Đánh giá giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của các phương pháp định tính, định lượng biến đổi gen

37 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 Sequencing, evaluating the similarity between the transformed sequences and the designed expression sequence of ZmDREB2A in maize Doan Thi Bich Thao, Nguyen Xuan Thang, Le Cong Luc, Nguyen Thi Thu Hoai, Ta Thi Thuy Dung, Le Cong Tung, Bui Manh Cuong, Nong Van Hai Abstract ZmDREB2A is a transcription factor belonging to AP2/ERF transcription factor family isolated from maize. Previous studies pointed out that ZmDREB2A have ability to activate many genes related to the abiotic stress signaling pathway. In this study, the expression structure Ubi :: ZmDREB2A-S :: 35S in two lines of maize (K3 and K7) and the accuracy were identified. To achieve that goal, PCR and DNA sequencing of the Ubiquitin promoter, ZmDREB2A sequence and 35S terminator was used. Results showed that the similarity between the transformed sequences and the expression sequence in the vector was higher than 98%. It indicated that the expression of the transformation structure in transformed maize can occur normally. Keywords: Maize, gene ZmDREB2A, Agrobacterium tumefaciens, drought tolerance Ngày nhận bài: 30/8/2017 Ngày phản biện: 9/9/2017 Người phản biện: TS. Huỳnh Thị Huệ Ngày duyệt đăng: 11/10/2017 1 Viện Di truyền Nông nghiệp ĐÁNH GIÁ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN, GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG BIẾN ĐỔI GEN Lưu Minh Cúc1 TÓM TẮT Nghiên cứu đã khảo sát các nền mẫu hạt, thức ăn chăn nuôi và thực phẩm có chứa ngô và đậu tương với hai phương pháp định tính, định lượng biến đổi gen trên ngô (NK603) và đậu tương (GTS40-3-2) với các nồng độ 1%; 0,1%; 0,04%; 0,02%; 0,01% bằng Real time PCR. Qua đó, đã chứng minh được với dãy nồng độ đã sử dụng, giới phát hiện và giới hạn định lượng đối với các nền mẫu chứa đậu tương và ngô đã được xác định: Giới hạn phát hiện: LODđậu tương: 0,04%; LODngô: 0,04%; Giới hạn định lượng: LOQđậu tương: 0,1%; LOQngô: 0,1%. Cách xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) là phương pháp chuẩn có thể áp dụng ở tất cả các phòng thí nghiệm về phân tích GMO. Từ khóa: Sinh vật biến đổi gen (GMO), đậu tương, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, ngô I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, đã có 495 sự kiện chuyển gen được phê chuẩn, tập trung chủ yếu vào một số cây trồng chính như ngô (231 sự kiện); bông (59 sự kiện); khoai tây (47 sự kiện); cải dầu (40 sự kiện); đậu tương (36 sự kiện) và các cây trồng khác. Các nước sử dụng sản phẩm biến đổi gen làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi cũng tăng lên đến 40 nước, trong đó có cả Cộng đồng Châu Âu (EU), tính là một nước (ISAAA, 2017). Việt Nam đã cấp phép 21 sự kiện ngô, đậu tương biến đổi gen sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Đây là một bước tiến quan trọng trong khâu quản lý để đảm bảo an ninh lương thực trong nước và quyền lợi người tiêu dùng khi các thông tin về sản phẩm trở nên minh bạch, công khai hơn. Các quyết định của cơ quan quản lý về việc có cấp phép hay không đối với một số hoạt động liên quan đến sinh vật biến đổi gen được dựa trên quy trình phân tích nguy cơ nghiêm ngặt, trong đó tập trung vào các bằng chứng khoa học và tư vấn sâu rộng của các chuyên gia (Phạm Văn Toản và Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2015). Các bằng chứng khoa học trên thế giới đã chứng minh về tính an toàn của các sản phẩm được tạo ra từ các loại cây trồng biến đổi gen (ISAAA, 2016). Thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật và sản phẩm biến đổi gen trải qua nhiều thử nghiệm hơn bất cứ thực phẩm nào trong lịch sử. Đối với Việt Nam, việc phát hiện biến đổi gen trong các sản phẩm thực phẩm và thực hiện dán nhãn không liên quan đến an toàn thực phẩm mà 38 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 chính là để đảm bảo quyền lựa chọn của người tiêu dùng. Trong quá trình xây dựng phương pháp định tính, định lượng biến đổi gen (Genetically Modified Organisms - GMO) trong các sản phẩm nông sản, thực phẩm, việc xác định giới hạn phát hiện (Limit of detection - LOD), giới hạn định lượng (Limit of quantification - LOQ) là bước quan trọng nhất để khẳng định năng lực của phòng thử nghiệm. Chính vì thế, nghiên cứu này được tiến hành nhằm tìm ra LOD, LOQ của phương pháp định tính, định lượng biến đổi gen có nguồn gốc từ ngô và đậu tương. Qua đó khẳng định độ tin cậy, chính xác về mặt kỹ thuật của các phòng thí nghiệm hoạt động theo tiêu chuẩn quốc tế ISO/IEC 17025 theo tiêu chí toàn cầu hóa “Một tiêu chuẩn - một lần thử nghiệm - được chấp nhận ở mọi nơi”. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Vật liệu tham chiếu chuẩn chứng nhận (Certified Reference Materials - CRM): BF410 (Đậu tương GTS 4032 - 5%), BF415 (Ngô NK603 -5%). - Các nền mẫu: Bột: Hạt ngô (giống ĐL20), hạt đậu tương (giống DT84); Thức ăn chăn nuôi: trộn (thành phần từ ngô ĐL20 và đậu tương DT84); Thực phẩm dạng lỏng: sữa đậu nành (làm từ đậu tương DT84 của công ty Green life); Thực phẩm chế biến: snack vị caramen. - Các hóa chất tách chiết ADN, Real Time PCR và các vật tư, hóa chất khác. - Các mồi và mẫu dò sử dụng cho PCR được nêu trong bảng 1. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp xử lý mẫu hạt ngô, đậu tương nghiền thành bột mịn; mẫu sữa đậu nành ly tâm, lấy phần lắng xuống làm mẫu phân tích; mẫu snack vị caramen được rửa nhẹ dưới vòi nước chảy, sấy khô ở 700 C trong 2 giờ, nghiền thành dạng bột mịn; mẫu thức ăn chăn nuôi được nghiền thành dạng bột mịn. Tách DNA bằng bộ kit Wizard Promega: theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Wizard® ADN Clean- Up System). - Phương pháp Real time PCR (Polymerase chain reaction - PCR): Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang màu FAM (mẫu dò) đặc hiệu cho đoạn gene được nhân bản, sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Mẫu dò đặc hiệu cho vùng gene mục tiêu cùng với phân tử phát huỳnh quang (reporter) và phân tử thu hút huỳnh quang (quencher) được gắn cộng hóa trị ở 2 đầu. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gene mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra. Để định lượng được số% GMO trong mẫu phân tích, cần phải có gen tham chiếu chuẩn theo loài, từ đó thông qua Real time PCR mới xác định được số% GMO bằng cách so sánh tỉ lệ giữa Bảng 1. Trình tự các mồi và mẫu dò sử dụng Tên gen/sự kiện Trình tự nucleotide theo chiều 5’ - 3’ Đậu tương GTS4032 Mồi xuôi: TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT Mồi ngược: GGCATTTGTAGGAGCCACCTT Mẫu dò: FAM-CCTTTTCCATTTGGG-MGBNFQ Ngô NK603 Mồi xuôi: ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA Mồi ngược: AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT Mẫu dò: FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-TAMRA Gen định loài đậu tương: Lectin Mồi xuôi: CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC Mồi ngược: GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC Mẫu dò: FAM -CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-TAMRA Gen định loài ngô: Adh Mồi xuôi: CCTTCTTGGCGGCTTATCTG Mồi ngược: CCAGCCTCATGGCCAAAG Mẫu dò: FAM -CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT- TAMRA 39 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 gen chuyển GMO và gen tham chiếu theo loài thông qua Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold - Ct): là số chu kỳ PCR mà ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền. Đây là nguyên lý cơ bản của real-time PCR và là yếu tố quyết định tính chính xác và lặp lại của kết quả. Số trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ, nghĩa là giá trị Ct càng thấp. Chương trình Realtime PCR như sau: Khử nhiễm 120 giây ở 500C; Quá trình lặp lại 45 chu kỳ bắt đầu từ biến tính 600 giây ở 950C; bắt cặp và kéo dài 60 giây ở 600C đồng thời ghi nhận tín hiệu Realtime (Method Verification, 2011). - Phương pháp thêm chuẩn: sử dụng hệ số pha loãng cho 2 dung dịch DNA, được tính toán theo công thức sau: X = (A/B) ˟ (Y – 1) + 1 Trong đó: X là hệ số pha loãng thực tế (lượng chất chuẩn biến đổi gen được pha loãng để bù đắp sự khác biệt về nồng độ); A: Nồng độ DNA của mẫu chứng dương (ng/ μl); B: Nồng độ DNA của mẫu âm tính (ng/ μl); Y: Hệ số pha loãng lý thuyết. - Cách tính LOD: Thực hiện phản ứng lặp lại ít nhất 10 lần ở nồng độ thấp của DNA mục tiêu là 1, 0,1; 0,04; 0,02; 0,01, 0%. LOD tương đối (%) là nồng độ thấp nhất của dãy pha loãng mà các lần lặp đều cho kết quả dương tính. - Cách tính LOQ: Thực hiện phản ứng lặp lại ít nhất 10 lần ở nồng độ thấp của DNA mục tiêu là 1, 0,1; 0,04; 0,02; 0,01, 0% đối với gen đích và gen tham chiếu. LOQ là nồng độ thấp nhất của dãy pha loãng mà tại đó độ lệch chuẩn tương đối tái lặp nội bộ lại (RSDR) của giá trị đo được < 25% giá trị chuẩn thêm vào (Trapman et al., 2009). RSDR được tính theo công thức sau: Trung bình 2 kết quả phân tích độc lập Khác biệt tuyệt đối giữa 2 kết quả phân tích độc lập di Khác biệt tương đối rad i (%) Độ lệch chuẩn tái lặp nội bộ SR (%) Độ lệch chuẩn tương đối của các tái lặp nội bộ RSDR (%) ci = ci,1 + ci,2 2 di = |ci,1 - ci,2| radi = di ci SR = = d d2 d 1.13 RSDR = rad 1.13 - Tiêu chí đánh giá: Đối với sản phẩm biến đổi gen, ngưỡng dán nhãn của Việt Nam là 5% (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Khoa học và Công nghệ, 2015). Giá trị LOD của phương pháp nên thấp hơn 20 lần nồng độ mục tiêu, liên quan đến ngưỡng kiểm soát theo luật định, thì LOD nên < 0,25% để đảm bảo độ chính xác của phương pháp (Guidance document from European Network of GMO laboratories -ENGL, 2011). Giá trị LOQ nên bằng hoặc thấp hơn giá trị tính toán trong so sánh liên phòng của thế giới (JRC Compendium of Reference Method for GMO Analysis, 2011). 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2017 tại Phòng Giám định Sinh vật và Sản phẩm Biến đổi gen -Viện Di truyền Nông nghiệp. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nghiên cứu này, để đánh giá được ảnh hưởng của nền mẫu đến giá trị LOD, LOQ của phương pháp định tính, định lượng GMO, hiệu quả của Real time PCR được xác định là thước đo đầu tiên. Các loại nền mẫu phân tích gồm: hai nền mẫu chưa qua xử lý là hạt ngô, hạt đậu tương; bốn nền mẫu đã qua xử lý là thức ăn chăn nuôi (chứa cả ngô và đậu tương), sữa đậu nành và snack (chứa ngô). Tiến hành tách chiết tinh sạch ADN với cùng một phương pháp sử dụng bộ kit Wizard của Promega. Các mẫu ADN tinh sạch đều đạt nồng độ từ 50-286 ng/µl và tỉ lệ OD260/280 trong khoảng từ 1,8 - 2,0, chứng tỏ các mẫu DNA đủ độ tinh sạch và không bị nhiễm tạp. Bảng 1. Kết quả đo nồng độ ADN (độ tinh sạch) tách chiết trên máy NanoDrop Tên mẫu/ Lần lặp Hạt ngô ĐL20 Hạt đậu tương DT84 Thức ăn chăn nuôi Sữa đậu nành DT84 Snack vị caramen (ngô) H2O ĐC (-) Lá ĐC (+)1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Nồng độ (ng/µl) 147 138 286 208 140 120 135 150 50 57 0,1 170 OD260/280 1,84 1,95 1,8 1,91 1,98 1,96 2,01 2,02 1,82 1,89 - 0,05 1,92 40 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 Tiến hành pha loãng tất cả các mẫu đưa về cùng một nồng độ là 40 ng/µl. Lượng ADN dùng cho mỗi phản ứng là 200 ng. Phân tích các mẫu trong thí nghiệm với phương pháp định tính sự kiện ngô biến đổi gen NK603 và đậu tương GTS40-3-2. Các mẫu phân tích đều được xác định là âm tính (undetermined) với hai sự kiện NK603, GTS40-3-2. Mẫu DNA của chuẩn BF410 (đậu tương GTS 4032 - 5%), BF415 (ngô NK603 -5%) được pha loãng về nồng độ 40ng/µl. Thêm chuẩn để đạt nồng độ nghiên cứu là 1; 0,1; 0,04; 0,02; 0,01% theo công thức đã nêu ở phần phương pháp, pha loãng theo dãy nồng độ cho thí nghiệm tiếp theo. Số phản ứng tiến hành trong thí nghiệm được tính toán bằng ma trận 4 chiều: hai loại thực vật (ngô/đậu tương) ˟ bốn nền mẫu (mẫu chuẩn, bột hạt, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi) ˟ năm nồng độ nghiên cứu (1, 0,1; 0,04; 0,02; 0,01%) ˟ 10 lần lặp lại = 400 phản ứng. Toàn bộ khối thí nghiệm được lặp lại 2 lần bởi 2 người khác nhau thực hiện. Mỗi lần tiến hành phản ứng sẽ khảo sát tại 1 nồng độ nghiên cứu. Kết quả khảo sát các để xác định giá trị LOD, LOQ cho thấy, ở nồng độ thấp nhất của dãy pha loãng (0,01%), tất cả các phản ứng đều không phát hiện được sản phẩm GMO. Khảo sát ở nồng độ 0,02%: kết quả cho 9 x 8 lần phát hiện được sản phẩm GMO ở cả 8 mẫu phân tích, giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) trung bình ở mức từ 38,06 đến 39,63 đối với nền mẫu có đậu tương và 38,07 đến 39,92 đối với nền mẫu có ngô. Kết quả mỗi nền mẫu trong 10 lần lặp lại có 1 lần không phát hiện được tại nồng độ 0,02%. Chính vì thế, nồng độ 0,02% không được chọn làm giới hạn phát hiện của phương pháp. Ở các nồng độ từ 0,04; 1%, kết quả Realtime PCR đối với mỗi nồng độ thể hiện ở các bảng 2, 3. Bảng 2. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện bằng Realtime PCR ở nồng độ 0,04% Nền mẫu có Đậu tương Nền mẫu có Ngô Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) trung bình của 10 lần lặp lại Kết quả định tính Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) trung bình của 10 lần lặp lại Kết quả định tính Chuẩn 36,24 Phát hiện Chuẩn 36,43 Phát hiện Bột hạt 35,97 Phát hiện Bột hạt 36,23 Phát hiện Thức ăn chăn nuôi 37,08 Phát hiện Thức ăn chăn nuôi 37,10 Phát hiện Thực phẩm dạng lỏng (sữa đậu) 35,76 Phát hiện Thực phẩm chế biến (snack) 35,96 Phát hiện Bảng 3. Kết quả xác định giới hạn định lượng ở nồng độ 0,1% Số nền mẫu Lần 1 ci,1 Lần 2 ci,2 Trung bình 2 kết quả phân tích độc lập ci Khác biệt tuyệt đối giữa 2 kết quả phân tích độc lập di Khác biệt tương đối radi (%) Độ lệch chuẩn tái lặp nội bộ SR (%) Độ lệch chuẩn tương đối của các tái lặp nội bộ RSDR (%) Nền mẫu có chứa đậu tương 1 0,12 0,11 0,115 0,01 8,696 0,008 6,84 2 0,13 0,11 0,12 0,02 16,667 3 0,085 0,087 0,086 0,002 2,326 4 0,092 0,095 0,0935 0,003 3,209 Nền mẫu có chứa ngô 1 0,111 0,134 0,1225 0,023 18,776 0,009 8,19 2 0,121 0,13 0,1255 0,009 7,171 3 0,092 0,098 0,095 0,006 6,316 4 0,086 0,082 0,084 0,004 4,762 41 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 Bảng 4. Hiệu quả Realtime PCR của các nền mẫu ngô và đậu tương Ở nồng độ 0,04%, kết quả 10 lần lặp lại đều phát hiện được sản phẩm GMO ở các nền mẫu phân tích, với giá trị chu kỳ ngưỡng Ct trung bình từ 35,76 đến 37,08 ở các nền mẫu có đậu tương và từ 35,96 đến 37,10 ở các nền mẫu có chứa ngô. Tại điểm nồng độ này, giá trị dương tính giả, âm tính giả đều bằng 0. Chính vì thế, điểm nồng độ GMO 0,04% được xác định là ngưỡng giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích với nền mẫu đậu tương và ngô. Ở nồng độ 0,1%, với mỗi loại nền mẫu, các giá trị định lượng có độ dao động nhất định giữa giá trị trung bình của 10 lần phân tích trên một nền mẫu của 2 lần phân tích độc lập. Số liệu được đưa vào tính toán thể hiện ở bảng 3 cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối của các tái lặp nội bộ RSDR (%) đối với nền mẫu có chứa đậu tương là 6,84% giá trị của mẫu chuẩn; đối với nền mẫu có chứa ngô là 8,19% giá trị của mẫu chuẩn. Kết quả này đạt độ tin cậy 99% (khi k = 1; t = 1,13) khi phân tích các nền mẫu nghiên cứu với mỗi nền mẫu lặp lại 10 lần. Các giá trị độ lệch chuẩn tương đối của các tái lặp nội bộ RSDR đều đạt trong giới hạn cho phép của phương pháp về độ lệch chuẩn của các giá trị đo phải < 25% giá trị chuẩn. Chính vì thế, điểm nồng độ GMO 0,1% được xác định là ngưỡng giới hạn định lượng của phương pháp phân tích với nền mẫu chứa đậu tương và ngô. Hiệu suất PCR được tính toán từ đường hồi quy của giá trị Ct nhận được từ chuỗi pha loãng của ADN theo nồng độ đã nêu. Đường chuẩn của từng loại nền mẫu được xây dựng dựa trên 5 điểm thêm chuẩn pha loãng lần lượt ở các nồng độ 5%; 1%; 0,1%; 0,04%; 0,02%. Loài Nền mẫu Gen định loài Gen được chuyển (GMO) Hệ số góc của đường chuẩn Hiệu suất PCR (%) Hệ số tương quan (R2) Hệ số góc của đường chuẩn Hiệu suất PCR (%) Hệ số tương quan (R2) Đậu tương CRM -3,51 98,61 0,998 -3,44 95,30 0,998 Hạt -3,31 100,15 0,998 -3,24 103,41 0,993 TĂCN -3,58 90,27 0,968 -3,60 90,43 0,994 Sữa đậu -3,33 97,29 ,0998 -3,57 99,95 0,967 CV (%) 3,45 0,83 6,56 0,85 Ngô CRM -3,28 101,45 0,998 -3,36 98,25 0,996 Hạt -3,36 98,62 0,996 -3,34 99,28 0,998 TĂCN -3,59 89,67 0,968 -3,59 89,68 0,968 Snack -3,57 90,43 0,997 -3,56 90,69 0,998 CV (%) 6,53 0,84 5,15 0,83 Kết quả bảng 4 cho thấy hiệu suất PCR đối với các nền mẫu khác nhau có sự khác nhau có ý nghĩa ở mức tin cậy 95% (k = 2). Các nền mẫu chuẩn, mẫu hạt của cả ngô và đậu tương cho hiệu suất cao từ 98,62 đến 101,45%. Với nền mẫu thức ăn chăn nuôi (TĂCN), hiệu suất PCR chỉ đạt từ 89,67 đến 90,27% trên các mẫu có cả thành phần là ngô, đậu tương và các thành phần khác. Như vậy, nền mẫu phức tạp cũng ảnh hưởng đến hiệu suất nhân bản của PCR. Đối với nền mẫu đã qua chế biến như sữa đậu hoặc snack, hiệu suất PCR đạt 90,43 đến 97,29%, chứng tỏ quá trình xử lý chế biến mẫu đã có ảnh hưởng ít nhiều đến hiệu suất PCR. So sánh giá trị hệ số góc của các nền mẫu trên các phương pháp khác nhau cho thấy, tuy hiệu suất PCR có sự dao động, nhưng hệ số góc đều trong giới hạn chấp nhận mà phương pháp yêu cầu từ -3,1 đến -3,6 (JRC Compendium of Reference Method for GMO Analysis, 2011). Mối liên quan giữa hệ số góc với hiệu suất PCR đã thể hiện hệ số tương quan chặt từ 0,83 đến 0,85. Việc định lượng GMO dựa trên đường chuẩn, vì thế sự tương đồng giữa nền mẫu chuẩn và nền mẫu phân tích là rất quan trọng để có thể định lượng đúng. Nghiên cứu này đã chứng minh được với phương pháp đã sử dụng, giới phát hiện và giới hạn định lượng đối với nền mẫu chứa đậu tương và ngô đã được xác định: LODđậu tương: 0,04%; LODngô: 0,04%. LOQđậu tương: 0,1%; LOGngô: 0,1% (ở độ tin cậy 99%).