Đánh giá chất lượng của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 253 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA VẬT LIỆU NỘI KIỂM HIV TỰ PHA CHẾ TẠI BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH Mai Nguyệt Thu Huyền*, Đặng Thị Minh Hà* Nguyễn Thị Bích Vân*, Công Thị Mai Linh*, Nguyễn Công Thành*, Nguyễn Mạnh Hoàng*, Khuất Thị Anh Đào*, Nguyễn Hữu Lân* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Nội kiểm xét nghiệm là một điều kiện không thể thiếu trong việc đánh giá chất lượng xét nghiệm nói chung và chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV nói riêng. Hiện tại vật liệu nội kiểm sinh phẩm HIV chưa có trên thị trường. Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế. Phương pháp: Thu thập các mẫu huyết thanh HIV dương tính với cả 3 sinh phẩm liên tiếp: Murex Ag/Ab, Determine HIV1/2, SD Bioline 3.0. Trộn đều các mẫu huyết thanh trên lại với nhau và phân ra thành các tube nhỏ, mỗi tube chứa 200 µl huyết thanh và lưu ở -20 độ C trong 3 tháng. Mẫu huyết tương âm tính được lấy từ các dây của các túi máu dùng truyền cho bệnh nhân. Trộn đều các mẫu huyết tương này lại với nhau sau đó chia ra thành các tube nhỏ, mỗi tube chứa 200 µl huyết tương và lưu - 20 độ C trong 3 tháng. Kết quả: Từ 1/11/2017/đến 5/11/2018, có 7 lô huyết thanh/huyết tương dùng cho nội kiểm tự pha chế, gồm 51 mẫu huyết thanh dương tính và 51 mẫu huyết tương âm tính. Tất cả các mẫu này đều có độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% đối với các sinh phẩm Murex Ag/Ab, Determine HIV1/2 và SD Bioline 3.0. Theo dõi trong vòng 3 tháng các optical density (OD) của chứng dương dao động từ 1,589-3,891 và các OD của chứng âm 0,049-0,088 ( OD cut off: 0,196-0,229). Không có mẫu nào cho kết quả dương tính giả hay âm tính giả. Kết luận: Chúng tôi đã pha chế thành công vật liệu nội kiểm HIV với độ nhạy và độ đặc hiệu 100%, Vật liệu này vẫn ổn định trong 3 tháng ở âm 20oC và rã đông một lần. Từ khóa: HIV, nội kiểm, optical density ABSTRACT EVALUATION OF THE STABILITY OF THE IN-HOUSE INTERNAL QUALITY CONTROL MATERIAL FOR HIV TESTING AT PHẠM NGỌC THẠCH HOSPITAL Mai Nguyet Thu Huyen, Dang Thi Minh Ha, Nguyen Thi Bich Van, Cong Thi Mai Linh, Nguyen Cong Thanh, Nguyen Manh Hoang, Khuat Thi Anh Dao, Nguyen Huu Lan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 253-258 Background: Internal control is an indispensable method in evaluating the quality of laboratory tests in general and of HIV-confirming tests in particular. The internal quality material control kit for HIV test is not yet available in the market. Objective: To evaluate the sensitivity, the specificity and the stability of the in-house internal quality material control kit for HIV test. Method: HIV-positive serum samples confirmed by all three sequential confirming tests including Murex Ag/Ab HIV, Determine HIV ½ and SD Bioline 3.0 were collected. They were well-mixed together *Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: TS.BS Mai Nguyệt Thu Huyền ĐT: 0902944701 Email: maihuyen1967@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 254 and divided into 200 µl aliquots that were then frozen at -20oC for 3 months. Negative plasma samples were collected from the strings of blood transfusion bags and then divided into 200 µl aliquots that were then frozen at -20°C for 3 months. Results: From November 1, 2017 to November 5, 2018, seven batches were made, including 51 HIV- positive serum samples and 51 HIV-negative plasma samples. They all showed 100% sensitivity and 100% specificity for Murex Ag / Ab, Determine HIV1/2 and SD Bioline 3.0 tests. Follow up within 3 months, ODs of positive control samples range from 1,589-3,891 and ODs of negative control samples range from 0.049-0.088 (ODs cut off: 0.196-0.229). There are no samples that show false positive or false negative results. Conclusion: We have successfully prepared the in-house internal quality material control for HIV test with 100% sensitivity and specificity, this material is still stable within 3 months at -20oC and thawed once. Keywords: HIV, Internal Control, optical density ĐẶT VẤN ĐỀ Để đạt mục tiêu kết thúc đại dịch AIDS vào năm 2030, chúng ta phải đạt được mục tiêu 90- 90-90. Đó là: 90% số người nhiễm HIV được biết tình trạng nhiễm HIV của mình; 90% số người chẩn đoán nhiễm HIV được điều trị ARV liên tục; và 90% số người được điều trị ARV kiểm soát được tải lượng vi-rút ở mức thấp và ổn định, tức là tải lượng vi-rút HIV ở mức thấp dưới ngưỡng phát hiện(2). Để đạt đươc mục tiêu 90 đầu tiên, bên cạnh việc gia tăng mở rộng hệ thống mạng lưới xét nghiệm phát hiện nhiễm HIV tại cộng đồng bằng các xét nghiệm chẩn đoán nhanh, mạng lưới các phòng xét nghiệm khẳng định HIV tại tuyến huyện thực hiện bằng ba test nhanh cũng phải được phát triển. Các phòng xét nghiệm thực hiện xét nghiệm khẳng định HIV cần phải bảo đảm chất lượng xét nghiệm bằng cách thực hiện nội kiểm và tham gia thực hiện ngoại kiểm theo Quyết định 2429/QĐ-BYT của bộ y tế về đánh giá chất lượng phòng xét nghiệm y học(3). Hiện tại, xét nghiệm ngoại kiểm được viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh tổ chức thực hiện mỗi 6 tháng. Tuy nhiên, xét nghiệm nôi kiểm HIV chưa thực hiện được vì bộ kít nội kiểm HIV chưa có trên thị trường. Do đó, để bảo đảm chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV theo Quyết định 2429/QĐ-BYT, chúng tôi đã tiến hành tự pha chế bộ kít nội kiểm gồm các mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu huyết tương âm tính từ các nguyên liệu hiện có. Mục tiêu Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Thực nghiệm y học. Đối tượng Mẫu chứng dương: Gồm huyết thanh của bệnh nhân đã được khẳng định dương tính với HIV bằng 3 test chẩn đoán HIV được Bộ Y tế công nhận(4). Mẫu chứng âm: Huyết thanh từ các dây trong túi máu để truyền máu cho bệnh nhân(1). Phương pháp Quy trình pha chế huyết thanh nội kiểm dương tính Thu thập các mẫu huyết thanh dương tính với HIV ở cả 3 sinh phẩm Murex Ag/Ab HIV1/2 (có OD >= 1 trở lên), Determine HIV1/2 và SD bioline 3.0. Sau khi lưu các mẫu dương tính theo quy định, dùng pipette hút toàn bộ huyết thanh dương tính còn lại cho vào các tube lớn 10ml đã được đánh đấu "chứng dương " (ống A). Trộn đều tất cả các mẫu dương trong ống A, sau đó hút 200 µl huyết thanh trong ống A cho vào mỗi tube effpendorf. Lưu các tube này ở -20°C trong 3 tháng. Ghi ngày pha chế. Mỗi tuần lấy một tube để làm nội kiểm. Thời gian từ lúc thu thập Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 255 mẫu đến lúc trữ đông là 24 giờ. Thu thập các dây của các túi máu dùng truyền cho bệnh nhân ( túi máu dùng truyền cho bệnh nhân chắc chắn đã được xác định HIV,HbsAg, và HCV âm tính). Dùng pipette hút toàn bộ máu trong dây truyền máu cho vào các tube effpendorf 2ml đã đánh dấu "chứng âm", quay ly tâm 3000 rpm/ 5 phút để tách huyết tương. Dùng pipette hút dung dịch nổi (huyết tương) cho vào ống 10ml (ống B - "Chứng âm"). Trộn đều huyết tương trong ống B và hút 200 µl cho vào mỗi tube effpendorf. Lưu các tube này ở -20°C trong 3 tháng. Ghi ngày pha chế. Mỗi tuần lấy một tube làm nội kiểm. Thời gian từ lúc thu thập mẫu đến lúc trữ đông là 24 giờ. Quy trình thực hiện Chọn ngẫu nhiên một mẫu HIV dương và một mẫu HIV âm trong cùng một lô pha chế. Thực hiện xét nghiệm với cả 3 test HIV cho mỗi mẫu. Lặp lại test 5 lần cho mỗi mẫu trong 5 ngày để đánh giá độ lặp lại. Mỗi tuần, thử mẫu nội kiểm dương và nội kiểm âm của mỗi lô với ba sinh phẩm Murex Ag/Ab HIV 1/2, Determine HIV1/2 và SD Bioline 3.0. Ghi nhận kết quả âm tính/ dương tính theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi tube sau khi rã đông chỉ dùng 1 lần. Phân tích kết quả Dùng phần mềm Excel. Để theo dõi độ ổn định của vật liệu nôi kiểm tự pha chế, do lượng huyết thanh có hạn, nên chúng tôi pha chế 3 lô 5,6,7 mỗi lô 12 tube (từ mẫu 16-51) và lưu âm 20 độ C sử dụng trong 3 tháng để theo dõi tính biến thiên của OD theo thời gian. Tất cả các kết quả OD của chứng dương và chứng âm được nhập vào 2 cột Excel riêng theo thứ tự thời gian của các lần thực hiện. Sau đó vẽ biểu đồ bằng excel tính giá trị OD trung bình, OD max và OD min và so sánh với giá trị OD cut off max và min để xác định giá trị chẩn đoán. Bảng 1: Độ nhạy và độ đặc hiệu được tính theo bảng 2x2 Sinh phẩm xét nghiệm Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Dương tính A C Âm tính B D Tổng cộng A+B C+D Độ nhạy = A/(A+B)X 100%. Độ đặc hiệu = D/(C+D)X 100%. KẾT QUẢ Từ ngày 01/11/2017/đến ngày 05/11/2018, chúng tôi đã pha chế được 7 lô mẫu nội kiểm, gồm 51 mẫu huyết thanh HIV dương tính và 51 mẫu huyết tương HIV âm tính: Độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Murex Ag/Ab HIV Bảng 2: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Murex Ag/Ab HIV Murex Ag/Ab HIV Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Dương tính 51 0 Âm tính 0 51 Tổng cộng 51 51 Độ nhạy: 100% Độ đặc hiệu: 100%. OD trung bình: 0,063 (Hình 1). OD min=0,049. OD max= 0,088. Giá trị OD cut off: 0,196-0,229. OD trung bình= 3,1 (Hình 2). OD min=1,589. OD max= 3,891. Giá trị OD cut off: 0,196 – 0,229. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 256 BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT TƯƠNG ÂM 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 SỐ LẦN NỘI KIỂM O D OD MẪU THỬ Theo dõi độ ổn định OD (lần 16-51) Hình 1: Biểu đồ biến thiên của OD mẫu huyết tương HIV âm tính theo thời gian BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT THANH DƯƠNG 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 SỐ LẦN NỘI KIỂM O D OD MẪU THỬ Theo dõi độ ổn định OD (lần16-51) Hình 2: Biểu đồ biến thiên của OD mẫu huyết thanh HIV dương tính theo thời gian Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 257 Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Determine HIV1/2 Bảng 3: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Determine HIV1/2 Determine HIV1/2 Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Dương tính 51 0 Âm tính 0 51 Tổng cộng 51 51 Độ nhạy: 100%. Độ đặc hiệu: 100%. Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ ở âm 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng SD Bioline 3.0 Bảng 4: Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ ở âm 20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng SD Bioline 3.0 SD Bioline 3.0 Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Dương tính 51 0 Âm tính 0 51 Tổng cộng 51 51 Độ nhạy: 100%. Độ đặc hiệu: 100%. Độ lặp lại của sinh phẩm MurexAg/Ab HIV trong cùng một lô pha chế Bảng 5: Độ lặp lại của sinh phẩm MurexAg/Ab HIV trong cùng một lô pha chế Mẫu OD/CO Lần 1 OD/CO Lần 2 OD/CO Lần 3 OD/CO Lần 4 OD/CO Lần 5 SD Mean CV% Dương 14.441 13.500 14.029 14.354 13.315 0.5 13.92 3.6 Âm 0.242 0.252 0.252 0.237 0.266 0.01 0.27 4.0 BÀN LUẬN 51 mẫu huyết tương âm tính HIV từ túi máu và 51 mẫu huyết thanh HIV dương tính được pha chế từ các mẫu huyết thanh HIV dương tính của bệnh nhân được lưu trữ ở -20 độ C trong thời gian tối đa 3 tháng có kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% ở cả 3 sinh phẩm murex, Determine HIV1/2 và SD bioline 3.0. Điều này cho thấy bộ huyết thanh này rất ổn định với nhiệt độ và thời gian lưu trữ. Cả 3 sinh phẩm Murex, Determine HIV1/2 và SD bioline 3.0 đều được Bộ Y Tế công nhận và khuyến cáo dùng trong xét nghiệm khẳng định HIV(4). Khoa xét nghiệm của chúng tôi đã dùng 3 sinh phẩm này tham gia ngoại kiểm HIV từ 2007 cho đến nay; mỗi năm thực hiện 02 đợt ngoại kiểm, tổng cộng 24 lần ngoại kiểm đều có kết quả đạt độ chính xác 100%. Điều này cho thấy việc sử dụng 03 sinh phẩm này để pha chế vật liệu nội kiểm là rất đáng tin cậy. Đối với mẫu chứng âm, chúng tôi đã dùng máu có trong dây truyền máu của túi máu để pha chế mẫu chứng âm. Đây là mẫu máu đã được loại trừ nhiễm HIV bằng công nghệ NAT (Nucleic Acid Testing) nên kết quả HIV âm tính của mẫu là rất đáng tin cậy(1). Sinh phẩm Murex hoạt động theo kỹ thuật ELISA nên để đánh giá tính ổn định của sản phẩm, chúng tôi dựa vào sự thay đổi của OD. Do lượng huyết thanh/huyết tương có hạn, chúng tôi chỉ pha chế lượng mẫu đủ dùng trong 3 tháng vì vậy chỉ đánh giá tính ổn định của sản phẩm trong thời gian 3 tháng, lưu trữ ở âm 20 độ C và chỉ rã đông 1 lần. Đối với 3 lô 5,6,7 (lưu trữ 3 tháng) kết quả cho thấy giá trị OD của các mẫu khá ổn định như 4 lô đầu tiên (thời gian lưu trữ trong vòng 1 tháng), tuy OD có thay đổi nhưng tính đến thời hạn 3 tháng kể từ ngày pha chế các giá trị OD vẫn đạt yêu cầu chẩn đoán (Hình 1, 2) và không có mẫu nào cho kết quả dương tính giả hay âm tính giả. Việc tự pha chế bộ mẫu nội kiểm mang lại rất nhiều lợi ích cho phòng xét nghiệm trong việc bảo đảm chất lượng xét nghiệm khi mà bộ kít nội kiểm chưa có trên thị trường. Hơn nữa, quy trình pha chế bộ mẫu nội kiểm từ các mẫu huyết thanh sẵn có rất dễ thực hiện và có thể nhân rộng ở các phòng xét nghiệm khẳng định HIV, giúp tiết kiệm chi phí hoạt động của phòng xét nghiệm và giảm giá thành của test. Tuy nhiên để vật liệu nội kiểm được ổn định cần lưu ý chia thể tích huyết thanh hay huyết tương đủ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 258 cho một lần sử dụng (tránh rã đông và tái đông nhiếu lần) và lưu trử âm 20 độ C đến thời gian 3 tháng vẫn còn sử dụng tốt. Trong nghiên cứu này còn hạn chế do lượng mẫu ít, nên chúng tôi chỉ có thể theo dõi vật liệu nội kiểm tự pha chế ở âm 20 độ C trong vòng 3 tháng. Hy vọng trong tương lai với số lượng mẫu thu thập nhiều hơn có thể theo dõi tính ổn định của vật liệu nội kiểm ở nhiều nhiệt độ khác nhau và thời gian lâu hơn. KẾT LUẬN Lần đầu tiên chúng tôi đã pha chế thành công vật liệu nội kiểm xét nghiệm khẳng định HIV bằng các vật liệu có sẳn với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100%; và vẫn ổn định trong 3 tháng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2013). Hướng dẫn hoạt động truyền máu. Thông tư số 26/2013/TT-BYT. 2. Bộ Y tế (2016). Mục tiêu 90-90-90 trong phòng chống HIV-AIDS. 3. Bộ Y tế (2017). Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học. Quyết định số 2429/QĐ-BYT 4. Bộ Ytế (2018). Cung cấp danh mục sinh phẩm chẩn đoán HIV. Công văn 117/AIDS-GSXN. Ngày nhận bài báo: 02/01/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25/01/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019