Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của cốm bụp giấm trên chuột nhắt trắng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 25 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA CỐM BỤP GIẤM TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Lê Thị Lan Phương*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mở đầu: Cốm Bụp giấm là một loại chế phẩm dạng hạt hòa tan, bào chế từ nguồn nguyên liệu là bột sấy phun đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) phối hợp với một số tá dược. Trong các nghiên cứu trước, cốm Bụp giấm đã được xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và được chứng minh có hiệu quả điều trị rối loạn lipid máu trên thực nghiệm. Đánh giá độc tính của chế phẩm trên động vật thử nghiệm là một trong những bước nghiên cứu quan trọng để tìm hiểu độc tính có thể có của chế phẩm, từ đó đưa ra khuyến cáo trước khi tiến hành những thử nghiệm kế tiếp trên lâm sàng, góp phần đưa chế phẩm vào sử dụng cho bệnh nhân. Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá độc tính cấp (xác định LD50 hoặc Dmax) và độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Chế phẩm cốm Bụp giấm (BSP Bụp giấm, manitol, aspartam, nước cất) được đóng gói kín, tránh ẩm và ánh sáng, khối lượng 2 g (± 5%), chứa 0,123% delphinidin-3-O- sambubiosid và 0,034% cyanidin-3-O-sambubiosid. Nghiên cứu được thực hiện trên chuột nhắt trắng, cả giống đực và giống cái, chủng Swiss albino. Trong nghiên cứu độc tính cấp, chuột thử nghiệm sử dụng chế phẩm với liều duy nhất, đường uống, tiến hành qua giai đoạn sơ khởi và giai đoạn xác định. Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, chuột thử nghiệm sử dụng cốm Bụp giấm đường uống, liều 0,4 g/kg (liều tối ưu có tác dụng), 0,8 g/kg và 4 g/kg trong 12 tuần liên tục, mỗi lô 20 chuột. Đánh giá độc tính trên các biểu hiện hành vi, mức độ ăn, uống, cân nặng, chỉ số sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, hematocrit, hemoglobin, số lượng hemoglobin trung bình, nồng độ hemoglobin trung bình, thể tích trung bình của hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu), chỉ số trọng lượng gan, thận, lách và vi thể gan, thận chuột. Kết quả: Liều tối đa của cốm Bụp giấm có thể cho động vật thử nghiệm uống mà không có động vật nào chết (Dmax) là 15 g/kg chuột. Cốm Bụp giấm khi sử dụng 12 tuần liên tục ở cả 3 mức liều 0,4 g/kg, 0,8 g/kg và 4 g/kg đều làm giảm cân nặng chuột ở tuần thứ 5 và từ tuần thứ 8 đến tuần thứ 12. Lô chuột sử dụng cốm Bụp giấm liều 0,4 g/kg có chỉ số glucose giảm 14% (p < 0,05) sau 6 tuần và 13% (p < 0,01) sau 12 tuần, chỉ số MCH (số lượng hemoglobin trung bình) giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) sau 12 tuần. Lô chuột sử dụng cốm Bụp giấm liều 4 g/kg có vi phẫu thận , 8/10 mẫu mức độ nhẹ, 2/10 mẫu mức độ trung bình so với lô chứng uống nước cất sau 12 tuần. Các biểu hiện và chỉ số khác của các lô sử dụng cốm Bụp giấm khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất. Kết luận: Cốm Bụp giấm có độ an toàn khá cao. Tuy nhiên, khi sử dụng cốm Bụp giấm trong thời gian dài có thể làm ảnh hưởng đến một số thông số như giảm cân nặng, giảm glucose máu và MCH. Khi sử dụng cốm Bụp giấm liều cao (4 g/kg chuột) trong 12 tuần gây viêm mô kẽ thận mức độ nhẹ so với lô chứng uống nước cất. Từ khóa: Cốm Bụp giấm, Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae, Dmax, LD50. * Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.DS. Lê Thị Lan Phương ĐT: 0907748591 Email: ltlphuong@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 26 ABSTRACT STUDYING ACUTE TOXICITY AND SEMI-CHRONIC TOXICITY OF BUP GIAM GRANULES IN MICE Le Thi Lan Phương, Nguyen Phuong Dung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 25 – 33 Background: Bup giam granules are dissolving granules, made from dry powder of Bup giam (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) calyx and some adjuvants. In previous studies, quality standard of Bup giam granules was formulated and the efficacy in the treatment dyslipidemia of Bup giam granules in mice was proved. Evaluating the toxicity of drug in animals is one of the important stages to investigate the possible toxicity of drug, thereby recommending precautions prior to conducting further clinical studies as well as contributing to the preparation of a new drug utilized in patients. Objectives: The study was undertaken to evaluate the acute toxicity (determine LD50 or Dmax) and semi- chronic toxicity of Bup giam granules in mice. Methods: Bup giam granules are prepared from dry powder of Bup giam calyx, manitol, aspartame and distilled water. The composition is sealed in a package in order to avoid moisture and light. Each package weights 2 g (± 5%) and contains 0.123% delphinidin-3-O-sambubiosid and 0.034% cyanidin-3-O- sambubiosid. This study was performed in white mice, both male and female, Swiss albino strain. In the acute toxicity study, mice administered a single oral dose. This research proceeded through the initial and definitive stages. In the semi-chronic toxicity study, mice were given Bup giam granules at dose level of 0.4 g/kg (effective dose), 0.8 g/kg and 4 g/kg during 12 weeks, 20 mice each group. Toxicity was measured through activities, eating and drinking capacity of mice, weight, biochemical tests (AST, ALT, total cholesterol, triglyceride, creatinine, uric acid, glucose) and hematology tests (hematocrit, hemoglobin, mean hemoglobin, mean hemoglobin concentration, average red cell volume, white blood cell count, platelet count), weight of liver, weight of kidney, weight of spleen, liver and kidney microscope. Results: The maximum recommended dose of Bup giam granules which were given to mice without any death (Dmax) was 15 g/kg. Bup giam granules were used for 12 weeks at 3 doses of 0.4 g/kg, 0.8 g/kg and 4 g/kg all reduced the weight of mice after 5th weeks and from 8th weeks to 12th weeks. The mice received 0.4 g/kg of Bup giam granules had lower glucose level by 14% (p < 0.05) after 6 weeks and by 13% (p < 0.01) after 12 weeks. MCH (mean number of hemoglobin) decreased significantly (p < 0.05) after 12 weeks. The group used Bup giam granules at the dose of 4 g/kg showed indication of mild kidney inflammation after 12 weeks. Other results were not statistically different compared to the control group. Conclusions: Bup giam granules are relatively safe. However, using Bup giam granules in long-term may cause some abnormal affects such as weight loss, reduction blood glucose level and reduction the number of MCH. There was mild kidney inflammation in mice using Bup giam granules with high dose (4 g/kg mouse weight) during 12 weeks. Keywords: Bup giam granules, Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae, Dmax, LD50. ĐẶT VẤN ĐỀ Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) là một loại dược thảo đang được sử dụng rộng rãi không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới như một dạng thực phẩm bổ sung và hướng đến điều trị một số bệnh lý, trong đó có rối loạn lipid máu. Dịch chiết đài hoa Bụp giấm khô ở liều 500 và 1,000 mg/kg được cho cùng với chế độ ăn giàu cholesterol trên chuột cống trong 6 tuần cho kết quả giảm đáng kể mức cholesterol huyết Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 27 thanh(5), dịch chiết nước từ đài hoa Bụp giấm cho tác dụng chống oxy hoá trong quá trình oxy hoá LDL và tác dụng giảm lipid máu(7,4). Hiện nay, rối loạn lipid máu vẫn được xác định là một trong những yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh mạch vành, có tỷ lệ gây tử vong cao ở cả nam và nữ(2). Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu bào chế cốm Bụp giấm, có thành phần chính là bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm và xây dựng tiêu chuẩn của chế phẩm này(6). Liều tối ưu có tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của chế phẩm được xác định ở mức 0,4 g/kg chuột, tương đương 2 g (1 gói cốm) trên người trưởng thành (nghiên cứu đã được báo cáo giám định năm 2017 - Sở khoa học công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh). Nhằm tạo cơ sở tiếp tục phát triển và nghiên cứu chế phẩm cốm Bụp giấm trên lâm sàng, đồng thời đưa ra những khuyến cáo về độc tính của chế phẩm, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng. PHƯƠNG TIỆN-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu, trang thiết bị Cốm Bụp giấm Chế phẩm cốm Bụp giấm (cốm BG) có thành phần gồm cao khô Bụp giấm, manitol, aspartam, nước cất. Chế phẩm được đóng gói kín, tránh ẩm và ánh sáng, mỗi gói 2 g ± 5%. Mỗi gói cốm chứa 0,123% delphinidin-3-O-sambubiosid và 0,034% cyanidin-3-O-sambubiosid, đạt tiêu chuẩn về độ ẩm, độ hòa tan, độ đồng đều khối lượng của thuốc cốm theo Dược điển Việt Nam IV. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng cả 2 giống đực và cái, trưởng thành (5 – 6 tuần tuổi), chủng Swiss abino, nặng 18 – 22 g được cung cấp bởi viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh. Chuột được nuôi ở nhiệt độ phòng với chu kỳ 12 giờ sáng/tối, mỗi lồng 8 – 10 chuột, sử dụng thức ăn là cám viên với thành phần bột gạo, bột bắp, carbohydrat và vitamin trong suốt thử nghiệm. Hóa chất, trang thiết bị Thuốc thử định lượng sinh hóa, huyết học máu: Chema Diagnostica - Ý. Hóa chất formol, ethanol, ... loại tinh khiết do công ty Xilong Chemicals, Trung Quốc sản xuất. Trang thiết bị: Máy sinh hóa DIRUI DR- 7000 - Trung Quốc, lồng chuyển hóa, cân phân tích Sartorius, kính hiển vi soi nổi, dụng cụ phẫu thuật và một số dụng cụ thí nghiệm khác. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm. Đánh giá độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng(4,10) Nghiên cứu độc tính cấp trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình nếu có (liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm, gọi là LD50: lethal dose 50%) trong những điều kiện nhất định. Chuột nhắt chia thành các lô tương tự, những chuột ở cùng một lô sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm sau 72 giờ. Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống để ghi nhận những triệu chứng bất thường (nếu có). Trong trường hợp sau khi cho chuột uống mẫu thử, số chuột trong lô thử nghiệm vẫn bảo toàn, ta có thể xác định liều cao nhất có thể bơm qua kim mà không làm chết chuột (Dmax) và liều tương đối an toàn dùng trong các thực nghiệm dược lý có thể bằng 1/5 Dmax hoặc lớn hơn. Thử nghiệm được tiến hành qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1 (sơ khởi), sử dụng 6 chuột (50% đực, 50% cái ở mỗi liều), giai đoạn 2 (xác định), trong trường hợp tìm LD50, số lượng chuột mỗi lô là 10 chuột và 12 – 20 chuột ở liều gần LD50, trong trường hợp xác định Dmax, số lượng chuột là 20 con (50% đực, 50% cái). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 28 Đánh giá độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng(9,10) Chuột thử nghiệm được nuôi ổn định 1 tuần, cân trọng lượng, xét nghiệm các thông số sinh hóa và huyết học ban đầu, chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 20 con (10 đực, 10 cái): Lô chứng: Uống nước cất. Lô thử 1: Uống cốm Bụp giấm (BG) 0,4 g/kg (liều tối ưu có tác dụng điều trị). Lô thử 2: Uống cốm Bụp giấm (BG) 0,8 g/kg (liều gấp 2 lần liều có tác dụng điều trị). Lô thử 3: Uống cốm Bụp giấm (BG) 4,0 g/kg (liều gấp 10 lần liều có tác dụng điều trị). Các thông số đánh giá hàng tuần: Hành vi (tăng đi lại, giảm đi lại, nằm im, run rẩy, co giật), lông (mượt, rụng...), biểu hiện của các cơ quan; cân nặng, tính chất phân, nước tiểu. Mức độ ăn, uống được đánh giá tại thời điểm ban đầu, sau 6 tuần và sau 12 tuần bằng cách nhốt riêng mỗi chuột vào lồng chuyển hóa, cho chuột làm quen lồng trong ngày thứ nhất, cân lượng cám và lượng nước uống đã sử dụng trong 24 giờ tiếp theo. Sau 6 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu đuôi chuột và xét nghiệm các thông số: Sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết học (số lượng hồng cầu - RBC, hematocrit - HCT, hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung bình - MCH, nồng độ hemoglobin trung bình - MCHC, thể tích trung bình của hồng cầu - MCV, số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu - PLT). Sau 12 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu đuôi chuột và xét nghiệm các thông số: Sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết học (số lượng hồng cầu - RBC, hematocrit - HCT, hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung bình - MCH, nồng độ hemoglobin trung bình - MCHC, thể tích trung bình của hồng cầu - MCV, số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu - PLT). Gây mê, mổ quan sát đại thể gan, thận, tim, lách, phổi, dạ dày, ruột. Xét nghiệm vi thể gan, thận (lấy ngẫu nhiên 50% số động vật). Cân trọng lượng gan, thận, lách chuột xác định: Chỉ số trọng lượng gan = (trọng lượng gan / trọng lượng cơ thể chuột) x 100%. Chỉ số trọng lượng thận = (trọng lượng thận / trọng lượng cơ thể chuột) x 100%. Chỉ số trọng lượng lách = (trọng lượng lách / trọng lượng cơ thể chuột) x 100%. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu Tất cả dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Dùng phép kiểm t- test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm Minitab 16.0 và Microsoft Excel 2017 để thống kê dữ liệu và vẽ đồ thị. KẾT QUẢ Độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng Bảng 1. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cốm Bụp giấm Thử nghiệm Liều dùng (g/kg chuột) Số chuột Số chuột chết trong lô Phân suất tử vong Sơ khởi 15 6 0 0 Xác định 15 14 0 0 Trong suốt thời gian 72 giờ đầu tiên và 2 tuần quan sát tiếp theo, không ghi nhận được bất kỳ dấu hiệu bất thường nào xảy ra trên chuột thử nghiệm. Tất cả các chuột đều ăn uống và hoạt động bình thường, không có chuột chết, cân nặng khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các lô. Do đó, không tìm được LD50 vì lô chuột uống 15 g/kg là liều tối đa thuốc phân tán vào nước có thể qua đầu kim để cho uống được mà vẫn không có chuột chết. Quan sát đại thể: Sau 2 tuần theo dõi, mổ chuột ở tất cả các lô để quan sát đại thể các phủ tạng của chuột. Kết quả: Tất cả các chuột thực nghiệm không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 29 về hình thái đại thể của tim, gan, thận, bàng quang và hệ thống tiêu hóa. Độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng Trong suốt thời gian cho uống thuốc (12 tuần), động vật lô uống thuốc thử nghiệm liều 1 (0,4 g/kg) và liều 2 (0,8 g/kg) có mức ăn uống, đi lại bình thường, tình trạng phân, lông và các biểu hiện bên ngoài bình thường so với lô chứng uống nước cất. Động vật lô uống thuốc thử nghiệm liều 3 (4 g/kg) có biểu hiện đi phân mềm (phân ướt hơn so với phân của lô chứng và không định hình) từ tuần thứ 6 trở đi. Bảng 2. Kết quả theo dõi cân nặng của các lô trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn Lô (n=20) T0 (g) T1 (g) T2 (g) T3 (g) T4 (g) T5 (g) T6 (g) Lô 1 (nước cất) 18,95 ± 1,28 21,75 ± 1,59 23,05 ± 2,16 23,30 ± 2,72 25,70 ± 2,87 27,30 ± 3,05 26,50 ± 2,54 Lô 2 (BG 0,4 g/kg) 18,90 ± 0,85 21,70 ± 1,63 22,65 ± 1,95 23,60 ± 2,48 25,10 ± 2,49 24,45 ** ± 2,74 26,10 ± 3,13 Lô 3 (BG 0,8 g/kg) 18,70 ± 0,92 20,90 ± 2,00 22,90 ± 1,92 22,80 ± 1,88 24,85 ± 2,25 24,40 ** ± 2,30 25,85 ± 3,05 Lô 4 (BG 4 g/kg) 18,90 ± 1,07 21,80 ± 1,88 22,85 ± 2,23 22,60 ± 1,90 24,95 ± 1,50 24,30 *** ± 1,84 26,60 ±2,30 Trọng lượng T7 (g) T8 (g) T9 (g) T10 (g) T11 (g) T12 (g) Lô 1 (nước cất) 27,15 ± 2,72 30,20 ± 3,07 30,30 ± 3,10 31,05 ± 2,61 31,35 ± 2,35 31,40 ± 2,35 Lô 2 (BG 0,4 g/kg) 26,00 ± 4,03 27,10 ** ± 3,77 27,75 * ± 4,25 27,85 ** ± 3,56 28,45 ** ± 3,89 28,55 ** ± 3,17 Lô 3 (BG 0,8 g/kg) 25,35 ± 3,22 26,15 *** ± 3,05 26,15 *** ± 3,22 26,65 *** ± 2,98 27,05 *** ± 2,80 26,95 *** ± 2,93 Lô 4 (BG 4 g/kg) 26,30 ± 2,20 26,30 *** ± 3,15 26,30 *** ± 3,25 25,50 *** ± 3,49 25,00 *** ± 3,21 24,30 *** ± 3,11 Cân nặng chuột của lô thử nghiệm uống cốm BG 0,4 g/kg giảm ở tuần thứ 5 (p < 0,01), tuần thứ 8 (p < 0,01), tuần thứ 9 (p < 0,05), tuần thứ 10 (p < 0,01), tuần thứ 11 (p < 0,01) và tuần thứ 12 (p < 0,01) so với lô chứng uống nước cất. Cân nặng chuột của lô thử nghiệm uống cốm BG 0,8 g/kg giảm ở tuần thứ 5 (p < 0,01), tuần thứ 8 (p < 0,001), tuần thứ 9 (p < 0,001), tuần thứ 10 (p < 0,001), tuần thứ 11 (p < 0,001) và tuần thứ 12 (p < 0,001) so với lô chứng uống nước cất. Cân nặng chuột của lô thử nghiệm uống cốm BG 4 g/kg giảm ở tuần thứ 5 (p < 0,001), tuần thứ 8 (p < 0,001), tuần thứ 9 (p < 0,001), tuần thứ 10 (p < 0,001), tuần thứ 11 (p < 0,001) và tuần thứ 12 (p < 0,001) so với lô chứng uống nước cất. Hình 1. Lượng nước uống của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn (ml) Lượng nước và lượng thức ăn tiêu thụ của chuột giữa các lô khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê tại các thời điểm: Ban đầu, sau 6 tuần và sau 12 tuần thử nghiệm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 30 Hình 2. Lượng thức ăn của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn (g) Chỉ số xét nghiệm sinh hóa Chỉ số sinh hóa của chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê tại thời điểm ban đầu. Sau 6 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất: Lô uống cốm BG 0,4 g/kg có chỉ số acid uric, creatinin, AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê, glucose giảm 14% (p < 0,05). Lô uống cốm BG 0,8 g/kg và 4 g/kg có chỉ số acid uric, creatinin, glucose, AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3). Sau 12 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất: Lô uống cốm BG 0,4 g/kg có chỉ số acid uric, creatinin, AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê, glucose giảm 13% (p < 0,01). Lô uống cốm BG 0,8 g/kg và 4 g/kg có chỉ số acid uric, creatinin, glucose, AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Bảng 4). Bảng 3. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 6 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn Lô (n = 20) Uric (mg/d) Creatinin (mg/dL) Glucose (mg/dL) ALT (U/I) AST (U/I) Cholesterol TP (mg/dl) Triglycerid (mg/dl) Lô 1 (nước cất) 7,69 ± 1,32 0,43 ± 0,05 88,28 ± 12,25 44,10 ± 10,93 74,55 ± 15,34 80,54 ± 14,22 112,09 ± 22,20 Lô 2 (BG 0,4 g/kg) 7,59 ± 1,92 0,39 ± 0,07 76,17 ± 16,21 45,30 ± 8,90 73,35 ± 13,12 80,98 ± 10,84 108,72 ± 19,30 Lô 3 (BG 0,8 g/kg) 7,36 ±1,66 0,40 ± 0,12 86,28 ± 14,37 43,55 ± 11,69 70,80 ± 20,27 79,76 ± 13,30 110,47 ± 18,50 Lô 4 (BG 4 g/kg) 6,85 ± 1,49 0,40 ± 0,07 92,76 ± 23,42 56,35 ± 24,81 83,15 ± 20,66 86,60 ± 16,14 114,94 ± 16,63 Bảng 4. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 12 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn Lô (n = 20) Uric (mg/d) Creatinin (mg/dL) Glucose (mg/dL) ALT (U/I) AST (U/I) Cholesterol TP (mg/dl) Triglycerid (mg/dl) Lô 1 (nước cất) 7,37 ± 0,97 0,39 ± 0,08 86,65 ± 11,55 45,65 ± 12,09 78,25 ± 18,71 82,97 ± 17,53 115,34 ± 21,10 Lô 2 (BG 0,4 g/kg) 7,19 ± 1,46 0,37 ± 0,07 75,17 ± 10,67 42,00 ± 14,84 75,75 ± 16,97 80,88 ± 15,87 114,80 ± 28,71 Lô 3 (BG 0,8 g/kg) 7,39 ± 1,29 0,39 ± 0,11 85,64 ± 13,24 45,80 ± 12,65 78,20 ± 25,22 74,79 ± 13,18 120,56 ± 20,27 Lô 4 (BG 4 g/kg) 7,24 ± 1,33 0,35 ± 0,08 89,76 ± 20,47 48,70 ± 15,18 83,40 ± 24,65 86,08 ± 21,45 126,28 ± 19,04 Chỉ số xét nghiệm huyết học Chỉ số huyết học của chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê tại thời điểm ban đầu. Chỉ số huyết học của chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê sau 6 tuần. Sau 12 tuần thử nghiệm, lô uống cốm Bụp giấm liều 0,4 g/kg có chỉ số MCH giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với lô chứng uống nước cất. Các chỉ số khác khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất (Bảng 5, Bảng 6). Bảng 5. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 6 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn Lô (n = 20) WBC 10^9/L RBC 10^12/L HGB g/L HCT % MCV fL MCH pg MCHC g/L PLT 10^9/L Lô 1 (nước cất) 6,24 ± 1,85 5,56 ± 0,57 12,41 ± 1,21 32,90 ± 6,21 59,67 ± 3,95 23,05 ± 3,85 37,08 ± 1,17 903,45 ± 191,10 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 31 Lô (n = 20) WBC 10^9/L RBC 10^12/L HGB g/L HCT % MCV fL MCH pg MCHC g/L PLT 10^9/L Lô 2 (BG 0,4 g/kg) 6,53 ± 1,57 6,03 ± 1,00 13,42 ± 1,93 34,65 ± 6,10 58,42 ± 3,74 21,50 ± 2,24 36,74 ± 2,89 993,95 ± 230,26 Lô 3 (BG 0,8 g/kg) 6,55 ± 1,67 5,42 ± 1,07 12,85 ± 1,82 31,55 ± 6,92 58,05 ± 3,25 22,17 ± 1,90 37,69 ± 1,19 946,50 ± 323,83 Lô 4 (BG 4 g/kg) 6,75 ± 2,75 5,82 ± 0,88 13,14 ± 2,06 33,93 ± 6,19 58,70 ± 4,17 22,36 ± 3,11 37,17 ± 1,47 1007,95 ± 226,90 Bảng 6. Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 12 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn Lô (n = 20) WBC 10^9/L RBC 10^12/L HGB g/L HCT % MCV fL MCH pg MCHC g/L PLT 10^9/L Lô 1 (nước cất) 6,43 ± 1,85 6,38 ± 0,87 13,66 ± 1,87 39,27 ± 5,42 62,30 ± 3,17 24,14 ± 3,14 36,42 ± 3,59 991,25 ± 155,48 Lô 2 (BG 0,4 g/kg) 6,70 ± 1,85 6,63 ± 0,68 14,64 ± 1,49 38,52 ± 6,00 61,26 ± 3,37 22,08 * ± 1,12 36,09 ± 1,14 965,85 ± 224,26 Lô 3 (BG 0,8 g/kg) 6,44 ± 2,02 6,48 ± 0,55 13,94 ± 1,70 38,84 ± 3,87 60,06 ± 7,33 22,63 ± 1,26 36,54 ± 0,86 982,35 ± 275,78 Lô 4 (BG 4 g/kg) 6,64 ± 2,12 6,41 ±0,82 14,16 ± 1,64 39,37 ± 4,98 60,03 ± 9,23 22,68 ± 3,62 36,24 ± 1,15 941,90 ± 243,62 Kết quả giải phẫu quan sát đại thể và vi thể Sau 12 tuần uống thuốc, chuột được gây mê, giải phẫu, quan sát tim, phổi, gan, thận, lách, ruột, bàng quang. Kết quả bình thường, không khác biệt so với lô uống nước cất (Hình 3). Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của chuột giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê sau 12 tuần. Kết quả giải phẫu bệnh gan, thận được gửi xét nghiệm tại bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Sau 12 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất: Lô uống cốm Bụp giấm 0,4 g/kg và 0,8 g/kg 10/10 mẫu có hình ảnh vi phẫu gan, thận không khác biệt nhau. Lô uống cốm Bụp giấm 4 g/kg có hình ảnh vi phẫu gan không khác biệt, vi phẫu thận có viêm mô kẽ thận, 8/10 mẫu mức độ nhẹ, 2/10 mẫu mức độ trung bình (Hình 4, Hình 5). Hình 3. Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn (%) n=20 cho mỗi lô Hình 4: Hình ảnh vi thể gan của các lô thử nghiệm độc tính bán trường diễn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 32 Hình 5: Hình ảnh vi thể thận của các lô thử nghiệm độc tính bán trường diễn BÀN LUẬN Độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng Cốm Bụp giấm không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều tối đa có thể bơm qua đầu kim để cho chuột uống là 15 g/kg, tương đương với 75 g/người 60 kg (bảng quy đổi liều(9)), gấp 32,5 lần liều dự kiến sử dụng hàng ngày là 2 g cốm. Như vậy, cốm Bụp giấm sử dụng trong thử nghiệm có độ an toàn khá cao và có Dmax = 15 g/kg. Kết quả của các nghiên cứu đã công bố trên thế giới về độc tính cấp của Bụp giấm cũng cho thấy độ an toàn cao của Bụp giấm khi sử dụng đường uống. Liều LD50 trên chuột nhắt (trọng lượng 30 g) được báo cáo là khoảng 0,4 - 0,6 ml (tiêm phúc mô, i.p.) nước sắc Bụp giấm 30% (Bụp giấm được ngâm trong nước cất 30 phút, lấy dịch chiết)(7). Độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng Cốm Bụp giấm sử dụng trong nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến lượng thức ăn, nước uống tiêu thụ ở chuột và các biểu hiện hành vi khi sử dụng dài ngày. Tuy nhiên, theo công bố của Iyare năm 2008 và 2010, dịch chiết nước Bụp giấm làm giảm lượng thức ăn, nước uống tiêu thụ ở chuột cống cái và tác dụng này phụ thuộc liều. Tác giả giải thích sự giảm lượng thức ăn và nước uống tiêu thụ ở chuột có thể là do chúng không thích mùi vị của Bụp giấm(3). Như vậy, có thể do cốm Bụp giấm đã cải thiện được mùi, vị của dược liệu nhờ bổ sung thêm mannitol và aspartam nên không làm ảnh hưởng đến các chỉ số này. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy có sự giảm trọng lượng chuột ở lô uống cốm Bụp giấm so với lô chuột uống nước cất ở tuần thứ 5, 8, 9, 10, 11 và 12 trong khi lượng thức ăn và nước uống sử dụng không khác biệt. Những nghiên cứu được tổng hợp đến năm 2014 đều không cho thấy sự giảm trọng lượng đáng kể gây ra bởi Bụp giấm trên động vật bình thường(3). Do đó, tác động đối với trọng lượng cần được đánh giá thêm trong những nghiên cứu tiếp theo để làm rõ hơn về lợi ích và nguy cơ. Nồng độ glusose trong máu của lô uống cốm Bụp giấm (0,4 g/kg) giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất sau 6 tuần và sau 12 tuần thử nghiệm. Tuy nhiên, ảnh hưởng này lại không xuất hiện ở lô sử dụng liều cao hơn (0,8 g/kg và 4 g/kg). Như vậy, tác động trên glucose máu của cốm Bụp giấm phụ thuộc liều sử dụng. Về tác động trên đường huyết, Bụp giấm cho hiệu quả ức chế α-amylase tụy(1); ở liều 200 mg/kg, Bụp giấm chống đề kháng insulin, làm giảm sự tăng đường huyết và sự tăng insulin trong máu trên chuột cống(8). Do đó, trong các nghiên cứu tiếp theo, cần đánh giá thêm khả năng gây giảm đường huyết trên đối tượng bình thường. Lô uống cốm Bụp giấm liều 0,4 g/kg có chỉ số MCH giảm so với lô chứng uống nước cất sau 12 tuần thử nghiệm. Tuy nhiên, tác động này lại không xảy ra khi sử dụng cốm Bụp giấm ở liều cao (0,8 g/kg và 4 g/kg). Chỉ số MCH thấp có thể do lượng sắt thấp trong Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 33 máu. Cơ thể sử dụng sắt để tạo ra huyết sắc tố, nếu như cơ thể hết chất sắt, thiếu máu do thiếu sắt gây ra có thể làm giảm MCH. Trong nghiên cứu sơ bộ về việc sử dụng nước sắc Bụp giấm như là một nguồn thay thế sắt trong điều trị thiếu máu và một số bệnh khác do thiếu hụt chất khoáng, kết quả cho thấy đài hoa khô Bụp giấm thúc đẩy khả năng sử dụng chất khoáng(3). Như vậy, có thể do khả năng tăng cường sử dụng chất khoáng trong thời gian dài đã dẫn đến sự thiếu hụt sắt trên chuột thí nghiệm với khẩu phần ăn tiêu chuẩn. Sự giảm MCH không gặp phải khi sử dụng Bụp giấm ở liều cao có thể do sự bù đắp chính từ Bụp giấm vì trong thành phần của nó có chứa khoáng chất. Lô uống cốm Bụp giấm 4 g/kg có dấu hiệu đi phân mềm từ tuần thứ 6 trở đi có thể do ảnh hưởng của lượng acid ascorbic và một số acid hữu cơ cao trong Bụp giấm. Hiện tượng viêm mô kẽ thận ở lô này sau 12 tuần thử nghiệm cần được đánh giá thêm về nguyên nhân và mức độ cũng như sự liên quan đến liều sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ hơn. Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra khuyến cáo cho các nghiên cứu sau cần chú ý theo dõi cân nặng, đánh giá lợi ích và nguy cơ; các thông số đường huyết (tình trạng giảm đường huyết ở đối tượng bình thường), MCH (tình trạng thiếu máu liên quan đến liều) và nên đánh giá chức năng thận khi sử dụng chế phẩm dài ngày với liều cao. KẾT LUẬN Cốm Bụp giấm có Dmax = 15 g/kg, thể hiện độ an toàn cao khi sử dụng. Tuy nhiên, cốm Bụp giấm sử dụng ở cả ba mức liều 0,4 g/kg, 0,8 g/kg và 4 g/kg đều làm giảm trọng lượng chuột ở tuần thứ 5 và từ tuần thứ 8 đến tuần thứ 12. Chuột nhắt được cho uống cốm Bụp giấm ở liều tối ưu có tác dụng điều trị (0,4 g/kg), không bị thay đổi hầu hết các chỉ số sinh học, nhưng có giảm glucose 14% sau 6 tuần và 13% sau 12 tuần, giảm MCH 8,5% sau 12 tuần. Chuột nhắt uống cốm Bụp giấm liều gấp đôi liều tối ưu có tác dụng điều trị (0,8 g/kg), không bị thay đổi các chỉ số sinh học. Chuột nhắt sử dụng cốm Bụp giấm liều gấp 10 lần liều tối ưu có tác dụng điều trị (4 g/kg) không bị thay đổi hầu hết các chỉ số sinh học nhưng có biểu hiện đi phân mềm từ tuần thứ 6 trở đi và có biểu hiện viêm mô kẽ thận mức độ nhẹ trên vi phẫu. Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu xin cảm ơn sự hỗ trợ của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Adisakwattana S et al (2012). “In vitro inhibitory effects of plant- based foods and their combinations on intestinal inverted question mark-glucosidase and pancreatic inveerted question mark amylase”. BMC Complementary and Alternative Medicine; 12(1): 110. 2. Benjamin EJ et al (2017). "Heart Disease and Stroke Statistics - 2017 Update: A Report from the American Heart Association". Circulation; 135(10): e146-e603. 3. Da-costa-Rocha I et al (2014). “Hibiscus sabdariffa L. - A phytochemical and pharmacological review”. Food Chemistry; 165: 424 - 443. 4. Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác định độc tính của thuốc. Nhà xuất bản Y học, tr. 7 - 24, 50 - 57. 5. Hainida E et al. (2008). “Effects of defatted dried roselle (Hibiscus sabdariffa L.) seed powder on lipid profiles of hypercholesterolemia rats”. Journal of the Science of Food and Agriculture; 88:1043-1050. 6. Lê Thị Lan Phương, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Phương Dung (2017). “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O- sambubiosid trong cốm Bụp giấm bằng phương pháp HPLC”. Tạp chí Y học TP.Hồ Chí Minh; 21(6): 81 - 86. 7. Ochani PC and D’Mello P (2009). “Antioxidant and antihyperlipidemic activity of Hibiscus sabdariffa Linn. leaves and calyces extracts in rats”. Indian Journal of Experimental Biology; 47: 276 - 282. 8. Peng CH et al (2011). “Hibiscus sabdariffa polyphenolic extract inhibits hyperglycemia, hyperlipidemia, and glycation-oxidative stress while improving insulin resistance”. Journal of Agricultural and Food Chemistry; 59(18): 9901 - 9909. 9. Sharaf A (1962). “The pharmacological characteristics of Hibiscus sabdariffa L.”. Planta Medica; 10: 48 - 52. 10. Viện Dược liệu (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 311 - 313. 11. Yang MY et al (2010). “The Hypolipidemic Effect of Hibiscus sabdariffa Polyphenols via Inhibiting Lipogenesis and Promoting Hepatic Lipid Clearance”. Journal of Agricultural and Food Chemistry; 58: 850 - 859. Ngày nhận bài báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018