Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid tách ra từ lá chè xanh và trầu không - Đoàn Thanh Huyền

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 185 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA FLAVONOID TÁCH RA TỪ LÁ CHÈ XANH VÀ TRẦU KHÔNG Đoàn Thanh Huyền1, Lê Minh Trí1, Ngô Thị Thúy Phương1, Đỗ Thị Tuyên2 Tóm tắt: Trong bài báo này chúng tôi tiến hành tách chiết các hợp chất flavonoid và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên các dòng vi khuẩn kiểm định: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans và Staphycoccus aureus. Kết quả chỉ ra rằng hoạt chất flavonoid tách ra từ lá chè xanh trầu không đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Như vậy từ những kết quả bước đầu cho thấy các hoạt chất flavonoid mà chúng tôi nghiên cứu có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là đối với 2 chủng E. coli và S. aureus. Hoạt chất flavonoid được tách chiết từ lá trầu không có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với hoạt chất từ lá trà xanh. Từ khoá: Bacillus subtilis, Candida albicans, Escherichia coli, Hoạt tính kháng khuẩn, Staphycoccus aureus, Hợp chất flavonoid. 1. MỞ ĐẦU Ở nước ta, do vị trí quan trọng của cây chè trong nền kinh tế quốc dân nên đã có rất nhiều nghiên cứu trên đối tượng này. Chỉ tính từ khoảng 10 năm trở lại đây đã có khoảng vài chục công trình được công bố, song những nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào việc nghiên cứu quy trình, điều kiện trồng, chăm bón, chọn giống, chế biến, sinh trưởng phát triển và tăng năng suất của chè Các nghiên cứu theo hướng hóa sinh học cũng chỉ tập trung vào các thành phần đóng vai trò chính trong việc nâng cao chất lượng chè uống. Còn các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh dược học của các chất polyphenol khai thác từ chè Việt Nam với mục đích phục vụ lĩnh vực y dược còn ít. Hiện nay một số nghiên cứu đã tập trung vào nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ chè xanh, trầu không [4]. Tuy nhiên, các nghiên cứu còn chưa có hệ thống. Một số nghiên cứu đã chứng minh hàm lượng polyphenol trong lá chè biến động mạnh theo mùa và theo tuổi lá. Bước đầu nghiên cứu thăm dò về một số hoạt tính sinh học của hoạt chất flavonoid chiết xuất từ lá chè Tân Cương nhận thấy: hoạt chất có khả năng chống oxy hóa cao, có tác dụng bảo vệ gan trên chuột bị nhiễm độc CCl4, có tác dụng kháng khuẩn tốt đối với nhiều chủng vi khuẩn gram dương và gram âm, có tác dụng chống viêm loét. Tiến hành nghiên cứu thăm dò trên các tế bào ung thư nuôi cấy in vitro cho thấy có tác dụng gây độc đối với các tế bào ung thư biểu mô người Hep- 2, tế bào u tủy chuột Sp- 2/0 và tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma- 180, nhưng không gây hủy hoại các tế bào máu ngoại vi ở người khỏe mạnh [5]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của lá trầu không, giải thích được tại sao cây trầu không được dân gian sử dụng trị vết thương nhiễm Hóa học và Kỹ thuật môi trường Đ.T.Huyền, L.M.Trí, N.T.T.Phương, Đ.T.Tuyên, “Đánh giá hoạt tính trầu không.” 186 trùng có mủ sưng đau, sâu kiến đốt, bỏng, viêm quanh răng, dùng phòng trị bệnh viêm họng, bệnh bạch hầu; chữa viêm kết mạc, chữa viêm tai, trị đau bụng đầy hơi, tiêu chảy, nôn mửa. Mặt khác, kết quả nghiên cứu đã phát hiện ra khả năng trị được mầm bệnh thủy sản của lá trầu không, tương lai có thể bào chế thuốc kháng sinh phòng trị bệnh cho gia súc và động vật thủy sinh từ lá trầu không. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật chuẩn gồm chủng B. subtilis, E. coli do Phòng Công nghệ sinh học Enzyme - Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Chủng vi sinh vật S. aureus, C. albicans do Phòng vi sinh vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học khoa học tự nhiên cung cấp Các chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu được cất giữ, cấy chuyển và bảo quản ở 30C trong các môi trường LB và YPG. 2.1.2. Nguyên liệu thực vật Cao chiết flavonoid được tách ra từ lá chè xanh và lá trầu không được thu mua từ các khu vực ở Hà Nội. Nguyên liệu được bảo quản nhiệt độ phòng, trong lọ tránh ánh sáng. Bảo quản ở điều kiện khô ráo, thoáng mát. 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu Xác định khả năng ức chế vi sinh vật: Các chủng vi sinh vật thử nghiệm được hoạt hóa trên môi trường đĩa thạch LB và YPG, ủ ở nhiệt độ 30C trong 5 ngày. Các khuẩn lạc thuần khiết được cấy sang bình tam giác chứa 20 ml môi trường LB và YPG, nuôi lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30C qua đêm. Sau đó 100 µl dịch nuôi cấy của các chủng vi sinh vật sẽ được trải đều sang các đĩa thạch môi trường tương ứng, các đĩa sau đó được đục lỗ và bổ sung lần lượt các mẫu: dịch chiết từ trà xanh, dịch chiết từ trầu không, ethanol, nước cất khử trùng và kháng sinh zeocine (1%) với thể tích 80µl. Mẫu được ủ qua đêm ở 30C, sau đó lấy ra quan sát vòng kháng khuẩn của các mẫu nghiên cứu và mẫu so sánh. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết hoạt chất flavonoid từ lá chè và lá trầu không Sau khi đã tối ưu được quy trình tách chiết lá chè xanh và lá trầu không để sản xuất hợp chất flavonoid từ các nguồn nguyên liệu trên với các thông số kỹ thuật như: dung môi chiết là ethanol và ethylacetate và dung môi n-hexan ở 50ºC trong 3 giờ (đối với lá trầu không), tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 3:1, ở 50C, trong 3 giờ, chúng tôi tiến hành tách chiết để thu hoạt chất flavonoid từ lá chè và lá trầu không. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 187 Hợp chất flavonoid được sắc ký lớp mỏng bằng bản sắc ký silica gel 60 F254 (Merck) với hệ dung môi toluen: ethylacetat: acetone: acid formic có tỷ lệ 5:2:2:1 (Hình 1). A B Hình 1. Sắc ký đồ hợp chất flavonoid được tách ra từ (A) lá trầu không (mẫu ký hiệu T1, T2: trầu không thu được ở hai mẻ khác nhau; (B) lá chè (T1, T2, T3: mẫu thu được ở các mẻ khác nhau). Trên Hình 1 sắc kí đồ dịch chiết lá chè xanh đều cho 9 vết có băng đậm có Rf = 0,28- 0,96. Các vết thu được có màu sắc: màu xanh, màu vàng, màu nâu, màu nâu đậm. Các vết phân tách tốt, hàm lượng các vết tách biệt rõ ràng, riêng biệt, có màu nâu đậm cao, thể hiện băng rõ nét. Kết quả định lượng hợp chất flavonoid cho thấy ở lá chè có chứa tới 10,34% và ở lá trầu không đạt 9,2% các hoạt chất flavonoid (so với nguyên liệu khô ban đầu). Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả [5] khi xác định hàm lượng flavonoid tổng số từ lá chè Tân Cương và Xuân Mai đạt 8,3- 10,4%. 3.2. Khả năng kháng khuẩn của các hợp chất flavonoid Chúng tôi xác định hoạt tính kháng khuẩn dựa vào phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Các chủng vi sinh vật sau khi được hoạt hóa và nuôi cấy qua đêm sẽ được trải trên đĩa thạch môi trường tương ứng, đục lỗ thạch và bổ sung các hoạt chất và đối chứng nghiên cứu, vòng kháng khuẩn của hoạt chất trên giếng thạch sẽ quan sát được sau 1 ngày ủ nuôi cấy. Đối với chủng vi sinh vật B. subtilis, E. coli và Candida albicans Cao flavonoid từ lá chè và lá trầu không được hòa tan trong cồn sau đó được bổ sung với thể tích 80 l tương ứng với lượng cao chiết flavonoid từ lá chè và lá trầu không là 2 mg và 4 mg. Đối với chủng vi sinh vật: B. subtilis, E. coli, C. albicans thì tất cả các cao flavonoid có thể hiện hoạt tính. Riêng chủng Candida albicans, hoạt tính kháng khuẩn của cao flavonoid tách chiết từ lá trầu không mạnh hơn lá chè xanh (hình 2). Hóa học và Kỹ thuật môi trường Đ.T.Huyền, L.M.Trí, N.T.T.Phương, Đ.T.Tuyên, “Đánh giá hoạt tính trầu không.” 188 A B C D Hình 2. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid tách chiết được với với chủng vi sinh vật B. subtilis (A); E. coli (B); C. albicans (C); S. aureus (D) (1: dịch chiết từ lá chè xanh, 2: dịch chiết từ lá trầu không, 3: ethanol, 4: nước cất, 5: kháng sinh zeocine 1%). Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, khi nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết ethanol của lá trầu không đã được đánh giá trên một số vi khuẩn gram (-) và gram (+). Giá trị MIC của các chúng vi khuẩn kiểm nghiệm trong khoảng 25 μg- 40 μg, trong đó giá trị MIC đối với chủng S. aureus xấp xỉ khoảng 40 μg [2]. Khi sàng lọc hoạt tính kháng nấm của một số hoạt chất polyphenol như theaflavin và hỗn hợp theaflavin và epicatechin đối với nấm C. albicans. Kết quả đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của theaflavin, epicatechin đối với chủng nấm C. albicans NCTC 3255 và C. albicans NCTC 3179 có nồng độ MIC tương ứng là 1,024 μg/ml và 128-256 μg/ml. Đối với chủng S. aureus Đối với chủng S. aureus (chủng vi sinh vật gram dương - là chủng được quan tâm đặc biệt bởi nó là nhóm tụ cầu khuẩn nguy hiểm có khả năng gây nên quá trình viêm và sinh mủ ở người thì khả năng ức chế của mẫu chè xanh và lá trầu không thể hiện hoạt tính mạnh (hình 2). Như vậy từ những kết quả bước đầu cho thấy các hoạt chất flavonoid mà chúng tôi nghiên cứu có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là đối với 2 chủng E. coli và S. aureus. Hoạt chất flavonoid được tách chiết từ lá trầu không có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với hoạt chất từ lá trà xanh. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới [1]. đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của dịch chiết chè xanh thu thập từ một số quốc gia và sử dụng các dung môi khác nhau để chiết thu hợp chất flavonoid. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên chủng Staphylococcus aureus đã ức chế với vòng hoạt tính kháng khuẩn đạt 10,00±0,0 mm. Hoạt tính kháng khuẩn cũng thể hiện mạnh khi chiết bằng ethanol, methanol and dimethyl sulphoxide. 4. KẾT LUẬN Hoạt chất flavonoid từ lá chè xanh và lá trầu không có khả năng ức chế các chủng sinh vi vật như C. albicans, B. subtilis, E. coli và S. aureus, đặc biệt là flavonoid từ lá trầu không với vòng kháng khuẩn lớn hơn so với flavonoid từ lá chè xanh đối với 4 dòng vi khuẩn kiểm định này. Từ đó mở ra hướng tạo sản phẩm Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 189 từ sự kết hợp của hai loại nguyên liệu tự nhiên có hàm lượng các hoạt chất flavonoid cao, tạo sản phẩm dung dịch tắm khô phục vụ cho nhu cầu cuộc sống đặc biệt là ở những nơi hẻo lánh, vùng biển hải đảo nơi mà nguồn nước ngọt còn khan hiếm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Bashir S et al. "Assessment of bioautography and spot screening of TLC of green tea (Camellia) plant extracts as antibacterial and antioxidant agents". Indian J Pharm Sci No76(4), 2014, pp 364-370. [2]. Betts JW, Wareham DW, Haswell SJ, Kelly SM (2013) "Antifungal synergy of theaflavin and epicatechin combinations against Candida albicans". J Microbiol Biotechnol No 23(9), 2013, pp 1322-1326. [3]. Datta A, Ghoshdastidar S, Singh M "Antimicrobial property of Piper Betel leaf against clinical isolates of bacteria". International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR) No 2(3), 2011, pp 104-109. [4]. Đỗ Thị Gấm "Nghiên cứu một số đặc điểm hóa học và tác dụng sinh học của các chất thực vật thứ sinh trong cây chè Camellia sinensis". Luận án tốt nghiệp thạc sĩ khoa sinh học 2002, Trường Đại học KHTN. [5]. Hà Thị Thanh Bình, Nguyễn Quốc Khang, Đỗ Thị Gấm " Đánh giá sự biến động thành phần polyphenol trong lá chè Tân cương (Thái nguyên) và hoạt tính chống oxy hóa của chúng". Hội nghị Hóa sinh y dược 2002 trang 37-46. ABSTRACT EVALUATION ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF FLAVONOID COMPOUNDS FROM CAMELLIA SINENSIS AND PIPER BETLE LEAFS In this paper, we extracted the flavonoid compounds and tested antibacterial activity on the strains such as: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans and Staphycoccus aureus. The results showed that the flavonoid compounds, extracted from Camellia sinensis (L.) O. Kuntze and Piper betle L. leafs, had very good antibacterial activity, especially on the C. albicans and S. aureus strains. Thus, from the initial results showed that flavonoid compounds studied have strong antibacterial activity, especially exhibited strongest antibacteral for C. albicans and S. aureus. Antibarterial activity of flavonoids extracted from Piper betle were better than Camellia sinensis leaf. Kewords: Bacillus subtilis, Candida albicans, Escherichia coli, Staphycoccus aureus,antibacterial, Flavonoid. Nhận bài ngày 09 tháng 07 năm 2015 Hoàn thiện ngày 06 tháng 08 năm 2015 Chấp nhận đăng ngày 07 tháng 09 năm 2015 Địa chỉ: 1Viện Hoá học - Vật liệu/ Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự. 2 Viện Công nghệ sinh học/ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Email: doanhuyenhhvl@gamil.com.