Đánh dấu đồng vị ổn định bằng axit amin trong nghiên cứu protein của vi khuẩn gây bệnh thương hàn salmonella enterica typhymurium lt2

KHCN 2 (31) - 2014 118 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG 1. TỔNG QUAN Vi khuẩn gây bệnh thương hàn có tên khoa học Salmonella enterica Typhimurium là một vi khuẩn Gram âm, chúng là nguyên nhân gây nên bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột, nhiễm trùng huyết, chúng có khả năng đáp ứng cao và gây bệnh cho cả người và động vật. Salmonella đi vào cơ thể qua đường miệng bởi thức ăn, nước uống nhiễm khuẩn và thích ứng với môi trường có độ pH thấp ở dạ dày. Proteomic là một thuật ngữ chỉ lĩnh vực nghiên cứu rộng lớn về protein đặc biệt về cấu trúc và chức năng, nó được phát triển trong khoảng 20 năm trở lại đây. Phương pháp khối phổ (mass spectrometry- MS), là một kỹ thuật dùng để đo đạc tỷ lệ khối lượng trên điện tích của ion (mass- to-charge ratio - m/z), dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế để cho ra phổ khối lượng. MS-dựa trên proteomics đang ngày càng trở thành công cụ mạnh mẽ và cần thiết cho nghiên cứu cơ bản như nghiên cứu tương tác giữa protein - protein, sửa đổi sau phiên mã, biểu hiện của protein - mối quan hệ với mARN; cho việc tìm ra nguyên nhân bệnh tật và chuẩn đoán; cho việc phát triển dược phẩm. Trong một vài phương pháp đánh dấu quá trình trao đổi chất, đánh dấu đồng vị ổn định bằng axit amin trong nuôi cấy tế bào (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell Culture - SILAC) nổi lên là một phương pháp đơn giản, chính xác để biểu hiện protein bằng việc đưa vào đồng vị ổn định tới tất cả các protein tế bào thông qua axit amin, thường là lysine and arginine. Một quần thể tế bào được phát triển trong môi trường chứa axit amin tự nhiên (SILAC- nhẹ), một quần thể khác được phát triển trong môi trường chứa axit amin đánh dấu với đồng vị (không phóng xạ) nặng ổn định (SILAC-nặng). Môi trường chứa arginine đánh dấu với sáu nguyên tử cacbon 13 (13C) thay cho cacbon 12 (12C). Khi các tế bào phát triển trong môi trường này, chúng hợp nhất axit amin nặng tới peptide dẫn đến sự thay đổi lượng so sánh với peptide tương ứng nhẹ (6 Da trong trường hợp của ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ ỔN ĐỊNH BẰNG AXIT AMIN TRONG NGHIÊN CỨU PROTEIN CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH THƯƠNG HÀN SALMONELLA ENTERICA TYPHYMURIUM LT2 TrầnTrung Kiên1, Lin Guo2 1Trường Đại học Hùng Vương 2College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, China TÓM TẮT Chúng tôi sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị trao đổi chất bởi axit amin, sau đó dựa trên phân tích so sánh định lượng proteomic của chủng Salmonella enterica Typhymurium LT2 đột biến gen rstB với chủng tự nhiên dưới điều kiện không đầy đủ Mg của môi trường nuôi cấy SILAC. Kết quả proteomic chỉ ra rằng, protein giảm điều hòa trong chủng đột biến gen rstB là gấp hai lần so với protein tăng điều hòa. Phân tích các con đường trao đổi chất và nhóm chức năng cũng chỉ ra điều này. Mặt khác phân tích biểu hiện protein của những protein thay đổi thấy rằng một số protein liên quan đến tổng hợp và vận chuyển sắt là giảm điều hòa đáng kể. Từ những kết quả này, chúng tôi dự đoán rằng chủng đột biến gen rstB là giảm độc tính. Từ khóa: Vi khuẩn thương hàn, Salmonella enterica Typhymurium LT2, phổ khối lượng, đánh dấu đồng vị, proteomic KHCN 2 (31) - 2014 119 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG 13C6-Arg), nhưng không thay đổi thành phần hóa học khác. Các tế bào sau khi được trộn lẫn sẽ được định lượng proteomic, mỗi peptide xuất hiện là một cặp trong quang phổ lượng - peptide với lượng thấp chứa axit amin nhẹ và peptide với lượng cao chứa axit amin nặng, tương ứng với các quần thể tế bào nuôi cấy được đánh dấu. Căn cứ vào tỷ lệ peptide được xác định bởi MS để thấy được sự thay đổi proteome, so sánh mức độ protein liên quan giữa các trạng thái tế bào khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện định lượng protein, tập trung trên những protein thay đổi đáng kể của Salmonella enterica Typhimurium LT2 (S.Typhimurium LT2) vi khuẩn thương hàn LT2 dưới điều kiện kích hoạt hệ thống PhoP/PhoQ (ở nồng độ Mg thấp). Dựa trên kỹ thuật đánh dấu protein, một nồng độ tối thiểu của Mg là được sử dụng để đánh dấu đồng vị axit amin trong nuôi cấy tế bào. Tiếp theo chúng tôi sử dụng sắc ký lỏng cao áp - bộ đôi phổ khối lượng (LC- MS/MS) - dựa trên proteomic để thực hiện phân tích so sánh định lượng protein của chủng đột biến gen rstB với chủng tự nhiên LT2. Vi khuẩn được nuôi cấy dưới điều kiện nồng độ Mg tối thiểu, điều kiện này đã được chỉ ra gần giống với môi trường mà vi khuẩn gặp phải trong đại thực bào [4]. Chúng tôi áp dụng thành công với hiệu suất cao kỹ thuật đánh dấu ổn định đồng vị bằng axit amin và phương pháp khối phổ, dữ liệu chỉ ra một quan sát toàn diện về độ phong phú của protein của chủng đột biến rstB gen so với chủng tự nhiên. Từ dữ liệu thu được, chúng tôi phân tích các con đường trao đổi chất, nhóm chức năng, sự tăng giảm của các protein điều hòa. Kết quả về sự thay đổi của các protein quan tâm được xác nhận bằng real-time PCR và một số biểu hiện kiểu hình. 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng vi khuẩn, môi trường nuôi cấy và điều kiện phát triển. Vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu này là S.Typhimurium LT2 (vi khuẩn thương hàn chủng LT2) và chủng đột biến gen rstB. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Luria - Bertani (LB) (10g/l NaCl, 5g/l Yeast extract, 10g/l Tryptone) và môi trường tối thiểu N (5mM KCl, 7.5mM (NH4)2SO4, 0.5mM K2SO4, 1mM KH2PO4, 0.1M Tris-base, 38mM glycerol, pH 7.4). Môi trường tối thiểu N-SILAC được bổ sung với 10 µM MgCl2 and 40g/L lysine, 40g/L arginine với ligh [13C615N4]-L-arginine và heavy [13C615N2]- L-lysine. Vi khuẩn được nuôi cấy ở điều kiện 37oC, với lắc đều trong 9h. 2.2. Chuẩn bị mẫu protein và phân giải Peptide Chuẩn bị mẫu protein: Vi khuẩn sau khi nuôi cấy 9h trong môi trường nuôi cấy SILAC, được thu hoạch và li tâm với tốc độ 10000g/phút trong 15 phút ở 4oC thu cặn, sau đó được làm tan trong dung dịch chứa 5mM Tris-HCl, 5mM EDTA, pH 7.5. Dịch tế bào sau đó được phá vỡ bằng sóng siêu âm (altra- sonication), li tâm loại bỏ những mảnh vỡ tế bào còn lại, dịch chiết protein thô được đo bởi phương pháp Bradford và trộn theo tỷ lệ 1:1 của đồng vị nặng - nhẹ và bảo quản ở -80oC. Hình 1: Các bước thực hiện trong nghiên cứu proteomic của vi khuẩn gây bệnh thương hàn KHCN 2 (31) - 2014 120 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Phân giải peptide: Protein thu được từ nuôi cấy SILAC được khử, alkyl hóa, thuỷ phân bằng trypsin và loại muối (Hình 1). Sau cùng peptide được phân tách bởi sắc ký trao đổi ion (Strong Cation Exchange chromatography-SCX). Tiếp theo các phân đoạn peptide được loại muối bởi đầu micropipet Ziptip C18 và hút chân không đến khô trước khi nhận diện peptide bởi MS 2.3. Xác định protein và làm giàu dữ liệu Phổ lượng được thực hiện bằng với cặp đôi thiết bị QSTAR-Eliter với hệ thống nano MDLC. Dữ liệu thu được từ thiết bị đo được xử lý tiếp với phần mền Mascot Daemon (version 2.3, Matrix Science, London, U.K.) để lựa chọn các đỉnh phù hợp dựa trên máy chủ MASCOT dựa trên kho dữ liệu của vi khuẩn S.Typhimurium được tải xuống từ Uniprot Web ( Và các thông số phù hợp cho việc phân tích định lượng được thiết lập cho phần mền xử lý. Sau khi dữ liệu proteomic được tạo ra, công việc tiếp theo là phân loại các nhóm chức năng của protein bằng việc chuyển dữ liệu thu được đến kho dữ liệu của máy chủ để tự động phân loại thông qua DAVID BIOINFORMATICS Resources 6.7 ( và các con đường trao đổi chất thông qua KEGG PATHWAY ( Và cuối cùng những protein quan tâm được phân tích và xác nhận kết quả một lần nữa thông qua real- time PCR. Toàn bộ quy trình được mô tả qua hình 1. 2.4. Định lượng real - time PCR (qPCR) Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được tách chiết RNA, sau đó chuỗi đơn cDNA được tổng hợp. qPCR được thực hiện với CFX Manager Version 3.0 với supermix SYBR green. dnaK được sử dụng như gen tiêu chuẩn (internal control), thí nghiệm được lặp lại 3 lần với mỗi mẫu. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tổng quan dữ liệu proteomics Proteomics được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật với mục đích nhận biết biểu hiện protein của sinh bệnh học dưới những biến đổi của môi trường. Để nghiên cứu sự thay đổi pro- tein của chủng S.Typhimurium LT2 đột biến gen rstB so sánh với S.Typhimurium LT2 chủng tự nhiên, mẫu protein được chuẩn bị bởi phương pháp đánh dấu đồng vị ổn định bởi axit amin với 9h nuôi cấy trong môi trường tối thiểu N- SILAC, nồng độ Mg thấp. Tiếp theo peptide được tách bởi sắc ký lỏng (SCX) và xác định bởi phổ lượng MS/MS và cuối cùng định lượng bởi phần mền Mascot Daemon. Thí nghiệm SILAC và định lượng proteomics được thực hiện hai lần. Kết quả định lượng xác định tổng số 911 protein, chiếm khoảng 20% tổng số protein đã được dự đoán trong Salmonella. Phân tích tỷ lệ protein giữa chủng đột biến gen rstB với chủng tự nhiên (∆RstB/WT) Hình 2: Kết quả định lượng MS với các tỷ lệ protein được chỉ ra. Trục tung tương ứng số lượng protein, trục hoành tương ứng với khoảng thay đổi của dữ liệu định lượng. KHCN 2 (31) - 2014 121 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG thấy rằng 55,92% protein là không thay đổi với tỷ lệ từ 0,769 đến 1,3; 13,93% là tăng điều hòa (up-regulated) với tỷ lệ trên 1,3; 30,15% là giảm điều hòa (down-regulated) với tỷ lệ nhỏ hơn 0,769 (hình 2). Như vậy có thể thấy rằng protein giảm điều hòa là cao hơn khoảng hai lần so với protein tăng điều hòa. Hầu hết những protein tăng điều hòa là những protein liên quan đến quá trình trao đổi chất, nó có thể cần thiết cho sự đền bù khi phải trải qua điều kiện môi trường không thuận lợi. Protein giảm điều hòa bao gồm nhiều protein liên quan đến độc tính của vi khuẩn, tích lũy và vận chuyển kim loại như Mg, Fe, P 3.2. Phân tích các con đường trao đổi chất và nhóm chức năng từ dữ liệu proteomics Để xác định ảnh hưởng của đột biến gen rstB ở vi khuẩn thương hàn LT2 dưới điều kiện nuôi cấy với nồng độ Mg thấp ở pha nuôi cấy muộn (9h) (late log phase) trên biểu hiện protein thông qua các con đường trao đổi chất và nhóm chức năng, chúng tôi thực hiện “làm giàu” dữ liệu thông qua phân tích Gene Ontology (GO). Kết quả chỉ ra rằng với hơn 900 protein được phân chia vào 55 con đường trao đổi chất. Trong đó duy nhất 1 con đường trao đổi chất là tăng điều hòa đó là trao đổi selenoamino acid, 5 con đường trao đổi chất là giảm điều hòa đó là phosphoryl hóa oxy hóa, trao đổi nitơ, trao đổi Thiamine (Vitamin B1), quá trình tổng hợp, vận chuyển và điều hòa sắt nội bào. Cũng thông qua việc phân tích dữ liệu này, các protein được phân chia vào 106, 18 và 36 nhóm chức năng cho protein tổng số, protein tăng điều hòa và protein giảm điều hòa, tương ứng. Cũng giống như phân tích tỷ lệ protein ở trên, phân tích các nhóm chức năng có thể thấy rằng số protein giảm điều hòa (down-regulated) được phân chia vào 36 nhóm chức năng, gấp đôi số nhóm chức năng của các protein tăng điều hòa (up-regulated) (18 nhóm). Dựa trên thông tin và phân loại dữ liệu này, chúng tôi dự đoán rằng chủng đột biến là giảm độc tố trong điều kiện thí nghiệm. 3.3. Protein điều hòa tổng hợp, vận chuyển và cân bằng sắt giảm dưới điều kiện không đầy đủ Mg của môi trường nuôi cấy SILAC Protein vận chuyển sắt (siderophore) được biết với vai trò quan trọng trong biểu hiện của độc lực vi khuẩn và hình thành màng sinh học (biofilm). Protein vận chuyển sắt- siderophore kiểm soát các gen khác nhau để tích lũy và vận chuyển sắt, sắt là cần thiết cho sự phát triển, bảo vệ hoạt động của tế bào. Kết quả LC-MS/MS chỉ ra bốn protein entrobactin gồm EntA, EntB, EntE, EntF là giảm điều hòa và các protein cho cân bằng sắt nội môi như IroB, FepA, FepB, FhuA, FhuE, Fes, NuoB, NuoC, NuoF, NuoG, IscS, IscR cũng giảm điều hòa (Bảng 1). Để kiểm tra có hay không điều hòa tổng hợp của protein vận chuyển sắt-siderophore và các protein cho cân bằng sắt nội môi là ảnh hưởng bởi việc xóa gen rstB, chúng tôi thực hiện thiết lập plasmid pUHE21-2lacIq mang gen rstB và chuyển vào chủng đột biến gen rstB, RstB protein là được biểu hiện (del rstB.pRstB) với IPTG 0.4mM. Sau đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm kiểm tra với real-time PCR, kết quả thấy rằng chủng đột biến mang plasmid chứa phần bù của chúng (pRstB plasmid) là trở lại vai trò của RstB protein. Trong chủng đột biến rstB, vai trò của RstB bị loại bỏ, do đó các protein liên quan đến tổng hợp của nhóm protein vận chuyển sắt - siderophore và protein cân bằng sắt nội môi là giảm điều hòa. Chủng đột biến mang plasmid pRstB, vai trò của RstB protein được thể hiện, dẫn đến làm tăng mức độ sao chép của những gen này tương tự trong chủng tự nhiên LT2 (Bảng 1). Kết quả này chỉ ra rằng RstB là kích hoạt với những protein điều hòa tổng hợp vận chuyển sắt - siderophore và protein cân bằng sắt nội môi. KHCN 2 (31) - 2014 122 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Bảng 1. Một số protein liên quan đến điều hòa tổng hợp siderophore và sắt nội bào được chỉ ra bởi phổ lượng MS và kết quả xác nhận bằng thí nghiệm qPCR. MS qPCR Tên Protein Tỷ lệ (Nhẹ/Nặng) ∆RstB (số lần biểu hiện) qRstB (số lần biểu hiện) Mẫu đối chứng Liên quan đến tổng hợp của siderophore và sắt nội bào EntA 0,53 0,79 ± 0,02 1,28 ± 0,05 1,0 ± 0,03 EntB 0,84 0,77 ± 0,04 1,41 ± 0,06 1,0 ± 0,03 EntE 0,49 0,82 ± 0,02 1,5 ± 0,08 1,0 ± 0,03 EntF 0,92 0,72 ± 0,03 1,42 ± 0,06 1,0 ± 0,03 Fur 0,62 0,58 ± 0,02 0,84 ± 0,06 1,0 ± 0,03 Fes 0,71 0,71 ± 0,04 1,06 ± 0,05 1 ± 0,06 IroB 0,65 0,95 ± 0,04 1,28 ± 0,06 1 ± 0,06 FepA 0,55 0,91 ± 0,03 1,83 ± 0,11 1 ± 0,04 FepB 1,22 0,72 ± 0,02 1,08 ± 0,09 1,0 ± 0,05 FhuA 0,8 0,73 ± 0,04 1,06 ± 0,05 1,0 ± 0,03 FhuE 0,26 0,70 ± 0,01 1,01 ± 0,07 1,0 ± 0,02 NuoC 0,46 0,88 ± 0,04 1,31 ± 0,09 1,0 ± 0,02 NuoF 1,17 0,74 ± 0,02 1,33 ± 0,1 1,0 ± 0,07 NuoG 0,48 0,79 ± 0,03 1,39 ± ,01 1,0 ± 0,03 NuoB 0,93 0,72 ± 0,03 1,0 ± 0,07 1,0 ± 0,07 IscR 0,45 0,47 ± 0,01 0,82 ± 0,06 1,0 ± 0,04 IscS 0,6 0,63 ± 0,02 1,48 ± 0,1 1,0 ± 0,04 Nhẹ là mẫu đột biến cần kiểm tra được đánh dấu đồng vị với SILAC nhẹ, nặng là mẫu đối chứng (chủng tự nhiên) được đánh dấu với SILAC nặng. ∆RstB là chủng đột biến gen rstB, qRstB là chủng đột biến gen chứa plasmid mang gen rstB. Giá trị ±SEM sai số chuẩn của số lần lặp lại thí nghiệm. Fur a protein kiểm soát nồng độ sắt trong tế bào, khi nồng độ sắt ngoài môi trường cao Fur ức chế với những protein liên kết với sắt nội môi để giảm sự hấp thụ và vận chuyển sắt. Kết quả MS/MS của chúng tôi chỉ ra rằng Fur là giảm điều hòa và kết quả real-time PCR cũng chỉ ra rằng chủng ∆rstB.pRstB hoàn lại không đầy đủ. Điều này có nghĩa là RstB kiểm soát không hoàn toàn với Fur protein. 4. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị trong quá trình trao đổi chất bằng axit amin, sau đó thực hiện so sánh định lượng proteomic bởi phổ lượng LC-MS/MS của chủng S.Typhimurium LT2 đột biến gen rstB và chủng S.Typhimurium LT2 tự nhiên phát triển dưới điều kiện thiếu Mg ở pha nuôi cấy muộn (9h nuôi cấy) thông qua nuôi cấy SILAC. Dữ liệu proteomic thu được từ phổ lượng thông qua việc phân tích các con đường trao đổi chất, nhóm chức năng có thể dự đoán được độc tính của vi khuẩn. Mặt khác thông qua việc lựa chọn những protein thay đổi (tăng điều hòa, giảm điều hòa) để đánh giá biểu hiện protein. Trong những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu biểu hiện protein thông qua những thay đổi của protein khác và ảnh hưởng của chúng đến sinh bệnh học vi khuẩn. KHCN 2 (31) - 2014 123 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Tài liệu tham khảo 1. Boumediene Soufi, et al. (2010). “Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) Applied to Quantitative Proteomics of Bacillus subtilis.” J Proteome Res 9(No. 7); 3638-3646. 2. Hammer, N. D. and E. P. Skaar (2011). “Molecular mechanisms of Staphylococcus aureus iron acquisition.” Annu Rev Microbiol 65: 129-147. 3. Haraga, A., et al. (2008). “Salmonellae interplay with host cells.” Nat Rev Microbiol 6(1): 53-66. 4. Hebrard, M., et al. (2011). “The challenge of relating gene expression to the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.” Curr Opin Biotechnol 22(2): 200-210. 5. Huang da, W., et al. (2009). “Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.” Nucleic Acids Res 37(1): 1-13. 6. Mann, M. (2006). “Functional and quantitative proteomics using SILAC.” Nat Rev Mol Cell Biol Vol 7: 952 - 958. 7. Munday, D. C., et al. (2012). “Using SILAC and quantitative proteomics to investigate the interactions between viral and host proteomes.” Proteomics 12(4-5): 666-672. 8. Ong, S. E. and M. Mann (2006). “Protocol: A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).” Nat Protocol 1(6): 2650-2660. 9. Oudenhove, L. and B. Devreese (2013). “A review on recent developments in mass spectrometry instrumentation and quantitative tools advancing bacterial proteomics.” Applied Microbiology and Biotechnology 97(11): 4749-4762. 10. Saha, R., et al. (2013). “Microbial siderophores: a mini review.” J Basic Microbiol 53(4): 303-317. 11. Steen, H. and M. Mann (2004). “The ABC’s (and XYZ’s) of peptide sequencing.” Nat Rev Mol Cell Biol 5(9): 699-711. 12. Troxell, B., et al. (2011). “The Fur regulon in anaerobically grown Salmonella enterica sv. Typhimurium: identification of new Fur targets.” BMC Microbiol 11: 236. 13. Yu, J. L. and L. Guo (2011). “Quantitative proteomic analysis of Salmonella enterica serovar Typhimurium under PhoP/PhoQ activation conditions.” J. Proteome Res 10(7): 2992-3002. SUMMARY STABLE ISOTOPE LABELING BY AMINO ACID IN CELL CULTURE FOR PROTEOMIC RESEACH OF SALMONELLA ENTERICA TYPHYMURIUM LT2 Tran Trung Kien1, Lin Guo2 1Hung Vuong University, 2College of Life Science, Wuhan University, Wuhan, China We use a SILAC (stable isotope labeling by amino acid in cell culture) - base a proteomic quantitative comparative analysis by LC-MS/MS of Salmonella enterica Typhymurium LT2 wild-type strain versus rstB mutant strain under the magnesium limitation of the SILAC culture medium. Proteomics result indicates that proteins down-regulated were twofold higher than up-regulated in the mutant strain. Metabolic pathways and functional group analysis also showed the same result. On the other hand, protein expression analysis of proteins alters shown that proteins relative to the synthesis and transport of iron were down-regulated. The from these findings predicts that mutant strain were virulence decrease. Keywords: Salmonella enterica Typhymurium LT2, SILAC, proteomic, LC-MS/MS, protein expression.