Chế tạo Oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 và khảo sát hiệu ứng gia tăng kích thước lá trên cây dâu tây (Fragaria Vesca L.)

TAÏP CHÍ KHOA HOÏC ÑAÏI HOÏC SAØI GOØN Soá 31 (56) - Thaùng 8/2017 3 Chế tạo Oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 và khảo sát hiệu ứng gia tăng kích thước lá trên cây dâu tây (Fragaria Vesca L.) Preparation of Oligochitosan by Gamma irradiation onto Chitosan/H2O2 solution and examining effects of increase in the size of leaves on Strawberry (Fragaria Vesca L.) TS. Đặng Xuân Dự, Trường Đại học Sài Gòn Dang Xuan Du, Ph.D., Saigon University ThS. Trần Thị Anh Thư, Trường THPT chuyên Hùng Vương, Gia Lai Tran Thi Anh Thu, MSc., Hung Vuong High School, Gia Lai Province TS. Lê Công Nhân, Trường Đại học Sài Gòn Le Cong Nhan, Ph.D., Saigon University Tóm tắt Trong nghiên cứu này, chitosan đã được cắt mạch trong dung dịch chitosan/H2O2 bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Khối lượng phân tử (Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA) của chitosan lần lượt được xác định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) và phương pháp phổ hồng ngoại (IR). Kết quả cho thấy oligochitosan khối lượng phân tử Mw ~ 7,5 kDa đã được chế tạo một cách hiệu quả bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 dung dịch chitosan/H2O2 ở liều xạ thấp, khoảng 11 kGy. Oligochitosan chế tạo được có hiệu ứng gia tăng kích thước lá của cây dâu tây. Nồng độ phù hợp của oligochitosan để phun lên cây dâu tây là khoảng 50 ppm. Từ khóa: Oligochitosan, bức xạ Gamma, dâu tây. Abstract In this study, the degradation of chitosan in the presence of H2O2 solution by gamma irradiation was investigated. The molecular weight and the degree of deacetylation of chitosan were determined by gel permeation chromatography (GPC) and infrared spectra (IR), respectively. Results showed that oligochitosan with molecular weight Mw ~7,5 kDa were preparared efficiently by gamma irradiation in small doses, ~11 kGy. The obtained oligochitosan imposes effects of increase in the size of leaves of fracaria vesca L. The appropriate concentration of oligochitosan used to spray onto fracaria vesca L. trees was 50 ppm. Keywords: Oligochitosan, Gamma irradiation, Fracaria Vesca L. CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH 4 1. Mở đầu Oligochitosan là polyme có nguồn gốc tự nhiên, là sản phẩm biến tính từ chitosan bằng phản ứng cắt mạch. Oligochitosan tự phân hủy sinh học, là prebiotic có độc tính thấp, có khả năng kháng nấm [6] và kháng khuẩn [7] [8]. Ngoài ra, oligochitosan còn làm tăng sinh tế bào, tăng cường miễn dịch của cơ thể động vật bằng cách kích thích sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol trong máu và có tác dụng làm lành các vết thương, vết bỏng [11]. Do có nhiều hoạt tính sinh học độc đáo, oligochitosan được ứng dụng khá đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như làm chất điều hòa sinh trưởng, phòng trị nấm bệnh thực vật và gia tăng khả năng miễn dịch trên động vật... Hoạt tính của oligochitosan thông thường bị chi phối bởi khối lượng phân tử (KLPT, Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA). Vì vậy, khi chế tạo oligochitosan từ chitosan ban đầu thì các thông số này rất được quan tâm trong quá trình phản ứng. Các phương pháp chế tạo oligochitosan phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp enzym và phương pháp chiếu xạ. Phương pháp hóa học có ưu điểm là điều kiện phản ứng khá đơn giản nên dễ dàng tiến hành với quy mô lớn. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là hiệu suất thấp và có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Phương pháp enzym có lợi thế là cho hiệu suất cao nhưng chi phí lại đắt. Phương pháp chiếu xạ được xem là thân thiện với môi trường và có thể tiến hành dễ dàng với quy mô lớn, tuy nhiên để chế tạo được oligochitosan thường phải sử dụng liều xạ cao [2], điều này dẫn đến sản phẩm tạo thành dễ bị cắt mạch nhóm amin và phá vỡ vòng glucopyranose [5], làm giảm hoạt tính của oligochitosan. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả chế tạo oligochitosan bằng sự kết hợp đồng thời giữa bức xạ gamma Co-60 và H2O2 nhằm giảm liều xạ. Oligochitosan thu được sau phản ứng cắt mạch được ứng dụng làm chất gia tăng kích thước lá đối với cây dâu tây (Fragaria vesca L), loại cây được trồng phổ biến ở cao nguyên Lâm Đồng, cho hiệu quả kinh tế cao. Kết quả nghiên cứu là cơ sở để chế tạo các chế phẩm kích thích tăng trưởng thực vật có nguồn gốc tự nhiên góp phần phát triển nền nông nghiệp bền vững. 2. Thực nghiệm 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất Chitosan ban đầu được chế tạo từ vỏ tôm có Mw khoảng 50 kDa, ĐĐA khoảng 90%. Dâu tây Labiang (Fragaria vesca L.) được mua ở tại vườn giống dâu tây xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai. Hydro peroxit (H2O2) là sản phẩm tinh khiết của Merck, Đức. Các hóa chất axit lactic, etanol, amoniac được dùng ở dạng tinh khiết phân tích. Nước cất một lần được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chế tạo oligochitosan Hòa tan 5 g chitosan trong dung dịch axit lactic 3%, thêm một lượng H2O2 30% và định mức đến 100 mL để thu được dung dịch chiếu xạ chứa 5% chitosan và 1% H2O2. Tiến hành chiếu xạ đến 11 kGy [5] trên nguồn SVST Co-60/B tại trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ VINAGAMMA, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam với suất liều 1,33 kGy/h. Dung dịch sau khi chiếu xạ được trung hòa bằng NH4OH 5%, thêm một lượng cồn bằng 6 lần thể tích dung dịch mẫu, khuấy đều, sau đó lọc kết tủa và rửa sạch bằng cồn [1]. Mẫu sau khi rửa sạch, để khô tự nhiên rồi sấy ở nhiệt độ 60°C trong 2 giờ. ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CÔNG NHÂN 5 2.2.2. Xác định khối lượng phân tử và độ đề axetyl của chitosan Khối lượng phân tử oligochitosan được xác định bằng phương pháp sắc kí gel (GPC), trên máy LC-20AB Shimadzu, Nhật, sử dụng detector RID - 10A và cột Ultrahydrogel 250 của hãng Water, Mỹ, nhiệt độ vận hành cột là 40°C, pha động là đệm axetat CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M, tốc độ dòng là 1mL/phút. Chất chuẩn được sử dụng là polysacarit Pullulan có khối lượng phân tử (KLPT) khác nhau từ 738 đến 380 000 Da [1]. Mẫu oligochitosan được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong axit axetic 0,25M với nồng độ 0,3% đến khi tan hoàn toàn, thêm muối CH3COONa 0,25M sau đó lọc dung dịch qua màng 0,45μm (Millipore filters). Mẫu oligochitosan này được tiêm vào cột sắc kí với thể tích khoảng 50 μl. Dựa vào thời gian lưu và so sánh với đường chuẩn xác định được KLPT của oligochitosan. Độ đề axetyl (ĐĐA) của oligochitosan được xác định bằng phương pháp hồng ngoại trên máy FT – IR 8400S, Shimadzu, Nhật. ĐĐA được tính dựa theo phương trình [3]: ĐĐA, % = 100 – ([31,92 × (A1320/A1420)] -12,00). Trong đó, A1320 và A1420 lần lượt là mật độ quang tương ứng tại các đỉnh 1320 và 1420 cm -1 . 2.2.3. Khảo sát hiệu ứng gia tăng kích thước lá của oligochitosan đối với dâu tây Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm được đánh số từ 1 đến 4 mỗi lô gồm có 40 cây. Tiến hành phun oligochitosan có KLPT khoảng 7,5 kDa với các nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm từ lô 2 đến lô 4. Lô 1 không phun oligochitosan để làm đối chứng. Thời điểm bắt đầu phun oligochitosan là sau khi cây giống được trồng khoảng 1 tuần. Sau đó, oligochitosan được phun bổ sung vào ngày thứ 30 và 60 kể từ lần phun đầu tiên. Cây được chăm sóc theo quy trình thông thường được canh tác tại địa phương, xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai. Kích thước lá của dâu tây được theo đo theo thời gian đến 120 ngày tuổi. Sau 120 ngày tuổi, mỗi lô thí nghiệm được chia làm 5 nhóm, mỗi nhóm 8 cây được đo kích thước lặp lại để phân tích thống kê bằng chương trình SPSS 16.0 và đánh giá sự khác biệt giữa các lô nghiên cứu. 3. Kết quả và thảo luận Mẫu Oligochitosan thu được ở liều xạ ~11 kGy có KLPT Mw ~7,5 kDa. Như vậy, KLPT của chitosan đã giảm 85% ở liều xạ khá thấp khi có mặt H2O2 1%. Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự đã cắt mạch chitosan bằng kỹ thuật chiếu xạ. Kết quả thu được oligochitosan có KLPT ~ 10 kDa cần liều xạ lên đến 100 kGy [2]. Điều này chứng tỏ sự có mặt H2O2 1% trong nghiên cứu của chúng tôi đã làm giảm đáng kể liều xạ cần thiết để chế tạo oligochitosan. Hiện tượng này được giải thích bằng hiệu ứng đồng vận (synergistic effect) của H2O2 và tia γ trong quá trình cắt mạch. Theo đó, gốc tự do hydroxyl (•OH) được hình thành nhờ quá trình phân ly bức xạ nước và H2O2 đã đóng vai trò như là tác nhân oxy hóa mạnh cắt mạch chitosan [12]: γ ray - • • + 2 aq 2 2 2 3 γ ray • 2 2 H O e , H , OH, H O , H , H O H O 2 OH   Ngoài ra, sản phẩm của quá trình phân ly bức xạ là e-aq và H • cũng có thể phản ứng với H2O2 để gia tăng gốc hydroxyl • OH [9]: - • - aq 2 2 • • 2 2 2 e + H O OH + OH H + H O OH + H O   Gốc •OH đóng vai trò là tác nhân bắt hydro, làm đứt liên kết C – H hình thành gốc cacbohydrat R•, dẫn đến quá trình chuyển vị và cuối cùng liên kết glycoside bị cắt, tạo thành phân tử chitosan có KLPT thấp hơn hay oligochitosan [12]. (1) (2) (3) (4) CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH 6 Hình 1. Phổ FT - IR của chitosan ban đầu (a) và oligochitosan (b) Phổ FT - IR của oligochitosan và chitosan ban đầu được thể hiện trên hình 1. Kết quả cho thấy cấu trúc chính của oligochitosan thu được (hình 1b) hầu như không khác biệt so với chitosan ban đầu (hình 1a). Phổ FT-IR của oligochitosan xuất hiện hầu hết các đỉnh đặc trưng tiêu biểu cho các nhóm liên kết có trong chitosan ban đầu. Đỉnh ở 1655 và 1595 cm- 1 đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C=O trong nhóm –CONH– (amide I) và dao động uốn của –NH trong nhóm – CONH– (amide II). Đỉnh phổ nằm trong vùng 3200 – 3500 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết N–H trong nhóm amine và liên kết O–H. Các đỉnh ở 1072, 1028, 1153 và 893 cm -1 lần lượt đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C–O, dao động kéo giãn của C–O–C trong vòng glucopyranose và các dao động của liên kết β – 1,4 glycoside [10]. Các đỉnh ở 1320 và 1420 cm -1 tương ứng đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên kết C–N trong nhóm CH3CONH– (amide III) và dao động biến dạng của liên kết C–H, đây là hai đỉnh đặc trưng được sử dụng để tính toán sự thay đổi ĐĐA của chitosan [3]. Từ phổ FT-IR DĐA của oligochitosan được xác định dựa vào phương trình ở mục 2.2.2 cho giá trị 86%, giảm khoảng 4% so với chitosan ban đầu. Như vậy, kết hợp đồng thời tia γ với H2O2 ở nồng độ thấp khoảng 1% có thể chế tạo oligochitosan ở liều xạ khá thấp khoảng 11 kGy. Oligochitosan thu được có ĐĐA giảm không đáng kể và cấu trúc hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu. Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến chiều dài lá ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CÔNG NHÂN 7 Hình 3. Chiều dài của lá dâu tây 120 ngày tuổi ở lô đối chứng (a) và lô 2 (b) Hình 2 mô tả sự thay đổi kích thước của lá dâu tây từ 75 đến 120 ngày tuổi. Kết quả cho thấy ở nồng độ 50 ppm của oligochitosan (lô 1), kích thước lá dâu tây có sự phát triển theo thời gian tương đối tốt hơn so với các lô còn lại. Kết quả quan sát sơ bộ cũng cho thấy kích thước lá dâu tây sau 120 ngày tuổi ở lô 2 được phun oligochitosan với nồng độ 50 ppm cũng tương đối lớn hơn so với lô đối chứng (hình 3). Bảng 1. Chiều dài trung bình của lá dâu tây (cm) sau 120 ngày tuổi ở các lô khác nhau Nhóm (8 cây/nhóm) Lô đối chứng 1 Lô 2 (50 ppm) Lô 3 (100 ppm) Lô 4 (150 ppm) 1 7,7 8,4 7,4 7,9 2 7,4 8,3 7,5 8,0 3 7,8 8,5 7,2 7,5 4 7,7 7,9 7,5 7,6 5 7,6 8,0 7,3 7,8 Trung bình 7,6 ± 0,2 a 8,2 ± 0,3 b 7,4 ± 0,1 c 7,8 ± 0,2 a Kết quả phân tích ANOVA số liệu trên bảng 1 cho thấy kích thước lá ở các lô khác nhau có ý nghĩa thống kê (p = 0,00). Trong đó, lô 4 tương ứng với nồng độ 150 ppm của oligochitosan có giá trị không khác biệt so với lô đối chứng (p = 0,342). Lô 1 tương ứng với nồng độ 50 ppm cho giá trị trung bình khác biệt có ý nghĩa so với lô đối chứng (p = 0,00). Điều này chứng tỏ nồng độ 50 ppm cho hiệu quả gia tăng kích thước lá tốt hơn so với các lô còn lại. CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH 8 Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến chiều rộng lá dâu tây Hình 5. Chiều rộng của lá dâu tây 120 ngày tuổi ở lô đối chứng (a) và lô 2 (b) Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến sự gia tăng chiều rộng kích thước lá được thể hiện trên hình 4. Kết quả cho thấy độ rộng kích thước lá của lô 1 lớn hơn đáng kể so với các lô còn lại. Quan sát sơ bộ cũng cho thấy lô 2 tương ứng với nồng độ 50 ppm cho chiều rộng kích thước lá lớn hơn so với lô đối chứng (hình 5). Trong khi đó, lô 4 tương ứng với nồng độ 150 ppm cho chiều rộng kích thước lá thấp hơn so với lô đối chứng. Nguyên nhân của vấn đề này vẫn chưa rõ cần được nghiên cứu thêm. Tuy nhiên, theo nhận định của chúng tôi có thể do oligochitosan là kháng sinh thực vật [9] khi được sử dụng ở liều cao (150 ppm) có thể gây ngộ độc cho cây dẫn đến ức chế sự phát triển lá của dâu tây. ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CÔNG NHÂN 9 Bảng 2. Chiều rộng trung bình của lá dâu tây (cm) sau 120 ngày tuổi ở các lô khác nhau Nhóm (8 cây/nhóm) Lô đối chứng 1 Lô 2 (50 ppm) Lô 3 (100 ppm) Lô 4 (150 ppm) 1 7,7 8,4 7,4 7,9 2 7,4 8,3 7,5 8,0 3 7,8 8,5 7,2 7,5 4 7,7 7,9 7,5 7,6 5 7,6 8,0 7,3 7,8 Trung bình 6,2 ± 0,2 a 6,9 ± 0,3 b 6,4 ± 0,3 a 5,9 ± 0,2 a Kết quả phân tích ANOVA số liệu ở bảng 2 cho thấy chiều rộng kích thước lá trên lô khác nhau có ý nghĩa (p = 0,00). Kiểm định LSD (least significant difference) cho thấy chiều rộng của lá trên lô 2 và các lô còn lại khác nhau có ý nghĩa (p = 0,00). Trong khi đó, chiều rộng của lá trên lô đối chứng so với lô 3 (p = 0,164) và lô 4 (p = 0,064) là không khác nhau. Ngoài ra, chiều rộng của lá trên lô 2 và lô 3 là khác nhau (p = 0,003). Điều này chứng tỏ nồng độ 50 ppm của oligochitosan có khả năng gia tăng chiều rộng kích thước lá hiệu quả hơn so với ở 100 ppm. Từ kết quả phân tích ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến hiệu quả gia tăng kích thước lá dâu tây chúng tôi nhận thấy ở nồng độ phù hợp, khoảng 50 ppm, oligochitosan có khả năng gia tăng kích thước lá đối với dâu tây. Ở những nồng độ lớn hơn, hiệu quả gia tăng kích thước lá giảm. Cơ chế kích thích và ức chế khả năng gia tăng kích thước lá của oligochitosan lên dâu tây vẫn cần được nghiên cứu thêm. Tuy nhiên, việc sử dụng oligochitosan phun cho dâu tây theo chúng tôi nên tiến hành ở liều thấp, với nồng độ nhỏ hơn 100 ppm. 4. Kết luận Oligochitosan có KLPT ~ 7,5 kDa đã được chế tạo hiệu quả bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan 5%, H2O2 1% ở liều xạ khá thấp, khoảng 11 kGy. Cấu trúc chính của oligochitosan thu được hầu như không khác biệt so với chitosan ban đầu. ĐĐA của oligochitosan giảm khoảng 4%. Oligochitosan KLPT khoảng 7,5 kDa có hiệu ứng gia tăng kích thước lá đối với dâu tây. Nồng độ phù hợp của oligochitosan để phun lên cây dâu tây là khoảng 50 ppm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đặng Xuân Dự, Đinh Quang Khiếu, Diệp Khanh, Nguyễn Quốc Hiến. “Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận dung Co – 60 và H2O2 cắt mạch chitosan chế tạo oligochitosan”, Tạp chí Hóa Học, 51(2C), 627-631 (2003). 2. Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân, Trương Thị Hạnh, Phạm Thị Lệ Hà. “Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ”, Tạp chí Hóa học, 38(2), 22-44 (2000). 3. J. Brugnerotto, J. Lizardi, F. M. Goycoolea, W. Arguelles – Monal, J. Desbrieres, M. Rinaudo. “An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization”, Polymer, 42, 3569-3580 (2001). CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH 10 4. G. V. Buxton, C. L. Greenstock, W. P. Helman, A. B. Ross. “Critical review of rate constants for hydrated electron, hydrogen atoms and hydroxyl radical (OH/O-) in aqueous”, Journal of Physical and Chemical Reference Data, 17(2), 513-886 (1988). 5. N. N. Duy, D. V. Phu, N. T. Anh, N. Q. Hien. “Synergistic degradation to prepare oligochitosan by  - irradiation of chitosan solution in the presence of hydrogen peroxide”, Radiation Physical Chemistry, 80, 848-853 (2011). 6. S. Hirano, N. Nagao. “Effects of chitosan, pectic acid, lysozyme and chitinase on the growth of several phytopathogens”. Agricultural and Biological Chemistry, 53, 3065-3066 (1989). 7. Y. J Jeon, S. K. Kim. “Effect of antimicrobial activity by chitosan oligosaccharides N- conjugated with asparagines”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 11, 281- 286 (2001). 8. Y. J. Jeon, P. J. Park, S. K. Kim. “Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor”, Carbohydrate Polymers, 44, 71-76 (2001). 9. S. K. Kim, N. Rajapakse. “Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review”, Carbohydrate Polymers, 62, 357-368 (2005). 10. J. Kumirstra, M. Czerwicka, Z. Kaczynski, A. Bychowska, K. Brozowski, J. Thoming, P. Stepnowski. “Application of spectroscopic methods for structural analysis of chitin and chitosan”, Marine Drugs, 8, 1567-1636 (2010). 11. J. Shao, Y. Yang, Q. Zhong. “Study on preparation of oligoglucosamine by oxidative degradation under microwave”, Polymer Degradation and Stability, 82, 395-398 (2003). 12. P. Ulanski, C. von Sontag. “OH – radical induced chain scission of chitosan in the absence and present of dioxygen”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions, 2, 2022-2028 (2000). Ngày nhận bài: 09/7/2017 Biên tập xong: 15/8/2017 Duyệt đăng: 20/8/2017