Công nghệ sinh học trong tạo giống cà chua chín chậm

TR NG ĐAI HOC NÔNG NGHIÊP HA NÔIƯỜ ̣ ̣ ̣ ̀ ̣ KHOA: CÔNG NGHÊ SINH HOC̣ ̣ ∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗ ∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗ Gv h ng dân: PGS.TS Ngô Xuân Manhướ ̃ ̣ Nhóm th c hi n:ự ệ Nông Th Quỳnh Anhị Lê Th C m Lêị ẩ Nguy n Th Tânễ ị Phan Th Thanhị Nguy n Ph ng Th oễ ươ ả Nguy n Th Tuy tễ ị ế Ph m Thu Trangạ M c l cụ ụ I. What are transgenic plants? II. How are Transgenic Plants made? III. C s c a vi c chuy n gen cà chua chín ch mơ ở ủ ệ ể ậ IV. C chê chuyên gen nh vi khuân Agrobacterium ơ ́ ̉ ờ ̉ tumefaciens V. Chuy n gene đi u khi n t ng h p ethyleneể ề ể ổ ợ VI. Chon loc cây chuyên gen nh nptII genẹ ̣ ̉ ờ VII. Nh ng l i ich cua ca chua chuyên genữ ợ ́ ̉ ̀ ̉ VIII. An toàn c a cà chua bi n đ i genủ ế ổ I. What are transgenic plants? • Transgenic plants result from the insertion of genetic material from another organism so that the plant will exhibit a desired trait. Recombinant DNA techniques (DNA formed by combining segments of DNA from different organisms) are usually used. • Cây tr ng chuy n gen là cây tr ng ngoài ồ ể ồ v t ch t di truy n s n có c a nó còn đ c ậ ấ ề ẵ ủ ượ chuy n thêm v t li u di truy n t các sinh ể ậ ệ ề ừ v t khác đ t o ra các tính tr ng mong ậ ể ạ ạ mu n b ng cách s d ng k thu t tái t ố ằ ử ụ ỹ ậ ổ h p ADN.ợ II. How are Transgenic Plants made? Transgenic plants are made by introducing new or foreign DNA into the genome of the plant by using recombinant techniques. Fours steps are involved in developing transgenic plants. Construction of the recombinant molecule. Transformation techniques. Selection and testing. Backcross and gene stability. Cây tr ng chuy n gen đ c t o ra b ng cách đ a ồ ể ượ ạ ằ ư đo n ADN ngo i vào b genome c a cây tr ng nh ạ ạ ộ ủ ồ ờ s d ng k thu t di truy n.ử ụ ỹ ậ ề Cây tr ng chuy n gen đ c t o ra thông qua 4 b c:ồ ể ượ ạ ướ Thi t k vector tái t h pế ế ổ ợ K thu t bi n n p di truy nỹ ậ ế ạ ề Ch n l c và đánh giáọ ọ Lai l i và t o tính n đ nh di truy nạ ạ ổ ị ề Diêp luc̣ ̣ Enzyme PG Lycopene Hô hâṕ Ethylene Th i gian (ngay)ờ ̀ 0 5 10 15 20 Tinh bôṭ Cac diên biên xay ra khi qua ca chua chiń ̃ ́ ̉ ̉ ̀ ́ III. C S C A S CHUY N GENE Ơ Ở Ủ Ự Ể CÀ CHUA CHÍN CH MẬ 1. Quá trình chín c a cà chuaủ • What are Pectins? Pectin là m t l p ộ ớ polysaccharide ph c ứ t p, nó chi m 35% ạ ế trong c u trúc thành ấ t bào th c v t.ế ự ậ Pectin t o nên k t ạ ế c u đ c tr ng c a ấ ặ ư ủ thành t bào là đ ế ộ v ng ch c.ữ ắ Nó đ c t o thành ượ ạ ch y u t các chu i ủ ế ừ ỗ acid galacturonic dài. • Lúc b t đ u chín, hormone s n sinh ethylene s ho t ắ ầ ả ẽ ạ hóa cho m t s ph n ng hóa sinh.ộ ố ả ứ • M t trong s các ph n ng đó s t o thành m t lo i ộ ố ả ứ ẽ ạ ộ ạ protein đ c g i là polygalacturonase (PG). ượ ọ • Enzyme này xúc tác cho ph n ng th y phân phá v ả ứ ủ ỡ liên k t (1,4)-glycosidic gi a các acid galacturonic ế ữ c a phân t pectin.ủ ử Quá trình trên đã phân gi i pectin t o ả ạ thành các đ n phân. S suy bi n này c a ơ ự ế ủ pectin đã gây ra quá trình m m thành t ề ế bào c a th c ph m nh là cà chua.ủ ự ẩ ư S thay đôi săc tô khi qua ca chua chinự ̉ ́ ́ ̉ ̀ ́ days days days(Mature green) Break Pectin lam cho ̀ tê bao c ng răń ̀ ứ ́ Khi qua chin l p v qua mêm la do qua trinh ̉ ́ ớ ỏ ̉ ̀ ̀ ́ ̀ phân giai pectin do enzyme tê bao sinh rả ́ ̀ PG Polygalacturonase enzyme Pectin lam cho ̀ tê bao c ng răń ̀ ứ ́ S mêm cua qua la nh vao qua trinh ự ̀ ̉ ́ ̀ ờ ̀ ́ ̀ phá huy câu truc cua pectin̉ ́ ́ ̉ PG Polygalacturonase 2. Công nghê đôi ban s dung đê han chê PG ̣ ́ ̉ ử ̣ ̉ ̣ ́ enzyme TATATACGAAGGCAC…… ATATATGCTTCCGTG…… TACGAAGGCAC..TATA ATGCTTCCGTG…ATAT AUGCUUCCGUG P P UACGAAGGCAC… AUGCUUCCGUG UACGAAGGCAC S i kep ARN không thê phiên ma do đó không tao ra ợ ́ ̉ ̃ ̣ enzyme PG SENSE ANTISENSE IV. C chê chuyên gen nh vi khuân ơ ́ ̉ ờ ̉ Agrobacterium tumefaciens Chuyên gen nh vi khuân ̉ ờ ̉ Agrobacterium tumefaciens Câu tao Ti-Plasmid cua ́ ̣ ̉ Agrobacterium tumefaciens Chuyên gen tao ca chua FLAVR SAVR̉ ̣ ̀ TM Đôi t ng tiên hanh chuyên gen là ca ́ ượ ́ ̀ ̉ ̀ chua. Tinh trang chuyên: ham qua trinh mêm ́ ̣ ̉ ̃ ́ ̀ ̀ cua qua thông qua viêc c chê s hoat ̉ ̉ ̣ ứ ́ ự ̣ đông cua enzyme PG ̣ ̉ (Polygalacturonase) Chuyên gen thông qua vi khuân đât ̉ ̉ ́ Agrobacterium tumefaciens Muc đich s dung cho tiêu dung hoăc chê ̣ ́ ử ̣ ̀ ̣ ́ biên san phâm đa đ c th ng mai hoá ̉ ̉ ̃ ượ ươ ̣ ́ San phâm rât an toan cho ng i s dung̉ ̉ ́ ̀ ườ ử ̣ Công nghê ARN ng c nghiạ ượ ̃ Antisense Technology Ca chua chuyên gen đôi ban PG giam ̀ ̉ ́ ̉ ̉ thiêu t i 95% PG enzyme.̉ ớ Ca chua Flavr-Savr chin ngay trên canh ̀ ́ ́ đông nh ng qua vân răn chăc trong môt ̀ ư ̉ ̃ ́ ́ ̣ th i gian dai.ờ ̀ mRNA se băt căp bô sung v i s i đôi ban ̃ ́ ̣ ̉ ớ ợ ́ ̉ v i no d n đ n không tiên hanh dich ma ớ ́ ẫ ế ́ ̀ ̣ ̃ đ c. Do đó enzyme PG không đ c tao ượ ượ ̣ ra, kêt qua la pectin không bi phân huy.́ ̉ ̀ ̣ ̉ ? S đô qua trinh chuyên gen vao ca chua ơ ̀ ́ ̀ ̉ ̀ ̀ thông qua vi khuân ̉ Agrobacterium PG  gene transcription mRNA translation PG  gene transcription mRNA Antisense mRNA translation Antisense Technology Enzyme PG sinh ra se ̃ phá v câu truc pectin ỡ ́ ́ ở thanh t bao lam cho ̀ ế ̀ ̀ qu chuyên trang thai ả ̉ ̣ ́ mêm.̀ Ca chua chuyên gen đôi ban PG se ̀ ̉ ́ ̉ ̃ tao ra l ng PG it h n, thanh tê ̣ ượ ́ ơ ̀ ́ bao se mêm châm h n.̀ ̃ ̀ ̣ ơ Wild-type fruit Antisense PG fruit P G a ct iv ity Days from 1st colour change 0 102 4 6 8 Thay đôi qua trinh chin cua qua nh antisense ̉ ́ ̀ ́ ̉ ̉ ờ RNA The Flavr Savr tomato ripens on the vine – resulting in fuller flavour. It is modified so that it remains firm after harvesting. Flavr Savr Traditional Ripe and Increased Flavour. Ripe but decreased Flavour. The traditional tomato is sprayed with ethylene after shipping to induce ripening. The traditional tomato must be harvested while it is still green and firm so that it is not crushed on the way to the supermarket. Th i gian thu hoach khi ờ ̣ qua chuyên mau săc chin ̉ ̉ ̀ ́ ́ đo tich luy đây đu cac chât̉ ́ ̃ ̀ ̉ ́ ́ Không cân phai x ly qua ̀ ̉ ử ́ ̉ chin băng ethylene, đê cho ́ ̀ ̉ qua chin tr c tiêp trên ̉ ́ ự ́ đông ruông̀ ̣ Qua c ng răn, thanh qua ̉ ứ ́ ̀ ̉ bi phân huy t t lam cho ̣ ̉ ừ ừ ̀ chât l ng qua ôn đinh va ́ ượ ̉ ̉ ̣ ̀ co thê d tr trong kho ́ ̉ ự ữ trong môt khoang th i gian ̣ ̉ ờ daì Thu hoach giai đoan chin ̣ ở ̣ ́ th ng phâm, qua vân con ươ ̉ ̉ ̃ ̀ xanh, khi thu vê vân con ̀ ̃ ̀ hiên t ng hô hâp chin tiêp ̣ ượ ́ ́ ́ (ca chua thuôc loai qua hô ̀ ̣ ̣ ̉ hâp đôt biên) lam giam ́ ̣ ́ ̀ ̉ ham l ng cac chât trong ̀ ượ ́ ́ qua ̉ X ly qua chin băng ử ́ ̉ ́ ̀ ethylene Qua nhanh bi thôi, dâp nat ̉ ̣ ́ ̣ ́ do vo qua mêm̉ ̉ ̀ FLAVOR SAVR Ca chuà Ca chua truyên thông̀ ̀ ́ Bao quan ca chua truyên thông̉ ̉ ̀ ̀ ́ Bao quan ca chua Flavr Savr trên đông ruông̉ ̉ ̀ ̀ ̣ Thanh phân dinh d ng cua ca chua ̀ ̀ ưỡ ̉ ̀ FLAVR SAVR so v i ca chua th ngớ ̀ ườ San phâm ca chua chuyên gen đ c ̉ ̉ ̀ ̉ ượ bây ban trong siêu thì ́ ̣ San phâm đ c th ng mai hoa va san ̉ ̉ ượ ươ ̣ ́ ̀ ̉ xuât thanh đô hôṕ ̀ ̀ ̣ V. Chuy n gene đi u khi n t ng h p ể ề ể ổ ợ ethylene • Khí ethylen • Ethylene co công th c hoa ́ ứ ́ hoc la C2H4, trong câu truc ̣ ̀ ́ ́ phân t co môt liên kêt đôi. ử ́ ̣ ́ Đây la môt chât khi không ̀ ̣ ́ ́ mau, không vi, không gây đôc̀ ̣ ̣ • Môt đăc tinh quan trong cua ̣ ̣ ́ ̣ ̉ khi ethylene la tac dung kich ́ ̀ ́ ̣ ́ thich qua trinh chin cua cac ́ ́ ̀ ́ ̉ ́ loai qua co hô hâp đôt biên ̣ ̉ ́ ́ ̣ ́ (climacteric) hay con goi la ̀ ̣ ̀ cac loai qua co qua trinh chin ́ ̣ ̉ ́ ́ ̀ ́ sau thu hoach, nghia la kê ca ̣ ̃ ̀ ̉ ̉ khi qua đa đ c thu hoach thi ̉ ̃ ượ ̣ ̀ qua trinh chin cua chung vân ́ ̀ ́ ̉ ́ ̃ đ c duy tri nh chuôi, xoai, ượ ̀ ư ́ ̀ đu đu, hông, ca chua... ̉ ̀ ̀ 1. Quá trình t ng h p ethylene ổ ợ trong th c v tự ậ S đô qua trinh tông h p ethylene ơ ̀ ́ ̀ ̉ ợ ở th c vâtự ̣ MACC Adenin ATP MTR MTA SAM MTR-1-P HCN O2 Malonyl CoA CO2 ACC oxidase Ethylene ACC ACC synthetase GACC MTA nudosidase MTR kinase Yang Cycle transaminase L-Methionine SAM synthetase KMBA 2. Đ ng h ng tác đ ng c chê ườ ướ ộ ứ ́ s tông h p ethyleneự ̉ ợ 3. Điêu khiên s chin châm thông qua c ̀ ̉ ự ́ ̣ ứ chê s tông h p ethylene qua chuyên geń ự ̉ ợ ̉ 3.1. c ch s bi u hi n c a gen ACC Ứ ế ự ể ệ ủ synthase. ACC (1-aminocyclopropane-1- carbonxylic acid) synthase là enzyme ch u ị trách nhi m chuy n hóa S-ệ ể adenosylmethiomine (SAM) thành ACC. • T b c th hai t i b c cu i cùng trong quá ừ ướ ứ ớ ướ ố trình sinh t ng h p ethylene. S bi u hi n ổ ợ ự ể ệ c a enzyme b c n tr khi m t antisense ho c ủ ị ả ở ộ ặ m t đo n c a b n sao gen synthase đ c ộ ạ ủ ả ượ chuy n vào trong genome c a th c v t.ể ủ ự ậ 3.2. Chuy n gen ACC deaminase. ể Gen mã hóa cho enzyme này nh n đ c t m t vi ậ ượ ừ ộ khu n đ t (Pseudomonas chlororaphis) không ẩ ấ gây b nh. Vi khu n này có kh năng chuy n hóa ệ ẩ ả ể ACC thành m t phân t khác, nh v y làm gi m ộ ử ờ ậ ả l ng ACC có th nh n đ c đ t o ethylene. ượ ể ậ ượ ể ạ 3.3. Chuy n gen SAM hydrolase. ể Ph ng pháp này cũng ươ t ng t nh ACC ươ ự ư diaminase, b ng cách ằ gi m ti n ch t c a ả ề ấ ủ ethylene. Trong tr ng ườ h p này, SAM đ c ợ ượ chuy n hóa thành ể homoserine. Gen mã hóa cho enzyme này đ c ượ phân l p t th th c ậ ừ ể ự khu n E. Coli T3. ẩ ACC oxidase là enzyme xúc tác cho s ự oxi hóa ACC thành ethylene, b c cu i ướ ố cùng trong con đ ng sinh t ng h p ườ ổ ợ ethylene. Thông qua công ngh anti-ệ sense, gi m s đi u khi n gen ACC ả ự ề ể oxidase d n đ n c ch s hình thành ẫ ế ứ ế ự ethylene. Do đó làm ch m s chín c a ậ ự ủ qu .ả 3.4. c ch s bi u hi n c a gen ACC Ứ ế ự ể ệ ủ oxidase. S đô ơ ̀ vector chuyên gen ̉ ACC deaminase VI. Chon loc cây chuyên gen nh nptII ̣ ̣ ̉ ờ gene Protein NPTII xuc tac cho qua trinh chuyên ́ ́ ́ ̀ ̉ nhom phosphate t adenosine 5’-́ ừ triphosphate (ATP) t i chât khanag khang ớ ́ ́ ́ sinh co nhom adenosineglycoside do đo ́ ́ ́ lam bât hoat cac chât khang sinh.̀ ́ ̣ ́ ́ ́ S co măt cua gen NPTII cho phep chung ự ́ ̣ ̉ ́ ́ ta co thê chon đ c cac cây ca chua ́ ̉ ̣ ượ ́ ̀ chuyên gen thông qua môi tr ng co ̉ ườ ́ ch a chât khang sinh kanamycine.ứ ́ ́ Hoa chât và h ng dân s dung gen nptII ́ ́ ướ ̃ ử ̣ marker Ca chua chuyên gen chin châm̀ ̉ ́ ̣ VII. Nh ng l i ich cua ca chua chuyên genữ ợ ́ ̉ ̀ ̉ Th i h n s d ng s n ph m tăng lên mang ờ ạ ử ụ ả ẩ l i l i ích cho c ng i s n xu t và ng i ạ ợ ả ườ ả ấ ườ tiêu dùng. B o đ m v ch t l ng rau qu trên th ả ả ề ấ ượ ả ị tr ng. Gi đây, nông dân có th ch rau ườ ờ ể ờ qu tr ng thành đ y đ m i thu ho ch. ả ưở ầ ủ ớ ạ Ng i tiêu dùng có th mua đ c hàng hóa ườ ể ượ t t v i giá ti n phù h p.ố ớ ề ợ Nông dân yên tâm khi v n chuy n s n ậ ể ả ph m c a mình trong m t kho ng th i ẩ ủ ộ ả ờ gian dài mà không c n ph i b o qu n ầ ả ả ả l nh.ạ Gi m thi t h i sau thu ho ch. Qu có ả ệ ạ ạ ả đ c ng cao h n qu thông th ng do ộ ứ ơ ả ườ đó nó không b b m d p trong quá ị ầ ậ trình v n chuy n và th i gian l u thông ậ ể ờ ư trên th tr ng lâu h n.ị ườ ơ Kéo dài th i h n s d ng nh ng rau ờ ạ ử ụ ư qu v n t i ngonả ẫ ươ VIII. An toàn c a cà chua bi n đ i genủ ế ổ  1994, th c ph m chuy n gen đ u tiên, ự ẩ ể ầ cây cà chua mang tính tr ng chín ch m đã ạ ậ đ c tr ng và tiêu th m t n c phát ượ ồ ụ ở ộ ướ tri n. T đó, ngày càng nhi u các th c ph m ể ừ ề ự ẩ có ngu n g c t cây tr ng chuy n gen đ c ồ ố ừ ồ ể ượ th ng m i hoá và s d ng trên toàn th ươ ạ ử ụ ế gi i.ớ  Vi c đ a các th c ph m m i này vào b a ệ ư ự ẩ ớ ữ ăn hàng ngày đang làm tăng lên nh ng băn ữ khoăn chính đáng v đ an toàn c a chúng ề ộ ủ đ i v i s c kh e con ng i.ố ớ ứ ỏ ườ Sau khi ti n hành nghiên c u công ngh ế ứ ệ chín ch m và các s n ph m c a nó, các c ậ ả ẩ ủ ơ quan qu n lý c a Hoa Kỳ đã k t lu n r ng ả ủ ế ậ ằ công ngh chín ch m là an toàn, cà chua ệ ậ t o ra nh công ngh này có thành ph n ạ ờ ệ ầ dinh d ng gi ng nh cà chua thông th ng ưỡ ố ư ườ và không có s sai khác v m c đ d ng ự ề ứ ộ ị ứ cũng nh đ c t so v i qu bình th ng.ư ộ ố ớ ả ườ Ngoài ra, các th nghi m đ ng ru ng cho ử ệ ồ ộ th y cà chua chín ch m không gây ra b t kỳ ấ ậ ấ m t s đe d a nào t i nh ng th c v t và ộ ự ọ ớ ữ ự ậ nh ng sinh v t có ích khác.ữ ậ V a qua, B NN&PTNT ừ ộ đã lên ti ng kh ng đ nh ế ẳ ị cây tr ng và s n ph m ồ ả ẩ bi n đ i gen không có ế ổ h i cho s c kh e và ạ ứ ỏ môi tr ng.ườ  Do v y áp d ng công ngh này có th làm ậ ụ ệ ể tăng đáng k hàm l ng dinh d ng c a qu ể ượ ưỡ ủ ả khi đ n tay ng i tiêu dùng và c i thi n đ c ế ườ ả ệ ượ cu c s ng c a nông dân nghèo trong vùng.ộ ố ủ • Tuy nhiên không ph i qu c gia nào cũng có ả ố quan đi m nh v y? B i s đánh giá bây gi ể ư ậ ở ự ờ không nh h ng nh ng không có nghĩa sau ả ưở ư này không nh h ng.ả ưở • Ng i ta đã nghiên c u các cây tr ng chuy n ườ ứ ồ ể gene và th y có hi n t ng di chuy n c a ấ ệ ượ ể ủ gene chuy n t cây vào mao m ch đ t. T ể ừ ạ ấ ừ cây lúa này sang cây lúa khác khi chuy n gene ể ch ng h n. Nh ng hi n t i trên cây cà chua ố ạ ư ệ ạ ch a tìm th y có s thay đ i nào khi chuy n ư ấ ự ổ ể gene chín ch m vào.ậ • Hi n nay châu Âu không cho s d ng ệ ở ử ụ các s n ph m chuy n gene.ả ẩ ể • M các n c đang phát tri n v n cho s ỹ ướ ể ẫ ử d ng r ng rãi có ghi đ y đ các thông tin.ụ ộ ầ ủ • V n đ này hi n nay v n đang đ c tranh ấ ề ệ ẫ ượ cãi trên th gi i. Trong gi i h n bài ti u ế ớ ớ ạ ể lu n này chúng tôi ch xin đ a ra m t s ậ ỉ ư ộ ố v n đ th o lu n m nh trên . Mong m i ấ ề ả ậ ở ư ọ ng i cùng th o lu n.ườ ả ậ Tai liêu tham khaò ̣ ̉ 1. Giao trinh bao quan chê biên nông san ́ ̀ ̉ ̉ ́ ́ ̉ Nguyên Manh Khai (Chu biên) NXBNN 2005̃ ̣ ̉ ̉ 2. Giao trinh sinh ly th c vât – Nguyên Quang ́ ̀ ́ ự ̣ ̃ Sang (Chu biên) NXBNN 2005́ ̉ 3. Tomato with a Delayed Ripening Gene 4. Transgenic Crops 1. 2. www.agbios.com/dbase.php?action=Submit&evidx=69 1. Môt sô tai liêu khac̣ ́ ̀ ̣ ́