Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase có hoạt tính cao nhất

Choïn loaøi naám moác sinh toång hôïp enzym cellulase coù hoaït tính cao nhaát. Ta coù 9 gioáng naám moác laáy töø PTNVS: A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A.oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus.sp. Thí nghieäm 1: Thöû nhanh xaùc ñònh loaøi naám moác coù hoaït tính enzym cellulase. Keát quaû thí nghieäm P.citrinum A.awamori A.aculactum A. Niger Hình 4.1-Keát quaû thöû nhanh hoaït tính cellulase cuûa 4 loaøi naám moác Nhaän xeùt vaø baøn luaän Phöông phaùp choïn loïc sô boä VSV coù khaû naêng sinh hoaït tính cellulase döïa treân söï baét maøu cuûa thuoác thöû Congo ñoû vôùi polysaccharide (CMC). Thuoác thöû Congo ñoû coù khaû naêng baét maøu vôùi lieân keát hidrogen cuûa polysaccharide. Khi CMC bò phaân huûy taïo thaønh caùc hôïp chaát coù troïng löôïng phaân töû thaáp hôn thì söï baét maøu vôùi Congo ñoû khoâng coøn nöõa. Vuøng trong suoát treân neàn ñoû laø nôi enzym taùc duïng vaø phaân huûy cô chaát. Tuy nhieân maøu ôû vuøng naøy coøn tuøy thuoäc vaøo saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình thuûy phaân cellulose. Trong thí nghieäm naøy vuøng thuûy phaân coù maøu vaøng. Nhö vaäy saûn phaåm cuoái khoâng chæ laø ñöôøng ñôn maø coøn caùc chaát khaùc coù troïng löôïng phaân töû cao hôn. Ngoaøi ra, trong phöông phaùp naøy dung dòch enzym thu ñöôïc töø moâi tröôøng loûng caàn ñöôïc loïc ñeå loaïi boû teá baøo naám moác tröôùc khi tieán haønh thöû treân hoäp petri. Laøm nhö vaäy ta loaïi boû ñöôïc aûnh höôûng cuûa sôïi naám moác ñeán khaû naêng baét maøu vôùi thuoác thöû Congo ñoû. Trong 9 loaøi naám moác ôû treân thì chæ coù 4 loaøi A.Niger, A.awamori, A.aculactum vaø P.citrinum coù xuaát hieän vuøng maøu vaøng treân neàn ñoû. Vuøng naøy chính laø vuøng CMC bò phaân giaûi bôûi enzym. Nhö vaäy vôùi ñieàu kieän thí nghieäm, trong 9 loaøi naám moác ñaõ choïn thöû hoaït tính thì 4 loaøi naøy laø coù khaû naêng sinh enzym cellulase. Keát quaû thu ñöôïc chæ laø töông ñoái, bôûi vì trong 9 loaøi naám moác maø ta choïn thuoäc 4 gioángï: Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus vaø Penicillium. Moãi gioáng naøy coù toác ñoä sinh tröôûng khaùc nhau. Do ñoù, thôøi gian ñeå chuùng sinh toång hôïp enzym coù hoaït tính cao nhaát cuõng khaùc nhau. Maø thí nghieäm naøy ta chæ söû duïng ôû cuøng moät thôøi ñieåm laø 3 ngaøy, cho neân döïa treân keát quaû naøy ta chæ choïn ñöôïc sô boä moät soá loaøi VSV coù hoaït tính enzym cellulase chöù chöa choïn ñöôïc loaøi VSV coù hoaït tính enzym cellulase cao nhaát. Muoán coù keát quaû chính xaùc ta caàn khaûo saùt khaû naêng sinh toång hôïp enzym theo thôøi gian. Thí nghieäm 2: Choïn loaøi naám moác coù hoaït tính enzym cao nhaát Tieáp tuïc ta nuoâi 4 loaøi naám moác naøy treân moâi tröôøng CZ vôùi nguoàn cô chaát laø CMC 1%. Sau ñoù ta tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính enzym baèng phöông phaùp ño ñöôøng khöû. Keát quaû ñöôïc ño ôû ngaøy thöù 2, 3, 4, 5. Keát quaû thí nghieäm Baûng 4.1– Hoaït tính CMCase cuûa caùc loaøi naám moác theo thôøi gian (UI/ml) Thôøi gian (ngaøy) Naám moác 2 3 4 5 A.Niger 0,040 0,053 0,033 0,028 A.awamori 0,047 0,067 0,047 0,032 A.aculactum 0,029 0,066 0,047 0,036 P.citrinum 0,034 0,102 0,123 0,100 Hình 4.2- Ñoà thò bieåu dieãn hoaït tính CMCase theo thôøi gian cuûa 4 loaøi naám moác Nhaän xeùt vaø baøn luaän Döïa vaøo ñoà thò 4.2 ta thaáy raèng naám moác P.citrinum coù hoaït tính CMCase cao nhaát. Trong thí nghieäm naøy ta thaáy caùc gioáng Aspergillus coù hoaït tính enzym cao ôû ngaøy thöù 3 coøn P.citrinum ôû ngaøy thöù 4. Tuy toác ñoä phaùt trieån cuûa A.Niger, A.awamori, A.aculactum nhanh hôn P.citrinum nhöng hoaït tính enzym cao nhaát cuûa chuùng thì laïi thaáp hôn. So saùnh hoaït tính cao nhaát cuûa caùc loaøi naøy ta thaáy loaøi A.Niger baèng 43%, A.awamori baèng 55%, A.aculactum baèng 54% hoaït tính cuûa P.citrinum. Trong thöïc teá ngöôøi ta thöôøng saûn xuaát enzym cellulase töø A.Niger, T.reesei, A.awamori. Coù raát ít nghieân cöùu treân caùc loaøi Penicillium do toác ñoä phaùt trieån chaäm vaø thöôøng trong quaù trình phaùt trieån chuùng taïo ra caùc chaát khaùng sinh gaây khoù khaên cho quaù trình tinh saïch enzym sau naøy. Nhöng theo thí nghieäm treân ñaây thì loaøi coù khaû naêng sinh hoaït tính enzym cao nhaát laø P.citrinum, ñaây coù theå laø moät höôùng nghieân cöùu môùi ñeå saûn xuaát enzym cellulase. Maët khaùc ôû ñaây ta chæ khaûo saùt hoaït tính CMCase bieåu thò hoaït tính enzym EG. Coøn hoaït tính enzym CBH vaø b-glucosidase thì chöa khaûo saùt neân ta chæ coù theå keát luaän loaøi naøy sinh toång hôïp enzym EG cao nhaát trong caùc loaøi naám moác ñaõ choïn. Aûnh höôûng nguoàn carbon (cellulose) ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym Thí nghieäm 3: choïn nguoàn carbon thích hôïp cho naám moác P.citrinum Rôm, baõ mía, muøn cöa sau khi xöû lyù ñöôïc duøng laøm nguoàn carbon cho vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy vôùi haøm löôïng 1%. Sau 4 ngaøy ta ño hoaït tính enzym trong dòch nuoâi caáy vaø choïn ra nguoàn carbon thích hôïp nhaát cho naám moác P.citrinum. Keát quaû Baûng 4.2- Hoaït tính enzym cuûa naám moác P.citrinum treân 3 nguoàn carbon khaùc nhau Nguoàn carbon Rôm Baõ mía Muøn cöa CMCase (UI/ml) 0,911 0,755 0,223 Nhaän xeùt vaø baøn luaän Döïa vaøo baûng keát quaû treân thì cô chaát rôm laø toát nhaát ñoái vôùi loaøi naám moác naøy. Töø keát quaû treân thì moâi tröôøng rôm laø toát nhaát. Baûng 4.3-Thaønh phaàn cuûa nguyeân lieäu rôm, baõ mía, muøn cöa [20] Cô chaát Cellulose (%) Hemicellulase (%) Lignin (%) Rôm 38,2 24,7 23,4 Baõ mía 50,0 30,0 18,0 Muøn cöa 41,9 21,6 27,1 Döïa vaøo baûng treân ta thaáy neáu döïa treân haøm löôïng cô chaát thì ñaùng leõ baõ mía phaûi cho haøm löôïng ñöôøng vaø hoaït tính enzym cao hôn. Theá nhöng keát quaû thí nghieäm laïi hoaøn toaøn khaùc.Ta thaáy raèng haøm löôïng ñöôøng vaø hoaït tính enzym treân nguyeân lieäu rôm laø cao nhaát, keá ñeán baõ mía vaø thaáp nhaát laø muøn cöa. Nghieân cöùu cuûa Solomon et al. thuûy phaân baõ mía, muøn cöa vaø loõi baép bôûi naám moác A.flavus thì muøn cöa coù hoaït tính enzym cao nhaát (0,0743UI/ml), baõ mía (0,0573 UI/ml) vaø loõi baép (0,0502 UI/ml) [7]. Theo nhö keát quaû nghieân cöùu thì hoaït tính CMCase treân muøn cöa laø 0,223UI/ml cao hôn keát quaû nghieân cöùu cuûa Solomon et al. (2003) 3 laàn; coøn treân baõ mía laø 0,755 UI/ml cao hôn keát quaû cuûa Solomon et al. (2003) 13 laàn. Nhö vaäy loaøi naám moác P.citrinum coù khaû naêng sinh hoaït tính CMCase cao hôn raát nhieàu so vôùi loaøi A.flavus trong nghieân cöùu cuûa Solomon et al. maëc duø treân cuøng moät cô chaát. Tuy nhieân ñieàu naøy cuõng phuï thuoäc raát nhieàu yeáu toá. Khi thuûy phaân cô chaát ligno-cellulose thì thaønh phaàn gaây caûn trôû khaû naêng tieáp xuùc enzym vôùi cô chaát cellulose chính laø lignin. Lignin coù caáu truùc voâ cuøng vöõng chaéc raát khoù phaân caét. Vieäc tieàn xöû lyù nguyeân lieäu baèng NaOH laø nhaèm muïc ñích phaù vôõ lieân keát cuûa lignin, nhöng vieäc xöû lyù naøy chæ laøm giaûm ñöôïc ½ löôïng lignin. Tuy nhieân nguyeân lieäu khaùc nhau khaû naêng giaûm lignin cuõng khaùc nhau. Maët khaùc, tæ leä vuøng keát tinh vaø vuøng voâ ñònh hình treân nguyeân lieäu khaùc nhau thì khaùc nhau. Caây caøng laâu naêm thì löôïng cellulose keát tinh caøng nhieàu. Chính vì vaäy maø haøm löôïng cellulose keát tinh cuûa muøn cöa laø cao nhaát, keá ñeán laø baõ mía vaø cuoái cuøng laø rôm. Nhö vaäy coù theå raèng loaøi naám moác naøy coù khaû naêng saûn sinh löôïng lôùn enzym EG – moät loaïi enzym cellulase coù khaû naêng phaân caét toát treân cô chaát cellulose voâ ñònh hình. Nhìn chung theo keát quaû naøy thì loaøi naám moác P.citrinum höùa heïn raát nhieàu khaû naêng öùng duïng ñeå saûn xuaát enzym cellulase trong coâng nghieäp. Thí nghieäm 4: khaûo saùt haøm löôïng rôm toát nhaát cho vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy Ta tieán haønh thí nghieäm ôû caùc noàng ñoä rôm 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%. Keát quaû thí nghieäm Baûng 4.4- Hoaït tính CMCase cuûa P.citrinum vôùi caùc noàng ñoä rôm khaùc nhau Rôm(%) CMCase(UI/ml) 0,5 0,383 1,0 0,962 1,5 1,111 2,0 1,150 2,5 1,022 3,0 0,953 3,5 0,832 Hình 4.3- Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä rôm ñeán hoaït tính enzym cellulase Nhaän xeùt vaø baøn luaän Döïa vaøo ñoà thò treân ta thaáy ôû noàng ñoä 2% thì hoaït tính CMCase laø cao nhaát. Noàng ñoä rôm cao hôn 2% thì hoaït tính enzym giaûm. Ñoù laø do noàng ñoä cô chaát cao taïo ra aùp suaát thaåm thaáu lôùn öùc cheá khaû naêng sinh toång hôïp enzym cuûa naám moác. Maët khaùc söï taïo thaønh saûn phaåm cellobiosa vaø caùc cellodextrin maïch ngaén trong quaù trình thuûy phaân cellulose cuõng gaây öùc cheá ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám moác. Cellobiosa coù khaû naêng öùc cheá caû enzym EG vaø CBH. Söï giaûm hoaït tính cuõng coù theå laø do thieáu nguoàn dinh döôõng khaùc nhö nguoàn nitô, nguoàn khoaùng,…hoaëc do söï taïo thaønh lieân keát ñaëc bieät cuûa enzym vôùi cô chaát laøm giaûm tính hoaït ñoäng cuûa enzym. Theo [10] nghieân cöùu söû duïng pheá lieäu noâng nghieäp saûn xuaát enzym cellulase töø A.Niger thì haøm löôïng nguoàn carbon toát nhaát laø 5%. Coù söï khaùc bieät trong keát quaû nghieân cöùu laø do söï khaùc nhau veà loaøi naám moác. Moãi loaøi naám moác coù khaû naêng chòu aùp suaát thaåm thaáu khaùc nhau. Nhöng cuõng coù theå laø do moâi tröôøng nuoâi caáy khaùc nhau, nguoàn goác cô chaát khaùc nhau. Moät soá nghieân cöùu khaùc nhö töø vi khuaån Thermomonospora curvata [20] söû duïng nguoàn carbon laø sôïi cotton thì haøm löôïng toái öu laø 0,8%; Chaetomium globosum [16] nguoàn carbon laø sôïi cotton thì toái öu laø 1%. Aûnh höôûng nguoàn nitô ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym Thí nghieäm 5: choïn nguoàn nitô Ta tieán haønh thí nghieäm treân 3 maãu: maãu coù boå sung pepton 0,5%, maãu coù yeast extract 0,5%, vaø maãu khoâng boå sung caû 2 thaønh phaàn treân. Keát quaû Baûng 4.5- Hoaït tính CMCase cuûa P.citrinum vôùi caùc nguoàn nitô boå sung khaùc nhau CMCase (UI/ml) None 0,572 Pepton 1,108 Yeast extract 1,092 Nhaän xeùt vaø baøn luaän Döïa vaøo keát quaû treân ta thaáy raèng pepton vaø yeast extract coù aûnh höôûng nhö nhau ñeán hoaït tính enzym celullase. Vì vaäy ta choïn nguoàn boå sung laø pepton. Khi khoâng boå sung pepton hay Yeast extract thì hoaït tính CMCase chæ baèng 50% khi coù boå sung. Nhö vaäy ta thaáy raèng moâi tröôøng CZ thieáu nguoàn nitô cho loaøi naám moác khaûo saùt. Nguoàn nitô raát caàn cho söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa VSV maëc duø vieäc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy vôùi haøm löôïng raát nhoû. Baûn thaân moâi tröôøng CZ cuõng coù chöùa nguoàn nitô döôùi daïng muoái voâ cô nhöng vôùi haøm löôïng raát thaáp. Nhö vaäy trong quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån, ngoaøi nguoàn nitô voâ cô VSV coøn caàn boå sung theâm nguoàn nitô höõu cô nhö pepton, yeast extract hay meat extract. Thí nghieäm 6: choïn haøm löôïng pepton boå sung toát nhaát. Tieán haønh thí nghieäm vôùi noàng ñoä pepton boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy laø 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 0,9%. Keát quaû Baûng 4.6- Hoaït tính CMCase öùng vôùi noàng ñoä pepton khaùc nhau Pepton(%) CMCase (UI/ml) 0.1 0,520 0.3 0,645 0.5 1,011 0.7 0,857 0.9 0,874 Hình 4.4- Ñoà thò aûnh höôûng cuûa noàng ñoä pepton ñeán hoaït tính CMCase Nhaän xeùt vaø baøn luaän Keát quaû cho thaáy haøm löôïng pepton 0,5% laø thích hôïp nhaát. ÔÛ noàng ñoä pepton cao hôn gaây ra aùp suaát thaåm thaáu lôùn öùc cheá khaû naêng sinh toång hôïp enzym cuûa naám moác. So saùnh vôùi caùc nghieân cöùu khaùc Thermophilic Clostridium [6] thì nguoàn boå sung yeast extract toát nhaát laø 0,5%; Chaetomium globosum [16] haøm löôïng pepton boå sung toát nhaát laø 0,6%. Aûnh höôûng cuûa pH ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym Thí nghieäm 7:Tieán haønh thí nghieäm vôùi 6 giaù trò pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Keát quaû Baûng 4.7 – Hoaït tính CMCase öùng vôùi pH vaø thôøi gian khaùc nhau Thôøi gian (ngaøy) pH 1 2 3 4 5 6 7 3 0,512 0,836 1,192 1,000 0,720 0,644 0,400 4 0,600 1,076 1,636 1,428 1,096 1,064 0,864 5 0,284 0,476 0,784 0,960 0,632 0,400 0,228 6 0,228 0,436 0,700 0,908 0,828 0,716 0,520 7 0,220 0,360 0,684 0,848 0,676 0,476 0,356 8 0,128 0,220 0,480 0,820 1,036 1,124 0,856 Sau ñaây laø ñoà thò bieåu dieãn hoaït tính CMCase theo thôøi gian öùng vôùi caùc pH khaùc nhau: Hình 4.5– Ñoà thò theå hieän hoaït tính CMCase theo thôøi gian ôû caùc pH khaùc nhau Nhö vaäy ôû ngaøy thöù 3, pH=4 coù hoaït tính CMCase cao nhaát. Hình 4.6- Ñoà thò bieåu dieãn aûnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán hoaït tính CMCase (ño ôû ngaøy thöù 3) Nhaän xeùt vaø baøn luaän Döïa vaøo baûng 4.7 ta thaáy pH=4 laø pH toái öu cho naám moác P.citrinum sinh toång hôïp enzym. Döïa vaøo ñoà thò 4.5 bieãu dieãn aûnh höôûng cuûa thôøi gian ñeán hoaït tính CMCase ôû pH=4, thì thôøi gian toái öu cho loaøi naám moác naøy laø 3 ngaøy. Ñeán ngaøy thöù 4 hoaït tính coøn 87%, ñeán ngaøy thöù 5 hoaït tính coøn 70%, ñeán ngaøy thöù 6 coøn 65%, ngaøy thöù 7 coøn 52%. Nhö vaäy hoaït tính enzym giaûm nhanh, sau 7 ngaøy hoaït tính giaûm 50%. Coù söï giaûm nhanh hoaït tính enzym laø do trong quaù trình nuoâi caáy pH moâi tröôøng nuoâi caáy luoân luoân thay ñoåi aûnh höôûng raát lôùn ñeán hoaït tính enzym. Trong quaù trình nuoâi caáy VSV sinh toång hôïp enzym cellulase phaân huûy cellulose thaønh hôïp chaát ñôn giaûn hôn dextrose maø chuùng coù theå haáp thuï ñöôïc. Sau khi vaøo cô theå hôïp chaát dextrose tieáp tuïc bò phaân giaûi theo 2 con ñöôøng: ñöôøng phaân (EMP) vaø Pento-photphat (PP) taïo saûn phaåm piruvat. Sau ñoù piruvat tham gia vaøo chu trình Krebs taïo ra naêng löôïng cung caáp cho caùc hoaït ñoäng soáng cuûa VSV. Quaù trình naøy taïo ra nhieàu acid höõu cô laøm thay ñoåi pH cuûa moâi tröôøng. Söï thay ñoåi pH cuûa moâi tröôøng trong quaù trình nuoâi caáy cuõng giaûi thích taïi sao ôû nhöõng pH khaùc nhau thì thôøi gian ñeå naám moác sinh toång hôïp enzym coù hoaït tính cao nhaát cuõng khaùc nhau. Ban ñaàu pH trong moâi tröôøng giaûm nhöng sau ñoù laïi taêng leân do VSV söû duïng nguoàn carbon laø caùc acid naøy ñeå sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Ñeå khaéc phuïc söï thay ñoåi pH trong suoát quaù trình nuoâi caáy ngöôøi ta coù theå söû duïng dung dòch ñeäm cho vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy hoaëc söû duïng thieát bò nuoâi caáy maø ta coù theå ñieàu chænh ñöôïc pH trong suoát quaù trình nuoâi caáy. Söï giaûm hoaït tính sau ngaøy thöù 3 laø do söï öùc cheá bôûi saûn phaåm cuoái nhö cellobiosa vaø caùc cellodextrin maïch ngaén do thuûy phaân cellulose. Theo [6] nghieân cöùu treân loaøi Thermophilic Clostridium thì haøm löôïng glucose vaø cellobiosa baét ñaàu coù taùc duïng öùc cheá khaû naêng sinh toång hôïp enzym cellulase laø 0,05%, coøn ôû haøm löôïng 0,3% cellobiose vaø 0,4% glucose thì coù taùc duïng öùc cheá hoaøn toaøn. Ngoaøi ra, söï thuûy phaân hôïp chaát lignin taïo caùc hôïp chaát thôm cuõng coù taùc duïng öùc cheá söï sinh toång hôïp enzym cuûa VSV. Nghieân cöùu treân caùc loaøi VSV khaùc nhö vi khuaån Thermomonospora curvata [20] thì pH toái thích laø 8, thôøi gian laø 6 ngaøy; A. Niger[8] pH=5, thôøi gian 5 ngaøy treân cô chaát xô döøa, vaø pH=6, thôøi gian 5 ngaøy treân cô chaát muøn cöa; A.Niger[10] pH=3, thôøi gian laø 3 ngaøy. Nhö vaäy cuøng 1 loaøi VSV nhöng vôùi nhöõng cô chaát khaùc nhau thì keát quaû cuõng khaùc nhau. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzym cellulase Thí nghieäm 8: Phaûn öùng ñöôïc thöïc hieän ôû caùc nhieät ñoä 40, 45, 50, 55, 600C Keát quaû Baûng 4.8– Hoaït tính CMCase ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau Nhieät ñoä(0C) CMCase (UI/ml) 40 1,503 45 1,566 50 1,794 55 1,725 60 1,647 Hình 4.7 – Ñoà thò bieåu dieãn hoaït tính CMCase theo nhieät ñoä Nhaän xeùt vaø baøn luaän Döïa vaøo ñoà thò 4.7 thì nhieät ñoä toát nhaát cho enzym cellulase thu nhaän töø P.citrinum laø 500C. ÔÛ nhieät ñoä 550C hoaït tính enzym giaûm 3,8%, ôû nhieät ñoä 600C hoaït tính giaûm 8%; coøn ôû nhieät ñoä 450C hoaït tính giaûm 10%, ôû 400C laø 16%. Nhìn chung enzym naøy coù hoaït tính oån ñònh theo nhieät ñoä. Tính oån ñònh cuûa enzym coù yù nghóa raát lôùn trong vieäc saûn xuaát cuõng nhö öùng duïng enzym. Vaø tính oån ñònh nhieät ñoä cuûa enzym saûn xuaát töø loaøi naám moác naøy höùa heïn raát lôùn khaû naêng öùng duïng trong saûn xuaát cheá phaåm enzym thöông maïi. Theo [22] nghieân cöùu sinh toång hôïp enzym cuûa naám moác A.Niger nhieät ñoä toái thích cho enzym laø 400C, enzym naøy oån ñònh hoaït tính ôû nhieät ñoä <400C vaø maát hoaït tính ôû nhieät ñoä 650C. Enzym thu nhaän töø naám moác P.citrinum coù khaû naêng chòu ñöôïc cao hôn, ôû nhieät ñoä 600C hoaït tính chæ giaûm 8%. Theo [4] thì nhieät ñoä toái thích cuûa enzym cellulase thu ñöôïc töø naám moác laø 45-600C. Nhieät ñoä toái thích cuûa enzym cellulase thu ñöôïc töø P.citrinum coù giaù trò thaáp hôn enzym thöông maïi töø A.Niger (600C). ÔÛ moät soá loaøi vi khuaån thì nhieät ñoä naøy thaáp hôn Thermophilic Clostridium [6] laø 670C, Thermomonospora curvata [20] laø 600C, Bacillus pumilus[9] laø 600C; naám moác A.Niger[10] laø 550C. Tuy nhieân keát quaû naøy cuõng chöa thaät söï laø nhieät ñoä toái thích cuûa enzym cellulase ñöôïc thu nhaän töø naám moác P.citrinum vì ñaây chæ laø enzym thoâ. Trong hoãn hôïp enzym thoâø coøn coù raát nhieàu thaønh phaàn khaùc coù aûnh höôûng ñeán hoaït tính enzym Muoán coù keát quaû chính xaùc enzym caàn ñöôïc tinh saïch baèng caùc phöông phaùp nhö: keát tuûa baèng coàn, trao ñoåi ion,…ñeå thu ñöôïc enzym tinh khieát. Aûnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính enzym cellulase Thí nghieäm 9: duøng dung dòch ñeäm vôùi caùc giaù trò pH laø 5; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0 ñeå oån ñònh pH cuûa phaûn öùng enzym. Keát quaû thí nghieäm Baûng 4.9- Hoaït tính CMCase ôû caùc pH khaùc nhau pH CMCase (UI/ml) 5,0 1,536 5,5 1,762 6,0 1,685 6,5 1,517 7,0 1,441 7,5 1,215 8,0 1,123 Hình 4.8- Ñoà thò bieåu dieãn hoaït tính CMCase theo pH Nhaän xeùt vaø baøn luaän Keát quaû thí nghieäm cho thaáy pH=5.5 laø thích hôïp nhaát ñoái vôùi enzym cellulase. ÔÛ giaù trò pH=5 hoaït tính enzym giaûm 12,83%, pH=6 giaûm 4,37%, pH=6,5 giaûm 13,34%, pH=7 giaûm 18,22%, pH=7,5 giaûm 31,04%, pH=8 giaûm 36,27%. Nhìn chung khoaûng pH=5-7 hoaït tính enzym thay ñoåi khoâng ñaùng keå, trong khoaûng pH naøy pH khoâng coù aûnh höôûng lôùn ñeán hoaït tính enzym. Khoaûng pH toái thích cho enzym cellulase töø naám moác theo [2] laø pH=4-6. Nhö vaäy keát quaû thu ñöôïc pH toái thích cuûa enzym töø loaøi naám moác naøy töông töï nhö keát quaû thu ñöôïc töø caùc loaøi naám moác khaùc. Nguyeân nhaân giaûm hoaït tính khi pH khaùc 5,5 laø do enzym coù baûn chaát laø protein neân deã daøng bò bieán tính bôûi ñieàu kieän pH cuûa phaûn öùng. Moät soá nghieân cöùu treân caùc loaøi VSV khaùc:pH toái thích cuûa cellulase töø Thermophilic Clostridium [6] laø 6,5, Bacillus pumilus[9] laø 6, A.Niger[10] laø 5. Qua nghieân cöùu ta thu ñöôïc enzym cellulase coù hoaït tính CMCase laø 1,762 UI/ml treân cô chaát laø rôm vôùi haøm löôïng 2%, haøm löôïng pepton boå sung laø 0,5%, pH moâi tröôøng nuoâi caáy laø 4; nhieät ñoä toái thích cuûa enzym laø 500C, pH toái thích cuûa enzym laø 5,5. Hoaït tính CMCase cuûa moät soá loaøi VSV ñöôïc nghieân cöùu: Thermophilic Clostridium laø 183mUI/ml, Aspergilus flavus [7] laø 0,0743 UI/ml treân cô chaát laø muøn cöa, Thermomonospora curvata [20] laø 5,9UI/ml treân cô chaát laø sôïi cotton, Aspergilus Niger[8] laø 0,258 UI/ml ñoái vôùi xô döøa vaø 0,274 UI/ml ñoái vôùi muøn cöa, Aspergilus fumigatus[8] laø 0,292UI/ml ñoái vôùi xô döøa vaø 0,272 UI/ml ñoái vôùi muøn cöa. Keát quaû thu ñöôïc khaùc nhau laø do söï khaùc nhau veà loaøi VSV, moâi tröôøng nuoâi caáy, cô chaát söû duïng. ÖÙng duïng enzym cellulase ñeå thuûy phaân cô chaát rôm Enzym ñöôïc nuoâi caáy vôùi nhöõng ñieàu kieän toái öu nhö treân, sau ñoù ñöôïc loïc vaø tieán haønh cho thuûy phaân cô chaát rôm (ôû ñaây cô chaát ñaõ ñöôïc xöû lyù). Löôïng cô chaát ñöôïc söû duïng trong öùng duïng naøy laø 5%, 10% vaø 20%. Baûng 4.10 - Keát quaû löôïng ñöôøng thu ñöôïc vaø heä soá thuûy phaân A Haøm löôïng rôm M(%) Löôïng ñöôøng taïo thaønh B (%) A (%) 5 0,1011 20,22 10 0,2499 24,99 20 0,4820 24,10 Trong 3 haøm löôïng rôm 5%, 10% vaø 20% thì haøm löôïng rôm toát nhaát ñeå thu ñöôøng laø 10%. Heä soá A=24,99% coù nghóa laø cöù 100g cô chaát ñem thuûy phaân thì thu ñöôïc 24,99g ñöôøng taïo thaønh. Döïa vaøo keát quaû thu ñöôïc ta chæ coù theå keát luaän ñöôïc raèng vieäc öùng duïng enzym cellulase ôû haøm löôïng rôm 10% laø thích hôïp nhaát trong 3 haøm löôïng rôm khaûo saùt. Ta coù theå öùng duïng enzym naøy ñeå thuûy phaân pheá lieäu rôm taïo ra ñöôøng. Töø ñoù coù theå öùng duïng saûn xuaát coàn trong coâng nghieäpcoâng nghieäp. Vì thôøi gian haïn cheá neân thí nghieäm treân chæ laø khaûo saùt böôùc ñaàu treân 3 haøm löôïng rôm 5%, 10% vaø 20%. Ñeå öùng duïng enzym naøy ta caàn phaûi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng rôm ñeán khaû naêng sinh ñöôøng cuûa enzym vaø löôïng enzym thích hôïp cho phaûn öùng.