Chuyên đề Tổng quan về chitosan và ứng dụng trong bảo quản thịt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BM CƠNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỊT CÁ-THỦY SẢN ************************** CHUYÊN ĐỀ TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT Giáo viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Hiền Sinh viên thực hiện : HC07SH Tháng 06/2011 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỊT Thịt 1.1 Khái niệm về thịt Thịt là một trong những sản phẩm cĩ giá trị dinh dưỡng cao. Từ thịt cĩ thể chế biến ra nhiều mĩn ăn thơm ngon và giàu chất bổ. Lượng thịt và các loại thịt được sử dụng trong bữa ăn hàng ngày phản ánh mức sống của xã hội. Hiện nay trên thị trường cĩ nhiều loại thịt, nhưng phổ biến vẫn là thịt lợn, thịt gà và thịt bị. Thịt gia súc, gia cầm là tổ hợp các loại mơ khác nhau như mơ cơ, mơ mỡ, mơ sụn, mơ xương … Giá trị của thịt phụ thuộc vào tỉ lệ giữa các mơ và chất lượng của chúng. Căn cứ váo cấu tạo thịt được phân thành các loại: bì(da), thịt nạc, thịt mỡ và xương. Về cấu tạo thịt gia súc, gia cầm là giống nhau, nhưng cấu trúc protein trong thịt gia cầm đơn giản hơn, các bĩ sợi cơ nhỏ ngắn hơn, mơ liên kết trong thịt gia cầm ít hơn trong thịt gia súc. Mơ mỡ của gia cầm ít xen kẽ giữa các mơ cơ và trong thành phần của thịt nạc.[1] 1.1.1. Thành phần dinh dưỡng của thịt Thịt động vật nuơi sau khi giết mổ gồm cĩ các thành phần hĩa học như: nước, protein, lipit, gluxit, muối khống và vitamin. Protein cĩ trong thịt tươi khoảng 15-20%, gồm chủ yếu là protein hồn thiện. Độ đồng hĩa của protein thịt là 96-97% . Do vậy thịt là nguồn cung cấp thức ăn protein quan trọng trong khẩu phần của con người. Lipit trong thịt thường ở dưới da, ở khoang bụng, bao quanh nội tạng và cĩ ở xương. Hàm lượng chất béo ở dạng là 0,5-50% (tùy thuộc vào từng loại thịt). Thành phần chất béo trong thịt khá phức tạp, chúng được cấu tạo từ các axit béo khác nhau. Các axit béo này tạo nên giá trị chất béo của thịt, tạo nên màu sâu, nhiệt độ nĩng chảy và độ đồng hĩa khác nhau.Độ đồng hĩa mớ động vật phụ thuộc vào độ nĩng chảy của các axit béo tạo nên chúng. Thí dụ: Mỡ lợn cĩ nhiệt độ nĩng chảy là 34-440C và cĩ độ đồng hĩa là 97-98%; mỡ bị nĩng chảy ở nhiệt độ là 45-520C cĩ độ đồng hĩa là 90%. Gluxit cĩ trong thịt một lượng rất nhỏ (khoảng 0,4-0,8 %) ở dạng glycogen cĩ chủ yếu trong gan. Khi nấu chất này tan trong nước hết. Muối khống khá phong phú trong thịt nĩi chung. Thịt cĩ nhiều mỡ thì ít muối khống. Các muối khống trong thịt cĩ: Ca, P, Mg, Zn, Co, Cu, Fe, Se … trong đĩ cĩ nhiều là Ca, P, Mg. Các chất này tập trung ở trong xương là nhiều nhất. Vitamin cĩ ở trong thịt như vitamin A, B1 , PP, C, B12… Lượng vitamin cĩ thể ở phụ tạng như gan, thận, tim ,não. [1] Giới thiệu khái quát thành phần hĩa học của một số loại thịt. Loại thịt Nước (%) Protein (%) Lipit (%) Chất khống (%) Năng lượng (Kcal) Thịt bò 75,8 21,0 3,0 1,2 285 Thịt lợn 72,9 21,5 37,5 1,1 406 Thịt bê 78,2 20,0 0,5 1,3 87 Thịt gà 65,6 20,3 13,1 1,0 205 Thịt ngỡng 46,1 14,0 39,2 0,7 422 Thịt vịt 35 11,4 53,0 0,5 540 1.1.2. Cấu trúc của thịt Phụ thuộc vào vai trị ,chức năng và thành phần hĩa học ,người ta chia thịt thành các loại mơ như sau: mơ cơ, mơ liên kết , mơ xương , mơ mỡ, mơ máu. Mơ cơ: Đây là loại mơ chiếm tỉ lệ cao nhất trong cấu tạo của thịt. Nĩ bao gồm nhiều sợi tơ cơ xếp thành bĩ, các sợi cơ được cấu tạo từ miozin hoặc actin. Chức năng chủ yếu của nĩ là thực hiện hoạt động co giản . Thành phần hố học của mơ cơ : nước chiếm tỉ lệ: 72%-75% , protein: 18%-21%. Cịn lại là các thành phần khác: glucid, lipit, khống, vitamin… mơ liên kết: Đây là loại mơ được phân bố rộng rãi cĩ vai trị liên kết các sợi tơ cơ ,các bĩ cơ lại với nhau ,tạo cấu trúc chặt chẽ cho thịt . mơ mỡ: Mơ mỡ được tạo thành từ các tế bào mỡliên kết với nhau dưới dạng lưới xốp. Lượng mơ mỡ trong cấu trúc thịt nhiều hay ít phụ thuộc vào giống lồi, giới tính và điều kiện nuơi dưỡng. Các kiểu hư hỏng của thịt trong giai đoạn trước và sau thu hoạch 1.2.1 giai đoạn của thịt trước và sau thu hoạch Động vật sau khi chết, các tính chất quan trọng của thịt đều thay đổi căn bản.Sự trao đổi chất trong các mơ chết ngừng lại và những quá trình hĩa sinh thuận nghịch bởi enzyme chuyển thành những quá trình khơng thuận nghịch. Các quá trình tổng hợp bị đình chỉ và hoạt động phá hủy của các enzyme nổi lên hang đầu. Dựa vào những biểu hiện bên ngồi, ta cĩ thể chia sự biến đổi của thịt sau khi chết thành ba thời kỳ chính: quá trình tê cứng, quá trình tự phân và quá trình phân hủy thối rữa. Quá trình tê cứng: Ngay sau khi chết, mơ cơ thịt tươi nĩng bị suy yếu, cĩ độ ẩm nhỏ, mơi trường pH gần 6,8 mùi thơm và vị thể hiện khơng rõ ràng. Sau khi động vật đình chỉ sự sống trong mơ cơ sự tê cĩng sẽ bắt đầu Biểu hiện bên ngồi cứng và cĩ sự co ngắn của mơ cơ. Thời gian tê cứng diễn ra phụ thuộc vào đặc tính con vật và nhiệt độ mơi trường. Thịt bị ở nhiệt độ 15 - 18o C sự tê cĩng hồn tồn bắt đầu xảy đến sau 10 - 12 giờ, ở nhiệt độ gần 0oC diễn ra sau 18 - 24 giờ. Vào lúc này độ rắn của thịt tăng khoảng 25%, thịt như thế cĩ độ rắn lớn kể cả sau khi nấu. Tê cĩng sau khi chết của bắp cơ là kết quả của sự phát triển các quá trình hĩa sinh phức tạp do enzyme mà đặc trưng của nĩ khác với các quá trình khi sống. Đĩ chủ yếu là các quá trình phân giải: glycogen, creatinphosphat, adenosintriphosphat, sự tạo thành phức actomyosin … Quá trình tự phân (chín tới) của thịt Chín tới đĩ là tập hợp những biến đổi về tính chất của thịt, gây nên bởi sự tựphân sâu sắc, kết quả là thịt cĩ được những biểu hiện tốt về hương thơm và vị,trở nên mềm mại tươi ngon, so với thịt ở trạng thái tê cứng, cĩ độ ẩm lớn hơnvà dễ bị tác dụng của enzyme tiêu hĩa hơn. Tốc độ phát triển quá trình tự phân trong thịt khơng những phụ thuộc vào nhiệt độ, mà cịn phụ thuộc vào lồi, tuổi, bộ phận trên súc thịt và trạng thái động vật trước khi giết. Quá trình tự phân cĩ thể điều chỉnh được bằng cách thay đổi nhiệt độ bảo quản. Nhiệt độ 1 - 2oC thời gian chín tới hồn tồn khoảng 10 -14 ngày ; nhiệt độ 10 - 15oC khoảng 4 - 5 ngày ; nhiệt độ 18 - 20oC khoảng 3 ngày. Thịt bảo quản 4 ngày đêm ở 16 - 18oC hoặc 6 ngày đêm ở 8 - 10oC cĩ tính chất cảm quan tương tự thịt bảo quản 14 ngày ở 0oC Quá trình chín tới sinh ra acid lactic, làm giảm mơi trường pH xuống khoảng 5 - 6 , hạn chế được sự phát triển của vi sinh vật cĩ tác dụng tốt đến quá trình bảo quản. Ta cĩ thể dựa vào trị số pH để đánh giá thịt tươi hay khơng tươi. Trong thực tế, tùy theo mục đích chế biến mà người ta đề nghị thời gian chín tới khác nhau. Thịt dùng để nấu nướng, nên duy trì 10 - 14 ngày ở nhiệt độ 0 - 4oC, khi đĩ các tính chất cảm quan đạt tới tối thích. Nếu việc chế biến thịt dự định vào thời kỳ đầu của quá trình tự phân (sản xuất xúc xích) hoặc thịt dự định làm lạnh đơng, thì duy trì trong thời gian 24 - 48 giờ là đủ. Quá trình phân hủy thối rữa: Sau quá trình tự chín nếu bảo quản khơng tốt thì đi đến quá trình thối hỏng. Giai đoạn thối rữa do vi sinh vật gây nên, các vi sinh vật hoạt động tạo ra các men phân hủy protein, lipid thành các hợp chất Indol, NH3 , H2S … Sự nhiễm vi sinh vật ở thịt khi động vật cịn sống khơng đáng kể, chủ yếu là do sự nhiễm vi sinh vật trên bề mặt sau khi giết mổ. Mức độ nhiễm vi sinh vật tùy thuộc vào điều kiện vệ sinh khi giết mổ và bảo quản. Vận tốc xâm nhập của vi khuẩn hiếu khí vào lớp sâu 2 ÷ 10cm trong thịt dao động vào khoảng 1 ÷ 2 ngày ở nhiệt độ phịng ; vào lớp sâu 1cm sau 20 ngày ở nhiệt độ 0oC. Sự phân hủy thịt diễn ra theo hai hướng: từ ngồi vào do các vi sinh vật hiếu khí và từ trong ra do các vi sinh vật kỵ khí Sự phân hủy protein là nguyên nhân làm ẩm ướt bề mặt và xuất hiện chất nhầy,đồng thời với sự tiết chất nhầy trên bề mặt thịt phân hủy, màu sắc, mùi, độ chắc và các chỉ tiêu khác của thịt cũng bị biến đổi. Thịt màu đỏ đầu tiên chuyển sang màu nhợt nhạt rồi sang màu xanh nhạt. Các dấu hiệu phân hủy thối rữa ở các mơ khác nhau xuất hiện vào các thời kỳ khác nhau. Độ bền vững đối với sự phân hủy thối rữa của các mơ tăng lên theo thứ tự như sau: mơ máu, mơ cơ, mơ mỡ, mơ liên kết. [1] 1.2.2 Các dạng hư hỏng của thịt Thịt là loại thực phẩm cĩ giá trị dinh dưỡng cao, rất thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sự nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm cĩ thể do động vật bị bệnh, do điều kiện vệ sinh khu vực giết mổ … các vi khuẩn và bào tử nấm cĩ thể xâm nhập và gây hư hỏng thịt. Yếu tố quyết định tốc độ quá trình hư hỏng thịt là nhiệt độ và độ ẩm tương đối của khơng khí và mức độ nhiễm vi sinh vật ban đầu. Sự hư hỏng thịt thường thể hiện qua các dạng thối rữa, hĩa nhầy, lên men mốc, đổi màu … Sự thối rữa thịt: Phân hủy thối rữa là sự biến đổi phức tạp đặc trưng nhất xảy ra trong thịt. Trong đĩ sự phân giải protein đĩng vai trị quan trọng trong sự phân hủy thối rữa do hoạt động của các vi sinh vật trên bề mặt thịt gây ra và được chia làm 3 giai đoạn: -Quá trình thủy phân protein dưới tác dụng của enzyme protease do vi sinh vật tiết ra tạo thành nhiều sản phẩm trung gian và cuối cùng là các acid amin. -Quá trình khử acid amin thành amoniac, acid (acetic, propyonic, butyric),rượu (propyolic, butylic, amylic), H2S, indol, skatol -Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân hủy sơ bộ acid amin lại tiếp tục chuyển hĩa. Tùy theo loại vi sinh vật và điều kiện mơi trường mà các hợp chất đĩ cĩ thể bị oxy hĩa hồn tồn cho ra các hợp chất vơ cơ như CO2 , H2O, NH3 , H2S . Trong điều kiện kỵ khí sẽ cho ra các acid hữu cơ, rượu, amin, trong đĩ cĩ nhiều chất độc và mùi hơi thối. Quá trình thối rữa càng sâu, thì vi khuẩn yếm khí càng nhiều. Khi đĩ mơ thịt cĩ màu xám hoặc xám xanh, mềm nhũn, mất tính đàn hồi, cuối cùng nát vữa, pH cũng chuyển từ mơi trường acid yếu đến mơi trường kiềm. Các chất khí cĩ mùi khĩ chịu cũng thốt ra và tăng lên dần. Các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh như là Bacterium Vulgaris, Bacterium Paecalis … vi khuẩn yếm khí Bacillus Spectogennes, Bacillus Putripicus, Baccillus Putripiciens, Bacillus Postamus ... Sự hĩa nhầy bề mặt: Đây là dạng hư hỏng thường gặp ở thịt bảo quản lạnh, nhất là độ ẩm của khơng khí cao ( trên 90%) sự hĩa nhầy gây ra bởi các giống trực khuẩn chịu lạnh, hiếu khí, khơng nha bào thuộc giống Achromobacter và Pseudomonas. Nhiệt độ tối ưu cho sự hĩa nhầy khoảng 2 ÷ 10oC, ẩm độ thấp thì thịt chĩng mất nước. Vì vậy nhiệt độ bảo quản thích hợp là từ 0 ÷ 2oC, ẩm độ tương đối của khơng khí tương ứng là 85 ÷ 90%. Sự lên men chua: Hiện tượng này thường gặp ở thịt khơng được làm sạch hết máu khi giết mổ và trong nhiều trường hợp khơng làm lạnh. Vi khuẩn gây ra quá trình này thường trực khuẩn yếm khí Bacillus Putripacens. Sự lên men chua biểu thị bằng sự xuất là hiện mùi chua khĩ chịu, thịt bị xám và mềm nhũn. Sự mốc thịt: Sự mốc thịt gây ra do sự phát triển của các lồi nấm mốc trên bề mặt thịt. Quá trình mốc thường bắt đầu bằng sự xuất hiện trên bề mặt thịt những vết chấm hoặc những mạng tơ cĩ màu trắng, về sau những vết đĩ lây lan dần và cĩ màu đậm hơn. Nấm mốc thuộc họ Mucoreadae tạo thành những vệt trắng xám, Clasosporium Herbarium tạo thành những vết đen. Nấm Penicillinium tạo thành vết xanh. Nhiều nấm mốc phát triển ngay cả nhiệt độ - 8oC. Nấm mốc phát triển trên bề mặt thịt khơng làm cho thịt bị biến đổi sâu sắc, tức thời nhưng nĩ chuẩn bị cho các vi khuẩn thối rữa hoạt động sau này. Sự biến màu: Màu sắc thịt phụ thuộc vào lượng và dạng của myoglobin, một chất màu với nhiều dạng tồn tại khác nhau. Myoglobin cĩ liên quan với việc lưu trữ và vận chuyển oxy trong mơ cơ. Nồng độ myoglobin thay đổi giữa các lồi và giữa các loại cơ bắp.[3] Khi oxy được đưa vào hoặc khi thịt được tiếp xúc với khơng khí, myoglobin bị oxy hĩa trở thành oxymyoglobin cĩ màu đỏ hồng đào, màu mà người tiêu dùng mong đợi khi mua sản phẩm. Nếu oxy bị khử, oxymyoglobin phục hồi màu myoglobin sẫm trở lại. Trong một khoảng thời gian và dưới điều kiện khơng khí cĩ thể thay đổi từ vài giờ đến vài ngày, oxymyoglobin tiếp tục bị oxy hĩa mạnh hơn tạo thành metmyoglobin. Đây là sắc tố chịu trách nhiệm về sự biến màu nâu của sản phẩm đồng nghĩa với thịt phi thương phẩm (Kerry et al., 2000). Myoglobin và oxymyoglobin là những protein chứa heme trong đĩ cĩ mặt Fe2+, trong khi metmyoglobin chứa Fe3+. [16] Hình: Màu sắc của thịt ở các dạng khác nhau của myoglobin 1.3 Các phương pháp bảo quản thịt 1.3.1 Phương pháp xử lý lạnh Là phương pháp tốt để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự hư hỏng của sản phẩm và duy trì đầy đủ các tính chất tự nhiên ban đầu của thịt. Thường sử dụng hai phương pháp xử lý lạnh sau : -Phương pháp làm lạnh thịt : là quá trình hạ thấp nhiệt độ của thịt xuống nhưng nhiệt độ đĩ lớn hơn nhiệt độ đĩng băng của dịch mơ. Nhiệt độ làm lạnh thường dùng là từ 0 - 40C. -Phương pháp lạnh đơng thịt : là quá trình hạ thấp nhiệt độ của thịt xuống thấp hơn điểm đĩng băng của dịch mơ. Nhiệt độ tốt nhất để lạnh đơng thịt bị từ -15 - -200C thịt heo, bê, cừu từ -12 - -150C với độ ẩm từ 80 - 85%. Phương pháp lạnh đơng thường ít được sử dụng vì làm giảm chất lượng thực phẩm, khơng hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên, do tính chất thời vụ của dự trữ và giết mổ gia súc, buộc phải làm lạnh đơng thịt để bảo quản lâu dài. Khi bảo quản lạnh trong súc thịt diễn ra các biến đổi vật lý và hĩa học của mơ cơ cũng như các quá trình vi sinh vật. Thịt trở nên chắc, mùi vị phát triển dần qua giai đoạn chín tới. Màu sắc súc thịt tiếp tục biến đổi do sự oxy hĩa hemoglobin và mioglobin. Bảo quản lạnh lâu sẽ diễn ra sự biến đổi hĩa học ở mơ mỡ do sự thủy phân và sự oxy hĩa chất béo. Bên cạnh đĩ cũng cĩ thể diễn ra hiện tượng ơi thịt do vi sinh vật, dấu hiệu phát triển vi sinh vật trên súc thịt là sự xuất hiện dịch nhầy, nấm mốc … Để kéo dài thời gian bảo quản thịt lạnh, cĩ thể phối hợp với các biện pháp như :dùng khí cacbonic, khí ozon, tia tử ngoại và chất kháng sinh. Thời gian bảoquản thịt lạnh ở nhiệt độ 00C với nồng độ khí CO2 từ 10 - 20% đạt khoảng 50 ngày, tăng gần 2 lần so với bảo quản trong khơng khí. Thời gian bảo quản thịt lạnh phối hợp với sử dụng khí ozon đã tăng lên gấp rưỡi so với bảo quản thường 1.3.2 Phương pháp ướp muối: Ướp muối thịt để bảo quản là phương pháp cổ truyền được sử dụng nhiều trong nhân dân. Cĩ thể ướp kéo dài từ vài ngày đến vài tuần hoặc ướp thời gian ngắn(vài giờ). Cĩ thể ướp muối khơ hoặc ướp muối ướt hoặc phối hợp cả hai cách.Cĩ thể kết hợp ướp muối với bảo quản lạnh để kéo dài thời gian bảo quản.natrinitrit, kalinitrit), các chất gia vị như hồi quế, gừng, tỏi, đường, … Nguyên liệu dùng để ướp muối là NaCl, các chất phụ gia (natrinitrat, kalinitrat,natrinitrit, kalinitrit), các chất gia vị như hồi quế, gừng, tỏi, đường, … Tác dụng của muối ăn là làm cho thịt mặn, nâng cao tính chất bền vững của sản phẩm khi bảo quản, xúc tiến các quá trình oxy hĩa các thành phần trong thịt làm cho sản phẩm thay đổi màu. Ngồi ra cịn tạo áp suất thẩm thấu và giảm độ ẩm của sản phẩm, giảm tỷ lệ oxy hịa tan trong mơi trường làm ức chế các vi sinh vật hiếu khí. Trong quá trình ướp muối thường xảy ra một số hiện tượng làm giảm chất lượng sản phẩm như sự mất nước và mất một số thành phần protid tan của thịt. Mức độ ngấm muối phụ thuộc vào tính chất của thịt, nồng độ muối, nhiệt độ và thời gian ướp muối. Thịt nạc thường ngấm muối nhanh hơn thịt mỡ. 1.3.3. Phương pháp xơng khĩi: Xơng khĩi thịt cĩ thể tiến hành ở các khoảng nhiệt độ : từ 18 ÷ 200C gọi là xơng khĩi lạnh ; từ 35 ÷ 500C gọi là xơng khĩi ấm ; từ 70 ÷ 1200C gọi là xơng khĩi nĩng. Các chế độ nhiệt của quá trình xơng khĩi cĩ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm do cĩ nhiều biến đổi sâu sắc trong thịt. Nhiên liệu để tạo khĩi là gỗ, mùn cưa, vỏ bào của các loại gỗ cĩ hương thơm như sồi, trầm, ổi, mít, …khơng dùng gổ cĩ nhựa như thơng vì trong khĩi cĩ nhiều bồ hĩng làm cho sản phẩm cĩ màu sẫm và vị đắng. Độ ẩm nhiên liệu khoảng 30%, nhiệt độ lị đốt 300 ÷ 3500C thì cho khĩi tốt nhất (khĩi cĩ màu vàng sẫm). Tác dụng bảo quản của khĩi chủ yếu là do các hợp chất phenol. Nĩ được hấp thu chọn lọc và thấm sâu vào súc thịt. Mơ mỡ hấp thu nhiều hơn mơ cơ. Thịt cĩ độ ẩm cao hấp thu nhiều hơn thịt cĩ độ ẩm thấp. Khĩi cĩ tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn làm hỏng thịt, chống oxy hĩa thành phần chất béo khơng no trong thịt, cải thiện mùi, vị, màu sắc của thịt. 1.4 hệ vi sinh vật trên thịt 1.4.1 nguồn lây nhiễm Sản phẩm thịt tươi lấy từ mơ khoẻ được coi là vơ trùng và sự lây nhiễm vi sinh vật cĩ hai nguồn chính: - Do bản thân vật: do vật bị ốm, bị bệnh… vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật kí sinh phát triển trên vật đĩ nên khi mổ xẻ thì lây sang mơ thịt. Thức ăn mà các gia súc ăn trước khi giết mổ cũng là nguồn lây nhiễm vi sinh vật từ bên trong cho thịt. - Do mơi trường bên ngồi: trong quá trình giết mổ, pha chế, vận chuyển, chế biến. Da và lơng cĩ lượng vi sinh vật lớn, ngồi ra cĩ hệ vi sinh vật đường ruột (106-108 tb/kg), khi giết mổ thì vi sinh vật lây nhiễm vào cơ thịt. Trong quá trình vận chuyển vi sinh vật trong đất, khơng khí, nước, dụng cụ, áo quần cơng nhân lây nhiễm sang thịt. Trong quá trình sơ chế, chế biến nếu thanh trùng khơng kỹ thì dạng bào tử vi sinh vật vẫn cịn trong sản phẩm thịt, nếu mơi trường tốt và cĩ đủ điều kiện bào tử sẽ phát triển thành sợi dinh dưỡng vì vậy thịt cũng bị lây nhiễm. Hay do nguyên liệu ban đầu đã bị nhiễm vi sinh vật. 1.4.2 hệ vi sinh vật trên thịt Vi sinh thấy ở thịt chủ yếu trên bề mặt miếng (hoặc xúc thịt) và dần phát triển tăng số lượng đặc biệt là những miếng thịt giữ ở điều kiện nĩng ẩm làm cho số lượng tăng lên nhanh, làm cho thịt chĩng bị hư hỏng. Ở đây thường gặp các loại mốc thuộc các giống Cladosporium, Sporotrichum, Oospora (Geotrichum), Thamnidium, Mucor, Penicillium, Antrnaria, Monilia… các giống vi khuẩn Bacillus subtilis, B.mesentericus, B. mycoides, B. megatherium, Clostririum sporogenes, Cl. Putrificus, các dạng khác nhau của cầu khuẩn, các dạng Coliform, Bacterium faecalis ancaligenes, Proteus vulagaris, Pseudomonas liquefaciens, Micrococcus anaerobis… trong các số vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ thấp cĩ Achromobacter, Pseudomonas. Một số nấm men cũng thấy ở thịt. Các vi khuẩn gây bênh cho người cĩ thể thấy ở đây như Brucella, Sulmonella, Streptococcus, Staphyloccus, Mycobacterium tuberculosis……[3] 1.4.3 bệnh liên quan tới vi sinh vật trên thịt Một số bênh của gia súc cĩ thể chuyển qua người như bênh thương hàn, phĩ thương hàn, bệnh lỵ trực trùng, bệnh tả, bệnh lở mồm long mĩng, bệnh tai xanh ở lợn, bệnh lao bị, bệnh nhiệt thán (bệnh than), bệnh bị điên, bệnh cúm gia cầm … Các bện này do tác nhân là vi sinh vật cĩ thể truyền từ vật sang người thành bệnh hoặc thành dịch bệnh. [3] 1.4.4 vi sinh vật gây thối 1.4.4.1 Các vi sinh vật tham gia vào quá trình gây thối [2] Các lồi vi sinh vật gây thối cĩ enzyme hỗn hợp Lồi vi sinh vật thuộc nhĩm này cĩ khả năng phân hủy khơng chỉ protit mà cịn phân hủy cả gluxit và lipit. Thơng thường các lồi vi sinh vật cĩ enzyme hỗn hợp thường phát triển và phân hủy các thành phần dinh dưỡng trên thịt trước. sau đĩ là sự phát triển của các vi sinh vật khác. các lồi vi sinh vật gây thối cĩ enzyme đơn Lồi vi sinh vật thuộc nhĩm này chỉ cĩ khả năng sinh tổng hợp một vài loại enzyme riêng biệt và chỉ cĩ thể thực hiện một vài phản ứng riêng rẽ. chúng thường phát triển và thực hiện các phản ứng gây thối sau khi nhĩm các lồi vi sinh vật cĩ enzyme hỗn hợp phát triển. Bảng vi sinh vật gây thối Nhĩm vi sinh vật Dạng phân hủy Kiểu gây thối Kỵ khí Hiếu khí Nhĩm vi sinh vật cĩ enzyme đơn Phân hủy protein Bacillus putrificus Bacillus Histolytics Bacillus coligenes Bacillus pyocyaneum Bacillus mensenterucus Phân hủy peptit Bacillus Ventriculosus Bacillus orbiculus Phân hủy axit amin Bacillus faccalis Alcaligenes Proteus zenkirii Nhĩm vi sinh vật cĩ enzyme hỗn hợp Phân hủy protein B. perfrigenes B. sporogenes Streptococus Straphylococcus Proteus vulgaris Phân hủy peptit B. bifidus B. acidophilus B. butyricus Phân hủy axit amin B. lactic aerogenes B. aminophilus B. coligenes 1.4.4.2 Diễn biển của quá trình gây thối [2] Giai đoạn gây thối Vi sinh vật tham gia Hiện tượng chuyển hĩa Giai đoạn đầu (0 giờ - 24 giờ ) Thịt nhiễm rất nhiều loại khác nhau. Trong đĩ đáng kể nhất là: Diplococcus Streptococcus Staphylococcus Coli paracoli Sinh khối vi sinh vật bắt đầu tăng Giai đoạn 2 (sau 24 giờ) Streptococcus và staphylococcus cĩ nhiều hơn cả Gluxit bị phân hủy nen mơi trường trở nên axit Giai đoạn 3 (đến ngày thứ 3) E.coli phát triển mạnh khống chế các vi sinh vật khác Hình thành nhiều amoniac, pH được chuyển sang trung tính. Cuối giái đoạn này lại thấy sự phát triển của nhiều vi sinh vật,xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn rất rõ Bắt đầu giai đoạn hĩa peptone. Thịt mềm, nhớt, pH trở về trung tính và kiềm, bắt đầu cĩ mùi thối Giai đoạn 4 (đến ngày thứ 5) Giai đoạn phát triển nhiều vi khuẩn kỵ khí. Trong đĩ thấy B. perfrigenes phát triển rất nhiều Thịt cĩ mùi ammoniac hydrosulfua rất rõ. Gluxit bị phân hủy, lipit bị xà phịng hĩa protit phân hủy mạnh làm tăng pepton Giai đoạn 5 (tuần lễ thứ 2) Vi sinh vật phát triển mạnh là B. putrificus, Proteus vulgari Bắt đầu quá trình thối rữa. Hàm lượng peptone và axit amin đều tăng. Ngồi ra cịn thấy cĩ NH3, axit béo tự do, phenol, indol, skatol mercaptan. Giai đoạn 6 (tuần lễ thứ 3) Vi khuẩn kỵ khí chuyển thành nha bào Hiện thượng thịt thối ở mức độ cao nhất. Amoniac tạo thành ức chế nhiều lồi vi sinh vật. Khối thịt trở nên nhão 2 Chitosan 2.1. Khái niệm và lịch sử phát hiện Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ơng đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nĩ. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ơng gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp cĩ nghĩa là vỏ giáp, nhưng ơng khơng phát hiện ra sự cĩ mặt của nitơ trong đĩ. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin cĩ dạng cơng thức giống với cellulose. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật khơng xương sống như: cơn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun trịn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mơ da nĩ giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin cĩ ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... Chitin cĩ cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ở dạng rắn.Do đĩ, các phương pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, và phương pháp hố học để biến tính chitin cũng như việc sử dụng và lựa chọn các ứng dụng của chitin gặp nhiều khĩ khăn.[6] Cịn chitosan chính là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn,xốp, nhẹ, hình vảy, cĩ thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau. Chitosan được xem là polymer tự nhiên quan trọng nhất. Với đặc tính cĩ thể hồ tan tốt trong mơi trường acid, chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm ... Giống như cellulose, chitosan là chất xơ, khơng giống chất xơ thực vật, chitosan cĩ khả năng tạo màng, cĩ các tính chất của cấu trúc quang học…Chitosan cĩ khả năng tích điện dương do đĩ nĩ cĩ khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và acid mật. Chitosan là polymer khơng độc, cĩ khả năng phân hủy sinh học và cĩ tính tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm qua, các polymer cĩ nguồn gốc từ chitin đặc biệt là chitosan đã được chú ý đặc biệt như là một loại vật liệu mới cĩ ứng dụng đặc biệt trong cơng nghiệp dược ,y học, xử lý nước thải và trong cơng nghiệp thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hĩa, hay tác nhân ổn định… Trong các lồi thủy sản đặc biệt là trong vỏ tơm, cua, ghẹ, hàm lượng,chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khơ. Vì vậy vỏ tơm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan.[5] Hình: 1)Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose Như hình vẽ trên, thì sự khác biệt duy nhất giữa chitosan và cellulose là nhĩm amin (-NH2) ở vị trí C2 của tritosan thay thế nhĩm hydroxyl (-OH) ở cellulose. [10] Chitosan tích điện dương do đĩ nĩ cĩ khả năng liên kết hĩa họcvới những chất tích điện âm như chất béo, lipid, cholesterol, protein và các đại phân tử. Chitin và chitosan rất cĩ lợi ích về mặt thương mại cũng như là một nguồn vật chất tự nhiên do tính chất đặc biệt của chúng như tính tương thích về mặt sinh học, khả năng hấp thụ, khả năng tạo màng và giữ các ion kim loại. 2.2. Cấu trúc hố học, tính chất lý hố của chitosan 2.2.1 Cấu trúc hố học của chitosan Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nĩ cĩ hoạt tính sinh học cao và cĩ nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, khơng cần dung mơi, hĩa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hĩa chitin, biến đổi nhĩm N-acetyl thành nhĩm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra khơng hồn tồn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hĩa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [10] Chitosan cĩ cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Cơng thức cấu tạo của chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Cơng thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Qua cấu trúc của chitin và chitosan ta thấy chitin chỉ cĩ một nhĩm chức hoạt động là -OH (H ở nhĩm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhĩm hydroxyl bậc 2 trong vịng 6 cạnh) cịn chitosan cĩ 2 nhĩm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đĩ chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hĩa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp.[10] 2.2.2 Tính chất lý hố của chitosan Chitosan cĩ màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, khơng mùi, khơng vị, nhiệt độ nĩng chảy 309 - 3110C. Chitosan cĩ tính kiềm nhẹ, khơng tan trong nước, trong kiềm nhưng hồ tan được trong dung dịch axit hữu cơ lỗng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hồ tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit lỗng lien quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khĩ tan. Chitosan tác dụng với iod trong mơi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. [9] 2.2.3 khả năng chống oxi hĩa của chitosan Các sản phảm thực phẩm chứa một hàm lượng cao các chất béo chưa bão hịa, dễ bị mất hương vị, tạo mùi ơi. Darmadji và Izumimoto (1994) nhận thấy rằng 1% chitosan thêm vào thịt dẫn đến một sự suy giảm 70% trong 2-thiobarbituric acid (TBA) giá trị sau 3 ngày kể từ ngày lưu trữ ở 4 0C.[15] Thịt bị băm được xử lý với 5000 ppm of N-carboxymethylchitosan thì làm giảm 93% giá trị TBA St Angelo và Vercellotti (1989) . Shahidi et al. (1999) nhận thấy cơ chế của quá trình này liên quan tới sự chelation các ion sắt tự do 2.3. Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế chính xác của hoạt động kháng VSV của chitosan, chitin và các dẫn xuất của chúng vẫn chưa được biết đến đầy đủ. Tuy nhiên hiện nay cĩ 2 cơ chế được quan tâm:[11] Cơ chế thứ nhất Chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa số tích điện âm, do đĩ xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo của tế bào bị thốt ra ngồi à tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon, 1999). Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tơm chống lại E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn. Nĩ cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung chitosan vào mơi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng chitosan khơng trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli do mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng của vi khuẩn. Chitosan N-carboxybutyl, một polycation tự nhiên, cĩ thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid tính cĩ trên bề mặt vi khuẩn, do đĩ làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau. Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng cĩ rất nhiều ion kim loại cĩ thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+,Mg2+ và Ca2+. Nồng độ lớn các ion kim loại cĩ thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+ đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus. Người ta cũng thấy rằng chitosan cĩ thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn. Khi sử dụng chitosan, thì một lượng lớn các ion K+ với ATP bị rị rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm candida albicans. Cả chitosan phân tử lượng 50kDa và 5kDa đều kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50kDa làm mất nhiều gấp 2-4 lần ion K+ với ATP chitosan 5kDa. Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn khác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp và cao. Hoạt động kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6 lồi vi khuẩn.Và cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh đựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng. Và nĩ tăng cao ở nồng pH thấp, giảm rõ rệt khi cĩ mặt ion Ca2+, Mg2+ . Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0.03-0.25%, thay đổi tùy từng lồi vi khuẩn và khối lượng phân tử của chitosan. Chitosan cũng là nguyên nhân làm thốt các chất trong tế bào và phá hủy thành tế bào.Tính kháng khuẩn này phụ thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi khuẩn. Đối với vi khuẩn Gram dương, chitosan 470 KDalton cĩ ảnh hưởng đến hầu hết các lồi trừ lactobacillus sp. , trong khi với vi khuẩn Gram âm chitosan cĩ khối lượng 1106 KDalton mới cĩ ảnh hưởng. Hoạt tính kháng khuẩn tăng khi gia tăng nồng độ chitosan. [18] Tĩm lại khả năng kháng khuẩn của chitosan đối vi khuẩn Gram âm mạnh hơn so với vi khuẩn Gram dương (Chung et al. 2004; No et al., 2002). Trong khi đĩ vi khuẩn Gram dương lại nhạy cảm hơn, cĩ thể do vi khuẩn Gram âm cĩ lớp màng chắn bên ngồi (Zhong et al., 2008). [13] Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên E.coli (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan. Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên S.aureus (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan. Hình: E. coli xử lý với 300 mg/l OCNP(hạt nano chitosan) trong 30 min. A. 0 phút, B. 5 phút, C. 15 phút, D. 30 phút (Xing et al., 2009b) Theo Ming Kong và các cộng sự (2008) tất cả các vi khuẩn gram âm cĩ một màng ngồi do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS). trong đĩ đĩng gĩp vào sự ổn định của lớp LPS thơng qua tương tác tĩnh điện với các cation hóa trị hai như vậy như Mg2+ (Hình).Giống như EDTA, chitosan loại bỏ các cation. Việc giải phĩng LPS làm mất sự ổn định của màng ngồi.[12] Cơ chế của hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Zheng & Zhu, 2003). Trong nghiên cứu này, họ phân biệt tác động của chitosan trên S. aureus (Gram dương) và Escherichia coli (Gram âm). Đối với S. aureus Gram dương, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lượng phân tử của chitosan. Bên cạnh đĩ, với Gram âm E. coli, hoạt động kháng khuẩn tăng lên khi giảm trọng lượng phân tử. Các tác giả gợi ý hai cơ chế khác nhau cho hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trường hợp của S. aureus, các chitosan trên bề mặt của tế bào cĩ thể hình thành một màng polymer, ức chế các chất dinh dưỡng đi vào tế bào và, (2) Đối với, E. coli, chitosan trọng lượng phân tử thấp sẽ đi vào các tế bào thơng qua sự lan tỏa. [14] Hình : Cấu tạo màng ngồi của vi khuẩn Gram âm Ảnh hưởng của chitosan đối với E.coli sau 30 phút (kong và các cộng sự 2008) Cơ chế thứ hai Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các tương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thơng tin và tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các thành phần dinh dưỡng của vi sinh vật…(Sudarshan và cộng sự, 1992).[11] Các cơ chế khác Chitosan kích hoạt một số hàng rào phịng thủ trên tế bào chủ, chitosan tiếp xúc với các mơ thực vật và kích thích tiết ra các emzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, b-1,3-glucanse, từ đĩ tiêu diệt vi sinh vật. Cơ chế này khơng cịn đúng trong trường hợp sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì khi đĩ chitosan bao bọc bên ngồi lớp vỏ thực vật, khơng cĩ điều kiện tiếp xúc với các mơ thực vật nên khơng thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật. Chitosan hoạt động như một tác nhân kìm hãm, liên kết cĩ chọn lọc với kim loại dạng vết do đĩ ức chế sự sản xuất chất độc và tăng trưởng vi sinh vật (Cuero, Osuji, và Washington, 1991b). 2.3. Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan cĩ hoạt động ức chế vi khuẩn và nấm. Một trong các đồng phân của chitosan là N- carboxybutyl chitosan cĩ tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 lồi vi sinh vật gây bệnh. Khi cĩ chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự phát triển của những lồi này. ở nồng độ 0.1% và pH 5.6 chúng kháng các loại nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những vi sinh vật mà trên thành tế bào cĩ chứa chitin, chitosan hoặc chitin-ß-glucan. Chính hoạt động ức chế vi khuẩn cao của chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm cĩ tính acid thì nĩ cĩ chức năng tăng cường hoạt động kháng khuẩn như là một chất bảo quản tự nhiên. Ở pH 5.5, với nồng độ 0.5-1% chitosan cĩ tác dụng ức chế đến các lồi S. aureus, E. coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes. Ở pH 6.5 chỉ cĩ S. aureus bị ức chế ở nồng độ đĩ trong khi các lồi khác vẫn phát triển ở nồng độ 2.5% (nồng độ cao nhất đã được nghiên cứu)[10]. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của chitosan đến các loại vi khuẩn: - (Shahidi et al, 1999.). Wang (1992) quan sát thấy rằng nồng độ chitosan (1-1,5%) ngừng hoạt động hồn tồn của Staphylococcus aureus sau 2 ngày kể từ ngày ủ ở pH 5,5 hoặc 6,5. -Chang et al. (1989) tìm thấy nồng độ chitosan 0,005% bất hoạt hồn tồn S. aureus. Điều này đã được tìm thấy bởi Darmadji và Izumimoto (1994)về ảnh hưởng của chitosan trong bảo quản thịt. -Simpson et al. (1997) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của chitosan vào sự phát triển của vi khuẩn vào tơm nguyên liệu. Họ tìm thấy vi khuẩn Bacillus cereus bị ức chế bởi chitosan nồng độ 0,02%, trong khi Eschcoli và Proteus vulgaris erichia tăng trưởng tối thiểu tại 0,005% và bị ức chế sự tăng trưởng ở nồng độ lớn hơn 0,0075%. -Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của chitosan tăng trưởng E. coli. Wang (1992) sau khi ủ ngày 2 với 0,5% hoặc 1% chitosan ở mức độ pH là 5,5.Nồng độ Chitosan 1% trong nước cũng ức chế hồn tồn E. coli [10] Một số nghiên cứu đã xem xét tác động của chitosan bất hoạt của một số loại nấm: -EL-Ghaouth et al. (1992b) đã nghiên cứu ảnh hưởng của Chitosan lên sự phát triển của nấm ở quả dâu tây sau thu hoạch.Các tác giả thấy rằng chitosan với 7,2% NH2 làm giảm sự phát triển của Botrytis cinerea và Rhizopus stolonife. -Trong một nghiên cứu trong phịng thí nghiệm, et al EL-Ghaouth.(1992b) đã quan sát các dấu hiệu của nhiễm trùng trong trái cây phủ chitosan sau 5 ngày lưu trữ tại 13OC so với 1 ngày so với một ngày khơng sử dụng Chitosan. Sau 14 ngày lưu trữ, chitosan phủ (tại 15 mg / ml) giảm sự hư hỏng của dâu gây ra bởi các loại nấm Fang et al. (1994) [10] 2.4 Độc tính của chitosan Nghiên cứu về độ an tồn, độ độc tích lũy Chitosan được thử độ an tồn (LD50) trên 123 chuột trắng (18-21 gam) chia 5 đợt, với liều lượng tăng dần 0,0025-0,020 g/ngày cho mỗi chuột. Theo dõi liên tục trong 72 giờ. Kết quả chuột vẫn khỏe mạnh, khơng chuột nào chết. Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02g một ngày cho một chuột, cho uống liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh bình thường. Độc tính cấp Trên 5 lơ chuột nhắt trắng (50 con) cho uống chitosan với liều lượng 9g/kg cân nặng, theo dõi liên tục 72 giờ: khơng cĩ chuột nào chết, suy ra chỉ số điều trị là 250g theo đường uống, chứng tỏ chitosan dùng an tồn. Độc tính tại chỗ Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy chitosan khơng gây tồn thương các tổ chức, khơng gây phù nề tại chỗ, khơng gây phản ứng giản mạch tại chỗ trên thỏ và chuột cống thực nghiệm. Độc tính bán trường diễn Dùng chitosan trên thỏ thực nghiệm, ở dạng bột trộn thức ăn với liều lượng 2g/kg cân nặng, liên tục trong 4 tuần lễ. Theo dõi ảnh hưởng của chitosan trên các chức năng gan, thận và tạo máu, chưa thấy cĩ độc tính bán trường diễn trên thỏ thực nghiệm. Kết quả Chitosan được thử trên xúc vật thực nghiệm( chuột nhắc, chuột cống, thỏ), kết quả cho thấy: chitosan khơng gây độc tính tại chỗ, độc tính bán trường diễn,khơng ảnh hưởng đối với trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu hĩa sinh trong nước tiểu của súc vật thực nghiệm[21] 2.5 Các chất kết hợp bảo quản 2.5.1 Chitosan và nitrite Youn et al. (1999) khám phá rằng cĩ thể thay 50% nitrite bằng chitosan 0,2 % trong xúc xích hàn quốc. Đối với xúc xích bào quản bằng nitrite nồng độ 150 ppm thì sau 4 ngày lượng vi khuẩn tăng hơn 2 log CFU/g và hơn 3 log CFU/g sau 7 ngày bảo quản ở 300C. Trong khi sử dụng hỗn hợp chitosan và nitrite thì sau 7 ngày lưu trữ ở 300C thì lượng vi khoảng 30 000 đến 120 000 Da thì màu đỏ, hệ nhủ tương, độ cứng của xúc xích vẫn được giữ nguyên, chitosan cĩ trọng lượng phân tử cao cĩ thế ảnh hưởng đến cảm quan [10]. 2.5.2 Chitosan and benzoate Sự kết hợp giữa chitosan và benzoate đã được nghiên cứu trong phịng thí nghiệm bởi (Sagoo et al., 2002b), ba chủng nấm men gây hỏng Sac. exiguus, Scd. ludwigii và T. delbrueckii, đã bị ức chế bởi 0.05 và 0.005% chitosan glutamate và 0.025% sodium benzoate trong dung dịch nước muối 0,9% tại pH 6.2 và 4.5. Phương thức tương tác giữa chitosan và benzoate chưa cĩ nghiên cứu rõ ràng, và đang được nghiên cứu, là một đại phân tử chitosan khơng thể di vào vách của tế bào nấm men khác với benzoate tác động lên các thành phần nội bào. Các kết quả nghiên cứu trong phịng cần được khẳng định trong thực phẩm trước khi đưa vào thực tiễn sản xuất tận dụng khả năng kết hợp giữa chitosan và benzoate [10]. 2.5.3 Chitosan và sulfite Sulfite là một yếu tố khơng thể thiếu trong xúc xích thịt lợn vì ngồi khả năng kháng các vi khuẩn Gram âm nĩ cịn mang lại màu hồng cĩ tính cảm quan cho sản phẩm. Do đĩ các nghiên cứu được xoay quanh vấn đề là lượng sulfite tối thiểu đơn lẻ hoặc kết hợp với chitosan để ứng dụng vào thực phẩm dựa trên các chỉ tiêu vi sinh vật, nấm men, vi khuẩn lactic, các vi khuẩn đường ruột, pH, mùi. Ví dụ như kết quả được minh họa trong hình. Hình ảnh hưởng của sự kết hợp chitosan 0,6% và 170 ppm sulfite (n) và các nồng độ riêng lẻ, kết hợp chitosan và sulfite trên xúc xích thịt lợn tươi ở 40C Roller et al. (2002). Cơ chế của sự bảo quản kết hợp giữa chitosan và sulfite theo 2 bước sau. Thứ nhất chitosan cĩ vai trị phân tán chậm sulfite, do đĩ giúp ngăn ngừa quá trình thái hĩa sớm của sulfite. Thứ 2 chitosan ức chế nấm men thực vật, ngăn ngừa việc tổng hợp acetaldehyde, một chức gây mất hoạt tính đối với sulfite (Roller et al., 2002)[10]. 2.6. Các nghiên cứu bảo quản trên thịt 2.6.1 ứng dụng chitosan bảo quản thịt bị băm [15] Chitosan nồng độ 0,5 - 1,0% ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hỏng trên thịt bị băm ở 300C trong thời gian là 48 giờ và 40C trong thời gian là 10 ngày.Ngồi ra chitosan cịn ngăn cản quá trình oxy hĩa lipid,tăng tính cảm quan và giữ màu thịt trong thời gian bảo quản. 2.6.1.1 vật liệu phương pháp Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm này là Lactobacillus plantarum IAM 1216,Pedicoccus pentosaceus IAM 12296, Micrococcus varians IFO 3765, Staphylococcus aureus IAM 1011, Escherichia coli RB, Bacillus subtilis IFO 3025 và Pseudomonas fragi IFO 3458. Các vi khuẩn này được nuơi trong mơi trường dịch triết peptone glucose (YPG) gồm 5g dịch triết nấm men, 10g peptone, 10g glucose 1g Tween 80, 0,1 g L-cystein trong 1 lít nước, pH 6,8 (Nakae etal., 1987). Tác dụng kháng khuẩn của chitosan lên sự phát triển của vi khuẩn với nồng độ 0%, 0.2%, 0.5%, 1% chitosan được xác định bằng máy đo OD bước sĩng 660 nm sau 24 giờ trên mơi trường YPG lắc chậm ở 300C Thịt bị tươi được mua vào ngày tiến hành thí nghiệm. Thịt được cắt và thái nhỏ thành miếng khoảng 4mm. Cứ 10g thịt sẽ được trộn với chitosan với nồng độ lần lượt 0%, 0.2%, 0.5%, 1% mỗi loại 3 mẫu. Sau đĩ các mẫu được bọc lại bằng Sarawrap và chia thành 2 lơ. Lơ thứ nhất ủ ở 300C trong thời gian 0, 12, 24 và 48 giờ. Lơ thứ 2 được làm lạnh ở 40C trong thời gian 0, 3, 5 và 10 ngày. Các mẫu này được dùng để phân tích vi sinh vật,xác định giá trị TBA (2-thiobarbituric acid) và VBN (volatile basal nitrogen). Chitosan được thu nhận từ Katokichi Co. Ltd., Japan. Phân tích hĩa học TBA được xác định bằng phương pháp chưng cất hơi nước(Ando & Yamauchi, 1968) và được sửa đổi bởi Izumimoto et al. (1990) số mg malonaldehyde/kg thịt. Giá trị VBN đo bằng phương pháp của Conway's method (Kousaka, 1983). Phân tích màu sắc Mỗi 40g mẫu được để trong đĩa petri kích thước 60 x 15 mm (Corning, Iwaki Co. Ltd), ép chặt và bọc lại bằng Saranwrap sau đĩ đĩng đĩa petri. Giá trị màu sắc được đo bằng máy đo màu Minolta (CM-1000, Minolta Co.Ltd) thể hiện qua các giá trị như L* (màu sắc), a* (đỏ), b* (vàng) Phân tích cảm quan Mỗi 40g mẫu đối chứng và mẫu chứa chitosan được cho vào 100g patty( bánh bao)cĩ đường kinh 10cm, dày 1cm chiên trong dầu ở 1900C, mỗi mặt chiên trong 4 phút. Sau đĩ cắt thành khối nhỏ 1-5 cm. Sau đĩ tiến hành đánh giá cảm quan ngẫu nhiên 2.6.1.2 kết quả và bàn luận Từ hình ta thấy chitosan (0,01%) ức chế sự tăng trưởng của một số vi khuẩn gây hỏng như Bacillus subtilis IFO 3025, Escherichia coli RB, Pseudomonas fragi IFO3458 và Staphylococcus aureus IAM 1011. Ở nồng độ cao hơn (0.1 và 1,0%), nĩ ức chế sự tăng trưởng của Lactobacillus 1216 01:00 plantarium, Pediococcus pentosaceus IAM 12296 và Micrococcus varians IFO 3765 Hình: ảnh hưởng của chitosan lên sự phát triển của vi khuẩn gây hỏng ở 30°C. Trong for 24 giờ. Lp: Lactobacillus plantarum IAM t216 Pp: Pediococcus pentosaceus IAM 12296 My: Micrococcus varians IFO 3765 Pf: Pseudomonasfragi IFO 3458 Sa: Staphylococcus aureus IAM 1011 Ec: Escherichiacoli RB Bs: Bacillus subtilis IFO 3025 Sự tăng trưởng của Staphylococci, Coliform, Gram-negative bacteria,Micrococci và Pseudomonas trên thịt trong thời gian lưu trữ ở 300C và 40C trong 10 ngày thể hiện ở 2 bảng sau Bảng : Ảnh hưởng của chitosan đến số lượng (log10 cfu/g) trên thịt 300C, 48 giờ Bảng : Ảnh hưởng của chitosan đến số lượng (log10 cfu/g) trên thịt 40C, 10 ngày Giá trị VBN Trong thời gian lưu trữ ở 300C trong 24 giờ và 48 giờ, giá trị VBN của thịt cĩ chứa chitosan thấp hơn so với mẫu đối chứng. Một số vi khuẩn gây hư hỏng như speudomonas tiết ra các enzyme phân hủy protein. Quá trình này cĩ thể làm ảnh hưởng đến sự thối rửa và làm hĩa hơi nitơ. Tuy nhiên chitosan cho thấy khả năng kháng sự phát triển của vi khuẩn này Hình: Ảnh hưởng của chitosan đến giá trị VBN trên thịt 300C, 48 giờ Hình: Ảnh hưởng của chitosan đến giá trị VBN trên thịt 40C, 10 ngày Giá trị TBA Sự thay đổi của giá trị TBA của thịt trong quá trình bảo quản ở 300C chứng tỏ tốc độ oxi hĩa lipid trong thịt giảm khi ta bổ xung chitosan vào, giá trị TBA phụ thuộc vào nồng độ của chitosan, ở nồng độ 0.2, 0.5, 1% chitosan giá trị TBA giảm lần lượt 10, 25, 40%. Tại 4oC giá trị TBA giảm khoảng 70% sau 3 ngày bảo quản, sau 10 ngày thì giá trị TBA của mẫu thịt chứa chitosan bằng với giá trị TBA ở 0 ngày, trong khi đĩ giá trị TBA của mẫu khơng chứa chitosan lại tăng mạnh. Cơ chế ức chế chitosan trên giá trị TBA vẫn chưa rõ, và hiện đang được nghiên cứu chi tiết hơn trong phịng thí nghiệm. Các mẫu 0 giờ ở 300C và 40C cho giá trị TBA như nhau ở các mẫu cĩ và khơng cĩ chitosan, điều này làm sáng tỏ chitosan trơ với các chất phản ứng TBA. Nĩ gợi ý rằng chitosan cĩ tính chất chống oxy hĩa, (Pasquel & Babbit 1991) Thịt tơm cĩ chứa chất chống oxy hĩa tự nhiên và trong thịt tơm cĩ thể chứa chitosan. Hình: ảnh hưởng của chitosan đến giá trị TBA trên thịt bảo quản ở 300C trong 48 giờ Hình: sảnh hưởng của chitosan đến giá trị TBA trên thịt bảo quản ở 40C trong 10 ngày Đặc tính cảm quan Đánh giá cảm quan được tiến hành trên thịt bảo quản ở 40C tại 0, 3, 5, 10 ngày. Như thể hiện ở bảng thịt cĩ chứa chitosan được chấp nhận nhiều hơn thịt khơng chứa chitosan. Gía trị TBA và VBN thấp cho thấy sự giảm bớt mùi ơi,thối trên thịt cĩ chứa chitosan so với thịt khơng chứa chitosan. Bảng: cảm quan trên thịt chứa chitosan bảo quản ở 40C, từ 0 đến 10 ngày Màu sắc Ảnh hưởng của chitosan lên màu của thịt trong thời gian bảo quản tại 300C trong 24 giờ và 40C trong 10 ngày được biểu hiện ở bảng sau.Tại thời điểm ban đầu chitosan khơng ảnh hưởng tới các giá trị như L* (màu sắc), a* (đỏ), b* (vàng). Trong thời gian bảo quản giá trị L của mẫu chứa chitosan giảm so với mẫu đối chứng, nĩ cĩ thể do sự cố định nước, làm giảm sự rỷ dịch. Kết quả là làm tăng độ trong suốt và giảm màu sắc. Nhìn chung giá trị a* và b* tăng trong suốt thời gian bảo quản, mẫu đối chứng tăng chậm hơn mẫu chứa chitosan . Quan sát này thấy rằng thịt bị chứa chitosan cho kết quả cảm quan tốt về màu sắc 2.6.2 ứng dụng chitosan bảo quản thịt heo 2.6.2.2 ứng dụng olygoglucosamin từ chitosan để bảo quản thịt heo [4] 2.6.2.2.1 nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu Olygoglucosamin là chất màu vàng nhạt, cĩ vị chát, khơng mùi và cĩ khả năng tan trong nước. Olygoglucosamin là hợp chất hữu cơ được sản xuất từ chitosan, cĩ tính chất tương tự như chitosan, nhưng cĩ một số tính chất khác biệt là tan trong nước.Theo một số tài liệu nghiên cứu gần đây thì olygoglucosamin cĩ một số tác dụng như hạn chế sự phát triển của vi sinh vật, chống oxy hố acid béo, chống phát triển của tế bào ung thư, là thực phẩm chức năng và là hoạt chất sinh học mạnh. Thịt heo được giết mổ vào lúc 5giờ sáng, sau đĩ thịt heo được đem về xử lý lúc 6giờ và phân lơ thí nghiệm. Các mẫu thịt heo tươi sống được nhúng trong các dung dịch cĩ các nồng độ lần lượt 0,5%; 1%; 1,5% và 2% Olygoglucosamin với thời gian 3 giây.Thịt được giữ tươi ở nhiệt độ phịng và nhiệt độ tủ lạnh (8 C÷10 C), tiến hành lấy mẫu theo thời gian: Ở nhiệt độ phịng sau 6 giờ lấy mẫu một lần, cịn ở nhiệt độ dương lạnh thì 24 giờ lấy mẫu một lần. Tiến hành xác định chất lượng cảm quan, vi sinh vật tổng số và NH3. Mẫu đối chứng khơng xử lý olygoglucosamin, đem giữ tươi và tiến hành như các mẫu thí nghiệm. Xác định chất lượng cảm quan của thịt theo phương pháp cảm quan-Áp dụng theo tiêu chuẩn TCVN3215-79 Xác định hàm lượng NH3 bằng phương pháp chưng cất lơi cuốn theo hơi nước Xác định vi sinh vật tổng số trên bề mặt thịt bằng phương pháp TCVN 5119/90. 2.6.2.2.2 kết quả và bàn luận Ảnh hưởng của olygoglucosamin đến chất lượng cảm quan của thịt heo tươi ở nhiệt độ phịng được trình bày ở đồ thị và bảng: Đ C Q 20 Mẫu đối chứng Olygoglycosamin 0.5 % Olygoglycosamin 1 % Olygoglycosamin 1.5 % Olygoglycosamin 2 % 0 6 12 18 24 giờ Hình : biến đổi điểm cảm quan của thịt theo thời gian ở nhiệt độ phịng Bảng: nhận xét cảm quan thịt tươi cĩ chứa olygoglucosamin ở nhiệt độ phịng Nồng Độ Thời gian 0 đối chứng 0.5% 1% 1.5% 2% 0 giờ Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc 6 giờ Mùi thơm giảm, màu xám chưa cĩ mùi lạ,vị ngọt Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc 12 giờ Mùi thơm giảm, xuất hiện mùi lạ, nhớt khơng đạt độ tươi Mùi thơm giảm vị ngọt, khơng nhớt Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc 18 giờ Khơng đạt yêu cầu về độ tươi Mùi thơm giảm, xuất hiện mùi lạ, khơng nhớt,khơng đạt độ tươi Mùi thơm giảm vị ngọt, khơng nhớt, màu xẫm Mùi thơm tự nhiên vị ngọt, màu xẫm Mùi thơm, màu sắc tự nhiên vị ngọt thịt luộc 24 giờ Như trên Khơng đạt yêu cầu về độ tươi Khơng đạt yêu cầu về độ tươi Mùi thơm giảm,mầu xẫm, vị ngọt, chưa cĩ mùi lạ Mùi thơm giảm vị ngọt, màu xẫm Từ kết quả trên cho thấy với thịt cĩ chứa olygoglucosamin thì cĩ thể bảo quản tới 18 giờ ở nhiệt độ phịng mà khơng ảnh hưởng đến mùi vị , kết quả tương tự là 6 ngày đối với thịt cĩ chứa olygoglucosamin bảo quản ở 8 - 100C Từ kết quả trên cĩ thể thấy nồng độ olygoglucosamin càng lớn thì khả năng bảo quản thịt càng tốt, tuy nhiên khơng nên làm dụng vì khi bổ xung quá nhiều olygoglucosamin thì sẽ tạo vị chát Ảnh hưởng của olygoglucosamin đến đạm bazo bay hơi (NH3) Hình : biến đổi NH3 của thịt theo thời gian ở nhiệt độ phịng Hình : biến đổi NH3 của thịt theo thời gian ở nhiệt độ 8-100C Từ kết quả hình cho thấy nồng độ NH3 tăng dần theo thời gian, mẫu đối chứng tăng nhanh hơn so với mẩu cĩ chứa olygoglucosamin Trong quá trình tự chín của thịt các enzyme nội tại trong cơ thịt phân giải protein thành các aminoacid, sau đĩ được các vi sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật khác hấp thụ vào tế bào. Trong tế bào vi sinh vật aminacid bị khử nhĩm cacboxyl và nhĩm amin tạo thành CO2, NH3 và các sản phẩm trung gian khác. Kết quả làm cho hàm lượng NH3 tăng dần theo thời gian giữ tươi. Ở các mẫu cĩ xử lý CBQ-O, hàm lượng NH3 tăng chậm hơn,do olygoglucozamin cĩ tác dụng ức chế vi sinh vật gây thối rữa và nấm mốc phát triển. Đạm thối là chỉ tiêu đánh giá mức độ hư hỏng của thực phẩm.Theo tiêu chuẩn thịt heo tươi thì hàm lượng NH3 phải nhỏ hơn 35mg%. Ảnh hưởng của olygoglucosamin đến số lượng vi sinh vật Hình: Ảnh hưởng của olygoglucosamin đến số lượng vi sinh vật Từ hình trên chúng ta cĩ thế kết luận Olygoglucosamin cĩ tác dụng ức chế vi sinh vật đảm bảo chất lượng của thịt và thời gian giữ tươi lâu hơn. Kết quả cũng cho thấy việc kết hợp giữ tươi thịt ở nhiệt độ thấp cùng với Olygoglucosamin cho hiệu quả ức chế vi sinh vật trên bề mặt tốt hơn so với bảo quản ở nhiệt độ phịng. 2.7 sinh tổng hợp chitosan 2.7.1 nguyên liệu Chitosan sản xuất từ deacetyl hĩa chitin. Trong khi đĩ, các lồi giáp xác lại là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin trong cơng nghiệp. Hàng năm, chitin được tổng hợp từ nước và hệ sinh thái biển chiếm lần lượt khoảng 600 và 1600 triệu tấn. Nguồn cung cấp tốt nhất là các lồi giáp xác (như tơm, cua, tơm hùm và các lồi nhuyễn thể), con hàu, mực với sản lượng hang năm là 29.9 , 1.4 và 0.7 triệu tấn. tùy thuộc vào giống, điều kiện dinh dưỡng, mùa vụ đánh bắt mà thành phần chitin trong vỏ các lồi giáp xác thay đổi từ 13-42%. Ngồi ra trong nguyên liệu sản xuất chitin cịn chứa protein (30-40%), muối khống (30-50%), carotenoid (với hàm lượng rất nhỏ). Người ta sử dụng hầu hết là phụ phẩm của quá trình đánh bắt, chế biến hải sản để sản xuất chitin và chitosan,điều này khơng những cĩ lợi về mặt kinh tế mà cịn cĩ lợi về mơi trường. Ngồi ra, trong hệ sợi của một số vi nấm cũng tìm thấy chitin và chitosan như: Allomyces, Asperillus, Penicillium, Mucor, Rhiropus, Phytomyces… thành tế bào của hệ sợi những lồi này người ta tìm thấy cĩ chitosan và các polysaccharide khác. Mặc dù hiện tại, trong hiện tại thì nguồn này chưa được sử dụng nhưng trong tương lai chắc chắn nĩ sẽ rất cĩ lợi vì các lồi nấm này phát triển rất nhanh, phù hợp với sản xuất cơng nghiệp, và ngồi chitosan ra trong tế bào của chúng cịn chứa các enzyme, khống chất, chất kháng sinh, hormone khác. 2.7.2 quá trình khử protein Chitin trong tự nhiên thường liên kết với protein. Một vài protein cĩ thể chiết ra theo phương pháp tự nhiên, nhưng phần khác khơng thể chiết ra bởi liên kết đồng hĩa trị với chitin. Xét về cấu trúc hĩa học thì protein liên kết với chitin thơng qua liên kết đồng hĩa trị với aspartyl và histidyl để hình thành một cấu trúc ổn định giống như glycoprotein. Vỏ giáp xác thường được nghiền và xử lý bằng dung dịch NaOH 1-10% ở nhiệt độ cao 65-100°C để hịa tan protein. Thời gian tiến hành phản ứng thường từ 0.5 -12h tùy từng phương pháp sử dụng. Xử lý bằng kiềm kéo dài trong điều kiện nghiêm ngặt để tiến hành quá trình khử protein và deacetyl. Để duy trì sự đồng đều trong suốt quá trình phản ứng thì tỉ lệ khối lượng vỏ với dung dịch KOH thường 1:10 hoặc 1:15-20 vì tỉ lệ nhỏ nhất cĩ thể dùng là 1:4(w/v). Điều kiện tối ưu của quá trình khử protein là sử dụng dung dịch NaOH 3.5% trong 2h ở 65°C, trong điều kiện luơn khuấy và tỉ lệ rắn lỏng là 1:10(w/v). Trong suốt quá trình này, sự tạo thành bọt xảy ra liên tục, nhưng khơng nhanh và mạnh như trong quá trình khử khống. 2.7.3 quá trình khử khống Sự khử khống thường được tiến hành bằng dung dịch acid HCl (trên 10%) ở nhiệt độ phịng để hịa tan CaCO3 thành CaCl2. cĩ thể dùng HCl nồng độ cao hoặc acid formic 90% để khử khống. Với các điều kiện tối ưu của quá trình này là HCl 1N, tỉ lệ rắn: lỏng = 1:15(w/v), trong 30’ khuấy liên tục. Thường thì nồng độ chất tro sau khử khống đánh giá hiệu quả của quá trình thường là 31-36%. Trong suốt quá trình khử khống cĩ hiện tượng khơng mong muốn là hình thành bọt khí rất mạnh do phản ứng: CaCO3 + 2HCl → CaCl2 + CO2↑ + H2O Để điều khiển và làm giảm bọt cĩ thể bổ sung chất phá bọt silicon polymer 10% mà khơng dùng chất tạp huyền phù. 2.7.3 quá trình khử màu Cĩ thể dùng acid hoặc kiềm để khử màu chitin. Chitin thương phẩm cần phải khử màu hoặc tẩy trắng thành dạng bột trắng. Chất màu trong vỏ giáp xác hình thành phức với chitin. Những nghiên cứu cho rằng đồng phân 4-ceton, 4,4’ dicetone-ß-carotene liên kết chặt chẽ với chitin ở ngồi vỏ của cua. Và mức độ liên kết này thay đổi giữa các lồi. Trong quá tình khử màu cần chú ý là những chất hĩa học khơng được làm ảnh hưởng đến tính chất vật lý, hĩa học của chitin và chitosan. 2.7.4 quá trình deacetyl Deacetyl là quá trình chuyển chitin thành chitosan bằng cách khử nhĩm acetyl. Thường được tiến hành bằng xử lý KOH hoặc NaOH 40-50% ở 100°C hoặc cao hơn trong 30phút hoặc lâu hơn nữa để khử 1 phần hoặc hồn tồn nhĩm acetyl khỏi polymer đĩ. Cĩ rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng chitosan thành phẩm do đĩ phải đảm bảo điều kiện phù hợp nhất. những điều kiện ảnh hưởng đến quá trình deacetyl: Nhiệt độ: Nhiệt độ cao sẽ làm tăng mức độ deacetyl hĩa nhưng lại làm giảm kích thước phân tử Thời gian và nồng độ kiềm: quá trình deacetyl sẽ diễn ra nhanh hơn trong 1 giờ đầu ở dung dịch NaOH 50% tại 100°C. Tuy nhiên sau đĩ quá trình phản ứng sẽ từ từ lên đến 78% trong 5h. Do đĩ, xử lý bằng kiềm hơn 2h sẽ khơng deacetyl hĩa chitin một cách đáng kể, mà cịn làm phá hủy chuỗi phân tử. khi nghiên cứu NaOH ở nồng độ 35, 40, 50% thì nồng độ kiềm giảm thì vận tốc giảm độ nhớt cũng như khối lượng phân tử chậm lại. Chitosan được deacetyl hĩa trong 5 phút ở NaOH 50% tại 145-150°C cĩ độ nhớt, phân tử lượng cao hơn chitosan deacetyl hĩa trogn 15phút. Ảnh hưởng của các điều kiện trong quá trình sản xuất chitin: chúng làm ảnh hưởng đến độ nhớt của chitosan thành phẩm. Khi sử dụng HCl với nồng độ trên 1,25N trong khử khống, NaOH 3% để khử protein, việc tẩy trắng đều cĩ tác động cĩ bất lợi đến độ nhớt của sản phẩm, làm tăng thời gian chế biến. khơng khí: khi cĩ mặt oxy trong quá trình này thì chitosan dễ bị phân hủy. Mặt khác nếu tiến hành trong mơi trường chứa Nitơ thì sản lượng cũng như độ nhớt, phân tử lượng của chitosan đều tăng hơn so với trong khơng khí. Tỉ lệ Chitin và kiềm: tỉ lệ này đĩng một vai trị lớn để xác định tính chất của chitosan trên cơ sở xác định độ nhớt của dung dịch, tit lệ này thường 1:10 đến 1:100. Kích thước phân tử: nếu kích thước tăng thì độ nhớt và kích thước phân tử lớn hơn là kích thước nhỏ. 2.7.5 quy trình sản xuất chitosan tham khảo Vỏ tơm Rửa sạch, phơi khơ Xay thơ Rửa trung tính Khử protein Khử khống Rửa trung tính Khử gốc acetyl Rửa sạch Chitosan NaOH 3%, 100oC 1:10 (w/v) HCl 5%, 1:6 (w/v), 24h NaOH 50%,1:5(w/v) 100-110oC, 4-5h 2.8 Các ứng dụng khác của chitosan 2.8.1 Cơng nghiệp mỹ phẩm Trong cơng nghiệp mỹ phẩm thì dung mơi thường là acid hữu cơ, chitosan cĩ tính chất diệt và kháng nấm, mà chitosan cĩ khả năng hịa tan trong dung mơi hữu cơ, do đĩ chitosan và các dẩn xuất được ứng dụng trong kem, sữa, sơn mĩng tay và các sản phẩm uốn tĩc.[19] Da nhân tạo (Malette et al) nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và dung dịch muối lên việc điều trị các vết bỏng và hình thành các mơ từ vết thương trên mơ ở mặc bụng chĩ, cĩ thể xem xét chitosan như một loại vật liệu để ứng dụng tạo da nhân tạo trong tương lai. 2.8.3 Thực phẩm và dinh dưỡng [20] N-acetylglucosamine (NAG) moiety giúp hỗ trợ cho sự phát triển của bifidobacteria.Trong đĩ các lồi vi sinh vật tạo ra lactase cần thiết cho sự hấp thu lactose trong sữa. Trong sữa bị lại chứa rất hạn chế NAG moiety, do đĩ trẻ sơ sinh sử dụng sữa bị thường cĩ chịu trứng khĩ tiêu. Hiện nay chitosan được sử dụng rất phổ biến trong sản xuất thực phẩm. Màng bao Chitosan cĩ thể cải thiện khả năng bảo quản các loại thực phẩm dễ bị thối rữa bằng cách giảm lượng khơng khí bên trong bao gĩi cũng như giảm quá trình thốt hơi nước. Cĩ thể nhúng trực tiếp thực phẩm vào dung dịch chitosan pha sẵn rồi để khơ, tạo thành một lớp màng mỏng tự nhiên trên bề mặt sản phẩm: trứng, thịt cá, rau quả, giá đỗ, bánh gạo, nhúng cải bắp trước khi làm kim chi… Hoặc cũng cĩ thể tạo thành màng trước rồi mới cho sản phẩm vào: bánh mì, xúc xích… Hoặc cho chitosan trực tiếp vào sản phẩm dạng lỏng: xử lý nước quả, làm trong giấm, bảo quản tàu hũ, đồng hĩa sữa, kem và mayonaise, bảo quản mì… 2.8.4 Quang học [20] Chitosan với các đặc điểm như độ trong quang học, cấu trúc bền vững, thống khí, khả năng miễn dịch, kính áp trịng được tạo ra bằng thủy phân và tinh sạch polymer của mực ống. 2.8.5 Xử lý nước thải [20] Thu hồi kim loại từ nước thải: Nair and Madhavan sử dụng chitosan để tách thủy ngân từ dung dịch, động lực hĩa học của quá trình hấp thu này được tìm ra bởi Peniche-covas. Kết quả cho thấy việc hấp thu này phụ thuộc vào thời gian xử lý, kích thước hạt, nồng độ thủy ngân và số lượng chitosan. McKay et al sử dụng chitosan thu hồi các kim loại cĩ trong nước thải như Cu , Hg , Ni và Zn ở nhiệt độ 25-600C pH trung tính. Loại bỏ màu từ nước thải nhà máy dệt: Chitosan cĩ ái lực cao đối với các loại thuốc nhuộm. Hình: chitosan tao phức chelat voi ion kim loại trong nước thải 2.8.6 Phụ liệu sản xuất giấy Chitosan cĩ khả năng làm tăng độ dai của giấy sau khi bổ sung chất này. Hydroxymethyl chitin và các dẩn xuất tan trong nước được bổ xung vào giấy. Các nhà sản xuất cĩ thể dùng polyme này để nâng cao chất lượng giấy. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lương Đức Phẩm, 2009. Cơng nghệ sinh học trong bảo quản và chế biến thực phẩm, NXB Hà Nội [2] Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm, 2002, Vệ sinh và an tồn thực phẩm,NXB Đại học quốc gia [3] Giáo trình vi sinh thực phẩm, Đại học CN4,tp Hồ Chí Minh,2004 [4]Trần Thị Luyến, Nghiên cứu sử dụng olygoglucosamin từ chitosan để giữ tươi thịt heo,Tạp chí khoa học 2006 [5] Phan Hồng Thu, 1997. Nghiên cứu hồn chỉnh cơng nghệ sản xuất chitin –chitosan từ vỏ tơm. Tĩm tắt các cơng trình nghiên cứu khoa học (1987 – 1997) của Viện nghiên cứu nuơi trồng thủy sản [6] Đặng Văn Luyến, “Chitin/Chitosan”. Các bài giảng và báo cáo chuyên đề, tập 2, tr 27-35, 1995. [7] Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào & cộng sự. Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia trong sản xuất giị lụa, bánh cuốn. Viện dinh dưỡng. Trung tâm kỹ thuật an tồn vệ sinh thực phẩm Việt Nam. [8] Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền và cùng các cộng sự . Vật liệu sinh học từ chitin. Viện hĩa học - Viện cơng nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên và Cơng nghệ quốc gia. Hà Nội.1997. [9]Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và một số cộng sự. Hồn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan và chế biến một số sản phẩm cơng nghiệp từ phế liệu vỏ tơm, cua. Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ. Nha Trang.2000. [10] fereidoon shahidi . chitin, chitosan, and co-products: chemistry, production, applications,and health effects 2005 Memorial University of Newfoundland [11] Ying-Chien Chung, Chih-Yu Chen. Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan Bioresource Technology 99 (2008). [12] Ming Kong, Xi Guang Chen. Antibacterial mechanism of chitosan microspheres in a solid dispersing system against E. coli. Biointerfaces 65 (2008) 197–202. [13] Ming Kong, Xi Guang Chen. Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: A state of the art review. International Journal of Food Microbiology 144 (2010). [14] Lian-Ying Zheng, Jiang-Feng Zhu. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights, Carbohydrate Polymers 54 (2003). [15] Purnama Darmadji, Masatoshi Izumimoto. Effect of Chitosan in Meat Preservation. Meat Sctenee 38 (1994). [16] Jane Ann Boles, Ronald Pegg. Meat Color. Montana State University [17] A.P. Martínez-Camacho. Chitosan composite films: Thermal, structural, mechanical and antifungal properties Carbohydrate Polymers 82 (2010). [18] Su-il Park. Application of chitosan-incorporated LDPE film to sliced fresh red meats for shelf life extension. Meat Science 85 (2010). [19] H.F Mark, N.M Bikales, C.G Overberger and G Menges, Editors, Encyclopedia of Polymer Science and Engineering Vol. 1, Wiley, New York (1985), p. 20 [20] Majeti N.V. Ravi Kumar. A review of chitin and chitosan applications. University of Roorkee, Roorkee 247 667, India(2000) [21] Nguyễn Văn Hiệu, Nguyễn Thị Ngọc Tú và các cộng sự. Nghiên cứu một số sản phẩm từ vật liệu polyme sinh học trên cơ sở chitin/chitosan và dẫn xuất trong y học.Trung tâm khoa học tự nhiên và cơng nghệ quốc gia (2001)