Đánh giá khả năng ức chế chu kỳ tế bào của bài thuốc lá dâu, dừa cạn thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế bào u nguyên bảo thần kinh SKN-DZ

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 174 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CHU KỲ TẾ BÀO CỦA BÀI THUỐC LÁ DÂU, DỪA CẠN THU THẬP TẠI TỈNH SÓC TRĂNG TRÊN DÒNG TẾ BÀO U NGUYÊN BÀO THẦN KINH SKN-DZ Tạ Nguyên Thảo Bình*, Khổng Lê Trường Giang**, Bùi Chí Bảo*, Trịnh Thị Diệu Thường* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam cũng như trên thế giới ngày càng gia tăng, trở thành mối đe dọa cộng đồng, kể cả trẻ em. Trong các loại ung thư ở trẻ từ 1 đến 5 tuổi, u nguyên bào thần kinh là loại u ác tính thường gặp, gây tử vong hàng đầu. Việc nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc điều trị căn bệnh này là cần thiết, đặc biệt các thuốc có nguồn gốc thảo dược, ít tác dụng phụ, đang ngày càng được các nhà khoa học quan tâm. Để ngăn chặn sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào ung thư, tác động vào chu kỳ tế bào được xem là mục tiêu của các tác nhân hóa trị liệu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra các hoạt chất chiết xuất từ lá dâu, cây dừa cạn có đặc tính kháng ung thư qua cơ chế ức chế chu kỳ tế bào và có tác động ức chế sự tăng sinh các tế bào u nguyên bào thần kinh. Tại Việt Nam nói chung và Sóc Trăng nói riêng có nhiều kinh nghiệm dân gian sử dụng thuốc nam điều trị ung thư cho thấy hiệu quả, trong đó có bài thuốc phối hợp Lá dâu, Dừa cạn. Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu về các cơ sở khoa học chính thức về bài thuốc này. Chính vì vậy, nhằm tìm kiếm bằng chứng khoa học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế chu kỳ tế bào của bài thuốc lá dâu, dừa cạn thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế bào u nguyên bào thần kinh. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là cao chiết nước của bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng. Dòng tế bào: Tế bào u nguyên bào thần kinh (SKN-DZ). Phương pháp dòng chảy tế bào. Kết quả: Tỉ lệ tế bào ở pha G2-M của lô xử lý với bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở nồng độ 621,3 µg/ml là 82,8% lớn hơn so với lô đối chứng là 17,8% (Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,05). Kết luận: Bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng có khả năng ức chế chu kỳ tế bào trên tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ. Từ khóa: Lá dâu, Dừa cạn, ức chế chu kỳ tế bào, phương pháp dòng chảy tế bào, kháng ung thư ABSTRACT EVALUATING THE CELL CYCLE INHIBITORY EFFECT OF A HERBAL FORMULA CONTAINING MORUS ALBA L. AND CANTHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON COLLECTED IN SOC TRANG PROVINCE ON SKN-DZ NEUROBLASTOMA CELL LINE Ta Nguyen Thao Binh, Khong Le Truong Giang, Bui Chi Bao, Trinh Thi Dieu Thuong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 174 - 178 Objectives: Along with the development of society, the number of people suffering from cancer in Vietnam and in the world is increasing, becoming a community threat, including children. Among the types of cancers in children aged 1 to 5 years, neuroblastoma is the most common, fatal malignant tumor. The search for drugs to treat this disease is necessary, especially the drugs from herbal medicines, with few side effects, currently attracting the attention of scientists. The cell cycle is currently considered the target of novel therapeutic agents. Many studies showed the active ingredients extracted from Morus alba L. and Cantharanthus roseus (L.) G. Don. had anti-cancer properties through cell cycle inhibitory mechanism to stop proliferation of neuroblastoma cells. In *Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh **Trường ĐH Công nghệ TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS. Tạ Nguyên Thảo Bình ĐT: 0986892766 Email: thaobinh@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 175 Vietnam, we have many folk experiences of using herbal medicine in cancer treatment, which showed effectiveness, including the combined remedy containing Morus alba L. and Cantharanthus roseus (L.) G. Don. However, up to now, there has been no scientific evidence to support this treament on neuroblastoma cell. Therefore, we conducted this research to evaluate the effectiveness of cell cycle inhibitory effect of the combined herbal formula containing Morus alba L. and Cantharanthus roseus (L.) G. Don., collected in Soc Trang province on the SKN-DZ neuroblastoma cell line. Materials and Methods: The object of the study: The aqueous extract of Morus alba L. and Cantharanthus roseus (L.) G. Don. collected in Soc Trang province. Cell line: SKN-DZ neuroblastoma cells. Method: Flow cytometry. Result: The ratio of cells in G2-M of the group treated with Morus alba L. and Cantharanthus roseus (L.) G. Don. extract at the concentration of 621.3 µg/ml is 82.8%, much higher than the control group at 17.8% (p <0.05). Conclusion: Morus alba L. and Cantharanthus roseus (L.) G. Don. remedy collected in Soc Trang province has the ability to inhibit the cell cycle on SKN-DZ neuroblastoma cells. Key words: Morus alba L., Cantharanthus roseus (L.) G. Don., the cell inhibition mechanism, anti-cancer, flow cytometry method ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam cũng như trên thế giới ngày càng gia tăng, trở thành mối đe dọa cộng đồng, kể cả trẻ em(2,12). Trong các loại ung thư ở trẻ nhỏ hơn 5 tuổi, u nguyên bào thần kinh là loại u rắn ngoại bào phổ biến nhất. Đây là nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư ở trẻ trong độ tuổi từ 1 đến 5, chiếm 13% trong tổng số tử vong do ung thư ở trẻ em(7). Việc nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc điều trị căn bệnh này là cần thiết, đặc biệt các thuốc có nguồn gốc loại thảo dược, ít tác dụng phụ, đang ngày càng được các nhà khoa học quan tâm. Để ngăn chặn sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào ung thư, tác động vào chu kỳ tế bào được xem là mục tiêu của các tác nhân hóa trị liệu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra các hoạt chất chiết xuất từ Lá dâu, Dừa cạn có khả năng ức chế chu kỳ tế bào, tác động đến tế bào u nguyên bào thần kinh như: vinblastin, vincristin, vinorelbin(3,4,5,13). Đặc biệt hoạt chất vincristin từ Dừa cạn được dùng trong hóa trị liệu nhiều loại ung thư, bao gồm căn bệnh kể trên(1,9,11,13). Tại Việt Nam nói chung và Sóc Trăng nói riêng có nhiều kinh nghiệm dân gian sử dụng thuốc nam điều trị ung thư cho thấy hiệu quả, một trong số đó là bài thuốc phối hợp Lá dâu, Dừa cạn. Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu chính thức về bài thuốc này. Chính vì vậy, nhằm tìm kiếm bằng chứng khoa học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế chu kỳ tế bào của bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế bào u nguyên bào thần kinh. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát khả năng ức chế chu kỳ tế bào của cao chiết nước bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Cao chiết nước của bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn thu thập được trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng, với nồng độ 6213,0µg/ml. Dòng tế bào Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ được cung cấp từ tiến sĩ Akira Nakagawa, Nhật Bản. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 176 Phương pháp dòng chảy tế bào Mục đích phương pháp Phương pháp dòng chảy tế bào là kỹ thuật có khả năng đo được các đặc tính huỳnh quang và quang học của một tế bào đơn hoặc các hạt như vi sinh vật, nhân và nhiễm sắc thể được chuẩn bị trong dung dịch lỏng khi chúng đi qua một nguồn sáng. Các máy flow cytometry đầu tiên là một thiết bị đơn thông số (single- parameter) chỉ được sử dụng để phát hiện kích thước của tế bào. Hiện nay, các thiết bị với độ phức tạp cao có khả năng phát hiện đồng thời 14 thông số đang được phát triển. Nguyên tắc phương pháp Phương pháp dòng chảy tế bào phân tích dựa trên tia laser để đếm số lượng tế bào (hoặc các thành phần khác như nhân tế bào, nhiễm sắc thể) dương tính với chất chỉ thị. Các thành phần chính của máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometer) và phân loại tế bào (cell sorter) bao gồm: hệ dung dịch, hệ thống quang học (ánh sáng kích thích và bộ thu ánh sáng kích thích), một thiết bị dò điện tử và một máy tính. Đầu tiên, tiến hành nhuộm các tế bào với kháng thể gắn huỳnh quang đặc hiệu cho từng loại chất chỉ thị. Sau đó, tế bào được đưa tới đèn laser trong một dòng chất lỏng. Khi tia laser chiếu vào các tế bào dương tính với chất chỉ thị sẽ tạo ra các ánh sáng huỳnh quang và được thu tại thấu kính tại vị trí thích hợp. Sự kết hợp giữa bộ phận tách chùm tia và các kính lọc sẽ hướng ánh sáng huỳnh quang tới thiết bị dò điện tử (detector) một cách chính xác. Cuối cùng các detector phát tín hiệu và chuyển các tín hiệu thành các thông tin số tỉ lệ thuận với cường độ ánh sáng và máy tính sẽ phân tích các thông tin này và biểu thị chúng dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tính với các huỳnh quang tương ứng với các kháng nguyên cần khảo sát. Theo đó, các tế bào không gắn hoặc gắn rất ít với kháng thể gắn huỳnh quang đặc hiệu sẽ biểu hiện thành cột âm tính nằm ở góc trái biểu đồ và quần thể tế bào gắn được nhiều kháng thể đơn dòng sẽ được biểu hiện thành cột dương tính nằm ở góc phải biểu đồ. Quy trình thực hiện Xử lý mẫu với thuốc Tế bào sau khi phân lập được cấy trên hai giếng của đĩa 6 giếng với mật độ 1x106 tế bào/giếng. Khi tế bào đã ổn định và đủ mật độ (bao phủ 80% bề mặt cấy), tiến hành phân lô và xử lý thuốc như sau: - Lô 1 (2x106 tế bào/lô): không xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn. - Lô 2 (2x106 tế bào/lô): xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở độ pha loãng 1/50 (tương ứng với nồng độ 124,3 µg/ml). - Lô 3 (2x106 tế bào/lô): xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở độ pha loãng 1/10 (tương ứng với nồng độ thuốc 621,3 µg/ml). - Lô 4 (2x106 tế bào/lô): xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở độ pha loãng 1/5 (tương ứng với nồng độ thuốc 1242,6 µg/ml). Sau đó ủ các tế bào trong 24 giờ, ở điều kiện 37oC và 5% CO2. Tiếp đến tiến hành cố định tế bào với Ethanol 70% lạnh và nhuộm nhân tế bào (1x105 tế bào) với 100 µl PI (Kit thương mại BD) trong 15 phút trong tối. Phân tích chu kỳ tế bào bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào Các tế bào của mẫu chứng và những mẫu xử lý thuốc được phân tích dựa trên số lượng nhiễm sắc thể (NST) để xác định chu kỳ tế bào bằng máy đếm dòng chảy tế bào (FACS Canto II- BD). Tế bào ở pha G1 được xác định có bộ NST là 2n, các tế bào ở pha G2-M có bộ NST là 4n, các tế bào đa bội được xác định dựa trên bộ NST > 4n. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm STATA 13.0. Số lượng tế bào trong các pha G1, S, G2-M và số tế bào đa bội được trình bày dưới dạng tỉ lệ %. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 177 Sử dụng phép kiểm chi bình phương để so sánh hai tỉ lệ. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,05. KẾT QUẢ Hình 1: Kết quả phân tích chu kỳ tế bào khi xử lý với bài thuốc lá dâu, dừa cạn Bảng 1. Tỉ lệ tế bào trong từng pha của các lô thí nghiệm Lô thí nghiệm G1 S G2/M Đa bội Lô 1 63,5 13,6 17,8 0 Lô 2 70,7 9,6 15,6 0 Lô 3 4,9 7,1 82,8 1,30 Lô 4 5,7 9,6 72,8 9,8 Kết quả cho thấy, ở lô xử lý với bài thuốc lá dâu, dừa cạn ở ở nồng độ thuốc 621,3 µg/ml tỉ lệ tế bào ở pha G2-M (82,8%,) lớn hơn so với lô đối chứng (17,8%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,05 (Bảng 1). BÀN LUẬN Khác với tế bào bình thường, các tế bào ung thư có đặc điểm là chu kì tế bào không được kiểm soát cùng với việc giảm sự chết tế bào theo chu trình (apoptosis)(6). Đây là nguyên nhân khiến khối u lan rộng. Chính vì thế, gây ra bắt giữ chu kì tế bào hoặc gây apoptosis là hai mục tiêu hướng đến của hầu hết các tác nhân hóa trị liệu. Chu kỳ tế bào là một quá trình kiểm soát sự phát triển và tăng sinh liên tục của tế bào. Quá trình này được điều chỉnh chặt chẽ bởi các điểm kiểm soát nghiêm ngặt áp dụng cho từng pha để tránh bất kỳ lỗi nào trong sự phát triển tổng thể của các mô. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi tiến hành phân tích chu kỳ tế bào, ở lô xử lý với bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn với nồng độ thuốc 621,3 µg/ml, kết quả cho thấy tỉ lệ tế bào ở pha G2-M lớn hơn so với lô chứng. Nghĩa là có sự ngăn chặn phân bào ở pha G2-M dưới tác dụng của thuốc. Điều này có thể liên quan đến tác dụng của một số hoạt chất chiết xuất từ Lá dâu và Dừa cạn. Vincristin là một chất chiết xuất từ cây dừa Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 178 cạn, được sử dụng kết hợp trong hóa trị liệu ung thư. Nghiên cứu của các tác giả Tu Y, Cheng SX về tác dụng ức chế chu kỳ tế bào của vincristin trên tế bào u nguyên bào thần kinh SH-SY5Y: Phân tích chu kỳ tế bào của các tế bào u nguyên bào thần kinh SH-SY5Y được xử lý với vincristin bằng phương pháp dòng chảy tế bào. Kết quả ghi nhận tại thời điểm 18 giờ tỷ lệ tế bào pha G2-M (72,3 ± 9,4%) cao hơn so với nhóm đối chứng không xử lý với vincristin (13,3 ± 3,8%) (p <0,01). Những dữ liệu này cho thấy rằng vincristin gây dừng chu kỳ tế bào ở pha G2-M(10,13). Chưa có nghiên cứu chính xác về tác dụng ức chế chu kỳ tế bào của Lá dâu trên dòng tế bào u nguyên bào thần kinh. Tuy nhiên một nghiên cứu của tác giả Naowaratwattana W đã chỉ ra các polyphenol trong Lá dâu gây tác dụng tương tự như trong nghiên cứu của chúng tôi trên tế bào HepG2 liên quan đến ung thư biểu mô tế bào gan(8). Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng cao chiết nước toàn phần của Lá dâu và Dừa cạn. Điều này chưa tìm thấy ở các nghiên cứu trước đó hầu hết sử dụng các hoạt chất chiết suất từ hai dược liệu này. Tuy nhiên kết quả vẫn cho thấy cao chiết nước toàn phần Lá dâu, Dừa cạn có tác dụng ức chế chu kì tế bào trên dòng tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ. Qua đây, bước đầu khẳng định cơ sở khoa học của bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn thu thập tại tỉnh Sóc Trăng. KẾT LUẬN Bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng có khả năng ức chế chu kỳ tế bào trên dòng tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ. Lời cảm ơn: Bài báo này là một phần kết quả của đề tài Nghiên cứu khoa học thuộc Sở Khoa học và công nghệ tỉnh Sóc Trăng, đã được công nhận kết quả theo Quyết định số 177/QĐ-SKHCN ngày 28/12/2018. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Blajeski AL, Phan VA, Kottke TJ, Kaufmann SH (2002). "G(1) and G(2) cell-cycle arrest following microtubule depolymerization in human breast cancer cells". J Clin Invest, 110:9-91. 2. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, et al (2018). "Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries". CA Cancer J Clin, 68:394-424. 3. Coderch C, Morreale A, Gago F (2012). "Tubulin-based structure-affinity relationships for antimitotic Vinca alkaloids". Anticancer Agents Med Chem, 12:25-219. 4. de Oliveira AM, da Silva MM, da Silva GC, et al (2015). "Evaluation of Toxicity and Antimicrobial Activity of an Ethanolic Extract from Leaves of Morus alba L. (Moraceae)". Hindawi, 5. Deepa M, Sureshkumar T, Satheeshkumar PK., Priya S (2013). "Antioxidant rich Morus alba leaf extract induces apoptosis in human colon and breast cancer cells by the downregulation of nitric oxide produced by inducible nitric oxide synthase". Nutr Cancer, 65:10-305. 6. Knudson AG (2001). "Two genetic hits (more or less) to cancer". Nat Rev Cancer, 1(2):62-157. 7. Maris JM, Hogarty MD, Bagatell R, Cohn SL (2007). "Neuroblastoma". Lancet, 369:20-2106. 8. Naowaratwattana W, De-Eknamkul W, De Mejia EG (2010). "Phenolic-containing organic extracts of mulberry (Morus alba L.) leaves inhibit HepG2 hepatoma cells through G2/M phase arrest, induction of apoptosis, and inhibition of topoisomerase IIalpha activity". J Med Food, 13(5):56-1045. 9. Packer RJ, Ater J, Allen J, Phillips P, Geyer R, et al (1997). "Carboplatin and vincristine chemotherapy for children with newly diagnosed progressive low-grade gliomas". J Neurosurg, 86:54-747. 10. Park S, Kim J, Kim Y (2012). "Mulberry leaf extract inhibits cancer cell stemness in neuroblastoma". Nutr Cancer, 64(6):98- 889. 11. Qaddoumi I, Billups CA, Tagen M, Stewart CF, Wu J, et al (2012). "Topotecan and vincristine combination is effective against advanced bilateral intraocular retinoblastoma and has manageable toxicity". Cancer, 118:70-5663. 12. Quỹ Dân số Liên hợp quốc (UNFPA) (2011). “Già hóa dân số và người cao tuổi ở Việt Nam: thực trạng, dự báo và một số khuyến nghị chính sách”, pp.12-36. 13. Tu Y, Cheng S, Zhang S, Sun H, Xu Z (2012). "Vincristine induces cell cycle arrest and apoptosis in SH-SY5Y human neuroblastoma cells". Int J Mol Med, 31(1):9-113. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019