Đánh giá hiệu quả sử dụng vi khuẩn đối kháng phòng trừ bệnh thối rễ do nấm phytophthora palmivora và fusarium solani gây ra trên cây có múi ở điều kiện nhà lưới

73 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 JAA, Bergsten J, Porter TM, Vaishampayan AJP, Ovaskainen O, Hallenberg N, Bengtsson-Palme J, Eriksson KM, Larsson HK, Larsson E, Koljalg U., 2012. Five simple guidelines for establishing basic authenticity and reliability of newly generated fungal ITS sequences. Myco Keys, 4: 37-63. Rowland, B,M. and H.W.Taber, 1996. Dulicate Isochorismate Synthase Genes of Bacillus subtilis; Regulation and Involvement in the Biosynthesis of Menaquione and 2,3-dihyhroxybenzoate. Jbacteroil, 178: 854-861. Schoch, C.L., Seifert KA, Huhndorf S, Robert V, Spouge JL, Levesque CA, Chen W., 2012. Fungal Barcoding Consortium; Fungal Barcoding Consortium Author List, Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for fungi. Proc Nat Acad Sci., 109: 6241-6246. Sutton, B.C., 1992. The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum.Pp. 1-26 in Bailey, J. A. & Jeger, M.J. (Eds.) Cottetotrichum-Biology, Pathology and Control. CAB International, Wallingford, England. White, T. J., T. D. Bruns, S. B. Lee, and J. W. Taylor, 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics. In: Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J. (eds) PCR Protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, New York, USA, PP. 315-322. Preliminary results of construction phylogenetic tree of Colletotrichum spp. causing anthracnose diseases on dragon fruit in Southern provinces Dang Thi Kim Uyen, Tran Nhan Dung, Nguyen Van Hoa Abstract Forty four isolates of anthracnose disease on dragon fruit in Southern provinces were investigated to observe their genetic diversity. First, they have been collected, then all were isolated in PDA Merd medium to get spore formation from mycelium (cultures of mycelium). DNA from fungus was extracted using procedure developed by Dung et al. (2011). After that, ITS regions were amplified by PCR method with specific primers ITS1 and ITS4. Finally, the ITS sequences of 44 isolates were analyzed and phylogenetic tree was created to express genetic relationship among studied isolates. The results showed that the causal organism of anthracnose disease on dragon fruit in Southern provinces was 84.09% of isolates belonging to Colletotrichum gloeosporioides species, 13.63% isolates belonging to Colletotrichum capsici and about 2.27% isolates belonging to Colletotrichum truncatum species. Schematic phylogenetic tree also showed that there were 3 groups: The first group included 37 Colletotrichum gloeosporioide strains at high bootstrap (99%); the second group included 6 Colletotrichum capsici strains at bootstrap (98%) and the third group was Colletotrichum truncatum species at bootstrap (98%). Keywords: Colletotrichum spp., dragon fruit, Internal transcribed spacer ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI RỄ DO NẤM Phytophthora palmivora VÀ Fusarium solani GÂY RA TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI Nguyễn Ngọc Anh Thư1, Nguyễn Thành Hiếu1, Nguyễn Văn Hòa1, Trần Thị Thu Thủy2 TÓM TẮT Trong những năm gần đây, bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi đã gây hại trầm trọng cho các vườn cây có múi ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. Nguyên nhân chủ yếu là do nấm Fusarium solani và Phytophthora spp. gây ra. Kết quả đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đối kháng với Phytophthora palmivora và Fusarium solani trong điều kiện nhà lưới cho thấy ở nghiệm thức 2 (chỉ chủng với vi khuẩn BS với mật số108 ) và nghiệm thức 6 (chủng nấm trước và sau đó chủng vi khuẩn BS với mật số108) cho kết quả kiểm soát tốt nhất đối với nấm Phytophthora palmivora và Fusarium solani. Từ khoá: Cây có múi, Fusarium solani, Phytophthora palmivora, Bacillus subtilis Ngày nhận bài: 10/12/2017 Ngày phản biện: 23/12/2017 Người phản biện: TS. Hà Minh Thanh Ngày duyệt đăng: 19/1/2018 1 Viện cây ăn quả miền Nam; 2 Đại học Cần Thơ 74 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây có múi là một trong những loại cây ăn trái có sản lượng và giá trị kinh tế cao trên thị trường thế giới và trong nước. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các vườn cây có múi ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long bị dịch vàng lá thối rễ gây hại nghiêm trọng. Năm 2000 có khoảng trên 1.300 ha quýt Tiều tại Lai Vung - Đồng Tháp bị chết do bệnh thối rễ gây ra. Trong các năm 2001 đến 2004, vùng trồng Cam Mật tại hai huyện Trà Ôn và Tam Bình - tỉnh Vĩnh Long cũng đang bị bệnh thối rễ và chết dần. Theo đánh giá của cán bộ địa phương, số cây bị chết có thể lên đến 40% diện tích cam của hai huyện. Tại thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang, bệnh thối rễ cũng gây hại khá nghiêm trọng ở các vườn trồng cam và quýt Đường (Phạm Văn Kim, 2004). Nguyên nhân chủ yếu là do nấm Phytophthora spp. và Fusarium solani và gây ra (Nguyễn Ngọc Anh Thư và ctv., 2012). Để hạn chế bệnh một trong những biện pháp hữu hiệu nhất là sử dụng gốc ghép kháng bệnh nhưng hiện nay cũng chưa có giống kháng bệnh này mà chủ yếu là sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh này tỏ ra kém hiệu quả và làm ô nhiễm môi trường đất và nước, ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người sản xuất và người tiêu dùng. Trong khi đó, trong tự nhiên có rất nhiều vi sinh vật có lợi như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn và virus có khả năng ức chế những vi sinh vật gây bệnh bằng các cơ chế như tiết ra kháng sinh, cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi ở. Chúng có khả năng ức chế sự phát triển của các nhóm vi sinh vật gây bệnh góp phần tạo cân bằng sinh thái trong tự nhiên (Mukerji and Grag, 1993). Đặc biệt, nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus còn có khả năng kích kháng hay đối kháng giúp giảm bệnh do nhiều tác nhân trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Kloepper et al., 2004). Ngoài ra, các loài vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas sống ở vùng rễ bao gồm P. fluorescens, P. putida, P. cepacia và P. aureofacien cũng có tác dụng phòng trị hầu hết các tác nhân gây bệnh trong đất như nấm Pythium, Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia và Gaeumannomyces (Agrios, 2005). Vì vậy nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học phòng trị bệnh thối rễ trên các loại cây có múi là điều rất cần thiết. Cho nên đề tài “Nghiên cứu và sử dụng vi khuẩn đối kháng trong phòng trừ bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani và Phytophthora palmivora gây ra trên cây có múi ở điều kiện nhà lưới” được thực hiện. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Nguồn vi sinh vật sử dụng: Gồm 2 dòng nấm gây hại Phytophthora palmivora, Fusarium solani và vi khuẩn BS (Bacillus subtilis), được Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Cây ăn quả miền Nam lưu giữ. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá hiệu quả của chủng vi khuẩn BS (Bacillus subtilis) trong kiểm soát bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmivora trên chanh Volka ở điều kiện nhà lưới - Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 6 nghiệm thức, 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 chậu, mỗi chậu 3 cây chanh Volka 6 tháng tuổi. Các nghiệm thức tham gia thí nghiệm: - Chỉ tiêu theo dõi: + Đo chỉ số diệp lục tố trước khi chủng bệnh và 4 tháng sau khi chủng bệnh. + Tỷ lệ nhiễm bệnh và chỉ số bệnh ở 4 tháng sau chủng bệnh, sau đó đặt trong nhà lưới bóng râm. + Công thức tính tỷ lệ bệnh (TLB) theo Viện Bảo vệ thực vật (1999). + Công thức tính tỷ lệ rễ thối (TLRT): Nghiệm thức Nguồn lây nhiễm Mật độ bào tử/ml 1 Nước sạch 2 Bacillus subtilis 108CFU/ml 3 Phytophthora palmivora 106 bào tử/ml 4 Phytophthora palmivora + Bacillus subtilis 106 bào tử/ml + 106CFU/ml 5 Phytophthora palmivora + Bacillus subtilis 106 bào tử/ml + 107CFU/ml 6 Phytophthora palmivora + Bacillus subtilis 106 bào tử/ml + 108CFU/ml 75 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 TLRT (%) = (Phần trăm diện tích rễ bị thối ˟ 100 / diện tích toàn bộ rễ). + Đếm số lá trên cây, đo chiều cao cây, chiều dài rễ ở 4 tháng sau khi chủng bệnh. 2.2.2. Đánh giá hiệu quả của chủng vi khuẩn BS (Bacillus subtilis) trong kiểm soát bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani trên chanh Volka ở điều kiện nhà lưới Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 6 nghiệm thức 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 chậu, mỗi chậu 3 cây chanh volka 6 tháng tuổi (các nghiệm thức sử dụng và phương pháp lấy chỉ tiêu tương tự như thí nghiệm 2.2.1). 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phân tích thống kê theo phần mềm MSTATC 1.41. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 8/2013 tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Cây ăn quả miền Nam. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá hiệu quả của chủng vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) trong kiểm soát bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmivora gây ra trên chanh volka trong điều kiện nhà lưới Kết quả bảng 1 cho thấy trước khi chủng bệnh chỉ số diệp lục tố ở các nghiệm thức thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa. Nhưng đến 4 tháng sau chủng với nấm Phytophthora palmivora và vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) có sự khác biệt rất có ý nghĩa giữa các nghiệm thức; trong đó: Ở nghiệm thức 3 chỉ chủng nấm Phytophthora palmivora, không có chủng thêm vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) cây biểu hiện triệu chứng vàng lá (Hình 1) và thể hiện qua chỉ số diệp lục tố trên lá thấp nhất chỉ có 21,70 và tỷ lệ lá vàng, tỷ lệ rễ thối cao nhất khác biệt rất có ý nghĩa so với tất cả các nghiệm thức còn lại, còn trọng lượng thân khác biệt so với nghiệm thức 1, 2, 5 và 6. Riêng trọng lượng rễ chỉ khác biệt so với nghiệm thức 1 và 2. Đặc biệt với chỉ tiêu chiều dài rễ và chiều cao cây là không có khác biệt giữa các nghiệm thức. Bảng 1. Đánh giá hiệu quả đối kháng của vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) đối với nấm Phytophthora palmivora (Phy-Quyt) Ghi chú: NTC: ngày trước chủng; TSC: tháng sau chủng; Trong cùng một cột các số có các chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 1% qua trắc nghiệm LSD. Mức ý nghĩa **: sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở mức 1%; ns: khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nghiệm thức Chỉ số diệp lục tố Tỷ lệ lá vàng (%) 4 TSC Trọng lượng rễ (g) 4 TSC Trọng lượng thân (g) 4 TSC Tỷ lệ rễ thối (%) 4 TSC Chiều cao cây 4 TSC Chiều dài rễ 4 TSC1 NTC 4 TSC ĐC 66,83 52,01ab 19,38 bc 57,50a 108,00a 14,58 cd 80,33 17.50 BS 108 66,03 58,22a 11,28 c 68,50a 106,00a 10,17 d 80,42 18.17 Phy 67,56 21,70 e 69,56a 36,50 b 88,50 c 79,67a 73,33 15.25 Phy + BS 106 67,57 34,87 d 35,76 b 49,00ab 90,00bc 36,00 b 75,17 16.83 Phy + BS107 66,03 44,37 c 29,46 b 55,00ab 104,00ab 32,08 bc 76,75 19.75 Phy + BS 108 67,56 49,13 bc 18,24 bc 56,50ab 107,50a 15,08 bcd 79,42 18.13 Mức ý nghĩa (F) ns ** ** ** ** ** ns Ns CV (%) 2,74 8,56 18,17 18,56 7,43 22,29 11,12 13,91 Tương tự ở nghiệm thức 4, 5, 6 cũng chủng nấm Phytophthora palmivora nhưng có chủng thêm vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) ở mật số 106, 107 và 108 thì chỉ số diệp lục tố; trọng lượng rễ và trọng lượng thân tăng lên, còn tỷ lệ lá vàng và tỷ lệ rễ thối giảm rõ và và biểu hiện rõ nhất là ở nghiệm thức chủng với mật số 107 và 108 có chỉ số diệp lục tố, tỷ lệ lá vàng và tỷ lệ rễ thối không khác biệt so với nghiệm thức không có chủng nấm Phytophthora palmivora ở nghiệm thức 1 và 2. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy khi chủng thêm vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) với mật số 107 và 108 có khả năng ức chế tốt sự phát triển của Phytophthora palmivora biểu hiện làm gia tăng chỉ số diệp lục tố, 76 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 trọng lượng rễ và trọng lượng thân, đồng thời giảm tỷ lệ lá vàng và tỷ lệ rễ thối. Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá ở điều kiện in vitro và cũng phù hợp với ghi nhận của Phạm Văn Kim (2000). 3.2. Đánh giá hiệu quả của chủng vi khuẩn Bacilllus subtilis trong kiểm soát bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra trên chanh Volka trong điều kiện nhà lưới Kết quả bảng 2 cho thấy trước khi chủng bệnh chỉ số diệp lục tố ở các nghiệm thức thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa. Nhưng đến 4 tháng sau chủng với nấm Fusarium solani và vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa giữa các nghiệm thức; trong đó: - Ở nghiệm thức 3 chỉ chủng nấm Fusarium solani không có chủng thêm vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) cây biểu hiện triệu chứng vàng lá (Hình 1) và thể hiện qua chỉ số diệp lục tố trên lá thấp nhất chỉ có 23,88; tỷ lệ lá vàng cao nhất khác biệt rất có ý nghĩa so với tất cả các nghiệm thức còn lại; nhưng tỷ lệ rễ thối, trọng lượng rễ và trọng lượng thân chỉ khác biệt so với nghiệm thức 1 và 2. Tương tự ở chỉ tiêu chiều dài rễ chỉ khác biệt so nghiệm thức 2, riêng chỉ có chỉ tiêu chiều cao cây là không có khác biệt giữa các nghiệm thức. - Tương tự ở nghiệm thức 4, 5, 6 cũng được chủng nấm Fusarium solani nhưng có chủng thêm vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) ở mật số 106, 107 và 108 thì chỉ số diệp lục tố, trọng lượng rễ và trọng lượng thân tăng lên, còn tỷ lệ lá vàng và tỷ lệ rễ thối giảm rõ, biểu hiện rõ nhất là ở nghiệm thức chủng với mật số 107 và 108 có chỉ số diệp lục tố, tỷ lệ lá vàng và tỷ lệ rễ thối không khác biệt so với nghiệm thức không có chủng nấm Fusarium solani ở nghiệm thức 1 và 2 nhưng khác biệt rất có nghĩa so với nghiệm thức 3 chỉ chủng với nấm Fusarium solani . Bảng 2. Đánh giá hiệu quả đối kháng của vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) đối với nấm Fusarium solani (Fu- Muong) Ghi chú: Trong cùng một cột các số có các chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 1% qua trắc nghiệm LSD. Mức ý nghĩa **: sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. Nghiệm thức Chỉ số diệp lục tố Tỷ lệ lá vàng (%) (4TSC) Trọng lượng rễ (g) (4TSC) Trọng lượng thân (g)(4TSC) Tỷ lệ rễ thối (%) (4TSC) Chiều cao cây (mm) (4TSC) Chiều dài rễ (mm) (4TSC)(1NTC) (4TSC) ĐC 64,52 45,05ab 22,64 c 57,00a 96,50ab 25,42 b 73,42 12,91 b BS 108 64,52 51,77a 19,27 c 61,50a 102,50a 21,25 b 77,75 17,66a Fu 63,78 23,88 c 61,64a 40,00 b 84,50 c 54,17a 71,92 12,25 b Fu + BS 106 64,93 38,28 b 38,54 b 41,05 b 90,00 bc 42,50ab 73,42 13,25 b Fu + BS 107 65,33 41,55ab 26,30 bc 48,50ab 94,50abc 31,50ab 74,75 13,66 b Fu + BS 108 65,82 43,48ab 22,84 c 57,50a 98,00ab 31,25ab 75,92 13,41 b Mức ý nghĩa ns ** ** ** * ** ns ** CV (%) 2,63 14,40 12,78 13,01 7,15 12,53 8,63 12,53 Từ kết quả thí nghiệm cho thấy khi chủng thêm vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) với mật số 107 và 108 có khả năng ức chế tốt sự phát triển của Fusarium solani biểu hiện làm gia tăng chỉ số diệp lục tố, trong lượng rễ và trọng lượng thân. Đồng thời giảm tỷ lệ lá vàng và tỷ lệ rễ thối. Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá ở điều kiện in vitro và cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ebtsam và cộng tác viên (2009); Saman (2007), Trần Thị Hoàng Linh và cộng tác viên (2010). IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Khảo sát khả năng quản lý bệnh thối rễ do của dòng vi khuẩn BS đối với nấm Phytophthora palmivora và Fusarium solani cho thấy dòng vi khuẩn BS 108 khả năng quản lý tốt bệnh thối rễ. 4.2. Đề nghị Đánh giá hiệu quả của dòng vi khuẩn ở điều kiện ngoài đồng để có thể đưa vào ứng dụng thực tế. 77 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 Hình 1. Tỷ lệ lá vàng trên cây chanh Volka ở 4 TSC vi khuẩn BS (Bacilllus subtilis) và với nấm Phytophthora palmivora và nấm Fusarium solani (A: đối chứng không chủng; B: chủng vi khuẩn BS mật số 108cfu/ml; C: (trái) chủng P. Palmivora, C (phải) chủng nấm F. solani mật số 106bào tử/ml; D: (trái) chủng P. Palmivora, D (phải)chủng nấm F. solani mật số 106bào tử/ml + vi khuẩn BS mật số 106 cfu /ml; E: (trái) chủng P. Palmivora, E (phải)chủng nấm F. solani mật số 106bào tử/ml + vi khuẩn BS mật số 107 cfu /ml; F: (trái) chủng P. Palmivora, F (phải) chủng nấm F. solani mật số 106bào tử/ml + chủng vi khuẩn BS mật số 108 cfu /ml) TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Văn Kim, 2000. Các nguyên lý về bệnh hại cây trồng. Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ, trang 45-66. Phạm Văn Kim, 2004. Nguyên nhân của dịch bệnh thối rễ cây ăn trái ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Hội thảo bệnh hại cây trồng có nguồn gốc từ đất. Tháng 10/2004. Trường Đại học Cần Thơ, Hội Sinh học phân tử bệnh lý thực vật Việt Nam, trang 19. Trần Thị Hoàng Linh, Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa, 2010. Nghiên cứu đánh giá khả năng đối kháng của một số dòng vi sinh vật có ích đối với tác nhân gây bệnh thối rễ vú sữa trong điều kiện in vitro. Báo cáo khoa học, Viện Cây ăn quả miền Nam, năm 2010. Nguyễn Ngọc Anh Thư, Đỗ Ái My, Nguyễn Thành Hiếu và Nguyễn Văn Hòa, 2012. Khảo sát tác nhân gây bệnh thối rễ trên cây có múi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Hội thảo Quốc gia, Bệnh hại thực vật Việt Nam, lần 11, trang 240 - 245. Agrios G. N., 2005. Plant Pathology. Academic Press, USA, 922p. Ebtsam M. M, Abdel-Kawi K.A. and Khalil, M. N.A., 2009. Efficiency of Trichoderma viride and Bacillus subtilis as Biocontrol Agents against Fusarium solani on Tomato Plants. Egypt. J. Phytopathol, 37 (1): 47-57. Kloepper J.W., Ryu, C.M. and Zhang S., 2004. Induced systermic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp.. Phytopathology, 94: 1259 - 1266. Saman, A., 2007. Biological control of Fusarium solani f.sp. phaseoli the causal agent of root rot of bean using Bacillus subtilis CA32 and Trichoderma harzianum RU01. Ruhuna Journal of Science, 2: 82 - 88.