion Ca2+ và Mg2+ thúc đẩy quá trình tái hoạt hoá enzyme, và ngược lại, các ion cobalt, đồng và niken lại kiềm hãm hiện tượng này. 1.3.2.Phosphatase acid: enzyme này có pH tối thích là 4,7 và là enzyme bền nhiệt nhất trong sữa đến 96oC và giữ ở nhiệt độ này trong thời gian tối thiểu là 5 phút . Phosphatase acid bị vô hoạt bởi NaF. Trong suốt chu kì tiết sữa ở bò, hoạt tính phosphatase acid trong sữa khá ổn định. Ngược lại, hoạt tính phosphatase kiềm tăng dần vào khoảng cuối chu kì tiết sữa. Để kiểm tra sữa có hoạt tính phosphatase hay không , người ta bổ sung ester của acid phosphoric và hoá chất đặc hiệu vào sữa. Nếu có enzyme, ester sẽ bị thuỷ phân, giải phóng ra rượi tự do. Sản phẩm này làm chuyển màu hoá chất đặc hiệu trên. 1.4.Lysozyme: Đến nay, người ta đã trích ly và tinh sạch được lysozyme từ sữa. Đó là một glucosaminidase (hay muramidase) có phân tử lượng khoảng 14.000÷18.000Da và là một enzyme bền nhiệt . Lysozyme xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết β giữa acid muramic và glucosamine của mucopolysaccharide trong màng tế bào vi khuẩn, từ đó gây phân huỷ tế bào. Lysozyme trong sữa bò hoạt động ở pH tối thích là 7,9. Hàm lượng lysozyme trong sữa bò trung bình là 130µg/l, khoảng 3000 lần thấp hơn trong sữa người (400mg/l) . 1.5.Protease: Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy trong sữa có hoạt tính enzyme protease. Theo Humber và Alais (1979) thì có 2 loại enzyme: protease acid và protease kiềm được tiết ra từ tuyến vú . Chúng thường liên kết với casein và cũng bị kết tủa ở pH = 4,6. Một số nghiên cứu khác tìm thấy 2 loại enzyme trên có mặt trong màng bao xung quanh các hạt cầu béo trong sữa. Các enzyme protease xúc tác phản ứng thuỷ phân protein, tạo các sản phẩm như proteosepepton, peptid và các acid amin tự do. Có lẽ các κ-casein là ít bị tấn công nhất. Sản phẩm thuỷ phân là γ-casein và các phân đoạn proteose-pepton có phân tử lượng khác nhau. Các protease acid trong sữa có pH tối thích là 4,0 ,còn protease kiềm hoạt động mạnh nhất ở pH = 7,5÷8,0. Chúng bị vô hoạt hoàn toàn ở 80oC sau 10 phút. 3 1.6.Catalase: Enzyme được tìm thấy trong protein màng bao xung quanh các hạt cầu béo. Trong sản xuất phomai, khi các casein bị đông tụ, một số phân tử catalase cũng bị kết tủa theo. Enzyme này xúc tác phản ứng phân huỷ hydrogen peroxide thành nước và oxy tự do. Sữa từ những con vật khoẻ mạnh có lượng catalase rất thấp. Sữa nhiễm vi sinh vật thường có hoạt tính catalase rất cao.Catalase là một metallo enzyme (có chứa Fe trong phân tử).Phân tử lượng của enzyme là 240.000Da. Enzyme có pH tối thích là 6,8 ÷ 7,0. Vào cuối chu kì tiết sữa của con vật, hoạt tính enzyme trong sữa thường rất cao. Catalase bị vô hoạt ở 75oC sau thời gian 1 phút hoặc vô hoạt ở 65÷68oC sau 30 phút. 2. Khảo sát ảnh hưởng của áp suất cao đến enzyme trong sữa: 2.1.Lactoperoxydase: 2.1.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Hoạt tính enzyme sau khi qua xử lý áp suất tại 73oC ở các áp suất khác nhau trong sữa tươi và trong whey loãng được trình bày trong hình 1. Từ đồ thị có thể nhân thấy là tại 73oC, sự vô hoạt lactoperoxidase tại áp suất khí quyển xảy ra rất nhanh, nếu sử dụng áp suất từ 150-700 MPa tại nhiệt độ này có thể ức chế hoàn toàn sự vô hoạt lactoperoxidase của nhiệt độ trong sữa. Như trên hình 1a, một tác động tương phản giữa áp suất cao và nhiệt độ đã được thể hiện. Tương tự, sự tác động tương phản này cũng xuất hiện trong nước whey. Tuy nhiên,trong nước whey, áp suất bằng hoặc cao hơn 700 MPa có thể làm vô hoạt lactoperoxidase nhưng tốc độ vô hoạt nhỏ hơn so với trường hợp tại áp suất khí quyển, nhiệt độ 73oC. Thậm chí, tại áp suất 150 MPa, hoạt tính của lactoperoxidase trong whey tăng nhưng không đáng kể. Điều này chứng tỏ sự ổn định áp suất của lactoperoxidase trong sữa cao hơn trong nước whey. 4 Hình 1: Hoạt tính enzyme sau khi xử lý nhiệt độ 73oC tại các áp suất khác nhau (a) sữa tươi: 0.1(O), 150( ), 400( ), 700( ) và 750(x) MPa (b) whey loãng: 0.1(O), 150( ), 400( ), 700( ) và 750(x) MPa 5 Hình 1 chỉ mô tả áp suất cao tại một nhiệt độ nhất định (73oC). Để hiểu rõ hơn, ta sẽ khảo sát thêm về sự ảnh hưởng ở các nhiệt độ khác nhau. Sự thay đổi hoạt tính enzyme qua xử lý áp suất cao (700MPa) tại các nhiệt độ khác nhau được trình bày trong hình 2. Ở áp suất 700 MPa, sự vô hoạt lactoperoxidase là không đáng kể, thậm chí ngay cả khi nhiệt độ là 65oC trong 140 phút (hình a). Trong nước whey, sự vô hoạt lactoperoxidase tại 65oC, 700 MPa và trong 140 phút cũng nhỏ. Nhìn chung, hoạt tính enzyme tại 700MPa ở các nhiệt độ khác nhau dao động không nhiều và không tuân theo quy luật nhất định nào cả. Sự ổn định áp suất của lactoperoxidase trong sữa cao hơn trong nước whey. 6 Hình 2: Hoạt tính enzyme sau khi xử lý áp suất 700MPa tại các nhiệt độ khác nhau (a) sữa tươi: 15(O), 25( ), 35( ), 45( ) và 65(x) oC (b) whey loãng: 10(O), 40( ), 65( ) oC 7 Nhìn chung, ở nhiệt độ phòng, lactoperoxidase có khả năng chịu được áp suất rất cao. Các kết quả tương tự đã đạt được bởi Rademacher et al. (1998b), ông cũng báo cáo rằng hoạt tính lactoperoxidase còn lại hơn 50% sau khi xử lý tại áp suất 800 MPa, nhiệt độ 25-60oC trong 4h. Còn Seyderhelm et al. (1996) đã phát hiện rằng nếu xử lý sữa tại áp suất 800 MPa, nhiệt độ 25-40oC trong 30 phút thì hoạt tính của nó giảm 20%. Trong dung dịch Tris tại pH 7, độ giảm là 70% trong điều kiện xử lý tương tự. 2.1.2.Giải thích: Giải thích cho sự ổn định áp suất cao của lactoperoxidase, các nhà khoa học cho rằng là do cấu trúc bậc cao của nó, chúng được ổn định bởi 8 liên kết disulfide và 1 ion calcium. Ngoài ra, Điều đáng chú ý nhất là tác động tương phản giữa áp suất và nhiệt độ cao. Ví dụ như tại 73oC ở áp suất khí quyển, sự vô hoạt enzyme xảy ra rất nhanh nhưng ở áp suất 700 MPa thì sự vô hoạt này bị ức chế hoàn toàn. Thực tế cho thấy áp suất làm chậm tốc độ vô hoạt trong suốt thời gian xử lý bằng nhiệt độ. Giải thích cho điều này, Suzuki (1960) Heremans (1982) cho rằng sự gia tăng áp suất tăng cường mức độ tổ chức của các phân tử protein. Còn tại nhiệt độ cao, sự hỗn loạn của phân tử protein hoặc sự duỗi ra của các chuỗi polypeptide xảy ra thông qua sự phá vỡ các liên kết bằng nhiệt. Sự hỗn loạn này được loại bỏ bởi áp suất. Cụ thể hơn ở đây, sự ổn định áp suất của enzyme chống lại sự biến tính hoặc vô hoạt bằng nhiệt xảy ra qua việc làm mất tác dụng giữa áp suất và nhiệt độ lên sự tạo thành hoặc phá vỡ các tương tác nội phân tử hoặc tương tác với dung môi. Ví dụ như: Sự hydrat hóa các nhóm chức của protein được gia tăng bởi áp suất nhưng tại nhiệt độ cao thì giảm. Các tương tác kị nước mạnh lên ở nhiệt độ trên 70oC nhưng yếu đi bởi áp suất là do kết quả của sự bộc lộ các amino acid không phân cực còn lại và sự tái tổ chức cấu trúc được bao bọc bởi nước. 2.2.Lipase: 2.2.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Hoạt tính của lipase ở các áp suất khác nhau được trình bày trong hình 3. Từ biểu đồ trên ta thấy tất cả các áp suất sử dụng đều làm gia tăng hoạt tính của lipase. Hoạt tính của lipase (tại thời điểm thời gian bằng 0) không bị ảnh hưởng tại 300 MPa trong khi lại gia tăng tại 350 MPa (133 %) và tại 400 MPa (100 %). Rõ ràng, sự thay đổi hoạt tính enzyme ở đây không theo quy luật nào cả. Hoạt tính của enzyme tại 300 MPa tiếp tục gia tăng theo thời gian (25-80 phút). Tại 350 và 400 MPa, nhìn chung hoạt tính enzyme dao động trong khoảng từ 150-240 % so với hoạt tính ban đầu theo thời gian (60-80 phút). Từ các dữ liệu này, việc mô tả ảnh hưởng của áp suất theo các kiểu động học là không thể. Rõ ràng trong phạm vi xử lý này, lipase là một enzyme có hoạt tính còn lại rất cao. Không có nhiều tài liệu thông tin về ảnh hưởng của áp suất cao lên hoạt tính enzyme này. Theo kết quả nghiên cứu của Seyderhelm et al. (1996) thì hoạt tính của lipase có thể giảm 40% trong dung dịch Tris tại pH 7, áp suất 600 MPa trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Nhiều nhà khoa học cũng khẳng định rằng khi tăng áp suất cao hơn nữa sẽ làm giảm thời gian vô hoạt enzyme. 8 Hình 3: Ảnh hưởng của áp suất cao lên enzyme lipase 2.2.2.Giải thích: Sự gia tăng hoạt tính của lipase ở áp suất cao vẫn chưa được hiểu rõ một cách cặn kẽ. Hiện tượng này có thể là do: -Sự thay đổi cấu tạo trong một giới hạn nào đó. -Sự giải phóng của các enzyme hoạt động từ phức enzyme-micelle -Sự giải phóng của các vị trí hoạt động trong enzyme qua sự thủy phân protein có giới hạn. Ngược lại, khi áp suất quá cao, sự thay đổi cấu trúc enzyme xảy ra mãnh liệt khiến hoạt tính enzyme giảm dần. 2.3.Phosphatase: 2.3.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Enzyme được khảo sát ở đây là phosphatase kiềm. Hoạt tính enzyme này tại các áp suất khác nhau (từ 500-800MPa) được biểu diễn trên hình 4 với các bậc phản ứng khác nhau n= 0-2 và ở nhiệt độ 5oC. Hình trên cho thấy hoạt tính enzyme tương đối Ct/Co đã giảm khi tăng thời gian và áp suất. Tại các áp suất cao hơn, hoạt tính giảm nhiều hơn và nhanh hơn, để giảm hoạt tính triệt để hơn ví dụ như giảm 99% thì áp suất phải từ 650 MPa trở lên. 9 Hình 4: Ảnh hưởng của áp suất cao lên enzyme phosphatase kiềm ở 5oC 2.3.2.Giải thích: Hiện tại, cơ chế vô hoạt enzyme này vẫn chưa được hiểu rõ một cách cặn kẽ. Theo Kouassi và cộng sự (2007), nguyên nhân có thể là do sự thay đổi cấu trúc phân tử của enzyme mà cụ thể ở đây là cấu trúc bậc 2. Khi áp suất tăng cao, cấu trúc xoắn giảm trong khi cấu trúc gấp nếp tăng, điều này cho thấy có thể có mối quan hệ giữa cấu trúc xoắn đến hoạt tính enzyme. Hay nói cách khác, cấu trúc bậc 2 có thể đóng vai trò quyết định đến hoạt tính enzyme. 10 2.4.Lysozyme: 2.4.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Ở đây, ta sẽ quan sát ở 2 môi trường khác nhau để đánh giá ảnh hưởng của áp suất cao lên lysozyme. Trong canh trường Brain Heart Infusion: Sự ức chế L. monocytogenes trong canh trường (Brain Heart Infusion) sử dụng đồng hóa áp suất cao, nhiệt độ và lysozyme được trình bày trong bảng sau: Bảng 1: Ảnh hưởng của đồng hóa áp suất cao (100MPa) và nhiệt độ lên hoạt tính ức chế vi sinh vật (L. monocytogenes) của lysozyme Cell load (log cfu mL-1) Immediately after inoculation Time of incubation 24h(37oC) 48h(37oC) 48h(6oC) 96h(6oC) Samples without Ly Untreated (UT) cells 7.3 0.2 8.1 0.2 7.8 0.3 7.1 0.2 8.6 0.2 HPH BHI 7.3 0.1 8.1 0.2 6.0 0.3 7.5 0.4 8.7 0.1 Samples with Ly UT cells + UT Ly 6.7 0.2 <2 <2 3.4 0.3 2.1 0.4 UT cells + HT1a Ly 5.6 0.2 <2 <2 3.1 0.1 2.3 0.3 UT cells + HT2b Ly 5.8 0.2 <2 <2 3.2 0.3 2.7 0.4 UT cells + HT3c Ly 6.3 0.1 <2 <2 3.5 0.2 2.8 0.2 UT cells + HPH Ly 5.0 0.2 <2 <2 3.3 0.3 2.0 0.3 a Heat treatment at 70oC for 30s. b Heat treatment at 70oC for 5min. c Heat treatment at 100oC for 5min. Từ bảng trên, tất cả các mẫu có bổ sung lysozyme đều cho thấy khả năng ức chế vi sinh vật L. monocytogenes. Sự hiện diện của lysozyme qua đồng hóa áp suất cao đã làm cho tế bào vi sinh vật giảm khoảng 2 log(cfu/ml). Cường độ phá hủy thành tế bào và giải phóng các tế bào chất trong tế bào của mẫu có lysozyme qua đồng hóa áp suất cao và mẫu không có lysozyme được biểu diễn trong hình 5. 11 Hình 5: Tế bào L. monocytogenes trong canh trường trước và sau khi bổ sung lysozyme qua xử lý áp suất cao Sự khác nhau của các điều kiện xử lý nhiệt độ tại 70oC trong 30s, 70oC trong 5 phút và 100oC trong 5 phút cũng có thể làm gia tăng hoạt tính ức chế vi sinh vật của lysozyme. Trong thực tế, ngay sau khi nuôi cấy thì độ giảm lần lượt là 1,7; 1,5; và 1 log(cfu/ml) tương ứng với các nhiệt độ là 70oC trong 30s, 70oC trong 5 phút và 100oC trong 5 phút. Cuối cùng so sánh với các mẫu không có enzyme thì mẫu có enzyme có khả năng vô hoạt cao hơn một chút khi có độ giảm là 0,6 log(cfu/ml). Trong suốt thời gian nuôi cấy tại 6oC, sự khác nhau về khả năng ức chế vi sinh vật trong các điều kiện thí nghiệm được xét là không đáng kể. Thực tế, tất cả các mẫu có lysozyme sau khi nuôi cấy ở 6oC trong 96h thì lượng tế bào còn lại dao động trong khoảng 2-2,8 log(cfu/ml). Tuy nhiên, lượng tế bào thấp nhất được ghi nhận ở mẫu có lysozyme qua đồng hóa áp suất cao. Khi nuôi cấy ở 37oC trong 24h và 48h, không phát hiện được sự 12 khác nhau giữa các mẫu có lysozyme vì tất cả đều có lượng vi sinh vật còn lại nằm dưới ngưỡng phát hiện. Trong sữa: Hình 6 mô tả sự vô hoạt tế bào trong sữa bò hoặc sữa cừu tương ứng với các phương pháp xử lý lysozyme khác nhau tại đồng hóa áp suất 100MPa hoặc 70oC trong 30s Hình 6: Sự ức chế tế bào L. monocytogenes trong sữa bò hoặc sữa cừu tương ứng với các phương pháp xử lý lysozyme khác nhau với (a) sữa bò và (b) sữa cừu 13 Sau 6h, mẫu sữa bò có lysozyme qua đồng hóa áp suất cao có độ giảm tế bào là 0,5 log(cfu/ml) khi so sánh với mẫu có lysozyme không qua xử lý. Mặt khác, độ chênh lệch về độ giảm tế bào giữa mẫu có enzyme qua đồng hóa áp suất cao và mẫu có enzyme qua xử lý nhiệt độ thì thấp hơn. Trong sữa cừu, mẫu có enzyme qua đồng hóa áp suất cao có thể làm giảm đáng kể lượng tế bào vi sinh vật. Điển hình là sau 6h nuôi cấy tại 37oC, mẫu có enzyme qua đồng hóa áp suất cao có lượng tế bào còn lại là 5 log(cfu/ml). Ngoài ra, mẫu qua đồng hóa không bổ sung enzyme cũng cho thấy sự giảm tế bào vi sinh vật. Tuy nhiên, số tế bào trong sữa cừu có lysozyme qua xử lý áp suất cao có dấu hiệu tăng lên khi thời gian từ hơn 6h đến 10h, trong khi đối với sữa bò thì vẫn chưa có hiện tương này ứng với khoảng thời gian trên. 2.4.2.Giải thích: Các số liệu ở trên cho thấy đồng hóa áp suất cao là một phương pháp hữu hiệu trong việc làm gia tăng hoạt tính ức chế vi sinh vật L. monocytogenes của lysozyme. Để giải thích cho điều này, Vannini et al. (2004) cho rằng sự gia tăng hoạt tính ức chế vi sinh vật của lysozyme có thể là do sự thay đổi cấu trúc phân tử của chúng. Thực tế, hoạt tính của lysozyme dựa trên cấu hình không gian ba chiều của chúng, một sự thay đổi nhỏ các vị trí hoạt động có thể làm gia tăng hoặc làm giảm hoạt tính của chúng. Mặt khác, Guerzoni et al. (1999) cho rằng sử dụng đồng hóa áp suất cao có thể làm bộc lộ các nhóm kị nước của protein, các vùng này gắn trên membrane của vi sinh vật, hậu quả là làm xác trộn chức năng của chúng nên làm gia tăng hoạt tính ức chế vi sinh vật của lysozyme. Nhưng theo thời gian, vi sinh vật có khả năng kháng lại enzyme này nên số lượng tế bào tăng lên. Thời điểm gia tăng phụ thuộc vào môi trường sống của chúng. 2.5.Protease: 2.5.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: Hoạt tính plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen trong sữa : Ảnh hưởng của áp suất cao lên hoạt tính plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen được trình bày trong bảng 3: 14 Bảng 2: Ảnh hưởng của áp suất cao tại các nhiệt độ khác nhau lên plasmin cộng dẫn xuất của plasminogen (PL) và chất hoạt hóa plasminogen (PA) Pressur e (MPa) Temper ature (oC) Activity (units ml-1) PL PA Milk serum Casein Milk serum Casein 0 Raw milk 1.66a,b,c 0.49 11.03e 1.90 2.06a,b 0.52 12.48f 2.20 200 20 40 55 2.15b,c 0.63 2.22b,c 0.69 2.14b,c 0.64 9.96d,e 1.37 10.03d,e 1.51 9.99d,e 1.43 2.67b 0.74 2.65b 0.68 2.71b 0.83 11.31e,f 1.98 11.42e,f 2.22 11.36e,f 2.04 450 20 40 55 2.59c 0.96 1.69a,b,c 0.35 1.13a 0.25 8.35c,d 1.29 5.86b 1.19 3.85a 0.08 3.16b 1.12 2.05a,b 0.28 1.29a 1.19 9.58d,e,f 1.93 6.68b,c 1.80 4.43a,b 1.44 650 20 40 55 2.52c 0.88 1.52a,b 0.35 0.98a 0.18 8.38c,d 1.18 6.63b,c 1.13 3.61a 0.75 2.93b 1.01 2.11a,b 0.56 1.33a 0.39 8.80c,d,e 1.16 6.81b,c,d 1.70 3.87a 1.51 Các số liệu trong bảng cho thấy hoạt tính của plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen giảm không đáng kể trong casein và tăng trong huyết thanh sữa khi xử lý ở 200 MPa. Nhưng ở 450 va 650 MPa, hoạt tính của plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen trong casein giảm đáng kể, còn ở huyết thanh sữa thì tăng ở 20oC nhưng lại giảm ở 40 và 55oC. Điều cần lưu ý ở đây là khi áp suất 450 và 650 MPa ở nhiệt độ 55oC thì hoạt tính của plasmin, dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen còn lại trong huyết thanh sữa là rất thấp. Hoạt tính của cathepsin D và các protease khác: Hoạt tính của protease trong acid whey của sữa cừu và sữa bò chưa qua xử lý được trình bày trên hình 7 từ các số liệu của sắc ký hấp phụ pha đảo. Các số liệu của các mẫu đã qua xử lý được trình bày trong hình 8. Các cuộc thí nghiệm với chất ức chế protease và cathepsin D và B của sữa bò được thực hiện để giải thích các dữ liệu của sắc ký hấp phụ pha đảo. 15 Hình 7: Biểu đồ biểu diễn hoạt tính protease trong acid whey của sữa cừu và sữa bò chưa qua xử lý, sau khi nuôi trong cơ chất Pro-Thr-Glu-Phe-[p-nitro-Phe]-Arg-Leu, pH 3,2 ; trong 12h, nhiệt độ 37oC WP: whey protein, S: cơ chất sót, P: cathepsin D 16 Hình 8: hoạt tính protease trong acid whey của sữa cừu xử lý tại 450 hoặc 650 MPa ở 55oC, sau khi nuôi trong cơ chất Pro-Thr-Glu-Phe-[p-nitro-Phe]-Arg-Leu, pH 3,2 ; trong 12h, nhiệt độ 37oC WP: whey protein, S: cơ chất sót, P: cathepsin D 17 Đỉnh P là của cathepsin D. Đỉnh 1 có thể là của các protease chưa được xác định trong whey. Đỉnh 2 có thể là cathepsin B. Đỉnh 3 là các cysteine protease khác, không phải catehpsin B. Ngoài ra, Sự thay đổi hoạt tính của cathepsin D và các protease khác cũng được trình bày trong bảng 4. Ở đây, các số liệu được trình bày theo vùng sắc kí đo được giống như trong hình 7 và 8. Để dễ hình dung, ta sẽ quan tâm đến bảng dưới. Bảng 3: Ảnh hưởng của áp suất cao tại các nhiệt độ khác nhau lên hoạt tính của protease trong acid whey của sữa cừu Pressure (MPa) Temperature (oC) Cathepsin D-like product (P) Peak 1 Peak 2 Peak 3 0 Raw milk 0.26d,e 0.02 2.30b,c 0.13 0.21a,b 0.11 0.49d 0.06 200 20 40 55 0.30e 0.05 0.29e,f 0.02 0.27d,e 0.01 2.34c 0.30 2.44c 0.17 2.32c 0.25 0.13a,b 0.07 0.13a,b 0.07 0.13a,b 0.06 0.21c 0.07 0.20c 0.08 0.17b,c 0.06 450 20 40 55 0.23c,d 0.04 0.19b,c 0.03 0.15a,b 0.03 2.23b,c 0.21 2.22b,c 0.19 2.14b,c 0.17 0.28b 0.13 0.23a,b 0.08 0.28b 0.07 0.13a,b,c 0.06 0.08a,b 0.02 0.08a,b 0.03 650 20 40 55 0.19b,c 0.04 0.12b 0.02 0.11a 0.03 1.94b 0.20 2.09b,c 0.17 1.58a 0.28 0.27a,b 0.12 0.22a,b 0.14 0.19a 0.06 0.07a,b 0.04 0.08a,b 0.05 0.06a 0.01 Hoạt tính của cathepsin D (đỉnh P) không thay đổi nhiều khi xử lý ở 200 MPa tại 3 nhiệt độ khác nhau và tại 450 MPa ở 20oC. Ngược lại, tại 450 MPa ở 40 hoặc 55oC, hoạt tính của chúng giảm còn 73% và 58% so với lúc chưa xử lý. Tại 650 MPa, độ giảm là đáng kể, tương ứng là 73, 46 và 42% tại 20, 40 và 55oC. Đỉnh 1 có khả năng chịu đựng rất tốt nó chỉ giảm đáng kể khi xử lý tại 650 MPa ở 55oC. Theo các điều kiện xử lý này, chúng giảm còn 69,2%. Đỉnh 2 thay đổi nhiều, hoạt tính của chúng giảm tại 200 MPa ở cả 3 nhiệt độ khỏa sát. Còn ở áp suất 450 và 650 MPa, hoạt tính của chúng lại tăng.Ngoài ra, nhiều ảnh hưởng đã được dấu kín bởi độ lệch tiêu chuẩn tương đối cao của các giá trị ở vùng 2. Đỉnh 3 giảm đáng kể và ở nhiệt độ cao thì giảm nhiều hơn. Đặc biệt hơn, việc xử lý ở 650 MPa làm giảm 80-84% so với hoạt tính ban đầu. Sự sụt giảm tương ứng ở 200MPa là 57-65%. 18 2.5.2. Giải thích: Một số vấn đề cần làm rõ trong phần này: - Thứ nhất, sự gia tăng hoạt tính của plasmin cộng dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen khi xử lý ở 200 MPa ở cả 3 nhiệt độ khảo sát hay tại 450 và 650 MPa ở 20oC. Theo Garı´a-Risco et al. (2003), nguyên nhân là do có sự dịch chuyển các enzyme từ casein đến huyết thanh sữa, việc dịch chuyển này diễn ra thuận lợi khi sự liên kết của chúng với casein bị phá vỡ. - Thứ hai, sự giảm hoạt tính của plasmin cộng dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen khi xử lý tại 450 và 650 MPa ở nhiệt độ 40 và 55oC. Nguyên nhân là do hiệu ứng đồng vận giữa nhiệt độ và áp suất là lớn, cơ chế có thể xảy ra ở đây là sự thay đổi cấu trúc của các enzyme xảy ra lớn. Ngoài ra, các nhà khoa học còn cho rằng có mối tương quan mật thiết giữa plasmin cộng dẫn xuất của plasminogen và chất hoạt hóa plasminogen với phần trăm whey protein còn lại trong sữa nhất là với -lactoglobulin, cho thấy rằng sự gia tăng độ biến tính whey protein làm giảm hoạt tính enzyme. Theo các nghiên cứu của Garcı´a-Risco et al. (2003), Huppertz, Smiddy, et al. (2006), và Scollard et al. (2000b) cho rằng sự có mặt của -lactoglobulin làm enzyme trong sữa bị mất ổn định dưới áp suất cao, nguyên nhân là do sự tương tác giữa thiol-sulfide với các liên kết disulfide trong phân tử plasmin, tương tự như sự vô hoạt bằng nhiệt. Một vấn đề khác cần nói ở đây chính là hoạt tính của các protease khác trong acid whey. Nhìn chung, hoạt tính của các protease này giảm khi tăng nhiệt độ và áp suất ngoại trừ cathepsin B (enzyme này giảm đáng kể ở 200MPa nhưng lại tăng tại 450 và 650 MPa). Hiện nay, vấn đề này vẫn chưa được nghiên cứu kỹ và giải thích rõ ràng. Nhưng theo Moatsou và cộng sự (2008) thì có mối tương quan giữa các vùng đỉnh và lượng -lactoglobulin dư, gợi ý rằng sự giảm hoạt tính enzyme có thể liên quan đến sự biến tính whey protein. 2.6.Một số enzyme khác: Các enzyme khảo sát trong phần này là -glutamyltransferase và phosphohexoseisomerase 2.6.1.Sự thay đổi hoạt tính enzyme: -glutamyltransferase: Ảnh hưởng của áp suất cao lên hoạt tính enzyme -glutamyltransferase ở 20oC được trình bày trong hình 9. Từ đồ thị dưới, ta thấy khi áp suất càng cao thì thời gian vô hoạt enzyme càng thấp. Tại 500 MPa, thời gian vô hoạt hoàn toàn vào khoảng 130 phút. Trong khi đó tại 700MPa, thời gian vô hoạt hoàn toàn là 18 phút. Nhìn chung, để vô hoạt enzyme một cách triệt để, áp suất áp dụng phải từ 500MPa trở lên. 19 Hình 9: Sự vô hoạt -glutamyltransferase bằng áp suất tại 20oC Phosphohexoseisomerase: Ảnh hưởng của áp suất cao lên hoạt tính enzyme phosphohexoseisomerase ở 20oC được trình bày trong hình 10. Đồ thị cho thấy enzyme này có khả năng chịu áp suất thấp hơn so với -glutamyltransferase. Áp suất càng cao thì thời gian vô hoạt enzyme càng thấp. Tại 500MPa, thời gian vô hoạt gần như hoàn toàn hoạt tính enzyme là 33 phút. Trong khi tại 420 và 460 MPa, thời gia vô hoạt cao hơn. 20 Hình 10: Sự vô hoạt phosphohexoseisomerase bằng áp suất tại 20oC 2.6.2. Giải thích: Do các enzyme này không có tầm ảnh hưởng quan trọng đến sữa nên không có nhiều các cuộc nghiên cứu về chúng. Sự vô hoạt enzyme bởi áp suất cao có thể là do sự tác động làm thay đổi cấu trúc phân tử của chúng (cấu trúc bậc 2 hoặc bậc 4). 3. Ứng dụng phương pháp xử lý áp suất cao để hoạt hóa/vô hoạt hệ enzyme trong sữa: Sữa chứa hơn 60 loại enzyme khác nhau, hầu hết đều được phân lập và phân tích đặc điểm tương đối tốt. Trong đó, nhiều loại enzyme có tiềm năng ứng dụng rất cao trong thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm từ sữa. Tuy nhiên, tiềm năng của chúng vẫn chưa được hiểu rõ một cách đầy đủ và cặn kẽ. Nguyên nhân là do hầu hết các enzyme này đều bị vô hoạt hoặc hoạt tính còn lại rất thấp sau quá trình thanh trùng bằng nhiệt. Vì thế, việc sử dụng áp suất cao trong thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Việc ứng dụng áp suất cao để xử lý enzyme trong sữa vẫn đang được nghiên cứu. Ở đây xin giới thiệu về một vài ứng dụng của chúng: 3.1. Trong sản xuất sữa thanh trùng: Ở đây, sữa sẽ được xử lý bằng áp suất cao thay vì dùng nhiệt độ. Theo các kết quả đã trình bày ở trên, ta thấy khi thanh trùng sữa ở áp suất cao sẽ có các ảnh hưởng có lợi và có hại trong sản xuất sữa thanh trùng. 21 Các ảnh hưởng có lợi: -Hoạt tính enzyme lactoperoxidase không thay đổi nhiều. Lactoperoxidase là enzyme có vai trò kháng khuẩn, tự nó không có khả năng ức chế vi khuẩn, chỉ đơn thuần là xúc tác tạo ra các chất ức chế vi sinh vật. Do đó, việc sử dụng áp suất cao không làm thay đổi vai trò ức chế vi sinh vật của nó trong khi nếu thanh trùng bằng nhiệt độ thì enzyme này sẽ bị vô hoạt gần như hoàn toàn. -Hoạt tính enzyme lysozyme tăng cao hơn so với khi xử lý bằng nhiệt độ. Điều này là có lợi vì lysozyme có khả năng ức chế vi sinh vật nên là gia tăng hiệu quả thanh trùng bằng áp suất cao. Tuy nhiên, enzyme này chỉ được khảo sát ở áp suất 100 MPa nên cần phải được nghiên cứu ở các áp suất cao khác để hiểu rõ hơn về sự thay đổi hoạt tính. Các ảnh hưởng có hại: -Hoạt tính enzyme lipase tăng khi xử lý ở áp suất 400 MPa. Enzyme này có khả năng thủy phân lipid tạo ra các acid béo tự do, các chất này dễ bị oxy hóa làm cho sữa bị ôi, hư hỏng. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme này sẽ giảm khi xử lý ở áp suất cao hơn 400 MPa. -Hoạt tính enzyme protease tăng. Điều này không có lợi trong quá trình bảo quản vì sự thủy phân protein bởi enzyme này ảnh hưởng đến sự mất ổn định vật lý hoặc làm gia tăng vị đắng. Ví dụ như sự thủy phân casein trong sữa có thể liên quan đến sự thay đổi vật lý trong sữa như sự đặc lại bất thuận nghịch trong quá trình bảo quản. Vấn đề này có thể được giải quyết khi ta kết áp suất cao với một nhiệt độ thích hợp. Ngoài ra, một vấn đề cũng cần phải quan tâm ở đây chính là cách đánh giá hiệu quả thanh trùng bằng áp suất cao. Để một enzyme được coi như là chất chỉ thị hiệu quả của quá trình xử lý sữa bằng áp suất., yêu cầu chủ yếu chính là sự tương đương về điều kiện vô hoạt giữa enzyme và các vi sinh vật mà ta quan tâm đến. Một số ý kiến chọn phosphatase kiềm làm chất chỉ thị do enzyme này chịu được áp suất tốt hơn các vi sinh vật có trong sữa. Do đó, sự vô hoạt enzyme ( như hoạt tính < 0,1%) có thể nói lên sữa đã qua xử lý bằng áp suất không có các vi sinh vật gây bệnh này. Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme này làm chất chỉ thị cũng có một vài điểm hạn chế: -Việc sử dụng áp suất cao có thể dẫn đến sự lãng phí do khi dùng các áp suất cao đủ ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật (dữ liệu về sự vô hoạt các vi sinh vật gây bệnh trong sữa đã được nói rõ trong 1 vài bài nghiên cứu) thì thời gian vô hoạt enzyme này là dài. -Một vài vi sinh vật trong sữa ( như một số vi khuẩn lactic và Penicillium roqueforti) có phosphatase kiềm nên sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả chỉ thị. -Sự tái hoạt hóa phosphatase kiềm có thể xảy ra. Do đó, một chất chỉ thị nhạy cảm với áp suất hơn được đặt ra. Trong đó, enzyme -glutamyltransferase là thích hợp hơn cả. 3.2. Trong sản xuất phomai: Việc sử dụng áp suất cao trong quá trình làm phomai có nhiều ưu điểm. Ngoài những ảnh hưởng có lợi trong thanh trùng sữa được trình bày ở trên còn có những ưu điểm sau: -Hoạt tính enzyme protease tăng. Điều này là có lợi vì hoạt tính protease có thể ảnh hưởng đến chất lượng phomai bằng 2 con đường. Thứ nhất, sự thủy phân 22 casein trước khi sản xuất có tác động đến đặc điểm đông tụ sữa của rennet. Thời gian đông tụ bởi rennet có thể được làm giảm bởi tác động của plasmin. Thứ 2, plasmin trong khối đông là chất quan trọng góp phần thủy phân casein trong suốt quá trình chín của phomai. -Hoạt tính enzyme lipase tăng khi xử lý ở áp suất 400 MPa. Lipase có vai trò trong sự thủy phân lipid trong suốt quá trình chín của phomai. Sự có mặt của lipase trong phomai là một trong những nhân tố tạo nên sự khác nhau về mùi vị giữa các loại phomai. Do đó, các loại phomai sẽ có mùi vị đặc trưng riêng cho chúng. 4. Kết luận: Sử dụng áp suất cao là một phương pháp có tiềm năng ứng dụng rất cao trong công nghiệp thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng. Tuy nhiên, vấn đề này cần phải được nghiên cứu nhiều hơn và ở phạm vi rộng hơn về ảnh hưởng của áp suất đến các giá trị dinh dưỡng ,enzyme, vi sinh vật trong sữa. Ngoài ra, việc kết hợp áp suất cao với nhiệt độ hoặc các chất kháng khuẩn cũng cần phải được nghiên cứu vì điều này sẽ giúp tránh được các nhược điểm khi sử dụng áp suất cao, việc xử lý bằng áp suất sẽ có hiệu quả cao và cải thiện chất lượng sữa hơn. 23 Tài liệu tham khảo 1. Lê Văn Việt Mẫn. Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống (tập 1). NXB ĐH quốc gia TPHCM, 2004. 2. Gerrit Smith. Dairy processing: improving quality. Woodhead publishing limited, 2003. 3. Y.H.Hui . Handbook of Food Science, Technology, and Engineering. CRC Taylor & Francis, 2006. 4. C.J.Doona, F.E.Feeherry. High pressure processing of foods. Blackwell publishing, 2007. 5. G.Moatsou, G.Katsaros, C.Bakopanos, I.Kandarakis, P.Taoukis, I.Politis (2008). Effect of high-pressure treatment at various temperatures on activity of indigenous proteolytic enzymes and denaturation of whey proteins in ovine milk. International dairy journal, 18, 1119-1125. 6. G.Moatsou, G.Katsaros, C.Bakopanos, I.Kandarakis, P.Taoukis, I.Politis, D.Katharios (2008). Effect of high-pressure treatment at various temperatures on activity of indigenous proteolytic enzymes and denaturation of whey proteins in bovine milk. Journal of dairy research, 75, 262-269. 7. B.Rademacher, J.Hinrichs (2006). Effect of high pressure treatment on indigenous enzymes in bovine milk: Reaction kinetics, inactivation and potential application. International dairy journal, 16, 655-661. 8. L.Iucci, F.Patrignani, M.Vallicelli, M.E.Guerzoni, R.Lanciotti (2007). Effect of high pressure homogenization on the activity of lysozyme and lactoferrin against Listeria monocytogenes. Food control, 18, 558-565. 9. P.K.Pandey, H.S.Ramaswamy (2004). Effect of high-pressure treatment of milk on lipase and -glutamyl transferase activity. Journal of food biochemistry, 28, 449-462. 10. L.R.Ludykhuyze, W.L.Claeys, M.E.Hendrickx (2001). Effect of temperature and/or pressure on lactoperoxidase activity in bovine milk and acid whey. Journal of dairy research, 68, 625-637. 11. G.K.Kouassi, R.C.Anantheswaran, S.J.Knabel, J.D.Floros (2007). Effect of high- pressure processing on activity and structure of alkaline phosphatase and lactate dehydrogenase in buffer and milk. Journal of agricultural and food chemistry, 55, 9520-9529. 12. M.G.Hayes, A.L.Kelly (2003). High pressure homogenisation of milk (b) effect on indigenous enzymatic activity. Journal of dairy research, 70, 307-313.