Đánh giá tác động kháng candida albicans của bài thuốc dị hoàng thang gia giảm vị hoàng bá trên in vitro

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 65 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS CỦA BÀI THUỐC DỊ HOÀNG THANG GIA GIẢM VỊ HOÀNG BÁ TRÊN IN VITRO Phan Thị Mỹ Linh*, Lê Thị Lan Phương* TÓM TẮT Tình hình chung và mục tiêu nghiên cứu: Cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang được nghiên cứu cho thấy có tác dụng kháng Candida albicans (C. albicans) ở nồng độ 1000 mg/mL và 2000 mg/mL, giá trị MIC là 1000 mg/mL. Qua khảo sát sơ bộ, Hoàng bá là thành phần chính trong bài thuốc có khả năng kháng C. albicans tốt nhất. Ở đề tài này, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng C. albicans in vitro của bài thuốc Dị hoàng thang khi gia giảm vị Hoàng bá nhằm đưa ra khuyến cáo về liều lượng Hoàng bá sử dụng trong bài thuốc khi muốn điều trị bệnh nhiễm nấm do C. albicans. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Bài thuốc Dị hoàng thang với lượng vị Hoàng bá khác nhau: 6 g, 8 g, 10 g, 12 g (ký hiệu lần lượt là DHT (6), DHT (8), DHT (10) và DHT (12)) được sắc với nước theo tỷ lệ dược liệu: nước là 1:10. Khảo sát một số tiêu chuẩn của cao chiết: Độ ẩm, độ tro theo Dược điển Việt Nam IV. Khảo sát tác dụng kháng nấm C. albicans theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán và tìm MIC theo phương pháp pha loãng đĩa thạch. Kết quả: DHT (6) và DHT (8) chỉ tạo vòng kháng nấm ở nồng độ khảo sát 500 mg/mL, 1000 mg/mL và 2000 mg/mL, MIC của DHT (6) >2000 mg/mL và của DHT (8) tại 1000 mg/mL. DHT (10) và DHT (12) tạo vòng kháng nấm ở tất cả nồng độ khảo sát (125 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL, 1000 mg/mL và 2000 mg/mL), MIC lần lượt là 250 mg/mL và 125 mg/mL. Như vậy, tác động kháng nấm C. albicans trên in vitro của cao chiết nước bài thuốc Dị hoàng thang tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá khi gia giảm trong bài thuốc. Kết luận: Cao chiết nước bài thuốc Dị hoàng thang thể hiện tác động kháng C. albicans hiệu quả hơn khi lượng vị Hoàng bá được tăng lên 10 g, 12 g so với bài thuốc gốc là 8 g. Từ khoá: Kháng nấm, Candida albicans, Dị hoàng thang. ABSTRACT EVALUATING THE ANTIFUNGAL EFFECT OF “DI HOANG THANG” EXTRACT AGAINST CANDIDA ALBICANS IN VITRO WHEN INCREASE OR DECREASE OF PHELLODENDRON AMURENSE Phan Thi My Linh, Le Thi Lan Phuong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 65 - 69 Background and Aims: The previous results of our study showed that the extract from Di hoang thang had the potential to be effective of anti – C. albicans at 1000 mg/mL, 2000 mg/mL, and the MIC value is 1000 mg/mL. Our previous study also showed that Phellodendron amurense is a major component of Di hoang thang which had the best activity against C. albicans. Therefore, we conducted this study to evaluate the anti – C. albicans efficiency when increase or decrease Phellodendron amurense in order to make a recommendation about Phellodendron amurense dose in Di hoang thang for the treatment of C. albicans infections. Materials and Methods: The Di hoang thang with different Phellodendron amurense doses: 6g, 8g, 10g, 12g (denote by DHT (6), DHT (8), DHT (10) và DHT (12) respectively) were extract with water (1:10 w/v). Survey moisture content test, total ash according Vietnamese Pharmacopoeia IV. Anti – C. albicans activity was Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Phan Thị Mỹ Linh ĐT: 0931101250 Email: phanlinh173@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 66 invvestigated by the disk diffusion method and MIC value by the agar dilution method. Results: DHT (6) and DHT (8) only showed inhibitory zone at 500 mg/mL, 1000 mg/mL và 2000 mg/mL, and MIC value of DHT (6) is >2000 mg/mL, MIC value of DHT (8) is 1000 mg/mL. DHT (10) and DHT (12) showed inhibitory zone at tested concentrations (125 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL, 1000 mg/mL và 2000 mg/mL), and MIC value are 250 mg/mL and 125 mg/mL, respectivevly. The results obtained from this study indicated that the anti – C. albicans effect of Di hoang thang extract in propotional to Hoang ba dose. Conclusions: The water extracts of Di hoang thang was more effective in control of C. albicans when Phellodendron amurense is increased up to 10 g and 12g. Keywords: Antifungal activity, Candida albicans, Di hoang thang. ĐẶT VẤN ĐỀ Có đến 75% phụ nữ bị nấm âm đạo ít nhất một lần trong đời và một trong ba tác nhân chính gây viêm nhiễm âm đạo là do C. albicans)(1). Trong y học cổ truyền, không có khái niệm tương đồng về bệnh viêm âm đạo do nhiễm nấm Candida mà có chứng Đới hạ. Tùy vào các thể bệnh trên lâm sàng mà có các bài thuốc điều trị thích hợp(7). Trong đó, Dị hoàng thang là một bài thuốc cổ phương, theo y học cổ truyền bài thuốc này trên lâm sàng chữa chỗ hư yếu của nhâm mạch, trừ thấp, thanh thận hỏa được sử dụng để chữa các chứng thuộc Đới hạ(7). Ở nghiên cứu trước, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Đánh giá tác động kháng Candida albicans của cao chiết Dị Hoàng thang trên in vitro” và kết quả cho thấy cao chiết nước bài thuốc Dị Hoàng thang ở nồng độ 2000 mg/mL và 1000 mg/mL cho vòng kháng nấm lần lượt 12,67 mm và 8,83 mm. Nồng độ 1000 mg cao chiết nước/mL ức chế tối thiểu sự phát triển của C. albicans sau 24 - 48 giờ nuôi cấy(6). Bên cạnh đó, trong 5 vị của bài thuốc Dị hoàng thang: Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bá, Xa tiền tử, Bạch quả ở cùng một nồng độ khảo sát thì Hoàng bá cho tác dụng kháng C. albicans tốt nhất. Trong các sách y học, liều dùng của Hoàng bá trên lâm sàng dưới dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán dao động từ 3 - 12g/ngày(2,4,8). Hoàng bá trong bài thuốc Dị hoàng thang được sử dụng trong nghiên cứu trước là 8g (Hoài sơn 40g, Khiếm thực 40g, Hoàng bá 8g, Xa tiền tử 4g, Bạch quả 10 quả)(7). Ở đề tài này, chúng tôi tiếp tục đánh giá hiệu quả kháng nấm C. albicans của bài thuốc Dị hoàng thang khi gia giảm vị Hoàng bá ở các lượng 6g, 10g và 12g trên in vitro nhằm đưa ra khuyến cáo về liều lượng vị Hoàng bá sử dụng trong bài thuốc khi muốn làm tăng tác dụng điều trị bệnh nhiễm nấm do C. albicans. PHƯƠNG TIỆN-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu Các dược liệu Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bá, Xa tiền tử, Bạch quả đươc mua tại nhà thuốc của Viện Y Dược học Dân tộc TP Hồ Chí Minh. Tất cả các dược liệu được lưu mẫu tại Phòng thí nghiệm Y Dược Cổ Truyền – Khoa Y Học Cổ Truyền – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh. Chủng vi sinh vật thử nghiệm: Candida albicans ATCC 90028TM của hãng Microbiologics – Mỹ. Môi trường thạch Sabouraud nuôi cấy nấm (BD, USA) và thạch Mueller-Hinton (MHA) thử hoạt tính kháng nấm (BD, USA). Thuốc đối chứng Fluconazole 150mg (Stada, Việt Nam). Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập. Chiết xuất cao Các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng bá được sắc riêng từng bài với nước theo tỷ lệ dược liệu: nước là 1:10 (kl/tt), dịch chiết được cô đặc, sấy để thu được cao khô với hàm lượng nước còn lại trong cao không quá 5%(2,4). Khảo sát một số tiêu chuẩn của cao chiết Hình thức cảm quan: Màu sắc, mùi vị, thể chất và độ đồng nhất. Xác định độ ẩm, độ tro toàn phần của cao chiết: Theo Dược Điển Việt Nam IV (DĐVN IV)(2). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 67 Đánh giá tác dụng kháng C. albicans(3) Tác dụng kháng C. albicans của cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang được tiến hành bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán theo hướng dẫn của CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Vi nấm thử nghiệm có mật độ 106 CFU/ml được trải đều trên đĩa thạch MHA bằng que bông vô trùng. Đặt các khoanh giấy có đường kính 6 mm đã được thấm dịch cao chiết ở các nồng độ khảo sát (125 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL, 1000 mg/mL và 2000 mg/mL) lên đĩa thạch đã láng đều C. albicans trước đó. Ủ 24 giờ ở 35oC (± 2oC), sự khuếch tán của cao chiết ra môi trường thạch sẽ ức chế sự tăng trưởng của C. albicans tạo thành vòng kháng nấm xung quanh khoanh giấy. Xác định đường kính vòng kháng nấm (mm). Xác định nồng độ ức chế tối thiểu sự phát triển C. albicans (MIC)(3) Bằng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch MHA. Cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang đã phân tán trong nước thành các nồng độ khảo sát được pha loãng tỷ lệ 1:10 (tt/tt) với môi trường thạch MHA. Chấm 1µL huyền dịch C. albicans khoảng 104 CFU lên mặt đĩa thạch. Ủ 24 và 48 giờ ở 35oC (± 2oC), quan sát và đếm lượng khúm nấm men mọc trên đĩa thạch. Nồng độ ức chế tối thiểu C. albicans (MIC) được xác định tại đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp nhất mà ở đó C. albicans bị ức chế phát triển, chỉ có 1 – 3 khúm nấm mọc. Phương pháp xử lý dữ liệu Kết quả được tính bằng Microsoft Excel 2013 và được biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SD). KẾT QUẢ Chiết xuất cao Hiệu suất chiết cao các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm khá thấp, không khác biệt đáng kể và dao động từ 11,79 – 12,54% (bảng 1). Khảo sát một số tiêu chuẩn của cao chiết Cao chiết nước các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm đều có thể chất rắn, khô rời nhau, màu vàng cánh gián, mùi thơm nhẹ, vị ngọt hơi đắng. Độ ẩm trung bình từ 4,09 – 4,32% < 5%, như vậy các cao chiết đạt tiêu chuẩn về độ ẩm cao khô theo qui định của DĐVN IV(2). Độ tro toàn phần trung bình từ 5,16 – 5,92% (bảng 2). Bảng 1. Hiệu suất chiết của các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm Cao chiết Tổng dược liệu ban đầu Cao chiết thu được (g) Hiệu suất chiết (%) Khối lượng (g) Độ ẩm (%) Khối lượng (g) Độ ẩm (%) DHT (6) 103,6 4,91±0,32 12,45 4,09±0,12 12,12 DHT (8) 105,7 4,82±0,31 12,39 4,18±0,20 11,79 DHT (10) 107,8 4,96±0,34 13,30 4,10±0,16 12,45 DHT (12) 109,7 5,06±0,22 13,65 4,32±0,15 12,54 Bảng 2. Độ ẩm trung bình và độ tro toàn phần trung bình của các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm Cao chiết Độ ẩm trung bình (%) Độ tro toàn phần trung bình (%) DHT (6) 4,09±0,12 5,45±0,73 DHT (8) 4,18±0,20 5,92±0,63 DHT (10) 4,10±0,16 5,55±0,51 DHT (12) 4,32±0,15 5,16±0,70 Đánh giá tác dụng kháng C. albicans Hình 1. Hoạt tính kháng C. albicans của các vị thuốc trong bài thuốc Dị hoàng thang. Bảng 3. Đường kính vòng kháng C. albicans của các vị thuốc trong bài thuốc Dị hoàng thang. Tác nhân kháng C. albicans Nồng độ (20 µL/khoanh giấy) Đường kính vòng kháng (mm) Nước cất - Không tạo vòng kháng Fluconazol 25 µg/khoanh giấy 29,33±1,53 Hoàng bá Dịch chiết nước tỷ lệ 2:1 (w/v) 15,33±1,15 Hoài sơn Không xác định được vòng kháng Khiếm thực Xa tiền tử Bạch quả Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 68 Kết quả ở hình 1 và bảng 3 cho thấy, trong 5 vị của bài thuốc Dị hoàng thang: Tại cùng một nồng độ khảo sát ngoại trừ Hoàng bá tạo vòng kháng nấm 15,33±1,15 mm, các vị còn lại Hoài sơn, Khiếm thực, Xa tiền tử, Bạch quả không xác định được vòng kháng nấm. Tác động kháng nấm C. albicans của các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của C. albicans thể hiện qua đường kính vòng kháng nấm như hình 2. Kết quả ở bảng 4 và biểu đồ 1 cho thấy đường kính vòng kháng C. albicans của các cao chiết DHT (6), DHT (8), DHT (10) và DHT (12) đều tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết khảo sát và ở cùng một nồng độ cao chiết thì đường kính vòng kháng tăng tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá sử dụng trong bài thuốc. Hình 2. Hoạt tính kháng C. albicans của các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm Bảng 4. Đường kính vòng kháng C. albicans của các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm Tác nhân kháng C. albicans Nồng độ (mg/mL) Đường kính vòng kháng (mm) Fluconazol 25 µg/ khoanh giấy 29,83±2,14 Nước cất - - Cao chiết DHT (6) 2000 9,67±0,82 1000 8,50±1,05 500 7,17±0,75 250 - 125 - Cao chiết DHT (8) 2000 12,83±0,98 1000 10,17±0,75 500 8,50±1,05 250 - 125 - Cao chiết DHT (10) 2000 18,50±1,05 1000 16,00±1,26 500 13,83±0,98 250 11,00±1,41 125 8,67±1,03 Cao chiết DHT (12) 2000 22,83±1,47 1000 19,50±1,05 500 17,17±1,47 250 13,83±1,17 125 11,67±1,03 “-”: Không xác định được vòng kháng nấm. Biểu đồ 1. Hoạt tính kháng C. albicans của cao chiết các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu sự phát triển C. albicans Thông qua kết quả khảo sát ở bảng 5 có thể nhận thấy MIC đối với C. albicans của DHT (6) khá cao > 2000 mg/mL, DHT (8) là 1000 mg/mL, riêng đối với DHT (10) và DHT (12) cần một nồng độ khá thấp lần lượt 250 mg/mL và 125 mg/mL là có thể ức chế được sự phát triển của C. albicans. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 69 Bảng 5. Mật độ khúm nấm C. albicans xuất hiện trên đĩa thạch Nồng độ (mg/ mL) Số lượng khúm nấm C. abicans trên đĩa thạch sau 24h và 48h thử nghiệm DHT (6) DHT (8) DHT (10) DHT (12) 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 2000 >3 >3 0 0 0 0 0 0 1000 >18 >23 <3 <3 0 0 0 0 500 >24 >30 >14 >16 0 0 0 0 250 >31 >37 >25 >27 1 2 0 1 125 >48 >51 >36 >42 3 3 1 1 BÀN LUẬN Hoàng bá có chứa 1,6% berberin và một ít palmatin(2), berberin và palmatin được xem là những chất có khả năng kháng nhiều vi khuẩn, vi nấm(9). Một nghiên cứu của nhóm các nhà nghiên cứu Hàn Quốc cũng chỉ ra Hoàng bá ở nồng độ 400 µg/khoanh giấy ức chế đáng kể các chủng nấm Candida như C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, nghiên cứu này cũng cho thấy các thành phần hoạt động kháng nấm chủ yếu là berberin và palmatin, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bởi berberin đối với C. albicans là 125-250 mg/L, C. krusei là 4 mg/L, C. parapsilosis >500 mg/L, bởi palmatin đối với C. parapsilosis là 15,6 mg/L(5). Bên cạnh đó, trong 5 vị của bài thuốc Dị hoàng thang: Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bá, Xa tiền tử, Bạch quả ở cùng một nồng độ khảo sát thì Hoàng bá cho tác dụng kháng C. albicans tốt nhất (hình 1, bảng 3). Với những kết quả thử nghiệm như trên có thể nói trong bài thuốc Dị hoàng thang, Hoàng bá được xem như thành phần chính có tác dụng kháng nấm C. albicans và khi Hoàng bá được gia thêm lên 10 g, 12 g (liều lượng này phù hợp với những khuyến cáo về liều lượng sử dụng Hoàng bá trong các sách y học(2,4,8)) thì làm tăng hiệu quả kháng C. albicans của bài thuốc. KẾT LUẬN Đánh giá và so sánh được tác động kháng C. albicans của 4 bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng bá DHT (6), DHT (8), DHT (10) và DHT (12). Tác động kháng nấm C. albicans trên in vitro của cao chiết nước các bài thuốc Dị hoàng thang tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá khi gia giảm. Như vậy, có thể tăng thêm lượng Hoàng bá sử dụng trong bài thuốc Dị hoàng thang lên 10 g, 12 g để đạt hiệu quả tốt hơn khi muốn điều trị bệnh nhiễm nấm do C. albicans. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn phụ sản – Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2011). Viêm âm đạo. Sản phụ khoa – Tập II. NXB Y học, TP Hồ Chí Minh, tr. 753-754. 2. Bộ Y Tế (2009). Cao thuốc, Độ ẩm, Độ tro toàn phần, Hoàng bá. Dược điển Việt Nam IV. NXB Y Học, Hà Nội, tr. PL9, PL182, PL183, 778-779. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute (2009). Method for Antifungal Disk diffusion susceptibility Testing of Yeasts, Approved Guideline - Second edition. CLSI document M44-A2 Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 4. Nguyễn Phương Dung (2016). Hoàng bá. Dược học cổ truyền. NXB Đại học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh, tr. 79-80 5. Park K et al (1999). “Differential inhibitory effects of protoberberines on sterol and chitin biosyntheses in Candida albicans”. Journal Antimicrobial Chemotherapy; 43(5): 667-674. 6. Phan Thị Mỹ Linh, Võ Thanh Phong, Lê Thị Lan Phương (2017). “Đánh giá tác dụng kháng Candida albicans của cao chiết Dị hoàng thang trên in vitro”. Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh; 21(6): 181-184. 7. Phó Thanh Chủ (2007). Bệnh Đới hạ. Dịch giả Lương Y Nguyễn Văn Nghĩa. Nữ khoa và nhi khoa. NXB Phương Đông, Cà Mau, tr. 18-32. 8. Trần Quốc Bảo, Trần Quốc Bình (2011). Hoàng bá. Thuốc y học cổ truyền và ứng dụng lâm sàng. NXB Y học, Hà Nội, tr. 49-50. 9. Williamson E, Driver S, Baxter K (2009). Berberin. Stockley’s Herbal Medicines Interactions. Pharmaceutical Press, London, pp. 58-60. Ngày nhận bài báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018