Đánh giá nồng độ CF ADN-EBV trong huyết tương trước xạ trị và mối tương quan với các thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh ung thư vòm mũi họng

T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 8-2018 102 ĐÁNH GIÁ NỒNG ĐỘ CF ADN-EBV TRONG HUYẾT TƢƠNG TRƢỚC XẠ TRỊ VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI CÁC THỂ MÔ BỆNH HỌC VÀ GIAI ĐOẠN BỆNH UNG THƢ V M M I HỌNG Đỗ Trâm Anh1; Nghiêm Đức Thuận1; Hồ Hữu Thọ2 TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá nồng độ cell-free ADN EBV trong huyết tương trước xạ trị và mối tương quan với các thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh ung thư vòm mũi họng. Đối tượng và phương pháp: bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư vòm mũi họng giai đoạn I - IV, có chẩn đoán mô bệnh học được lựa chọn vào nhóm nghiên cứu; sử dụng quy trình realtime PCR xét nghiệm cell-free ADN-EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao, với ngưỡng phát hiện 25 copies/ml huyết tương. Kết quả: 50 bệnh nhân được làm xét nghiệm định lượng nồng độ cell-free ADN-EBV trong huyết tương trước xạ trị: 49 bệnh nhân (98%) dương tính, nồng độ cell-free ADN-EBV trung bình 1,14 x 10 4 (0 - 1,4 x 10 5 ) copies/ml. Mối tương quan giữa nồng độ cell-free ADN-EBV huyết tương với chẩn đoán TNMs: giai đoạn bệnh càng muộn hay di căn hạch cổ càng nhiều, nồng độ cell-free ADN-EBV trong huyết tương càng cao, sự tương quan này có ý nghĩa thống kê. Kết luận: nồng độ cell-free ADN-EBV huyết tương có mối liên quan với tình trạng di căn hạch cổ, giai đoạn và thể mô bệnh học của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. * Từ khoá: Ung thư vòm mũi họng; Cell-free ADN-EBV; Mô bệnh học; Giai đoạn bệnh. Evaluation of cf DNA-EBV Levels in Plasma before Radiotherapy and the Correlation with Histopathology, Disease Stage of Nasopharyngeal Carcinoma Summary Objectives: To investigate serum cf DNA-EBV levels in plasma before radiotherapy and the correlation with histopathology, disease stage of nasopharyngeal carcinoma patients. Subjects and methods: Diagnosis of nasopharyngeal carcinoma was confirmed by histopathology of nasopharyngeal biop sies; cf DNA-EBV in peripheral blood was detected using a sensitive technique of realtime PCR with the detection limit of 25 copies/mL of plasma. Results: 50 patients were tested cf DNA-EBV serum level plasma before radiotherapy, 49 patients (98%) were positive and 1. Bệnh viện Quân y 103 2. Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Trâm Anh (tramanhdo3110@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/08/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/09/2018 Ngày bài báo được đăng: 02/10/2018 t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 8-2018 103 had 1.14 x 10 4 (0 - 1.4 x 10 5 ) copies/mL DNA-EBV average serum. The correlation between the plasma cf DNA-EBV level and TNMs diagnosis: The rate of patients with high DNA-EBV positive levels was positively correlated with the higher disease stages with metastatic lymphadenopathy, and the correlation was statistically significant with p < 0.05. Conclusion: Plasma cf DNA-EBV level is correlated with node metastases, disease stages, and histopathology of nasopharyngeal carcinoma patients. * Keywords: Nasopharyngeal carcinoma; cf DNA-EBV; Histopathology; Disease stage. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là bệnh ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ vùng vòm họng, đây là một trong những loại ung thư phổ biến hay gặp ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á [6]. Bệnh đứng hàng đầu trong các bệnh ung thư vùng đầu mặt cổ và là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở nước ta. Trên thế giới, hàng năm có khoảng 80.000 trường hợp mới mắc. Phía nam Trung Quốc, tỷ lệ mắc cao (25 trường hợp/100.000 dân/năm), trong khi ở Mỹ và châu Âu tỷ lệ này thấp hơn (0,5 - 2/100.000 dân [7]. Tỷ lệ mắc bệnh UTVMH cao ở nam giới, độ tuổi từ 40 - 60, UTVMH có liên quan đến nhiều yếu tố như địa lý, chủng tộc, thói quen sinh hoạt và đặc biệt là vai trò sinh bệnh học của Epstein Barr Virus (EBV) trong UTVMH [1]. Việc sử dụng các xét nghiệm phát hiện kháng thể chống lại EBV để chẩn đoán sớm và sàng lọc bệnh UTVMH đã tiến hành ở một vài khu vực. Tuy nhiên, các xét nghiệm thường âm tính ở thể ung thư biểu mô tế bào vảy của UTVMH và các bệnh ung thư đầu cổ khác. Vì vậy, EBV là một dấu ấn sinh học để chẩn đoán sớm bệnh. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về xuất hiện EBV trong mô sinh thiết khối UTVMH, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào cụ thể về nồng độ cell-free ADN-EBV (cf ADN-EBV) trong huyết tương bệnh nhân (BN) UTVMH với các thể mô bệnh học, giai đoạn bệnh và biến đổi nồng độ này trong quá trình xạ trị. Với mục đích góp phần đưa xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV vào chẩn đoán sớm, điều trị và tiên lượng bệnh UTVMH tại Việt Nam, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Đánh giá nồng độ cf ADN-EBV trước xạ trị và mối liên quan với các thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh UTVMH, từ đó giúp tiên lượng, đánh giá kết quả điều trị bệnh UTVMH. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. BN được chẩn đoán UTVMH và điều trị tại Trung tâm Y học Hạt nhân, Bệnh viện K Trung ương từ tháng 1 - 2017 đến 1 - 2018. * Tiêu chuẩn lựa chọn BN: - Được chẩn đoán xác định UTVMH bằng mô bệnh học. - Chưa được điều trị. - Có đầy đủ hồ sơ bệnh án. - BN đồng ý hợp tác nghiên cứu. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. Nghiên cứu tiến cứu mô tả từng trường hợp có can thiệp. T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 8-2018 104 * Khám lâm sàng và cận lâm sàng: - Hỏi bệnh: + Khai thác tiền sử bản thân BN và gia đình liên quan đến ung thư, lý do vào viện. + Dựa vào các triệu chứng cơ năng: ngạt mũi, khịt khạc nhày lẫn máu, xì ra nhày lẫn máu, ù tai, đau nửa đầu, nghe kém, viêm tai giữa thanh dịch, liệt dây thần kinh sọ não. - Thăm khám: sau khi lập bệnh án và khai thác các triệu chứng cơ năng, đánh giá các triệu chứng thực thể, nội soi tai mũi họng cho thấy: + Vị trí khối u: thành sau trên, thành bên, thành dưới. + Kích thước khối u. + Hình ảnh đại thể: sùi, loét, thâm nhiễm, hoại tử chảy máu. + Lan tràn khối u: mũi xoang, họng miệng, nền sọ, hố chân bướm hàm. + Khám hạch cổ: vị trí, kích thước, mật độ, màu sắc da. + Sinh thiết khối u chẩn đoán mô bệnh học. + Chẩn đoán tế bào học nếu có hạch cổ. + Chẩn đoán hình ảnh: MRI, CT-scanner đầu mặt cổ, PET/CT. + Chẩn đoán giai đoạn TNM theo phân loại AJCC (2010) của WHO. + Kết quả xét nghiệm ADN-EBV trong huyết tương trước điều trị. * Định lượng nồng độ cf ADN-EBV huyết tương: Xác định nồng độ cf ADN-EBV huyết tương bằng kỹ thuật realtime PCR với độ nhạy cao đã được chúng tôi thiết lập và mô tả chi tiết trong công bố gần đây [12], bao gồm các bước sau: - Chuẩn bị mẫu máu: mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5 ml/lần lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA. - Trong vòng 6 giờ sau lấy, vận chuyển mẫu máu đến labo, tách huyết tương bằng ly tâm 1.500 g trong 10 phút và chuyển sang tuýp nhựa polypropylen. - Tách chiết ADN-EBV từ huyết tương theo quy trình: tách chiết ADN huyết tương bằng bộ kít Anapure DNA/RNA Viral Mini với quy trình cải tiến, đồng thời bổ sung lượng Viral Lysis buffer và Proteinase K. - Đánh giá kỹ thuật realtime PCR tối ưu trên bộ panel mẫu chuẩn quốc tế. Độ nhạy của kỹ thuật realtime PCR tối ưu phát hiện cf ADN-EBV đánh giá chất lượng trên bộ panel mẫu chuẩn của Đại học Hồng Kông, kết quả thu được từ kỹ thuật realtime PCR tối ưu có độ đặc hiệu cao (chứng âm không cho tín hiệu khuếch đại) và có khả năng phát hiện mẫu ADN của EBV có nồng độ thấp nhất trong bộ panel mẫu chuẩn quốc tế. Kết quả xét nghiệm với 10 lần lặp lại cho thấy ngưỡng phát hiện của kỹ thuật realtime PCR tối ưu là 25 copies/ml huyết tương [12]. * Xử lý số liệu: Số liệu xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0, so sánh các đại lượng định tính bằng thuật toán 2, khảo sát khác biệt về giá trị trung bình bằng kiểm định Mann - Whitney. t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 8-2018 105 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 1: Chẩn đoán giai đoạn theo TNM (AJCC, 2010). Đánh giá theo khối u nguyên phát, đa số BN thuộc giai đoạn T1, T2 và T4. Đánh giá theo hạch vùng, đa số BN thuộc giai đoạn N1, N0, N2. Đánh giá theo di căn xa, đa số BN thuộc giai đoạn M0. Đánh giá theo giai đoạn: gặp nhiều ở giai đoạn IV (36%) và giai đoạn II (30%) theo chẩn đoán TNM. * Chẩn đoán mô bệnh học khối u nguyên phát vòm mũi họng: Týp I (ung thư biểu mô dạng biểu bì sừng hóa): 1 BN (2%); týp II (ung thư biểu mô dạng biểu bì không sừng hóa): 2 BN (4%); týp III (ung thư biểu mô không biệt hóa): 47 BN (94%). * Nồng độ cf ADN-EBV trong huyết tương: âm tính: 1 BN (2%); dương tính: 49 BN (98%); số bản copies trung bình: 1,14 x 104. Bảng 2: Mối tương quan giữa nồng độ cf AND-EBV huyết tương với chẩn đoán T và chẩn đoán N. Chẩn đoán TNMs < 25 copies/ml ≥ 25 copies/ml Tổng p n % n % Theo kích thước u (T) T1 2 12,5 14 87,5 16 0,324 T2 3 18,8 13 81,2 16 T3 0 0 3 100 3 T4 0 0 15 100 15 Theo kích thước hạch (N) Nx, N0 5 38,5 8 61,5 13 0,003 N1 0 0 15 100 15 N2 0 0 16 100 16 N3 0 0 3 100 3 Chẩn đoán TNMs (n = 50) % Theo kích thước hạch (N) No, Nx 16 32 N1 15 30 N2 16 32 N3 3 6 Theo kích thước khối u (T) T1 16 32 T2 16 32 T3 3 6 T4 15 30 Theo di căn xa (M) M0 48 96 M1 2 4 Chẩn đoán TNMs I 6 12 II 15 30 III 11 22 IV 18 36 T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 8-2018 106 - Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV với giai đoạn T: giai đoạn T1 và T2 có nồng độ ≥ 25 copies/ml là 87,5% và 81,2%; giai đoạn T3 và T4 đều ≥ 25 copies/ml (100%), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05. - Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV với giai đoạn N: giai đoạn N1, N2, N3 đều ≥ 25 copies/ml (100%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05. Bảng 3: Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV huyết tương với giai đoạn bệnh. Nồng độ ADN-EBV huyết tƣơng Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III Giai đoạn IV p < 25 copies/ml 2 3 0 0 0,036 ≥ 25 copies/ml 4 12 11 18 Nồng độ trung bình 1048 3985 19554 16102 (13 - 5.990) (0 - 39.000) (119 - 114.000) (156 - 140.000) Trước điều trị, 100% BN UTVMH giai đoạn III - IV có nồng độ cf ADN-EBV huyết tương ≥ 25 copies/ml. Nồng độ trung bình có sự khác biệt rõ rệt, tăng cao ở giai đoạn III, IV so với giai đoạn I, II. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Bảng 4: Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV huyết tương với mô bệnh học. Nồng độ ADN-EBV huyết tƣơng Týp 1 Týp 2 Týp 3 p < 25 copies/ml 1 0 4 0,009 ≥ 25 copies/ml 0 2 43 Nồng độ trung bình 22 798 12.115 (156 - 1.440) (0 - 140.000) Đa số mô bệnh học của BN UTVMH là ung thư biểu mô không biệt hoá (týp 3) với nồng độ cf ADN-EBV huyết tương tăng cao ở thể mô bệnh học týp 2, týp 3. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). BÀN LUẬN Mối liên quan giữa EBV và UTVMH được chứng minh qua các phản ứng huyết thanh miễn dịch, qua phản ứng PCR phát hiện sự hiện diện của EBV trong máu, nước bọt và trong mô sinh thiết khối u của BN UTVMH. Năm 1998, Mutirangura và CS đã phát hiện cf ADN-EBV lưu hành trong máu ngoại vi của BN UTVMH [8] mà không xuất hiện ở 82 đối tượng trong nhóm chứng khỏe mạnh, mặc dù có tới 95% người trong nhóm chứng khỏe mạnh đã từng bị nhiễm EBV. Như vậy, EBV thâm nhiễm vào tế bào lympho B ở thể tiềm ẩn, có thể không giải phóng cf ADN-EBV tự do ra huyết tương, vì thế không gây hiện tượng dương tính giả. t¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 8-2018 107 Phát hiện này là một bước đột phá quan trọng cho thấy cf ADN-EBV trong huyết tương là dấu ấn rất đặc hiệu của UTVMH. Tuy nhiên, tại Việt Nam kỹ thuật định lượng cf ADN-EBV có độ nhạy còn thấp, với ngưỡng phát hiện 300 copies/ml huyết tương, nên chỉ phát hiện được cf ADN-EBV trong máu ngoại vi ở 64 - 68% BN UTVMH, nghiên cứu của Nguyễn Huy Tần (2018) là 74% [4]. Chúng tôi xác định nồng độ cf ADN-EBV trong huyết tương ở 50 BN UTVMH bằng kỹ thuật realtime PCR với độ nhạy cao, ngưỡng phát hiện 25 copies/ml, kết quả đã xác định được nồng độ dương tính 98%, tỷ lệ âm tính trước điều trị 2%. Kết quả của chúng tôi tương đương với nghiên cứu của Lo và CS sử dụng phương pháp realtime PCR để nâng cao độ nhạy phát hiện cf ADN-EBV tự do lưu hành trong máu ngoại vi và phát hiện được cf ADN-EBV ở 96% BN UTVMH [9]. Nồng độ cf ADN-EBV có vai trò quan trọng trong chẩn đoán, tiên lượng, đánh giá kết quả điều trị. Về mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV huyết tương và giai đoạn bệnh theo phân loại TNM (AJCC 2010) cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê. Ở giai đoạn III, IV: 100% BN có nồng độ cf ADN-EBV huyết tương ≥ 25 copies/ml, cao hơn rõ rệt so với giai đoạn I, II. Khi đánh giá nồng độ so với giai đoạn T, chúng tôi thấy không có sự khác biệt nhiều giữa giai đoạn T1, T2 và T3, T4. Như vậy, nồng độ cf ADN-EBV không bị biến đổi nhiều bởi kích thước khối u. Tuy nhiên, chưa có tài liệu nào công bố cụ thể về vấn đề này. Ngược lại, đối với giai đoạn N, càng nhiều di căn hạch cổ, tỷ lệ ADN-EBV dương tính càng cao. UTVMH là bệnh đáp ứng tốt với điều trị nhưng thường áp dụng điều trị đặc thù đa mô thức [2], đối với giai đoạn I (T1N0M0), xạ trị đơn thuần có thời gian sống thêm 5 năm > 90%; giai đoạn II (T2N0M0) đáp ứng với xạ trị đơn thuần như giai đoạn I, trong khi ở giai đoạn II (T1,2N1M0), nguy cơ tái phát cao hơn, cần cân nhắc hóa xạ trị đồng thời. Ở giai đoạn III, IV, thời gian sống thêm 5 năm toàn bộ giảm xuống 75% và 58% [2, 8]. Chính vì vậy, việc xét nghiệm nồng độ cf ADN-EBV có ý nghĩa quan trọng trong phát hiện, sàng lọc sớm và tiên lượng bệnh. Về kết quả chẩn đoán mô bệnh học: chúng tôi gặp cả ba loại theo phân nhóm của WHO, trong đó thể mô bệnh học phổ biến nhất là ung thư biểu mô không biệt hóa týp 3 (94,0%). Kết quả này phù hợp với nhiều tài liệu và nghiên cứu trong nước cũng như nước ngoài trước đây: Nguyễn Đình Phúc (92,5%), Nghiêm Đức Thuận (88,89%), Tang M (96,1%) [3, 5, 11]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, mối liên quan giữa thể mô bệnh học và nồng độ cf ADN-EBV huyết tương có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. KẾT LUẬN 50 BN được làm xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV trong huyết tương trước điều trị xạ trị, 49 BN (98%) cho kết quả dương tính, nồng độ cf ADN-EBV trung bình 1,14 x 104 copies/ml. Nồng độ cf ADN-EBV huyết tương có tương quan thuận với chẩn đoán giai đoạn TNMs: T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 8-2018 108 giai đoạn bệnh càng muộn hay di căn hạch cổ càng nhiều, nồng độ cf ADN-EBV trong huyết tương càng cao, sự tương quan này có ý nghĩa thống kê. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Hòa Bình. Nghiên cứu tình trạng suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng trước điều trị. Tạp chí Y học Việt Nam. 1993, 9, tr.5-9. 2. Lê Chính Đại. Nghiên cứu điều trị phối hợp hóa-xạ trị và xạ trị đơn thuần bệnh ung thư vòm mũi họng giai đoạn III, IV (Mo). Luận án Tiến sỹ Y học. Trường Đại học Y Hà Nội. 2007. 3. Nguyễn Đình Phúc. Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng và gen virut Epstein-Barr trong ung thư vòm mũi họng. Luận án Tiến sỹ Y học. Trường Đại học Y Hà Nội. 2006. 4. Nguyễn Huy Tần. Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và định lượng nồng độ ADN-EBV huyết tương trong ung thư vòm mũi họng. Luận án Tiến sỹ Y học. Trường Đại học Y Hà Nội. 2018. 5. Nghiêm Đức Thuận. Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học và hoạt tính gen virut Epstein-Barr trong ung thư vòm mũi họng. Luận án Tiến sỹ Y học. Học viện Quân y. Hà Nội. 2002. 6. Jemal A, Bray F, Center M.M et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011, 61 (2), pp.69-90. 7. Altun M, Fandi A, Dupuis O et al. Undifferentiated nasopharyngeal cancer (UCNT): Current diagnostic and therapeutic aspects. J Radiat Oncol Biol Phys. 1995, 32 (3), pp.859-877. 8. Mutirangura A et al. AND-EBV in serum of patients with NPC. Clin Cannar Res. 1998, 4 (3), pp.665-659. 9. Lo Y.M et al. Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res. 1999, 59 (6), pp.1188-1191. 10. Al-Sarraf, M, LeBlanc, M, Giri P.G et al. Chemoradiotherapy versus radiotherapy in patients with advanced nasopharyngeal cancer: Phase III randomized intergroup study 0099. J Clin Oncol. 1998, 16, p.1310. 11. Tang M, Ou N, Li C et al. Expression and prognostic significance of macrophage inflammatory protein-3 alpha and cystatin A in nasopharyngeal carcinoma. BioMed Res. 2015, 617143. 12. Ho Huu Tho et al. Establishment of ultrasensitive PCR assay targeting cell-free DNA-EBV for early detection of nasopharyngeal carcinoma. Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering. 2017 [S.l.], v. 59, n. 3, p.53-59, 2017, Sep. ISSN 2525-2461.