Đặc điểm lâm sàng và di truyền học phân tử trong bạch cầu cấp dòng tủy có đa bội thể nhiểm sắc thể 8 ở trẻ em

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Chuyên Đề Nhi Khoa 96 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ DI TRUYỀN HỌC PHÂN TỬ TRONG BẠCH CẦU CẤP DỊNG TỦY CĨ ĐA BỘI THỂ NHIỂM SẮC THỂ 8 Ở TRẺ EM. Đỗ Hồng Cúc*, Nguyễn Minh Tuấn** TĨM TẮT Mục tiêu: Xác định đặc điểm lâm sàng và di truyền học phân tử trong bạch cầu cấp dịng tủy (BCCDT) ở trẻ em cĩ đa bội thể nhiểm sắc thể 8 (trisomy 8). Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu hồi cứu, mơ tả hàng loạt ca. Kết quả: 180 bệnh nhân từ (0 đến 16 tuổi) được chuẩn đốn bạch cầu cấp dịng tủy (BCCDT) từ tháng 1/2005 đến tháng 5/2012. Xét nghiệm di truyền học bao gồm nhiễm sắc thể đồ, kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang được thực hiện trên tất cả các bệnh nhân thu được 19/180 (10,6%) bệnh nhi BCCDT cĩ tam bội của nhiễm sắc thể 8. Các bệnh nhi này cĩ các đặc điểm sau: tuổi trung bình mắc bệnh là 7,6 ± 3,2 tuổi; tỉ lệ nam/nữ là 1/0,9. Thường gặp nhất các triệu chứng lâm sàng là sốt, thiếu máu, xuất huyết và gan lách to. BCCDT cĩ +8 gặp nhiều nhất là thể bệnh M5 gần 1/3 trường hợp (31,6%), kế đến là M2 chiếm 1/5 trường hợp (21,1%). Về đặc điểm di truyền học phân tử, hơn ½ trường hợp (52,6%) cĩ ít nhất 1 bất thường nhiễm sắc thể khác ngồi trisomy 8, trong đĩ, complex karyotype (là bất thường ≥ 3 NST khác nhau trong cùng 1 quần thể tế bào khảo sát) chiếm 15,8%. Tất cả 19 bệnh nhân này đều được thực hiện xét nghiệm đa hình đơn nucleotide ghi nhận thêm các đột biến mất đoạn nhỏ trên 11 trường hợp (57,9%) và 4 trường hợp (21,1%) cĩ bất thường nội tại nhiễm sắc thể “loss of heterozygosity” (hoặc homozygous, hmz). Kết quả của giải trình tự gen thế hệ mới (next generation sequencing) vùng gen exome (whole exome sequencing) cho thấy tất cả các trường hợp đều cĩ ít nhất 1 trong các đột biến sau: ASXL1, CEBPA, IDH2, KIT, KRAS, RUNX1,TET2, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, FLT3 và NRAS; trong đĩ, 14/19 ca (73,7%) tìm thấy ≥ 2 đột biến kể trên. Kết luận: Bạch cầu cấp dịng tủy với trisomy 8 ở trẻ em chiếm khoảng 10%, thường gặp là thể M5 và M2. Bệnh thường kết hợp với nhiều bất thường NST và đột biến gen khác nhau ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh nên cần thực hiện các phương pháp di truyền học sinh học phân tử để xác định chính xác tiên lượng bệnh. Từ khĩa: Bạch cầu cấp dịng tủy trẻ em, nhiễm sắc thể đồ, kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang, đa hình đơn nucleotide, giải trình tự gen thế hệ mới vùng gen exome. ABSTRACT CLINICAL, CYTOGENETIC AND MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF PEDIATRIC ACUTE MYELOID LEUKEMIA WITH TRISOMY 8 Do Hoang Cuc, Nguyen Minh Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 22 - No 5- 2018: 96 – 104. Objectives: To determine the clinical, cytogenetic and molecular genetic characteristics in pediatric acute myeloid leukemia (AML) with trisomy 8. Methods: Retrospective descriptive study. Results: 180 patients (0 to 16 years) were diagnosed with AML from January 2005 to May 2012. Cytogenetic testing including karyotype, fluorescence in situ hybridization was performed in all patients receiving * Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch. ** Bệnh viện Nhi Đồng 1-TPHCM Tác giả liên lạc: ThS.BS.Đỗ Hồng Cúc ĐT: 0918684042 Email: dohoangcuc@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nhi Khoa 97 19/180 (10.6%) pediatric AMLs with trisomy 8. These pediatric AMLs have the following characteristics: mean age at diagnosis was 7.6 ± 3.2 years; the ratio of male/female was 1/0.9. The most common clinical symptoms were fever, anemia, hemorrhage, and hepato/splenomegaly. The most common type of AML with +8 was M5 in nearly 1/3 of cases (31.6%), followed by M2 accounted for 1/5 of cases (21.1%). In terms of molecular genetics, more than half (52.6%) had at least one chromosomal abnormality other than trisomy 8; in which. complex karyotype (≥3 chromosome aberrations in the same clone) accounted for 15.8%. All 19 of these patients received a single nucleotide polymorphism (SNP) array, in which, 11 cases (57.9%) were detected other microdeletions and 4 cases (21.1%) had chromosome "loss of heterozygosis" (or homozygous, hmz). The results of the whole exome sequencing showed that all cases have at least one of the following mutations: ASXL1, CEBPA, IDH2, KIT, KRAS, RUNX1, TET2, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, FLT3, and NRAS; Of these, 14/19 cases (73.7%) with ≥ 2 coexisting mutations in the list above. Conclusions: The frequency of trisomy 8 in pediatric AML in this study was approximately 10%, the higher frequency of FAB M5 and M2 have been found. It is often associated with a variety of chromosomal abnormalities and genetic mutations that affect the prognosis of the disease. Therefore, cytogenetic and molecular genetics methods should be explored in AML with +8 to accurately determine disease prognosis. Keywords: pediatric acute myeloid leukemia, chromosomes, fluorescence in situ hybridization, single nucleotide polymorphism array, whole exome sequencing. ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch cầu cấp dịng tủy (BCCDT) là tăng sinh bất thường và vơ hạn của các tế bào non ác tính đầu dịng thuộc hệ tạo máu dịng tủy. Ở trẻ em, BCCDT chiếm 15-20% trên tổng số bệnh lý máu ác tính(5,24).Đa bội thể nhiểm sắc thể số 8 (trisomy 8, +8) là bất thường về số lượng nhiễm sắc thể (NST) thường gặp nhất trong BCCDT(32,35) và chiếm khoảng 10% đến 23%(3,9,21) trên tổng số bệnh nhân BCCDT. Trong đĩ, chỉ cĩ gần 1/3 trường hợp cĩ +8 là bất thường NST duy nhất (trisomy 8 alone)(21,37). Diễn tiến và tiên lượng BCCDT với +8 ở trẻ em vẫn chưa rõ ràng phụ thuộc vào các bất thường NST/đột biến kèm theo(17,34), một số nghiên cứu ghi nhận là tiên lượng xấu(8,10), trong khi đa số các nghiên cứu khác thì chứng minh là BCCDT cĩ +8 thì tiên lượng trung bình(4,11,14). Ngồi ra, một số giả thuyết cho rằng +8 được xem như khơng đủ để gây ra BCCDT cần kết hợp với các yếu tố di truyền học phận tử bất thường khác(29). Vì vậy, việc khảo sát rõ hơn về các đặc điểm của bệnh nhi BCCDT cĩ +8 và kết hợp chẩn đốn tryền học phân tử gĩp phần vào quyết định điều trị và tiên lượng là cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát Khảo sát các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và di truyền học phân tử trong bạch cầu cấp dịng tủy (BCCDT) ở trẻ em cĩ đa bội thể nhiểm sắc thể 8 (trisomy 8) từ tháng 1/2005 đến tháng 5/2012. Mục tiêu cụ thể Xác định tỉ lệ các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và phân loại các thể bệnh của bệnh nhi được chẩn đốn bạch cầu cấp dịng tủy cĩ trisomy 8. Xác định tỉ lệ các đặc điểm di truyền học phân tử trên bệnh nhi bạch cầu cấp dịng cĩ trisomy 8, với các phương pháp sử dụng bao gồm: nhiễm sắc thể đồ, kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang, đa hình đơn nucleotide, giải trình tự gen thế hệ mới vùng gen exome. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu mơ tả hàng loạt ca. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Chuyên Đề Nhi Khoa 98 Đối tượng nghiên cứu Tất cả bệnh nhi ≤ 16 tuổi được chẩn đốn bạch cầu cấp dịng tủy cĩ trisomy 8. Sơ lược các kỹ thuật di truyền học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu Nhiễm sắc thể đồ (karyotype) Để xác định và đánh giá kích thước, hình dạng và số lượng nhiễm sắc thể trong cùng 1 tế bào, kết quả được khảo sát trên 20 tế bào thời kỳ phân bào. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (fluorescence in situ hybridization, FISH) Khảo sát bất thường di truyền trên tế bào khơng phân bào, cách thực hiện là mạch đơi DNA của tế bào và đoạn dị sẽ được tách ra bằng nhiệt độ và lai hĩa với nhau; sau đĩ rửa đi những đoạn dị thừa/lai hĩa khơng đặc hiệu; nhuộm nhân bằng DAPI và khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sĩng phù hợp trên 200 tế bào. Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism array, SNP-array) Khảo sát tồn bộ NST, kỹ thuật dựa vào DNA microarray (850K, Affmetrix), các đoạn DNA được cắt nhỏ ra cho lai với những đoạn dị trong thư viện DNA đã được sắp xếp theo matrix. Giải trình tự gen thế hệ mới vùng gen exome (whole exome sequencing, WES) Xác định trình tự các nucleotide của phân tử DNA, chỉ giải mã các vùng gen exome (gen dịch mã hay gen biểu hiện). Kỹ thuật sử dụng máy giải trình tự gen Illumina MiSeq. Chất lượng và độ tin cậy đươc kiểm tra lại bằng Illumina Analysis Viewer (Illumina, Hayward, USA). Số liệu thu được phân tích bằng chương trình NextGENe software V2.4.2 (Next generation sequencing software for biologists). Những đột biến (potential mutations) tìm ra dựa vào phân tích chương trình Illumina VariantStudio™ 3.0 và tiêu chuẩn của Hiệp hội Hoa kì về gen, sinh học phân tử và bệnh học. KẾT QUẢ Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhi BCCDT cĩ +8 Bênh nhi được chẩn đốn là BCCDT (theo tiêu chuẩn của WHO(2)). Karyotype được thực hiện trên 100% bệnh nhân thu được 19/180 (10,6%) bệnh nhi BCCDT cĩ +8. Các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và phân loại thể bệnh của 19 bệnh nhi này được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và phân loại BCCDT cĩ +8 (n=19) Đặc điểm Số bệnh nhân Tỉ lệ (%) Tuổi Tuổi trung bình ± Độ lệch chuẩn 7,6 ± 3,2 Tuổi trung vị 7 (5 – 10) Nhĩm tuổi 0-6 tuổi 8 42,1 >6-10 tuổi 7 36.8 >10 tuổi 4 21,1 Giới Nam/Nữ 10/9 52,6/47,3 Lâm sàng Sốt 9 47,3 Thiếu máu 13 68,4 Xuất huyết 11 57,9 Gan và /hoặc lách to 10 52,6 Cận lâm sàng Bạch cầu (x10 3 /µL) < 50 14 73,7 50 đến 100 3 15,8 >100 2 10,5 Hb (g/dL) < 8 10 52,6 8 đến 10 6 31,6 >10 3 15,8 Tiểu cầu (x10 3 /µL) <20 4 21,1 20 đến 100 12 63,2 >100 3 15,8 Tế bào non ở máu ngoại vi Hiện diện 9 47,4 Khơng hiện diện 10 52,6 % tế bào blast trong tủy Trung bình ± Độ lệch chuẩn 57,5 ± 20,5 Phân loại (FAB) M0 1 5,3 M1 3 10,5 M2 4 21,1 M3 1 5,3 M4 3 15,8 M5 6 31,6 M6 1 5,3 M7 1 5,3 Tuổi trung bình lúc chẩn đốn BCCDT là 7,6 ± 3,2 tuổi, trong đĩ nhĩm tuổi chiếm tỉ lệ cao Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nhi Khoa 99 nhất là nhỏ hơn bằng 6 tuổi. Tỉ lệ nam/nữ gần bằng nhau. Về đặc điểm lâm sàng, khoảng 1/2 trường hợp cĩ sốt, thiếu máu, xuất huyết, gan/lách to. Ghi nhận gần 3/4 trường hợp (73,7%) cĩ bạch cầu nhỏ hơn 50 000/µL lúc chẩn đốn, hơn ½ trường hợp (52,6%) cĩ Hb < 8 g/dL, và hầu hết các trường hợp đều cĩ giảm tiểu cầu (84,2%). Phân loại thể bệnh theo hình thái học, dựa theo nhĩm nghiên cứu hợp tác Pháp-Mỹ-Anh (French-American-British, FAB), BCCDT cĩ +8 trong nghiên cứu này gặp thể bệnh M5 nhiều nhất 6/19 trường hợp (31,6%), kế đến là M2 với 4/19 trường hợp (21,1%) và M4 là 3/19 trường hợp (15,8%). Ngồi ra, ghi nhận cĩ 5,3% trường hợp lần lượt là M0, M1, M3, M6, M7. Đặc điểm chẩn đốn di truyền học phân tử Karyotype được thực hiện trên bệnh phẩm máu tủy tất cả trường hợp, phân loại được 19 trường hợp cĩ +8. +8 phát hiện trên karyotype đều được xác định lại bằng kỹ thuật FISH (tỉ lệ dương tính > 30%). SNP-array cũng được tiến hành trên các trường hợp BCCDT cĩ +8 (bảng 2). Tỉ lệ quần thể tế bào mang trisomy 8 thực hiện bằng karyotype thì tương đồng với tỉ lệ +8 phát hiện bằng FISH. Theo karyotype, ghi nhận trung bình 81,3 ± 15% quần thể khảo sát cĩ +8, cịn theo FISH ghi nhận trung bình 82,6 ± 17,1% tế bào khảo sát cĩ +8. Cĩ 9/19 (47,4%) trường hợp chỉ cĩ 1 bất thường NST là +8 (trisomy 8 alone) (trường hợp 1 - 9, bảng 2), 10/19 (52,6%) là +8 kèm theo ít nhất 1 bất thường NST khác lần lượt là: del5q, del17p, inv(16), + 6, + 13, + 14, + 19, + 22, t (6; 9), t (9; 11), t (10; 11), t (15; 17), t (8; 21), t (11; 17). Trong đĩ cĩ 3 trường hợp là complex karyotype (là bất thường ≥ 3 NST khác nhau trong cùng 1 quần thể tế bào khảo sát) (trường hợp 11, 15, 19, bảng 2). Kết quả SNA-array phát hiện thêm 4/19 trường hợp (ca 7, 8, 13, 17, bảng 2) cĩ bất thường nội tại NST loss of heterogenous (homozygous, hmz). Đồng thời ghi nhận thêm 13/19 ca (68,4%) cĩ thêm các đột biến mất đoạn khơng phát hiện trên karyotype bao gồm: del2q (ca 17), del3q (ca 13), del5q (ca 6), del7q (ca 7,12), del9q (ca 1,14,18), biallelic del13q (ca 16), del15q (ca 5), del17p (ca 3,9), delXq (ca 10). Đặc điểm các đột biến gen BCCDT +8 19 trường hợp BCCDT cĩ +8 đươc thực hiện WES, các biến thể sao chép (transcript variant), kiểu đột biến (mutation type), thay đổi acid amine (AA change) và tiên đốn khả năng gây bệnh của các đột biến (clinical significance) trên được trình bày trong bảng 3. Nghiên cứu ghi nhận đa số trường hợp đều cĩ ít nhất 2 đột biến khác nhau. Các đột biến tìm thấy đa số là missense. 100% các transcript variant đều được tiên đốn là gây bệnh (pathogenic). Tỉ lệ các đột biến ghi nhận trên các gen bao gồm ASXL1, CEBPA, IDH2, KIT, KRAS, RUNX1,TET2, WT1 và TP53 là 10,5%, DNMT3A, IDH1 và NPM1 chiếm tỉ lệ 15,8%, kế đến là FLT3 21,1% và đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất là NRAS 26,3%. Bảng 2. Đặc điểm nhiễm sắc thể đồ, kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang và đa hình đơn nucleotide trên bệnh nhi BCCDT cĩ +8 (n=19). Ca Karyotype FISH (%) SNP-array 1 47, XY, +8[19] /46, XY [1] 93 Arr (8) x3, 9q31.1(101,882,274-103,394,717)x1, (XY)x1 2 47, XX, +8[20] 98.5 Arr (8)x3, 19p13.2(6,896,483-7,105,136)x 3, (X)x2 3 47, XY, +8[20] 97 Arr (8)x3, 17p13.1(7,128,825-8,208,155)x1, (XY)x1 4 47, XY, +8[13]/46, XY [7] 70 Arr (8)x3, (XY)x1 5 47, XX, +8[18]/46, XX [2] 84 Arr (8)x3, 15q15.1(40,162,766-42,550,445)x1, (X)x2 6 47, XX, +8[15]/46, XX [5] 81 Arr (8)x3, 5q31.2q31.3 (141,213,723-144,327,586)x1, (X)x2 7 47, XY, +8[11]/46, XY [9] 62 Arr (8)x3, 12q13.11(42,304,125-48,713,787)x2 hmz, 7q22.1(101,627,204-104,036,866)x1, (XY)x1 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Chuyên Đề Nhi Khoa 100 Ca Karyotype FISH (%) SNP-array 8 47, XX, +8[12]/46, XX [8] 52 Arr (8)x3, 13q12.11q34(20,587,851-115,103,529)x2 hmz, (X)x2 9 47, XY, +8[19]/46, XY [1] 93 Arr (8)x3, 17p13.3 p11.2(12,344-21,452,282)x1, (XY) x1 10 47, XX, +8[15]/48, XY, +8, +14[5] 88 Arr (8,14)x3, Xq22.3q28(108,515,336-155,254,881)x1, (Y)x1 11 47, XX, +8[11]/46, XX, +8, +22, t(6;9) (p23; q34) [9] 93 Arr (8,22) x3,6p23p25.2(2,668,844-13,877,986)x1, 9q31.2q34.11(107,039,664-128,663,838)x1, (X)x2 12 47, XY, +8, t (9;11) (p22; q23) [20] 98 Arr (8)x3, 7q21.3q22.1(94,860,650-99,591,233)x1, 9p22.3p21.1(14,985,416-.28,648,588)x1, 11q22.3q24.3(109,518,176-128,268,369)x1, (XY)x1 13 47, XX, +8, t (9;11) (p22; q23) [16]/46, XX, del (17) (p12p13) [4] 87 Arr (8)x3, 9p24.1p21.1(7,712,400-30,421,130)x1, 17p13.1p11.2(8,404,538-16,546,431)x1, 3p24.1p13(8,404,538-16,546,431)x2 hmz, (X)x2. 14 47, XY, +8[11]/46, XY, t (8;21) (q22; q22) [9] 49 Arr (8)x3, 8q22.2q24.22(8,404,538-16,546,431)x1, 21q21.3q22.3(30,133,097-42,289,479)x1, 9q21.13(72,873,469-75,252,127)x1, (XY)x1. 15 48, XY, +8, +19, t (11;17) (q23; q25) [18]/46, XY, del (17) (p12p13) [2] 86 Arr (8,19)x3, 17p13.1p12(17,584,963-30,392,555)x1, 11q21q22.3(95,668,601-114,418,794)x1, (XY)x2. 16 47, XX, +8, t (15;17) (q22; q12) [14]/47, XX, +6 [6] 81 Arr (8,6)x3, 13q14.2q14.3 (50,605,679-51,457,809)x0, 15q22.2q25.2(59,000,531-81400000)x1, (X)x2. 17 47, XY, +8, inv(16) (p13q22)[20] 93 Arr (8)x3, 2q21.1q23.3(131,603,226-151,087,000)x1, 14q11.2q32.33(22,416,910-107,287,663)x2 hmz, (XY)x1. 18 47, XX, +8[11]/46, XX, +13, t (10;11) (p12; q23) [9] 62 Arr (8,13)x3, 10p12.1p11.22(28,948,379-32,687,497)x1, 9p22.2p21.1(17,442,000-31,745,845)x1, (X)x2. 19 47, XY, +8, +22, del (5) (q12q34), der(17)t(11;17)(q12;q21)[17]/46,XY[3] 78 Arr (8,22) x3, 5q11.2q14.1(62,687,431-81,124,909)x1, 11q12.3q14.1(62,687,431-81,124,909) x1, 17pq11.1q21.2 (62,687,431-81,124,909) x1, (XY)x1. hmz: homozygous Bảng 3. Các đột biến tìm thấy trên BCCDT +8 và tiên lượng gây bệnh. Ca Gen Transcript variant Mutation type AA change Clinical significance 11 NRAS c.183A>T Missense p.Q61H Pathogenic 13 NRAS c.182A>G Missense p.Q61R Pathogenic 5 NRAS c.181C>A Missense p.Q61K Pathogenic 6 NRAS c.38G>A Missense p.G13D Pathogenic 7 NRAS c.35G>A Missense p.G12D Pathogenic 2 DNMT3A c.2645G>A Missense p.R882H Pathogenic 4 DNMT3A c.2645G>C Missense p.R882P Pathogenic 7 DNMT3A c.2546C>T Missense p.P849L Pathogenic 1 DNMT3A c.939G>A Nonsense p.W313* Pathogenic 8 IDH1 c.395G>A Missense p.R132H Pathogenic 11 IDH1 c.394C>T Missense p.R132C Pathogenic 10 IDH1 c.394C>A Missense p.R132S Pathogenic 9 KIT c.1655T>C Missense p.M552T Pathogenic 12 KIT c.1854G>A Missense p.M618I Pathogenic 15 TET2 c.1955delC Deletion-Frameshift p.Q654fs*46 pathogenic 3 TET2 c.1924C>T Missense p.Q642* pathogenic 14 NPM1 c.863_864insTAGG Insertion-Framshift p.W288fs*12 pathogenic 5 NPM1 c.869_873GGAGG>GTTTTTCAA Frameshift p.W290fs*10 pathogenic 7 WT1 c.1395C>A Missense p.H465Q pathogenic 6 WT1 c.1385G>C Missense p.R462P pathogenic 9 WT1 c.1384C>T Missense p.R462W pathogenic 4 KRAS c.436G>A Missense p.A146T pathogenic 19 KRAS c.35G>T Missense p.G12V pathogenic Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nhi Khoa 101 Ca Gen Transcript variant Mutation type AA change Clinical significance 18 FLT3_TKD c.2523C>A Missense p.N841K pathogenic 6 FLT3_TKD c.2522A>C Missense p.N841T pathogenic 9 FLT3_TKD c.2504A>T Missense p.D835V pathogenic 10 FLT3_ITD N/A N/A pathogenic 13 IDH2 c.515G>A Missense p.R172K pathogenic 12 IDH2 c.419G>A Missense p.R140Q pathogenic 11 TP53 c.818G>A Missense p.R273H pathogenic 14 TP53 c.800G>C Missense p.R267P pathogenic 8 CEBPA c.962A>G Missense p.N321S pathogenic 19 CEBPA c.899G>T Missense p.R300L pathogenic 2 ASXL1 c.1888_1910del23 Deletion - Frameshift p.E635fs*15 pathogenic 9 ASXL1 c.2077C>T Nonsense p.R693* pathogenic 16 RUNX1 c.485G>A Missense p.R162K pathogenic 18 RUNX1 c.496C>G Missense p.R166G pathogenic Neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog (NRAS), 1p13.2; DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3 alpha (DNMT3A), 2p23.3; Isocitrate dehydrogenase 1 (NADP+), soluble (IDH1), 2q33.3; V-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog (KIT), 4q12; Tet methylcytosine dioxygenase 2 (TET2), 4q24; Nucleophosmin 1 (NPM1), 5q35.1; Wilms tumor 1 (WT1), 11p13; V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS), 12p12.1; Fms related tyrosine kinase 3 (FLT3), tyrosine kinase domain (FLT3-TKD), FLT3 Internal Tandem Duplication (FLT3-ITD), 13q12.2; Isocitrate dehydrogenase 2 (NADP+), mitochondrial (IDH2), 15q26.1; Tumor protein p53 (TP53), 17p13.1; CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) alfa (CEBPA), 19q13; Additional sex combs like 1 (ASXL1), 20q11.21; Runt-related transcription factor 1 (RUNX1), 21q22.12. Missense: đột biến sai nghĩa, Nonsense: đột biến vơ nghĩa Pathogenic: gây bệnh, Frameshift: đột biến lệch khung đọc, Insertion: đột biến gây chèn đoạn; FLT3-ITD: là đột biến nhân đoạn nội tại. Các transcript variant tìm thấy trong bảng trên đều đã được kiểm tra lại bằng giải trình tự gen Sanger. BÀN LUẬN Nghiên cứu BCCDT cĩ +8 của chúng tơi cĩ tuổi trung bình lúc chẩn đốn là 7,6 tuổi, tương tự với kết quả nghiên cứu của tác giả Laursen (6,7 tuổi trên nhĩm BCCDT cĩ +8) và cao hơn so với nhĩm BCCDT khơng cĩ +8 (4,7 tuổi)(21). Tác giả Krance(19) ghi nhận trên bệnh nhi BCCDT chung cũng cĩ tuổi trung bình là 4,9 tuổi. Điều này cĩ thể đưa đến giả thuyết là BCCDT cĩ +8 sẽ phát hiện trễ hơn so với nhĩm chung của BCCDT. Chúng tơi ghi nhận thể M5 là 31,6% gặp nhiều nhất, kế đến là M2 với 21,1%. Tỉ lệ này phù hợp với y văn(21,39) là 36% M5, 14% M2 trên BCCDT trẻ em cĩ +8. So sánh kết quả với BCCDT chung thì M5 dao động từ 12% đến 26% và M2 từ 27% đến 34%(20,38). Đồng thời, thể bệnh M5, M2 cĩ mối liên quan cĩ ý nghĩa thống kê với BCCDT +8 ở trẻ em so với BCCDT trẻ em khơng cĩ +8(21). Ngồi ra, tất cả các thể bệnh từ M0 đến M7 đều tìm thấy trong nhĩm BCCDT +8 trong nghiên cứu chúng tơi, cĩ thể thấy rằng +8 rất đa dạng kiểu gen cũng như kiểu hình đưa đến diễn tiến và tiên lượng bệnh rất khác nhau. Hiện nay, vai trị của chẩn đốn di truyền học phân tử vơ cùng quan trọng trong BCCDT(26,33). Karyotype là xét nghiệm đầu tay trong chẩn đốn di truyền học ở BCCDT. Theo y văn, tần suất bất thường nhiễm sắc thể đồ gặp ở 55 – 78% người lớn(7) và 77 – 85% trẻ em(9,33). Trong nghiên cứu trên BCCDT ở trẻ em, +8 chiếm 14%(21) với 21,4% là +8 alone cịn lại là +8 kết hợp với các bất thường khác; tác giả(17) báo cáo trên nhĩm BCCDT ở người lớn là 30,1% +8 alone. Kết quả này thấp hơn so với kết quả chúng tơi ghi nhận là 47,4% + 8 alone dựa vào karyotype. Điều này cĩ thể giải thích là thật sự tỉ lệ + 8 alone thấp hơn trong nghiên cứu chúng tơi chỉ chiếm 15,6% (3/19) nếu dựa thêm vào kỹ thuật SNP-array. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Chuyên Đề Nhi Khoa 102 Ngồi ra, chúng tơi ghi nhận khoảng 1/7 trường hợp BCCDT + 8 cĩ complex karyotype, điều đĩ cĩ thể giải thích là do bất ổn định gen (genomic instability) dễ xảy ra khi cĩ + 8. Tỉ lệ này thấp so với(17,25) trên BCCDT + 8 ở người lớn, 1/5 trường hợp cĩ bất ổn định gen. FISH là kỹ thuật dùng centromere 8 probes để xác định lại đa bội thể NST số 8 trên tế trạng thái bình thường khơng cần kích thích phân bào, nên khơng tốn thời gian nuơi cấy 5 - 7 ngày so với karyotype(16). FISH thì khảo sát trên 200 tế bào trong khi karyotype thì dựa trên 20 quần thể NST của 1 tế bào. Các đặc điểm này giúp giải thích tại sao tỉ lệ trisomy 8 cĩ sự khác nhau giữa 2 phương pháp. Ngồi ra, FISH chỉ khảo sát định vị đoạn dị đặc hiệu đưa vào, khơng khảo sát được tồn bộ NST như karyotype(27). Hiện nay, SNP-array là phương pháp mới khơng những cĩ thể khảo sát tồn bộ NST mà cịn giúp phát hiện các trường hợp “loss of heterozygosity” (LOH) mặc dù karyotype là bình thường(30). Trong nghiên cứu chúng tơi ghi nhận đươc 4/19 trường hợp cĩ “loss of heterozygosity”, yếu tố này liên quan cĩ ý nghĩa thống kê với tiên lượng xấu trong BCCDT trong trường hợp 13qLOH(15). Tác giả Vaniawala (2017)(37) chứng minh là cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa về tiên lượng bệnh nhân BCCDT chỉ cĩ 1 bất thường NST duy nhất là +8 và +8 kết hợp với các di truyền phân tử thuận lợi khác. Đồng thời nghiên cứu này(37) cũng ghi nhận chuyển vị NST thường gặp trong BCCDT + 8 là t (8;21) là 1,9% và t (15;17) là 8,3%; trong nghiên cứu chúng tơi ghi nhận là 5,3% cho mỗi chuyển vị NST nêu trên. Sự khác biệt này do cĩ thể do quần thể bệnh nhân nghiên cứu khác nhau và nhất là cỡ mẫu của chúng tơi khá nhỏ. Giới hạn của karyotype là khơng khảo sát được những bất thường NST nhỏ hơn 5 đến 10 Mb(31), nhất là trong những trường hợp đột biến mất đoạn nhỏ (microdeletion), nhưng SNP-array với độ phân giải cao hơn cĩ thể phát hiện ra(22,36). Điều đĩ nhằm giải thích tại sao kết quả trong nghiên cứu chúng tơi cĩ thể phát hiện thêm 68,4% trường hợp cĩ microdeletion bằng SNP- array. Trường hợp số 6 trong bảng 2 mặc dù karyotype chỉ cĩ +8 nhưng SNP-array phát hiện thêm đột biến mất đoạn 5q31 nhỏ, theo y văn, BCCDT kết hợp với del5q sẽ cĩ tiên lượng xấu(26). Bệnh sinh của BCCDT theo nhiều giả thuyết được cho là xảy ra cần cĩ 2 loại đột biến (“two hits”)(18,13), thứ nhất là đột biến bất thường về khả năng tăng sinh tế bào và chết tế bào do bất thường trên lộ trình tín hiệu trong tế bào (cellular signaling pathway) (như là FLT3, KIT, NRAS, KRAS)(12) hay đột biến các gen ức chế sinh u (tumor suppressor) như TP53 hay WT1; và thứ hai là đột biến bất thường nhân tố phiên mã (transcription factor) gây ngăn cản tế bào trưởng thành (gồm CEBPA, NPM1, RUNX1). Những năm gần đây nghiên cứu đã ghi nhận rằng cơ chế bệnh sinh cịn cĩ sự tham gia của những đột biến điều chỉnh trên gen di truyền biểu sinh (epigentic) như là TET2, IDH1, IDH2 và DNMT3A(28). Đột biến FLT3 đã được ghi nhận ở BCCDT trẻ em. FLT3 là thụ thể tyrosine kinase tìm thấy chủ yếu trên tế bào blast dịng tuỷ chiếm tỉ lệ 16,5% và cĩ tiên lượng xấu ở trẻ em AML(23). Trong trường hợp số 9 (xem bảng 2, bảng 3) bệnh nhi ngồi +8 là normal karyotype, nhưng tìm thấy đột biến gen FLT3 (c.2504A>T) sẽ đồng nghĩa với tiên lượng xấu(1). Nghiên cứu(37,38) tìm thấy đột biến NMP1 là gặp nhiều 27% và trong tường hợp khơng kèm đột biến FLT3-ITD và DNMT3A sẽ cĩ diễn tiến bệnh và tiên lượng thuận lợi. Do đĩ, ca số 5 trong nghiên cứu của chúng tơi (xem bảng 2, bảng 3) ngồi +8, cĩ normal karyotype và đột biến NMP1 nhưng khơng đột biến FLT3-ITD và DNMT3A sẽ cĩ tiên lượng tốt. Nghiên cứu(6) cũng tìm thấy tỉ lệ các đột biến gen bao gồm ASXL1, CEBPA, IDH2, KIT, KRAS, RUNX1, TET2, WT1 và TP53 dao động từ 10% đến 15%, phù hợp với kết quả tìm thấy. So sánh với nghiên cứu(5) với tỉ lệ đột biến WT1 người lớn là 10% trong khi ở BCCDT trẻ em là 13%, tương tương với ghi nhận của chúng tơi. Đồng thời, tỉ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nhi Khoa 103 lệ đột biến NRAS ở BCCDT người lớn là 10% trong khi ở BCCDT trẻ em là 20%, phù hợp với kết quả nghiên cứu chúng tơi chiếm tỉ lệ cao nhất là 26,3%. KẾT LUẬN BCCDT +8 ở trẻ em gặp nhiều thể bệnh M5, hơn phân nữa là cĩ bất thường NST khác đi kèm, 3 đột biến (NPM1, FTL3 và NRAS) là gặp nhiều nhất. Tĩm lại, BCCDT +8 là bệnh cảnh ác tính rất đa dạng về bệnh sinh, cĩ phạm vi thay đổi về di truyền học phân tử rất lớn nên cần phải được phân loại ra những nhĩm nhỏ hơn theo đặc điểm bất thường NST/gen kèm theo nhằm đưa ra chính xác tiên lượng bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Al-Issa K. and Nazha A, (2016), Molecular landscape in acute myeloid leukemia: where do we stand in 2016. Cancer Biology & Medicine, 13(4): p. 474-482. 2. Arber, D.A., et al., (2016), The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood, 127(20): p. 2391-405. 3. Becker H et al (2010), Sole Trisomy 8 In Patients (pts) with De Novo Acute Myeloid Leukemia (AML) Is Associated with Age-Independent Poor Outcome That Is Modified by Molecular Markers and with Unique Gene- and Microrna (miR)-Signatures: a Cancer and Leukemia Group B (CALGB) Study. Blood, 116(21): p. 577-577. 4. Betts DR et al (2007), The prognostic significance of cytogenetic aberrations in childhood acute myeloid leukaemia. A study of the Swiss Paediatric Oncology Group (SPOG). Eur J Haematol, 78(6): p. 468-76. 5. Creutzig, U et al (2012), Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in children and adolescents: recommendations from an international expert panel. Blood, 120(16): p. 3187-205. 6. Dưhner H et al (2016), Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. ww.bloodjournal.org/content/early/2016/11/28/blood- 2016-08-733196. 7. Dohner H et al (2017), Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood, 129(4): p. 424-447. 8. Elliott MA et al (2002). The prognostic significance of trisomy 8 in patients with acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma, 43(3): p. 583-6. 9. Erik F et al (2003). Cytogenetic abnormalities in childhood acute myeloid leukaemia: a Nordic series comprising all children enrolled in the NOPHO‐93‐AML trial between 1993 and 2001. British Journal of Haematology, 121(4): p. 566-577. 10. Farag SS et al (2002). Isolated trisomy of chromosomes 8, 11, 13 and 21 is an adverse prognostic factor in adults with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B 8461. Int J Oncol, 21(5): p. 1041-51. 11. Forestier E et al (2003). Cytogenetic abnormalities in childhood acute myeloid leukaemia: a Nordic series comprising all children enrolled in the NOPHO-93-AML trial between 1993 and 2001. Br J Haematol, 121(4): p. 566-77. 12. Frohling S et al (2005). Genetics of myeloid malignancies: pathogenetic and clinical implications. J Clin Oncol, 23(26): p. 6285-95. 13. Gou H et al (2016). The prevalence and clinical profiles of FLT3- ITD, FLT3-TKD, NPM1, C-KIT, DNMT3A, and CEBPA mutations in a cohort of patients with de novo acute myeloid leukemia from southwest China. Tumour Biol, 37(6): p. 7357-70. 14. Grimwade D et al (2010). Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials. Blood, 116(3): p. 354-65. 15. Gronseth CM et al (2015). Prognostic significance of acquired copy-neutral loss of heterozygosity in acute myeloid leukemia. Cancer, 121(17): p. 2900-8. 16. Hammer RD et al (2016). Is It Time for a New Gold Standard? FISH vs Cytogenetics in AML Diagnosis. Am J Clin Pathol, 145(3): p. 430-2. 17. Jaff N et al (2007). Trisomy 8 as sole anomaly or with other clonal aberrations in acute myeloid leukemia: impact on clinical presentation and outcome. Leuk Res, 31(1): p. 67-73. 18. Kelly LM and Gilliland DG (2002). Genetics of myeloid leukemias. Annu Rev Genomics Hum Genet, 3: p. 179-98. 19. Krance RA et al (2001). Experience with 2-chlorodeoxyadenosine in previously untreated children with newly diagnosed acute myeloid leukemia and myelodysplastic diseases. J Clin Oncol, 19(11): p. 2804-11. 20. Kumar CC. (2011). Genetic Abnormalities and Challenges in the Treatment of Acute Myeloid Leukemia. Genes & Cancer, 2(2): p. 95-107. 21. Laursen AC et al (2016), Trisomy 8 in pediatric acute myeloid leukemia: A NOPHO-AML study. Genes Chromosomes Cancer, 55(9): p. 719-26. 22. Maciejewski JP and Mufti GJ (2008), Whole genome scanning as a cytogenetic tool in hematologic malignancies. Blood, 112(4): p. 965-74. 23. Meshinchi S et al (2006). Clinical implications of FLT3 mutations in pediatric AML. Blood, 108(12): p. 3654-3661. 24. Metayer C et al (2013). The Childhood Leukemia International Consortium. Cancer Epidemiol, 37(3): p. 336-47. 25. Mrĩzek K (2008). Cytogenetic, molecular genetic, and clinical characteristics of acute myeloid leukemia with a complex karyotype in Seminars in oncology. Elsevier. 35(4): 365-77. 26. Mrozek K., Heerema NA and Bloomfield CD (2004). Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev, 18(2): p. 115-36. 27. Najfeld V (2003). Diagnostic application of FISH to hematological malignancies. Cancer Invest, 21(5): p. 807-14. 28. Naoe T and Kiyoi H (2013). Gene mutations of acute myeloid leukemia in the genome era. Int J Hematol, 97(2): p. 165-74. 29. Paulsson K et al (2003). Trisomy 8 as the sole chromosomal aberration in myelocytic malignancies: a multicolor and locus- specific fluorescence in situ hybridization study. Cancer Genet Cytogenet, 140(1): p. 66-9. 30. Pinheiro RF et al (2008). Association of loss of heterozygosity with cytogenetic abnormalities in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome. Braz J Med Biol Res, 41(7): p. 610-4. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 4 * 2018 Chuyên Đề Nhi Khoa 104 31. Reddy UM et al (2012). Karyotype versus Microarray Testing for Genetic Abnormalities after Stillbirth. The New England journal of medicine, 367(23): p. 2185-2193. 32. Sandahl JD et al (2014). Ploidy and clinical characteristics of childhood acute myeloid leukemia: A NOPHO-AML study. Genes Chromosomes Cancer, 53(8): p. 667-75. 33. Schoch C and Haferlach T (2002). Cytogenetics in acute myeloid leukemia. Current Oncology Reports, 4(5): p. 390-397. 34. Schoch C et al (2006). Impact of trisomy 8 on expression of genes located on chromosome 8 in different AML subgroups. Genes Chromosomes Cancer, 45(12): p. 1164-8. 35. Shi L et al (2017). Current views of chromosomal abnormalities in pediatric acute myeloid leukemia (AML). European review for medical and pharmacological sciences, 21(4 Suppl): p. 25-30. 36. Simons A et al (2012). Genome-wide arrays in routine diagnostics of hematological malignancies. Hum Mutat, 33(6): p. 941-8. 37. Vaniawala SN et al (2017). The possible significance of trisomy 8 in acute myeloid leukemia. International Journal of Research in Medical Sciences, 5(6): p. 2652-2656. 38. Walter RB et al (2013). Significance of FAB subclassification of “acute myeloid leukemia, NOS” in the 2008 WHO classification: analysis of 5848 newly diagnosed patients. Blood, 121(13): p. 2424-2431. 39. Wolman SR et al (2002). Impact of trisomy 8 (+8) on clinical presentation, treatment response, and survival in acute myeloid leukemia: a Southwest Oncology Group study. Blood, 100(1): p. 29-35. Ngày nhận bài báo: 14/06/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 14/07/2018 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2018