Đặc điểm của gen gmdreb6 phân lập từ giống đậu tương chịu hạn dt2008

Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 163 - 168 163 ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB6 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008 Lò Thị Mai Thu1, Nguyễn Việt Nga2, Nguyễn Thị Ngọc Lan2, Chu Hoàng Mậu2* 1Trường Đại học Tây Bắc; 2Trường Đại học Sư phạm- ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loài cây họ Đậu có giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế cao, nhưng rất mẫn cảm với tác động của hạn. Hạn là yếu tố phi sinh học làm giảm năng suất và chất lượng hạt đậu tương. Để chống lại stress hạn, cây đậu tương tổng hợp nhiều loại protein, trong đó có các nhân tố phiên mã kích hoạt hoạt động các gen chức năng. Phân họ protein DREB (Dehydration Responsive Element Binding) thuộc họ AP2 là nhân tố phiên mã kích hoạt biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn, làm tăng khả năng chống chịu các stress hạn của cây đậu tương. Tăng cường biểu hiện gen GmDREB là giải pháp công nghệ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương, trong đó khâu quan trọng là tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen. Trong nghiên cứu này, gen GmDREB6 (cDNA) đã được khuếch đại và tách dòng từ mRNA của giống đậu tương DT2008. Gen GmDREB6 có kích thước là 693 bp, mã hóa 230 amino acid, sai khác ở 16 vị trí nucleotide và 8 vị trí amino acid suy diễn so với trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank. Trình tự gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương chịu hạn DT2008 được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn ở cây đậu tương. Từ khóa: Gen GmDREB6, Glycine max, khả năng chịu hạn, nhân tố phiên mã, vùng AP2 MỞ ĐẦU* Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] là cây thực phẩm dễ trồng và có hiệu quả kinh tế cao. Hạt đậu tương giàu dinh dưỡng, hàm lượng protein trong hạt đạt từ 30%-52%, hàm lượng lipid từ 12%-25%, có nhiều loại vitamin, khoáng và đặc biệt trong hạt chứa nhiều amino acid thiết yếu cho người và động vật. Cây đậu tương không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng mà còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác do rễ đậu tương có khả năng cố định đạm [1], [2] [3]. Trong những năm gần đây do biến đổi khí hậu mà hạn hán đã xảy ra ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Ở một số vùng ở nước ta như các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên, hạn đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm suy giảm rõ rệt khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng, trong đó có đậu tương. Đậu tương được xem là loại cây trồng rất mẫn cảm với tác động của hạn và hạn là yếu tố phi sinh học nghiêm trọng nhất có thể làm giảm năng suất hạt đậu * Tel: 0913 383289; Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn tương [2]. Câu hỏi đặt ra là, có thể cải thiện được khả năng chịu hạn của cây đậu tương hay không và nếu có thì ứng dụng công nghệ nào để tăng cường khả năng kháng hạn của loài cây họ đậu này. Cho đến nay các nghiên cứu đã khẳng định rằng, có thể cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng kỹ thuật chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học hiện đại. Để chống lại stress hạn, cây đậu tương tổng hợp nhiều loại protein, trong đó có các loại protein là nhân tố phiên mã kích hoạt hoạt động phiên mã của các gen chức năng [5]. Protein DREB ở đậu tương (Dehydration Responsive Element Binding) là một phân họ thuộc họ AP2, có chức năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn, tạo ra khả năng chống chịu các stress hạn từ ngoại cảnh. Một số thành viên của phân họ gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [7]. Trên bản đồ gen của đậu tương, gen GmDEB6 có một exon ở vị trí LOC100101914 thuộc nhiễm sắc thể số 5 Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 163 - 168 164 (Hình 1) [10]. Tăng cường biểu hiện gen GmDREB sẽ kích hoạt mạnh sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn, do vậy việc lựa chọn kỹ thuật biểu hiện mạnh gen GmDREB sẽ là giải pháp công nghệ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương mà khâu quan trọng là tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen. Giống đậu tương DT2008 trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam được chọn tạo bằng phương pháp xử lý đột biến chiếu xạ tia gamma trên hạt khô dòng 2001HC từ tổ hợp lai DT2001 với HC100 được đánh giá là giống chịu hạn [9]. Trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả tách dòng và phân tích trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ mRNA của giống đậu tương chịu hạn DT2008. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu: Giống đậu tương DT2008 là giống chịu hạn do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp được sử dụng làm vật liệu để phân lập và nghiên cứu đặc điểm gen GmDREB6. Phương pháp Quá trình thực hiện phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2. Nghiên cứu thông tin và thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R để nhân gen GmDREB6 dựa trên trình tự gen DREB6 đã công bố trên GenBank có mã số EF551166 [6] cặp mồi DREB6-F/ DREB6-R thiết kế có trình tự là: DREB6-F:5’- ATGGTCATGGAAGAATCTAAC-3’; DREB6-R:5’-TTAATATGATTCCCATAGA-3’. Kích thước của đoạn DNA được nhân bản dự kiến là 693 bp. Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit Trizol Reagents của hãng Invitrogen. cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số bằng bộ KIT SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis. PCR được thực hiện theo chương trình: 95C/5 phút; 30 chu kỳ (95C/30 giây; 55C/30 giây; 72C/30 giây); 72C/8 phút và giữ ở 4C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,0% và được tinh sạch theo bộ kit GeneJET PCR Purification của hãng Fermentas. Tách dòng gen được thực hiện theo Sambrook và Russell (2001) [8]. Trình tự DNA được xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer và trình tự nucleotide của gen được đọc trên phần mềm BLAST và BioEdit. Hình 1. Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu tương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách dòng và giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 Mẫu lá non từ giống đậu tương giống DT2008 được sử dụng để tách chiết RNA tổng số, kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số được thể hiện trên hình 3A. RNA tổng số sau khi xử lý bằng DNase được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược. Từ cDNA, bằng PCR với cặp mồi DREB6-F/DREB6-R đoạn mã hóa của gen GmDREB6 đã được Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 163 - 168 165 khuếch đại. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 thu được băng DNA đặc hiệu với kích thước gần 0,7 kb, đúng như tính toán theo lý thuyết (Hình 3B). Sản phẩm PCR nhân bản gen GmDREB6 đã tinh sạch được sử dụng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT (kích thước 2705 bp) để tạo vector tái tổ hợp pBT_GmDREB6. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào E.coli DH5α, các khuẩn lạc được chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh ampicillin, có chất cảm ứng IPTG và cơ chất X-Gal. Năm dòng khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tiến hành phản ứng colony-PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen GmDREB6. Kết quả điện di sản phẩm colony- PCR ở hình 3C cho thấy một băng DNA có kích thước gần 0,7 kb là kích thước của gen GmDREB6. Khuẩn lạc số 2 không xuất hiện đoạn DNA. Các dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính với colony-PCR được nuôi tăng sinh và sử dụng để tách chiết plasmid phục vụ giải trình tự nucleotide. Kết quả giải trình tự đoạn DNA từ plasmid tái tổ hợp pBT_GmDREB6 trên thiết bị tự động thu được trình tự nucleotide có kích thước 693 bp. Kết quả phân tích bằng BLAST trong NCBI cho thấy, trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có độ tương đồng 100% so với hai trình tự gen mang mã số NM_001248412 và EF551166. Kết quả phân tích BLAST cho phép khẳng định đoạn gen phân lập từ giống đậu tương DT2008 là gen Glycine max dehydration-responsive element binding protein 6 (GmDREB6) mRNA của cây đậu tương. Trình tự gen GmDREB6 có kích thước 693 bp mã hóa 230 amino acid (Hình 4). RNA tổngsố cDNA Trình tựnucleotide củagen GmDREB6 Giải trình tự nucleotide Gen GmDREB6 củađậutương CặpmồiDREB6- F/ DREB6-R GENBANK Thiết kế PCR Hình 2. Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 163 - 168 166 A B C Hình 3. Hình ảnh điện di trên gel agarose. A: Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách từ lá non giống đậu tương DT2008; B: Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 (M-thang DNA 1 kb; làn điện di 1, 2, 3- Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008); C: Sản phẩm colony-PCR nhân bản gen GmDREB6 từ 5 dòng khuẩn lạc màu trắng (M: Thang DNA 1 kb; Làn điện di số 1, 3, 4, 5 cho sản phẩm colony-PCR; làn điện di số 2 không có sản phẩm colony-PCR). Hình 4. Kết quả phân tích BLAST gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 So sánh trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB6 của giống đậu tương DT2008 với trình tự EF551166 và NM_001248412 trên GenBank Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 với gen GmDREB6 mang mã số trên GenBank là NM_001248412 [4] và EF551166 [6], kết quả được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1 cho thấy, trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có 16 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự nucleotide của gen GmDREB6 mang mã số EF551166 và NM_001248412 trên GenBank, đó là các vị trí 19, 20, 51, 52, 75, 197, 319, 320, 408, 409, 580, 581, 635, 636, 680, 681. Tất cả những sai khác này đều là sự thay thế cặp A-T bằng G-C hoặc G-C bằng A- T. Vấn đề đặt ra là sự thay thế cặp nucleotide có làm thay đổi amino acid hay không cần phải tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 với hai trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank cho thấy có 8 vị trí amino acid sai khác, đó là các vị trí 6, 18, 66, 107, 137, 194, 212, 227 (Bảng 2). Phân tích vùng AP2 và các điểm liên kết với sợi DNA, kết quả so sánh ở hình 5 cho thấy, vùng AP2 của protein suy diễn từ gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có 2 vị trí sai khác, đó là amino acid thứ 66 và 107. Hai điểm sai khác về amino acid không thuộc vào những vị trí DNA binding (60, 61, 63, 65, 67, 69, 73, 75, 82, 84, 87). Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 163 - 168 167 Bảng 1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 và trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank TT Vị trí nucleotide DT2008 EF551166 NM_001248412 1 19 T A A 2 20 T A A 3 51 A T T 4 52 A T T 5 75 A T T 6 197 T A A 7 319 C G G 8 320 C G G 9 408 C G G 10 409 C G G 11 580 A T T 12 581 A T T 13 635 G C C 14 636 G C C 15 680 C G G 16 681 C G G Bảng 2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 và suy diễn từ trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank TT Vị trí amino acid DT2008 EF551166 NM_001248412 1 7 F N N 2 18 T S S 3 66 L Q Q 4 107 P G G 5 137 P A A 6 194 K L L 7 212 G A A 8 227 S W W Hình 5. So sánh trình tự amino acid của vùng AP2 trong protein suy diễn từ gen GmDREB6 của giống đậu tương DT2008 và EF551166, NM_001248412 trên GenBank KẾT LUẬN Gen GmDREB6 (cDNA) đã được khuếch đại và tách dòng thành công từ mRNA của giống đậu tương DT2008 có kích thước là 693 bp, mã hóa 230 amino acid. Gen GmDREB6 của giống đậu tương Việt Nam DT2008 có 16 vị trí nucleotide và 8 vị trí amino acid suy diễn sai khác so với trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank. Trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen trong mục đích tăng cường khả năng chịu hạn ở cây đậu tương. Lò Thị Mai Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 163 - 168 168 LỜI CẢM ƠN: Nghiên cứu này được hỗ trợ và trong khuôn khổ của Đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo mang mã số B2017-TNA-38. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ngô Thế Dân (1999), Cây Đậu Tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Chu Hoàng Mậu (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu tương – Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 4. GenBank (2017), Glycine max dehydration- responsive element binding protein 6 (LOC100101914, mRNA. NCBI Reference Sequence: NM_001248412.2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_00124 8412. 5. Li X. P., Tian A. G., Luo G. Z., Gong Z. Z., Zang J. S., Chen S. Y. (2005), “Soybean DRE- binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”, Theor. Appl. Genet., 110(8), pp. 1355-1362. 6. Liu Y. W., Chen M., Xu Z. S., Zh G. Y., Li L. C., Ma Y. Z. (2007), Glycine max dehydration- responsive element binding protein 6 mRNA, complete cds.. GenBank: EF551166.1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF551166. 7. Mizoi J., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2012), “AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses”, Biochem Biophys Acta., 1819(2), pp. 86-96. 8. Sambrook J. F. and Russell D. W. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols 1, 2 and 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2100 pp. 9. Saad Sulieman, Chien Van Ha, Maryam Nasr Esfahani, Yasuko Watanabe, Rie Nishiyama, Chung Thi Bao Pham, Dong Van Nguyen, and Lam-Son Phan Tran (2015), “DT2008: A promising new genetic resource for improved drought tolerance in soybean when solely dependent on symbiotic N2 fixation”, BioMed. Research International, Article ID 687213, 7 pages. 10.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=EF5 51166 SUMMARY CHARACTERISTICS OF THE GmDREB6 GENE ISOLATED FROM DROUGHT-RESISTANT DT2008 SOYBEAN CULTIVAR Lo Thi Mai Thu 1 , Nguyen Viet Nga 2 , Nguyen Thi Ngoc Lan 2 , Chu Hoang Mau 2* 1 Tay Bac University; 2 –TNU – University of Education Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is a species of legume, which has economic values and high nutrition, but is very sensitive to the effects of drought. Drought is abiotic stress reduces the yield and quality of soybean seeds. To against drought stress, soybean plants synthesize the proteins, including transcription factors that activate functional genes. Dehydration responsive element binding protein subfamily in soybean of the AP2 family is a transcription factor that activates the expression of drought-induced genes, increases tolerance to drought stress in soybean plants. Enhancing GmDREB gene expression is technological solution in order to improve the drought tolerance of soybean, which GmDREB gene isolation is important engineering to create genetic material for transgenic technicque. In this study, gene GmDREB6 (cDNA) was amplified and cloned from mRNA of soybean DT2008. The coding region of GmDREB6 gene isolated from DT2008 soybean cultivar was 693 nucleotides in length, encoding 230 amino acids, a difference in 16 nucleotide positions and 8 amino acid positions in comparison to GmDREB6 gene sequences with codes EF551166, NM_001248412 on GenBank. GmDREB6 gene isolated from drought- resistant DT2008 soybean cultivar was used to design transgenic vector for create transgenic soybean lines with high drought tolerance. Key words: drought tolerance, AP2 region, Glycine max, GmDREB6 gene, transcription factor Ngày nhận bài: 19/10/2018; Ngày phản biện: 25/10/2018; Ngày duyệt đăng: 31/10/2018 * Tel: 0913 383289; Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn