Đánh giá ảnh hưởng chức năng suy giảm sinh dục của thuốc natri valproate trên mô hình chuột đực Swiss Albino

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Ngoại Khoa 86 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CHỨC NĂNG SUY GIẢM SINH DỤC CỦA THUỐC NATRI VALPROATE TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT ĐỰC SWISS ALBINO Trần Thị Thanh Loan*, Nguyễn Lê Việt Hùng*, Bùi Thị Thanh Tâm*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mở đầu: Natri valproate (NV) là một loại thuốc chống động kinh chính và phổ biến. Tuy nhiên, có mối quan ngại ngày càng tăng về các tác động của NV đối với chức năng nội tiết sinh sản. Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của NV trên thể trọng của chuột, số lượng và sự vận động của tinh trùng, thay đổi mô học trong tinh hoàn. Phương pháp: Chuột đực Swiss albino (6 - 7 tuần tuổi) được thử nghiệm bằng NV với các liều 100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg, 750 mg/kg, và 1000 mg/kg và nước cất. Số lượng tinh trùng, khả năng vận động tinh trùng và mô bệnh học của tinh hoàn được phân tích. Kết quả: Số lượng tinh trùng và nhu động tinh trùng đã giảm đáng kể bởi NV. Nghiên cứu mô bệnh học cho thấy rằng NV đã gây ra sự sụt giảm của các tế bào biểu mô trong tinh hoàn. Kết luận: NV gây ra sự thay đổi trong sự vận động của tinh trùng, số lượng tinh trùng, hình thái và cấu trúc biểu mô của tinh hoàn. Từ khóa: Suy giảm sinh dục, natri valproate, tinh trùng ABSTRACT EVALUATING THE EFFICIENCY OF THE NATRI VALPROATE INDUCED BY SEXUAL DYSFUNCTION WITH NATRI VALPROATE IN MALE MICE SWISS ALBINO MODEL Tran Thi Thanh Loan, Nguyen Le Viet Hung, Bui Thi Thanh Tam, Nguyen Phuong Dung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2018: 86 – 91 Background: Natri valproate (NV) is a major antiepileptic drug with a broad spectrum of antiepileptic activity. There is, however, increasing concern about the possible effects of NV on reproductive endocrine function. Objective: To assess the effects of NV on mice body weight, sperm count, motility, and histopathological changes in testis. Methods: Male Swiss albino mice (6 - 7 week old) were treated with sodium valpraote at 100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg, 750 mg/kg, and 1000 mg/kg dose and distilled water. Epididymal sperm count, sperm motility, and histopathology of testes were analyzed. Sperm count and sperm motility were decreased significantly by NV. Results: A histopathological study revealed that NV had caused sloughing of epithelial cells in testes. Conclusion: NV causes reversible change in sperm motility, sperm count, morphology, and cytoarchitecture of testes. Keywords: sexual dysfunction, natri valproate, sperm ĐẶT VẤN ĐỀ Natri valproat (NV) là một thuốc chống động kinh đa cơ chế, là lựa chọn đầu tay cho điều trị các thể động kinh(9). Những người bị động kinh có tỷ lệ sinh thấp hơn đáng kể so với cộng đồng và rối loạn chức năng tình dục  Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Trần Thị Thanh Loan ĐT: 0903968810 Email: nnld2001@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ngoại Khoa 87 là phổ biến(10). Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chứng minh NV làm suy giảm khả năng sinh sản của nam giới theo hướng tác dụng vào trục dưới đồi tuyến yên(2,5) hoặc do ảnh hưởng trực tiếp lên tinh hoàn, dẫn đến chất lượng tinh dịch kém hơn việc tạo mô hình thử nghiệm gây suy sinh dục trên chuột nhắt trắng đực được tiến hành nhằm tạo bước đệm nghiên cứu, đánh giá tác khả năng trong phục hồi bệnh lý suy sinh dục ở nam giới chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá ảnh hưởng chức năng suy giảm sinh dục của thuốc NV trên mô hình chuột đực swiss albino”. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng mô hình thực nghiệm gây suy sinh dục trên chuột nhắt trắng đực bằng NV. Đánh giá tác dụng của thuốc NV lên chức năng suy giảm sinh dục trên chuột đực swiss albino. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu NV 500 mg hay còn gọi là Depakine chrono 500 mg (Sanofi, Pháp). Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino do viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Chuột thí nghiệm khoảng 6-7 tuần tuổi có khối lượng 30 ± 2,0g/con và được nuôi ổn định ở nhiệt độ 25 0 C, chu kỳ 12 giờ sáng – tối, chuột được cung cấp dinh dưỡng theo đúng tiêu chuẩn dành cho động vật thí nghiệm. Thiết kế nghiên cứu Thực nghiệm, so sánh giữa các lô. Phương pháp nghiên cứu Xây dựng mô hình suy sinh dục Liều NV được khảo sát bằng đường uống trên chuột sau khi ổn định 1 tuần. Chuột được uống theo liều 10ml/kg, mỗi ngày 1 lần vào 8g sáng. Khảo sát liên tục trong trong vòng 35 ngày. Sau khi kết thúc quy trình xử lí thuốc, tiến hành đánh giá hiệu quả suy giảm sinh dục của chuột qua các chỉ tiêu: trong lượng cơ thể, trọng lượng tinh hoàn, chỉ số sinh lý, bệnh lý của tinh trùng, chỉ tiêu mô học và lượng hormone testosterone. Chia chuột thành 6 lô: lô chứng (L1) gồm 6 con uống nước cất 2 lần. mỗi lô gồm 5 con uống NV ở các liều 100 mg/kg (L2), 250 mg/kg (L3), 500 mg/kg (L4), 750 mg/kg (L5), 1000 mg/kg (L6) thể trọng chuột (Bảng 1). Chuột thí nghiệm được gây ngạt bằng CO2, tiến hành giải phẫu, thu nhận máu tim tinh hoàn và ống dẫn tinh. Bảng 1: Thiết kế mô hình thí nghiệm dùng thuốc NV Lô chuột (n=6) Liều (10 ml/kg) Lô 1 (Lô chứng) Nước cất Lô 2 NV 100 mg/kg Lô 3 NV 250 mg/kg Lô 4 NV 500 mg/kg Lô 5 NV 750 mg/kg Lô 6 NV 1000 mg/kg Qui trình đánh giá chất lượng tinh trùng Ống dẫn tinh sau khi giải phẫu, rửa sạch bằng PBS và để trong 250 μl dung dịch Ferticult Flushing Medium (Fertipro – Bỉ), tách mô ống dẫn tinh bằng kẹp để thu nhận tinh trùng. Tinh trùng sau khi được thu nhận sẽ tiến hành đánh giá tiêu chí tinh trùng trong vòng 2 giờ. Phương pháp xác định độ di động của tinh trùng Hút 10 μl mẫu tinh dịch trãi trên lame và quan sát khả năng di động của tinh trùng dưới kính hiển vi độ phóng đại x40 [40] theo tiêu chí đánh giá là: tinh trùng di động (tinh trùng vận động thẳng tiến tới và tinh trùng vận động tại chỗ), tinh trùng bất động (tinh trùng nằm im, không vận động). Phương pháp xác định mật độ tinh trùng Tinh dịch được pha loãng với dung dịch NaHCO3 0,5%. Hút 10 μl dung dịch tinh dịch pha loãng và bơm vào mỗi bên buồng đếm hồng cầu có tráng bạc. Số lượng tinh trùng sẽ được đánh giá ở cả 2 buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi độ phóng đại 40X. Tính tổng số và hiệu số tinh trùng giữa 2 lần đếm. Công thức tính mật độ tinh trùng(8): Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Ngoại Khoa 88 C= D Trong đó: C: Mật độ tinh trùng, đơn vị (triệu con/mL). D: Độ pha loãng tinh dịch. N: Số tinh trùng đếm được ở 2 buồng đếm. n: Thể tích của tổng số hàng đã khảo sát cho một lần khảo sát (thể tích tinh dịch nạp vào mỗi buồng đếm là 10 μl). Phương pháp xác định tỉ lệ sống chết tinh trùng(8) Đánh giá tỉ lệ tinh trùng sống/chết, dị dạng của mẫu tinh dịch bằng phương pháp nhuộm Eosin – Nigrosin. Trong mẫu nhuộm, tinh trùng sống có đầu sáng, trắng không bắt màu; tinh trùng chết có đầu bắt màu hồng tím của thuốc nhuộm. Phương pháp mô học tinh hoàn(1) Sử dụng kỹ thuật nhuộm Hematoyline– Eosin (HE) để đánh giá hình thái tinh hoàn. Tinh hoàn sau khi được phẫu thuật, còn nguyên cả vỏ bao, được cố định trong dung dịch Neutral buffered formalin 10% (NBF). Sau khi cố định hơn 24h, tinh hoàn được xử lý qua các bước: vùi paraffin bằng hệ thống xử lý mô Microm STP120, đúc khối paraffin tạo thành các bloc nến chứa mẫu bệnh phẩm, cắt lát bệnh phẩm dày 3 micrimet, trải trên lam kính, nhuộm HE. Xử lý số liệu Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2013, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA và t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances. Được trình bày dưới dạng số liệu thực nghiệm thể hiện bằng số trung bình (M) ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P < 0,05 so với lô chứng. KẾT QUẢ Ảnh hưởng Natri valproate lên trọng lượng chuột Kết quả đánh giá ảnh hưởng của NV lên thể trọng chuột trước và sau khi cho chuột uống thuốc 35 ngày được thể hiện trong biểu đồ 1 ta thấy thể trọng chuột ở các lô trước khi thí nghiệm đồng đều nhau và không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Sau thí nghiệm nhận thấy rằng thể trọng chuột ớ các lô 1, 2, 3, và 4 đều tăng; Tuy nhiên, lô 5 (NV 750 mg/kg) và lô 6 (NV 1000 mg/kg) thể trọng chuột sau thí nghiệm giảm so với lúc đầu. Kết quả cho thấy thể trọng chuột sau thí nghiệm ở lô 2, lô 3, lô 4, lô 5, lô 6 đều đạt ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng (lô 1) và đạt độ tin cậy đến 95% (Hình 1). Hình 1. Thể trọng chuột trước và sau thí nghiệm (g), *P < 0,05 so với lô 1 (lô chứng). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ngoại Khoa 89 Ảnh hưởng Natri valproate lên khối lượng tinh hoàn NV đã làm thay đổi trọng lượng và kích thước tinh hoàn. Trọng lượng và kích thước tinh hoàn cũng giảm dần từ lô 2 đến lô 6. Nhưng ở lô 2 (NV 100 mg/kg) và lô 3 (NV 250 mg/kg) không đạt ý nghĩa thống kê so với lô 1 (lô chứng). Lô 4 (NV 500 mg/kg), lô 5 (NV 750 mg/kg), lô 6 (NV 1000 mg/kg) đạt ý ngĩa thống kê so với lô 1 (lô chứng) đạt độ tin cậy đến 95% (Hình 2). Hình 2. Thể trọng tinh hoàn dưới ảnh hưởng của NV (g), *P<0.05 so với lô 1 (lô chứng) Ảnh hưởng của Natri valproate lên mật độ tinh trùng Hình 3. Ảnh hưởng của Natri valproate lên mật độ tinh trùng, *P<0.05 so với lô 1 (lô chứng) NV đã làm giảm đáng kể mật độ tinh trùng. Cụ thể ở lô chứng mật độ tinh trùng là 27,83 ± 0,28 (triệu con/mL) (lô 1) giảm mạnh xuống còn triệu 0,14 ± 0,05 (triệu con/mL) (lô 5). Tuy nhiên ở lô 6 sử dụng liều 1000 mg/kg thì nhận thấy không có tinh trùng. Các lô 2, lô 3, lô 4, lô 5 đều đạt ý nghĩa thống kê so với lô 1 (lô chứng), với độ tin cậy lên đến 99% (Hình 3). Ảnh hưởng của Natri valproate lên độ di động của tinh trùng Các lô 3 (NV 250 mg/kg), lô 4 (NV 500 mg/kg), lô 5 (NV 750 mg/kg) đều đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (lô 1) với P < 0,05 đạt độ tin cậy 95%. Mặt khác nhận thấy ở lô 5 (NV 750 mg/kg) tinh trùng hoàn toàn không di động, điều đó cho thấy rằng NV ảnh hưởng đến khả năng di động của tinh trùng. Khả năng di động của tinh trùng càng giảm khi cho chuột uống NV ở nồng độ càng cao (Hình 4). Hình 4. Ảnh hưởng của Natri valproate lên khả năng di động của tinh trùng, *P < 0,05 so với lô 1 (lô chứng) Ảnh hưởng của Natri valproate lên tỷ lệ tinh trùng sống-chết Dựa vào Hình 5 cho thấy tỷ lệ tinh trùng sống giảm dần từ lô 1 (nước cất) 48,7 ± 2,3 (%) đến lô 5 (NV 750 mg/kg) 8,1 ± 0,4 (%), đồng thời làm tăng tỷ lệ tinh trùng sống. So với lô 1 (lô chứng uống nước cất) thì lô 3 (250 mg/kg), lô 4 (500 mg/kg), lô 5 (750 mg/kg) đạt ý nghĩa thống kê với P<0,05, đạt độ tin cậy là 95%. Ở lô 2 (NV 100 mg/kg) có lượng tinh trùng còn sống ít hơn so với lô 1 (lô chứng) nhưng không đạt ý nghĩa thống kê P>0,05. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Ngoại Khoa 90 Hình 5. Ảnh hưởng của Natri valproate lên tỉ lệ tinh trùng sống – chết sau 35 ngày thí nghiệm, *P < 0,05 so với lô 1 (lô chứng). Ảnh hưởng của Natri valproate lên mô học tinh hoàn Hình 6. Hình dạng và cấu trúc của ống sinh tinh bên trong mô tinh hoàn ở các lô chuột: lô 1(hình A), lô 2 (hình B), lô 3 (C), lô 4 (D), lô 5 (E), lô 6 (F) sau 35 ngày thí nghiệm trên chuột. Dựa vào hình 6 cho thấy sự thay đổi về hình dạng và cấu trúc của ống sinh tinh bên trong mô tinh hoàn ở các lô chuột sau 35 ngày thí nghiệm trên chuột. Lô uống NV 100 mg/kg (hình B) và NV 200 mg/kg (hình C) cho thấy hình thái tinh hoàn và ống sinh tinh không khác biệt so với lô chứng (hình A). Tuy nhiên đã bắt đầu có sự giảm tinh trùng bên trong lòng ống sinh tinh, tế bào mầm sinh dục, mô ống sinh tinh có các tế bào sertoli bao quanh các tinh bào tạo nên, tế bào leydig liên kết giữa các ống dẫn tinh (hình C). Lô uống NV 500 mg/kg (lô 4) cho thấy hình thái ống sinh tinh bắt đầu co lại và biến dạng. Tuy nhiên, trong lòng ống sinh tinh vẫn có tinh trùng, tế bào kẽ leydig, tế bào sertoli nhưng số lượng ít và suy giảm hơn so với lô chứng (hình A), Đối với lô uống NV 750 mg/kg (hình E) và lô uống NV 1000 mg/kg (hình F) cho thấy hình thái ống sinh tinh biến dạng và cấu trúc bên trong ống sinh tinh dường như bị phá hủy hoàn toàn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ngoại Khoa 91 so với lô chứng (hình A). Tinh trùng không còn xuất hiện bên trong lòng ống sinh tinh, các tế bào ống sinh tinh bên trong tinh hoàn trở nên rời rạc thiếu liên kết do sự suy giảm tế bào Leydig. BÀN LUẬN NV là một thuốc chống động kinh đa cơ chế, được sử dụng rất nhiều để điều trị các cơn động kinh lại có những tác dụng không mong muốn trên chức năng sinh dục do ức chế trục dưới đồi- tuyến yên(6). Nghiên cứu của Soliman và cộng sự (1999) cho thấy sử dụng NV làm giảm nồng độ Testosteron, FSH và LH máu(7). Khi nồng độ Testosteron máu giảm, quá trình sinh tinh trùng bị giảm, dẫn đến số lượng tinh trùng giảm, trọng lượng cơ quan sinh sản cũng giảm(4). NV còn ảnh hưởng đến tế bào Sertoli làm ảnh hưởng tới quá trình sinh tinh trùng, ảnh hưởng chức năng vận chuyển và lưu trữ tinh trùng ở mào tinh, giảm khả năng di động của tinh trùng(3). Như vậy, có thể thấy NV gây suy sinh dục theo cơ chế tương tự như cơ chế suy sinh dục ở nam giới. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng NV như một tác nhân để gây suy sinh dục cho chuột gần giống với bệnh suy sinh dục muộn theo ở người. Từ các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy NV ở mức liều 500 mg/kg, 750 mg/kg đều đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất. NV làm giảm các chỉ số sinh sản ở chuột như giảm phần trăm tinh trùng di động nhanh, tăng phần trăm tinh trùng không di động, giảm số lượng tinh trùng, giảm tỷ lệ sống của tinh trùng, giảm trọng lượng các cơ quan sinh sản và giảm các tế bào biểu mô bên trong mô tinh hoàn sau khi cho chuột uống thuốc 35 ngày. Như vậy, chúng tôi nhận thấy việc sử dụng NV gây suy sinh dục ở chuột trong nghiên cứu này là phù hợp với cơ chế gây suy sinh dục muộn ở nam giới. KẾT LUẬN NV gây giảm thể trọng chuột, giảm mật độ tinh trùng, giảm tỷ lệ tinh trùng sống, giảm tỷ lệ tinh trùng. Khi cho chuột uống NV ở các liều cao 500 mg/kg, 750 mg/kg, 1000 mg/kg thì cấu trúc biểu mô bên trong tinh hoàn bị tổn thương. Từ đó chúng tôi kết luận rằng NV gây ảnh hưởng đến chức năng sinh dục ở chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino. KIẾN NGHỊ Để rõ hơn tác dụng của NV chức năng sinh dục và sinh sản, Chúng tôi đề nghị tiến hành các thí nghiệm đánh giá hình thái và DNA tinh trùng sau 35 ngày uống thuốc. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ y tế (2016). “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành giải phẫu bệnh, tế bào học”. Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 2. Đào Thu Hồng (2018). “Nghiên cứu xây dựng mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ bằng natri valproat và tác dụng cải thiện hành vi của môi trường phong phú trên chuột nhắt trắng”. Luận án Tiến sĩ y học, Học viện Quân Y. 3. Kaufman JM (2014). “Mortality associated to late-onset hypogonadism: Reasons not to treat with testosterone?”. J Clin Endocrinol Metab, 99:1161–3. 4. Nguyễn Thị Thùy (2011). “Bước đầu đánh giá tác dụng của rễ bá bệnh (Eurycoma longifolia J.)”. Khóa luận cử nhân dược sĩ, Trường Đại học Y Hà Nội. 5. Schreiber G, Ziemer M (2008). “The aging male - diagnosis and therapy of late-onset hypogonadism”. The Authors Journal compilation, 6:273-280. 6. Shier D, Butler J, Lewis R (2004). “Human Anatomy ang Physiology. 10th ed”. Mc Graw-Hill Higher Education. New York. 7. Soliman GA, Abla ABD (1999). “Effects of antiepileptic drugs carbamazepine and sodium valproate on fertility of male rats”. Dtsch Tierarztl Wochenschr, 106:110-113. 8. WHO (2010). “WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen”. World Health Organization. 9. Krogenaes AK, Taubøll E, Stien A et al (2008). “Valproate affects reproductive endocrine function, testis diameter and some semen variables in non-epileptic adolescent goat bucks”. Theriogenology, 70(1):15-26. 10. Webber MP, Hauser WA, Ottman R, Annegers JF (1986). “Fertility in persons with epilepsy: 1935–1974”. Epilepsia; 27: 746–52. Ngày nhận bài báo: 08/11/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/12/2018 Ngày bài báo được đăng: 10/03/2019