Chuyển nạp gen HIV-1 P24 vào lạp thể cây cà chua (solanum lycopersicum l.) bằng phương pháp bắn gen - Phạm Đức Trí

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 242 CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 P24 VÀO LẠP THỂ CÂY CÀ CHUA (Solanum lycopersicum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN Phạm Đức Trí*, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, (*)phamductri75@gmail.com TĨM TẮT: Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum) cùng với gien chọn lọc aadA kháng spectinomycin và streptomycin được thực hiện bằng cách bắn gien vào lá thật và lá mầm. Hepta adaptor được dùng trong những nghiên cứu chuyển gien. Sau ba ngày bắn gien, mẫu được cắt thành những miếng 3 × 3 mm. Lá thật đặt trên mơi trường MS vitamin B5 cĩ bổ sung zeatin 2,0 mg/l, IAA 0,2 mg/l, 50 mg/l spectinomycin; và lá mầm đặt trên mơi trường MS vitamin B5 cĩ bổ sung BA 2,0mg/l, IAA1,0mg/l, Kinetin 0,5 mg/l, 50 mg/l spectinomycin. Tăng dần nồng độ spectinomycin lên đến 300 mg/l qua những lần cấy chuyền. Phân tích PCR gien aadA và gien HIV-1 p24 cho thấy cĩ sự cĩ mặt của băng DNA khuếch đại tương ứng 250 bp, 700 bp trong các dịng cà chua chuyển gien. Kỹ thuật Southern blot phân tích gien HIV-1 p24 tái tổ hợp trong bộ gien lạp thể cây cà chua ở dạng khơng đồng nhất vì cho hai băng DNA khuếch đại tương ứng 5,8 kb của lạp thể chuyển gien và 3,5 kb của lạp thể khơng chuyển gien. Từ khĩa: Solanum lycopersicum, chuyển gien vào lục lạp, gien aadA, giene HIV-1 p24, promoter RRN. MỞ ĐẦU Từ những năm cuối thế kỷ 20, hướng chuyển gen vào lục lạp cây trồng đã được các nhà khoa học quan tâm vì những thuận lợi của nĩ. Obembe et al. (2010), Wang et al. (2009) [11, 17] đã cho rằng, gen lục lạp di truyền theo mẹ sẽ hạn chế sự phát tán gen; số lượng bộ gen trong lục lạp sẽ giúp cho gen mục tiêu biểu hiện ở mức cao hơn khi chuyển gen vào nhân; chuyển gen vào lục lạp được thực hiện theo nguyên tắc tái tổ hợp tương đồng giữa DNA vector và DNA lục lạp, điều này cho phép biết được chính xác vị trí gen được chuyển vào và khơng cịn lo lắng hiệu quả biểu hiện; chuyển gen lục lạp khơng cĩ hiện tượng gen im lặng như trong chuyển gen nhân. Đến nay, những thành cơng từ nghiên cứu chuyển gen vào lục lạp đã tạo ra những cây trồng cĩ khả năng kháng sâu [2], kháng thuốc diệt cỏ [3, 19], những protein dược liệu [6, 8] và đặc biệt là những vaccine từ thực vật [4, 7, 20]. Obembe et al. (2010) [11] cho rằng, vaccine từ thực vật cĩ lợi thế là bỏ qua cơng đoạn lên men, tinh sạch, trữ lạnh, tiêm vơ trùng như vaccine thơng thường. Vaccine kháng nguyên biểu hiện trong lục lạp được bảo vệ khỏi sự phân hủy của acid và enzyme trong bao tử, và được phĩng thích trong ruột khi vách tế bào lục lạp bị phân hủy bởi những vi khuẩn trong ruột. Với việc tiếp cận kỹ thuật hiện đại trong cơng tác chuyển gen lục lạp, nghiên cứu sản xuất protein kháng nguyên HIV-1 p24 từ thực vật là hướng nghiên cứu đang được nhắm đến. Trong nghiên cứu này, chúng tơi thực hiện chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Lycopersicon esculentum) bằng kỹ thuật bắn gen dựa trên những cơng trình của các tác giả Wiebke & Ralph (2009), Nugent et al. (2005), Ruf et al. (2001), Staub et al. (2000), Svab & Maliga (1993), Wurbs et al. (2007), Zhou et al. (2008) [1, 10, 12, 14, 15, 18, 20]. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các giống cà chua được dùng trong nghiên cứu là hai giống thương mại của Cơng ty giống cây trồng Trang Nơng: TN84 và TN386. Chúng tơi sử dụng lá thật và lá mầm cây cà chua làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen. Mơi trường, điều kiện nuơi cấy Mơi trường nuơi cấy in vitro là MS (Murashige, Skoog 1962) + Vitamin B5, 30g/l đường, 8 g/l agar, pH 5,8. Mơi trường tái sinh chồi từ lá cà chua là MS vitamin B5 + 2,0 mg/l Zeatin + 0,2 mg/l IAA. Mơi trường tái sinh chồi từ lá mầm cà chua là MS vitamin B5 + 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l IAA + 0,5 mg/l Kinetin. Mơi trường đồng nuơi cấy là MS vitamin B5 + 1,0 Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho 243 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA. Mơi trường chọn lọc mẫu cà chua chuyển gen kháng spectinomycin là mơi trường tái sinh tối ưu + spectinomycin nồng độ từ 50 mg/l. Tăng dần nồng độ kháng sinh sau mỗi lần cấy chọn lọc. Điều kiện nuơi cấy ở nhiệt độ từ 25-26oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 500-1000 lux đối với mẫu sau bắn gen; nhiệt độ từ 25-26oC, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500-3000 lux đối với mẫu tái sinh chồi và cây con. Vector chuyển gen Plasmid pITB-HIV-1 p24 được chúng tơi thiết kế, được sử dụng làm vector chuyển gen vào lạp thể cà chua. Gen HIV-1 p24 được điều khiển bởi promoter rrn (ribosomal RNA operon promoter) đặc hiệu cho chuyển gen vào lạp thể với trình tự kết thúc của gen TrbcL và gen chọn lọc aadA kiểm sốt bởi promoter rrn và trình tự kết thúc của gen psbA. Cassette chứa những gen này được gài vào giữa hai gen trnfM và trnG của bộ gen lạp thể. Kích thước vector 8344 bp (hình 1). Hình 1. Sơ đồ cấu trúc vector lục lạp plasmid pITB-HIV-1 p24 Phương pháp Tạo cây cà chua in vitro Hạt cà chua mua từ các cơng ty giống cây trồng được khử trùng bằng cồn 70% trong một phút, rửa với nước vơ trùng. Tiếp theo khử trùng bằng nước javel 3,8% được pha thêm nước vơ trùng thành nồng độ 1,9% với thời gian khử trùng 10, 20 và 30 phút. Rửa lại 3 lần với nước vơ trùng. Hạt sau khử trùng được đặt trong mơi trường 1/2 MS cho nảy mầm. Tách chiết plasmid DNA Mơi trường nuơi cấy và giữ giống vi khuẩn E. coli DH5α mang plasmid pITB-HIV-1 p24 là LB (Luria-Bertani) cĩ chứa 100 mg/l ampicillin. Chúng tơi dùng QIAGEN Plasmid Mega kit để tách chiết DNA plasmid dùng làm vật liệu chuyển nạp gen. Qui trình chuyển nạp gen Theo Kikkert et al. (2005), Sanford et al. (1993) [5, 13], chuyển gen vào lạp thể dùng hệ thống bắn gen PDS-1000/He cần hạt vàng cĩ kích thức 0,6 µm, Rupture disks 1.100 psi, áp suất 28 mmHg. Chuẩn bị mẫu chuyển gen: Lá mầm sau 10 ngày nảy mầm, lá thật cà chua sau khoảng 4 tuần nuơi cấy in vitro sẽ được cắt và đặt mặt gân lá hướng lên trên trong đĩa petri đường kính 9 cm chứa mơi trường tái sinh trước một ngày để chuẩn bị bắn gen. Kết dính plasmid DNA vào hạt vàng: Lấy 50 µl dung dịch vàng, vortex 2 phút. Thêm 10 µg DNA (nồng độ 1 µg/1µl). Thêm 50 µl CaCl2 2,5M. Thêm 20 µl spermidine 0,1 M, vortex 3 phút. Thêm 200 µl cồn tuyệt đối. Ly tâm 10.000 vịng/phút trong 10 giây. Loại bỏ phần dịch phía trên tủa. Lập lại lần thứ hai bước này. Thêm 75 µl cồn tuyệt đối và trộn đều dung dịch vàng- DNA 5 giây. Thực hiện thao tác bắn gen: Hút 10 µl vàng/DNA cho vào mỗi Macrocarrier trong hepta, để khơ tự nhiên 5 phút trong tủ cấy vơ trùng. Đặt mẫu ở vị trí khoảng cách từ hạt vàng mang plasmid đến mẫu mơ là 6 cm. Bật cơng tắc và đợi cho đến khi áp suất đạt 28 mmHg. Thực hiện thao tác bắn gen. Quá trình chọn lọc sau bắn gen: Sau khi bắn gen, mẫu được để trong tối 3 ngày trước khi cắt thành từng mẫu 3 × 3 mm cấy vào mơi trường thích hợp cĩ chất chọn lọc spectinomycin và đặt trong điều kiện ánh sáng mờ. Cấy mẫu sang mơi trường chọn lọc mới sau TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 244 mỗi 3 tuần. Nồng độ chất chọn lọc spectinomycin trong mơi trường được tăng dần lên theo thời gian đến 300mg/l. Sau khoảng 6-8 tháng, sẽ nhận được dịng chuyển gen giả định kháng spectinomycin và kiểm tra bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Kiểm tra mơ, cây chuyển gen Những dịng cà chua kháng spectinomycin được tách chiết DNA tổng số bằng kit DNeasy plant (QIAGEN, Đức). DNA này được dùng cho phản ứng PCR và Southern blot. Phân tích PCR Kiểm tra sự hiện diện của gen HIV-1 p24 và aadA trong dịng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật PCR với những cặp mồi đặc hiệu. Gen aadA: mồi xuơi: 5’-AACCTCCTATAGACT AGG C-3’ và mồi ngược: 5’-AGCGAAATG TAGTGCTTACG-3’, chương trình nhiệt: 95oC: 30 giây; 30 chu kỳ (94oC: 1 phút, 52oC: 1 phút, 72oC: 2 phút) 72oC: 5 phút, khuyếch đại đoạn DNA 250 bp. Gen HIV-1 p24: mồi xuơi: 5’- CATATGGCTAGCGGATCCCCTATT-3’ và mồi ngược: 5’-TCTAGAGGAATTCTACTC AGCTTTATGTC-3’, chương trình nhiệt: 95oC: 2 phút; 30 chu kỳ (95oC: 1 phút, 52oC: 1 phút, 72oC: 2 phút) 72oC 5 phút, khuyếch đại đoạn DNA 700 bp. Phân tích Southern blot Phương pháp Nonradioactive Southern blot được dùng để phân tích dịng cà chua chuyển gen. Dùng PCR DIG-labeling kit (Roche) để tạo probe của đoạn gen lục lạp psaB (hình 2). Phản ứng PCR gồm: PCR buffer cĩ MgCl2 5µl, PCR DIG Labeling 5 µl, mồi xuơi 2 µl (10 pM), mồi ngược 2 µl (10 pM), Taq polymerase 0,75 µl, DNA template 1 µl, thêm nước cất vơ trùng vừa đủ 50 µl. Chương trình nhiệt: 95oC: 2 phút, 30 chu kỳ (95oC: 1 phút; 52oC: 1 phút; 72oC: 2 phút) 72oC: 5 phút, khuyếch đại đoạn DNA 543 bp. Cho 5 µg DNA của mỗi dịng chuyển nạp gen và đối chứng âm (cây khơng được chuyển nạp gen) ủ với enzyme giới hạn BglII ở 37oC trong 4 giờ. Mẫu DNA được điện di trên gel agarose 0,8% ở 25vol qua đêm cùng với thang chuẩn  Hind III. Dùng phương pháp của McCabe et al. (1997) [9] chuyển DNA lên màng lai Hybond (GE healthcare) và hiện phim. Hình 2. Sơ đồ probe và enzyme cắt giới hạn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chọn lọc và tái sinh tế bào chuyển nạp gen Trong chuyển nạp gen lục lạp, gen aadA mã hĩa protein aminoglycoside-3′-adenyl transferase cĩ tính kháng spectinomycin và streptomycin. Dịng cây chuyển gen sẽ phát triển xanh tốt cịn cây khơng chuyển gen sẽ cĩ màu xanh nhợt nhạt hoặc trắng và chậm phát triển. Vì khi cĩ mặt trong mơi trường, spectinomycin và streptomycin gắn với ribosome 70S của lục lạp gây ra sự ức chế tổng hợp protein bên trong lục lạp. Trong thời gian đầu, lạp thể chuyển gen trong một tế bào cịn ít, nên khả năng kháng kháng sinh của tế bào chưa cao. Do đĩ, chúng tơi chọn lọc ở nồng độ tối thiểu gây ức chế khả năng tái sinh của mẫu mơ là 50 mg/l spectinomycin. Dưới áp lực của chất chọn lọc, lạp thể chuyển gen sẽ dần thay thế lạp thể khơng chuyển gen, nên khả năng kháng spectinomycin tăng lên đến nồng độ 300 mg/l. Việc cắt nhỏ mẫu sau bắn gen thành 3 × 3 mm cĩ vai trị làm tăng khả năng tái sinh cây do cây cà chua chủ yếu tái sinh từ vết cắt của mẫu lá. Khi đặt mẫu trong điều kiện ánh sáng mờ nhằm tăng số lượng bộ gen trong một lạp thể đồng thời kéo dài thời gian phân chia lạp thể. Với những điều kiện nuơi cấy ở trên cùng với mơi trường tái sinh thích hợp giúp tạo điều kiện tối ưu để nhận được dịng cà chua kháng spectinomycin (hình 3). Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho 245 Hình 3. a. Mơ sẹo sống trên mơi trường cĩ spectinomycin; b. Chồi tái sinh trên mơi trường cĩ spectinomycin. Xác định gen HIV-1 p24 và aadA Một dịng cà chua kháng kháng sinh spectinomycin được tách chiết DNA tổng số để phân tích PCR. Kết quả cho thấy, qua khuếch đại với các cặp mồi đặc hiệu của gen aadA, cĩ sự hiện diện của các băng DNA tương ứng 250bp (hình 4). Tiếp tục dùng dịng cà chua chuyển nạp gen đã cĩ kết quả dương tính gen aadA để phân tích PCR gen HIV-1 p24 với cặp mồi đặc hiệu của gen HIV-1 p24. Kết quả cho thấy, cĩ sự hiện diện của các băng DNA tương ứng là 700bp (hình 5). Những kết quả này trùng với băng đối chứng dương là những gen aadA, HIV-1 p24 trong plasmid pITB HIV-1 p24. Hình 4. Phân tích PCR gen aadA M. Thang chuẩn 1kb (BioLabs); 1. Cây cà chua khơng chuyển gen; 2. Gen aadA của plasmid; 3: Dịng cà chua chuyển gen. Hình 5. Phân tích PCR gen HIV-1 p24 M. Thang chuẩn 1kb (BioLabs); 1. Cây cà chua khơng chuyển gen; 2. Đối chứng dương (Gen HIV-1 p24 của plasmid); 3. Đối chứng âm (nước cất); 4: Dịng cà chua chuyển gen. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 246 Phân tích sự xuất hiện gen HIV-1 p24 trong lục lạp Hệ thống đánh dấu các DNA khơng dùng đồng vị phĩng xạ (nonradioactive), với ưu điểm an tồn, probe ổn định hơn so với hệ thống sử dụng đồng vị phĩng xạ, được chúng tơi sử dụng trong kỹ thuật southern blot. Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng hệ thống phát hiện và đánh dấu khơng dùng phĩng xạ, hoạt động trên cơ sở sử dụng digoxigenin (DIG). Dịng cà chua đã qua kiểm tra PCR tiếp tục được nghiên cứu chứng minh thêm về sự biến nạp gen chuyển trong bộ gen lục lạp bằng kỹ thuật Southern blot, qua đĩ xác định chính xác cây cà chua chuyển nạp gen bền vững và đồng nhất trong lục lạp (homoplasmic) hoặc chưa đồng nhất (heteroplasmic) khi trong tế bào chứa cả hai dạng, lạp thể mang gen cần chuyển và lạp thể khơng mang gen cần chuyển. Dưới áp lực của chất chọn lọc, những lạp thể khơng mang gen chuyển sẽ dần bị loại bỏ và tế bào chỉ cịn loại lạp thể mang gen chuyển. Lúc này kết quả nhận được sẽ là dịng cây chuyển nạp gen đồng nhấtm bền vững. Kết quả thí nghiệm cho thấy, HIV-1 p24 đã được cài vào bộ gen lạp thể của cây cà chua nhưng ở dạng chưa đồng nhất vì cĩ cả hai băng 5,8 kb và 3,5 kb. Đối chứng âm chỉ cĩ băng 3,5 kb, khơng thấy băng DNA 5,8 kb so với các dịng chuyển nạp gen (hình 6). Hình 6. Phân tích Southern blot cây chuyển gen a: Bảng gel điện di cho Southern blot; b: Kết quả phân tích Southern blot; M: Thang chuẩn HindIII; 1: Cây cà chua khơng chuyển gen; 2: Dịng cà chua chuyển gen. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ chuyển nạp gen vào lạp thể cà chua bằng phương pháp bắn gen, cho phép thu nhận được một dịng cà chua TN84 kháng spectinomycin 300 mg/l. Phân tích PCR các gen HIV-1 p24 và aadA nhận được các băng DNA được khuếch đại tương ứng 700 bp và 250 bp. Phân tích Southern blot, chúng tơi xác nhận gen cần chuyển đã vào bộ gen lạp thể đối với dịng chuyển gen nhưng ở dạng chưa đồng nhất. Dịng cà chua này cần tiếp tục chọn lọc, tái sinh để nhận được dịng chuyển gen lạp thể đồng nhất. Lời cảm ơn: Cơng trình được sự hỗ trợ của Văn phịng các Chương trình Khoa học và Cơng nghệ trọng điểm cấp Nhà nước, Ban chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10 đã tài trợ cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Apel Wiebke, Bock Ralph, 2009. Enhancement of Carotenoid Biosynthesis in Transplastomic Tomatoes by Induced Lycopene-to-Provitamin A Conversion. Plant Physiology, 151: 59-66. 2. De Cosa B., Moar W., Lee S. B., Miller M., Daniell H., 2001. Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals. Nature Biotechnology, 19: 71-74. Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho 247 3. Dufourmantel N., Dubald M., Matringe M., Canard H., Garcon F., Job C., Kay E., Wisniewski J. P., Ferullo J. M., Pelissier B., Sailland A., Tissot G. 2007. Generation and characterization of soybean and marker-free tobacco plastid transformants overexpressing a bacterial 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase which provides strong herbicide. Plant Biotechnology Journal, 5: 118-133. 4. Glenz K., Bouchon B., Stehle T., Wallich R., Simon M. M., Warzecha H., 2006. Production of a recombinant bacterial lipoprotein in higher plant chloroplasts. Nature Biotechnology, 24: 76-77. 5. Kikkert J. R., Vidal J. R., Reisch B. I., 2005. Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics. In: Peđa L. (Ed.) Transgenic Plants: Methods and Protocols. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 61-78. 6. Leelavathi S., Reddy V. S., 2003. Chloroplast expression of His-tagged GUS- fusions: a general strategy to overproduce and purify foreign proteins using transplastomic plants as bioreactors. Molecular Breeding, 11: 49-58. 7. Lelivelt C. L., McCabe M. S., Newell C. A., Desnoo C. B., van Dun K. M., Birch- Machin I., Gray J. C., Mills K. H., Nugent J. M., 2005. Stable plastid transformation in lettuce (Lactuca sativa L.). Plant Molecular Biology, 58: 763-774. 8. Magee A. M., Coyne S., Murphy D., Horvath E. M., Medgyesy P., Kavanagh T. A., 2004. T7 RNA polymerase-directed expression of an antibody fragment transgene in plastids causes a semi-lethal pale-green seedling phenotype. Transgenic Research, 13: 325-337. 9. McCabe M. S., Power J. B., De Laat Ad M. M., Davery M. R., 1997. Detection of single- copy genes in DNA from transgenic plants by nonradioaction southern blot analysis. Molecular Biotechnology, 7: 79-84. 10. Nugent G. D., Ten Have M., Van Der Gulik A., Dix P. J., Uijtewaal B. A., Mordhorst A. P., 2005. Plastid transformants of tomato selected using mutations affecting ribosome structure. Plant Cell Report, 24: 341-349. 11. Obembe O. O., Popoola J. O., Leelavathi S., Reddy V. S., 2010. Recent advances in plastid transformation. Indian Journal of Science and Technology, 3(12): 1229-1235. 12. Ruf S., Hermann M., Berger I. J., Carrer H., Bock R., 2001. Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit. Nature Biotechnology, 19: 870-875. 13. Sanford J. C., Smith F. D., Russell J. A., 1993. Optimizing the biolistic process for different biological applications. Methods in Enzymology, 217: 483-509. 14. Staub J. M., Garcia B., Graves J., Hajdukiewicz P. T. J., Hunter P., Nehra N., 2000. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nature Biotechnology, 18: 333-338. 15. Svab Z., Maliga P., 1993. High frequency plastid transformation in tobacco by selection for a chimeric aadA gene. PNAS, 90: 913-917. 16. Verma D., Daniell H., 2007. Chloroplast vector systems for biotechnology application. Plant Physiology, 145: 1129- 1143. 17. Wang Huan-Huan, Yin Wei-Bo, Hu Zan- Min, 2009. Advances in chloroplast engineering. Journal of Genetic & Genomics, 36: 387-398. 18. Wurbs D., Ruf S., Bock R., 2007. Contained metabolic engineering in tomatoes by expression of carotenoid biosynthesis genes from the plastid genome. Plant Journal, 49: 276-288. 19. Ye G. N., Hajdukiewicz P. T., Broyles D., Rodriguez D., Xu C. W., Nehra N., Staub J. M., 2001. Plastid-expressed 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco. Plant Journal, 25: 261- 270. 20. Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 248 Borchers A.-M. Inka, Maloney A. P., Kavanagh T. A., Gray J. C., Bock R., 2008. High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes. Plant Biotechnology Journal, 6: 897-913. PLASTID TRANSFORMATION OF TOMATO (Solanum lycopersicum L.) WITH HIV-1 P24 GENE BY BIOLISTIC PARTICLE DELIVERY SYSTEM Pham Duc Tri*, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology SUMMARY Plastid transformation in tomato (Solanum Lycopersicum L.) is carried out using vector carrying HIV-1 p24 gene and a selection of aadA gene, spectinomycin for resistance to antibiotics, and streptomycin. We used the hepta adaptor to replace the rupture disk retaining cap and microcarrier launch assembly. Three days after bombardment, the leaves and cotyledons were cut into small pieces each of 3 × 3 mm and placed on medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l Zeatin, 0.2 mg/l IAA, 50 mg/l spectinomycin for leaves, and medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l BAP, 1.0 mg/l IAA, 0.5mg/l Kinetin, 50 mg/l spectinomycin for cotyledons. Selected further time on the medium containing spectinomycin was up to 300 mg/l. PCR analysis of aadA and HIV-1 p24 genes of the tomato plastid transformation lines showed the presence of DNA amplification with the corresponding 250bp and 700bp. Southern blot analysis confirmed that the foreign genes were inserted into the tomato plastid genome. The result indicated the presence of HIV- 1 p24 in the tomato plastid genome with the presence of DNA band of 5.8 kb. However, it is heteroplasmic transformant because it has a DNA band of 3.5 kb of wide type plant. Keywords: Chloroplast transformation, Solanum lycopersicum L., HIV-1 p24 gene, aadA gene, promoter RRN. Ngày nhận bài: 21-6-2012