Chất lượng tiêu bản giải phẫu bệnh khi nhuộm bằng phương pháp Hematoxylin Eosin, có thay thế dung dịch Clear-rite 3, cồn bằng dung dịch có thành phần chất hoạt động bề mặt

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 295 CHẤT LƯỢNG TIÊU BẢN GIẢI PHẪU BỆNH KHI NHUỘM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HEMATOXYLIN EOSIN, CÓ THAY THẾ DUNG DỊCH CLEAR- RITE 3, CỒN BẰNG DUNG DỊCH CÓ THÀNH PHẦN CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT Trần Thị Khuê Nữ*, Nguyễn Văn Thắng**, Nguyễn Ngọc Minh Tâm* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) là một phương pháp nhuộm thường quy trong xét nghiệm mô bệnh học. Trong phương pháp (PP) nhuộm HE có bước dùng hóa chất clear-rite 3, cồn để tẩy parafin ra khỏi mô, có tính quyết định nhiều đến chất lượng nhuộm tiêu bản (TB). Tuy nhiên clear-rite 3 rất độc hại đối với con người và môi trường. Mong muốn môi trường làm việc ít độc hại và không ảnh hưởng đến chất lượng nhuộm, chúng tôi tiến hành sử dụng dung dịch tẩy rửa chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS) 1,7 % để thay thế hóa chất clear-rite 3 và alcool. Mục tiêu: So sánh kết quả nhuộm giữa PP nhuộm HE sử dụng hóa chất Clear-rite 3 (PP nhuộm HE thường quy) với PP nhuộm HE sử dụng dung dịch có thành phần chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (PP nhuộm HE cải tiến). Phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm. Kết quả: Nhuộm hạt nhân đầy đủ được ghi nhận 99,2% ở nhóm A và 100% ở nhóm B, nhuộm tế bào chất đầy đủ 99,2% ở nhóm A và 95,1% ở nhóm B, trong rõ 93,4% nhóm A và 97,5% ở nhóm B, đồng nhất 92,6% nhóm A và 94,3% các tiêu bản nhóm B, nhuộm sắc nét,tương phản 96,7% của nhóm A và 92,6% các tiêu bản nhóm B, và 100% các tiêu bản nhóm A đủ tiêu chuẩn để chẩn đoán so với 98,4% trong các tiêu bản nhóm B. Kết luận: Dung dung dịch tẩy rửa chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS)1,7% có thể được sử dụng như là một thay thế hiệu quả cho hóa chất Clear-rite 3 và cồn trong quy trình nhuộm HE thường quy. Từ khóa: phương pháp nhuộm HE, chất hoạt động bề mặt LAS ABSTRACT QUALITY OF PATHOLOGY SPECIMEN DYEING WITH HEMATOXYLIN EOSIN METHOD USING SURFACTANT COMPOSITION INSTEAD OF CLEAR-RITE 3 AND ALCOHOL Nguyen Van Thang, Nguyen Ngoc Minh Tam, Tran Thi Khue Nu * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 294 – 299 Background: Hematoxylin-Eosin (HE) staining is a standard procedure in histopathological examination. One step of this procedure is to use Clear-rite 3 and alcohol to clean tissue of paraffin. This step is crucial to the quality of the staining. However, Clear-rite 3 is hazardous to humans and the environment. In this study, we experimented with replacing Clear-rite 3 and alcohol with a liquid dishwashing solution containing 1.7% of Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS) as a way to improve the safety of working environments while maintaining high staining quality. Objectives: Evaluate the efficacy of 1.7% dish washing liquid (LAS) solution as a deparaffinization agent for hematoxylin (H) and eosin (E) staining in comparison to Clear-rite 3 and alcohol. *Bệnh viện Bình Dân, Thành phố Hồ Chí Minh **Bộ môn Xét nghiệm, Đại học Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Trần Thị Khuê Nữ ĐT: 0986232315 Email: khuenutt@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 296 Methods: Expreimental study. Results: Adequate nuclear staining was noted in 99,18% in group A and 100% in group B, adequate cytoplasmic staining in 99,2% in group A and 95,1% in group B, clarity in 93.4% of group A and 97.5% of group B sections, uniform staining in 92.6% of group A and 94.3% of group B sections, crisp stain in 96.7% of group A and 92.6% of group B sections, and 100% of group A sections stained adequately for diagnosis in comparison with 98.4% in group B. Conclusions: 1.7% DWS was found to be an effective, less hazardous, more economical and aster alternative deparaffinization agent to clear-rite 3 and alcohol. Keywords: deparaffinization hematoxylin and eosin, liquid dishwashing solution (LAS) ĐẶT VẤN ĐỀ Nhuộm Hematoxylin- Eosin (HE) là một phương pháp nhuộm thường quy trong xét nghiệm mô bệnh học, được sử dụng rộng rãi nhất và là tiêu chuẩn vàng(7) trong chẩn đoán mô bệnh học. Trong PP nhuộm HE có bước dùng hóa chất clear-rite 3 (là hóa chất thay thế Xylen hay Toluen, hiện nay các bệnh viện đang dùng) để tẩy parafin trong mô là bước quan trọng, quyết định nhiều đến chất lượng nhuộm tiêu bản. Tuy nhiên Xylen, Toluen(9,10) rất độc hại đối với con người và môi trường. Các chất thay thế có thể là hóa chất hydrocacbon béo, hydrocacbon thơm, dầu dừa, các hóa chất đó có chức năng tương tự như Toluen, Xylen: như làm trong sáng mô trong xử lý, khử parafin ở mô trong kỹ thuật nhuộm HE. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm thay thế Toluen đắt tiền hơn và không phải là ít nguy hiểm hơn(3,10). Theo phân loại của Cơ quan Quản lý An Toàn và Sức Khỏe Nghề Nghiệp - Hoa Kỳ (Occupational Safety and Health Administration –OSHA)(5), thành phần hóa chất trong dung dịch Clear rite 3(13) hiện đang sử dụng, được phân loại lớp 1B nguy cơ gây ung thư, hóa chất dễ cháy lớp 2, cũng có ảnh hưởng đến cơ quan đích là gan và thận khi tiếp xúc hóa chất lâu dài hoặc thường xuyên, nguy cơ đột biến tế bào mầm và nguy cơ gây ung thư, có thể gây tổn thương các cơ quan do phơi nhiễm kéo dài, hoặc tiếp xúc lập đi lập lại. Mong muốn môi trường làm việc ít độc hại và không ảnh hưởng đến chất lượng nhuộm, chúng tôi tiến hành sử dụng dung dịch tẩy rửa chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS) 1,7% để thay thế hóa chất clear-rite 3 và alcool ở giai đoạn tẩy parafin trong quy trình nhuộm Hematoxylin Eosin (Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch chất tẩy rửa Sunlight pha loãng 1,7%). Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát nhuộm nhân và nhuộm tế bào chất ở 2 PP nhuộm. Khảo sát độ trong rõ, tương phản và đồng nhất ở 2 PP nhuộm. So sánh hiệu quả giữa PP nhuộm HE dùng dung dịch Clear-rite 3 (HE thường quy) với PP nhuộm HE dùng LAS 1,7% (HE cải tiến). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 122 khối mô đúc parafin và cắt mỏng tại khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện Bình Dân trong thời gian từ tháng 12/2018 đến tháng 05/2019 và Bộ môn Xét nghiệm Đại học Y Dược. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm. Phương pháp chọn mẫu Lấy mẫu thuận tiện trong thời gian nghiên cứu. Cỡ mẫu Có 122 khối mô đúc parafin. Quy trình tiến hành nghiên cứu Có 122 khối parafin trong nghiên cứu sẽ được cắt mảnh 244 tiêu bản với độ dày 3-4µm. 122 TB nhóm A được nhuộm quy trình nhuộm HE thường quy sử dụng hóa chất clear-rite 3 và Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 297 alcool làm chất tẩy parafin. 122 TB nhóm B sử dụng dung dịch chứa thành phần LAS 1,7% ở 90°C tẩy parafin. Dung dịch chứa thành phần LAS 1,7% được điều chế bằng cách hòa tan 25 ml DWL (Sunlight Dish washing Liquid) trong 1500 ml nước cất. Quy trình nhuộm các nhóm A và B được đưa ra trong Bảng 1 và 2. Bảng 0. Quy trình nhuộm HE thường quy Các giai đoạn Hóa chất Thời gian Tẩy parafin 1. Clear-rite 3 5 phút 2. Clear-rite 3 5 phút 3. Clear-rite 3 5 phút 4. Alcool 99,5 0 1 phút 5. Alcool 95 0 1 phút 6. Alcool 90 0 1 phút 8. Rửa nước 1 phút Nhuộm nhân 9. Hematoxylin 4-5 phút 10. Rửa nước 1 phút Tẩy axit 11. Rửa axit alcool 1% 2 nhúng 12. Rửa trong nước 1-2 phút Kiềm hóa (bluing) 13. Dung dịch Ammonia 1% 1 phút 14. Rửa nước 2 phút 15. Alcool 70 0 1 phút Nhuộm tế bào chất 16. Eosin 1-2 phút Biệt hóa trong alcool, làm trong 17. Alcool 90 0 1 phút 18. Alcool 95 0 1 phút 19. Alcool 99.5 0 1 phút 20. Clear rite 3 1 phút Lau mô thừa xung quanh, để khô, dán keo Bảng 2. Bảng quy trình nhuộm HE với dung dịch có thành phần LAS 1,7% Các giai đoạn Hóa chất Nhiệt độ Thời gian Tẩy parafin 1. LAS 1,7% I 90 0 1 phút 2. LAS 1,7% II 90 0 1 phút 3. Nước cất I 90 0 30 giây 4. Nước cất II 90 0 30 giây 5. Nước máy 45 0 30 giây 6 Nước máy T 0 PXN 30 giây Nhuộm nhân 7.Hematoxylin Harris T 0 PXN 7 phút 8. Rửa với nước 4 phút Kiềm hóa (bluing) 9. Dung dịch Thilium carbonate 1% T 0 PXN 1 phút 10. Rửa nước 5 phút Nhuộm tế bào chất 11. Eosin T 0 PXN 1 phút Rửa nước Rửa nước T 0 PXN 1 phút Khử nước 12. Sấy khô 60 0 10 phút Xử lý và phân tích số liệu Nhập liệu excel và xử lý bằng phần mềm thống kê Stata 14.0. KẾT QUẢ Nhuộm nhân đầy đủ đã được ghi nhận ở nhóm A là 99,2% so với 100% của nhóm B (p >0,05). Nhuộm tế bào chất đầy đủ của nhóm A là 99,2% so với 95,1% của nhóm B (p >0,05). Độ trong rõ trên tiêu bản nhóm A là 93,4% so sánh với 97,5% của nhóm B (p >0,05). Nhuộm màu đồng nhất của nhóm A là 94,3% so sánh với nhóm B là 92,62% (p >0,05). Sự tương phản, sắc nét ở nhóm A là 96,7% so sánh với nhóm B là 92,62% (Hình 1). Đủ tiêu chuẩn đủ chẩn đoán ở nhóm A là 100% so với nhóm B là 98,4% (p >0,05) (Hình 2). Hình 1. Tổng hợp các tỉ lệ nhuộm Hình 2. Tỉ lệ tiêu bản đủ chẩn đoán Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 298 Hình 3. Chất lượng nhuộm nhân trên tiêu bản mô túi mật. A: Nhuộm HE thường quy (40X), B: Nhuộm HE cải tiến (40X) Hình 4. Nhuộm tế bào chất trên tiêu bản mô túi mật. A, C: Nhuộm HE thường quy (10X, 40X), B, D: Nhhuoojm HE cải tiến (10X, 40X) Hình 5. Độ trong rõ, tương phản trên tiêu ba3n mô túi mật. A, C: Nhuộm HE thường quy (10X, 40X), B, D: Nhhuoojm HE cải tiến (10X, 40X) BÀN LUẬN Theo phân loại của OSHA(5) và MSDS(13), clear-rite 3 thuộc hóa chất dễ cháy loại 2 có điểm cháy 18,3°C/64,9°C, có tác dụng đến cơ quan đích là gan và thận khi tiếp xúc hóa chất lâu dài hoặc thường xuyên, phân loại nhóm 1B về nguy cơ đột biến tế bào mầm và nguy cơ gây ung thư; nhóm 1 nguy hiểm về đường hô hấp, có thể gây tổn thương các cơ quan do phơi nhiễm kéo dài hoặc tiếp xúc lặp đi lặp lại. Do có điểm cháy thấp 18,3°C tương tự xylen nên chất thải không bỏ trực tiếp xuống hệ thống chất thải thông thường, mà được xử lý chất thải hóa chất nguy hại. Tương tự các nghiên cứu trước chúng tôi sử dụng dung dịch có thành phần LAS 1,7% thay thế cho hóa chất clear-rite 3 trong quá trình tẩy parafin. Dung dịch có thành phần LAS là hỗn hợp tạo bọt cao của các chất hoạt động bề mặt không ion, được tạo thành từ alkylbenzenesulfonates, có tính chất dung môi giúp hòa tan parafin. Nguyên tắc cơ bản của chất tẩy rửa là ở nhiệt độ 900C(4) cùng với chất hoạt động bề mặt sẽ giúp cho việc loại bỏ parafin ra khỏi tiêu bản bằng cách giảm sức căng bề mặt của nước, bước đầu tẩy parafin ra khỏi mô, kế đến ngăn không cho parafin dính lại các mảnh mô từ đó parafin được loại ra khỏi mảnh cắt, giúp tẩy parafin hoàn toàn. So với clear-rite 3, chất tẩy rửa chén kinh tế, an toàn và có sẵn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng chất chứa thành phần LAS 1,7%. Điều này dẫn đến tác động gián tiếp đến sự an toàn của nhân viên khi xử dụng và xử lý chất thải các hóa chất này. Với tác dụng có hại của xylene được biết đến, nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng sử dụng các chất thay thế của xylene trong mô bệnh học. Buesa và Peshkov trong nghiên cứu của họ đã chứng minh rằng các tiêu bản được tẩy rửa bằng dung dịch rửa chén 1,7% ở 900C có thể giúp loại bỏ xylen khỏi quy trình nhuộm(3). Nghiên cứu của Ankle(1) kết luận rằng nhuộm HE không chứa xylen và alcool là phương pháp thay thế tốt hơn so với phương pháp thường quy, có đến 90% tiêu bản được nhuộm đầy đủ để đưa ra chẩn đoán trong phương pháp không có xylen so với 88,33% trong phương pháp thường quy(1). Ramulu kết luận rằng xà phòng rửa chén dạng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 299 lỏng có thể được sử dụng như một chất thay thế hiệu quả cho xylen alcool trong quy trình nhuộm HE thường quy, nhuộm nhân đầy đủ và rõ ràng hơn so với nhuộm HE thường quy(12). Pandey cho thấy các tiêu bản nhuộm HE với dung dịch tẩy rửa chén 1,7% ghi điểm tốt hơn về nhuộm tế bào chất và độ tương phản. Tỉ đủ để chẩn đoán trong 86% trường hợp so với nhuộm HE dùng xylen là 84%(8). Trong nghiên cứu hiện tại đã được thực hiện để xem liệu dung dịch chứa thành phần chất hoạt động bề mặt LAS 1,7% ít độc hại, rẻ tiền và sẳn có trên thị trường có thể xem như một giải pháp thay thế hiệu quả như một chất tẩy parafin cho phương pháp nhuộm HE. Các tiêu bản được nhuộm bằng cả phương pháp HE thường quy (nhóm A) và HE cải tiến (nhóm B), được Bác sĩ Giải phẫu bệnh đánh giá cho các thông số nhuộm màu nhân, nhuộm tế bào chất, độ trong rõ, tính đồng nhất của nhuộm và sự tương phản, sắc nét của nhuộm. Nhuộm nhân đầy đủ đã được ghi nhận ở nhóm A là 99,2% so với 100% của nhóm B. Các nghiên cứu khác cũng báo cáo số lượng nhóm A thấp hơn nhóm B(1,8,12). Về sự nhuộm tế bào chất đầy đủ, nghiên cứu hiện tại cho thấy 99,2% ở nhóm A so sánh với 95,1% ở nhóm B. Kết quả tương tự các nghiên cứu(1,12). Về vấn độ trong rõ nhuộm màu, nghiên cứu hiện tại thống kê có 93,4% các tiêu bản cho thấy sự rõ ràng đầy đủ để đánh giá ở nhóm A so sánh nhóm B là 97,5%, kết quả nghiên cứu này tương tự hầu hết các nghiên cứu khác, thỏa đáng so với các nghiên cứu khác. Vấn đề đồng nhất của nhuộm màu, tất cả các nghiên cứu sử dụng phương pháp dùng chất tẩy rửa chén pha loãng đều cho tỉ lệ không đồng nhất thấp hoặc ngang bằng với dùng xylen. Dung dịch chứa thành phần LAS 1,7% được sử dụng phổ biến trong tất cả các nghiên cứu rằng quy trình nhuộm không chứa xylen và chúng rất nhạy cảm với nhiệt độ. LDW hay LAS pha loãng phải được duy trì nghiêm ngặt ở 900C. Nhiệt độ giảm nhẹ có thể không tẩy parafin hoàn toàn. Điều này dẫn đến lượng parafin dư còn lại trên các tiêu bản. Điều này có thể dẫn đến các tiêu bản nhuộm không đồng nhất. Một số nghiên cứu đã thêm một bước bổ sung 1,7% LDW III ở 900C trong 30 giây trong quy trình nhuộm và tìm thấy kết quả tốt hơn. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng các tiêu bản có chất lượng nhuộm tương phản sắc nét ở nhóm A là 96,7% so với nhóm B là 92,6%, tương tự(12,14) một số các nghiên cứu khác đã báo cáo tỉ lệ tốt hơn về thông số này ở 2 phương pháp nhuộm(1,8). Trong các điểm số tổng thể, tiêu bản được nhuộm HE dùng LAS 1,7% đủ để chẩn đoán là 98,2% so sánh với 100% tiêu bản đủ chẩn đoán ở nhóm A, trường hợp này tương tự như các nghiên cứu khác(12,14). Phân tích thống kê cho thấy các tiêu bản nhuộm HE với dung dịch chứa LAS 1,7% có tác dụng tương đương như phương pháp nhuộm HE thường quy. Giá trị p thu được là 0,292 (p >0,05). Tuy nhiên các tiêu bản nhuộm cải tiến có khuynh hướng nhuộm màu đỏ. Điều này làm các tiêu bản kém độ tương phản giữa nhân và tế bào chất. KẾT LUẬN Đạt chất lượng nhuộm nhân: HE cải tiến 99,2%, HE thường quy 100%. Đạt chất lượng nhuộm tế bào chất: HE cải tiến 95,1%, HE thường quy 99,2%. Đạt chất lượng của HE cải tiến/ HE thường quy: Độ trong 97,5%/93,4%, Độ tương phản 92,6%/96,7% và Độ đồng nhất 91,8%/94,3%. Nhuộm HE cải tiến có các ưu điểm nỗi trội: Ít độc hại - Giá thành thấp - Thời gian nhuộm nhanh hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ankle MR, Joshi PS (2011). "A study to evaluate the efficacy of xylene-free hematoxylin and eosin staining procedure as compared to the conventional hematoxylin and eosin staining: An experimental study". J Oral Maxillofac. Pathol, 15(2):161-167. 2. Bộ Y Tế (2016). Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh- Tế bào học. NXB Y học, pp.22; 215; 245-247. 3. Buesa René J, Peshkov Maxim V (2009). "Histology without xylene". Ann Diagn Pathol, 13(4):246-256. 4. Gayathri G, Snegha A, Teleflo B (2016). Substitutes for xylene in histopathology and the role of temperature. J Path Micro, 2(2):55- 63. 5. Hazard Communication (2016). "Hazard Classification Guidance for Manufacturers, Importers, and Employers". Department of Labor, pp.221, 300-304. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 300 6. Kandyala R, Raghavendra SP, et al (2010). "Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures". Journal of Oral and Maxillofacial Pathology, doi: 10.4103/0973-029X.64299. 7. Kumar GL, Kiernan JA, Dako AS (2010). "Education Guide- Special Stains and H & E: Pathology". Dako North America, pp.29-36, 118-129, 177-183. 8. Pandey P, Dixit A, Tanwar A, et al (2014). "A comparative study to evaluate liquid dish washing soap as an alternative to xylene and alcohol in deparaffinization and hematoxylin and eosin staining". Journal of Laboratory Physicians, 6(2):84. 9. Phạm Minh Khiêm, Nguyễn Thị Kim Oanh, Nguyễn Văn Lực (2010). Toluen & ảnh hưởng môi trường con người. Bài tiểu luận Đại học Sư Phạm Đà Nẵng. 10. Rai R, Yadav R, Bhardwaj A (2016). "Biosafe sunstitutes to xylene: A review". International Journal of Information Research and Review, 3(6):2529-2532. 11. Ramaswamy AS, et al (2017). "A Study of Xylene Free Hematoxylin and Eosin Staining Procedure". AAMS, 1:A16-A21. 12. Ramulu S, Koneru A, Ravikumar S, et al (2012). "Liquid dish washing soap: An excellent substitute for xylene and alcohol in hematoxylin and eosin staining procedure". J Orofac Sci, 4(1):37. 13. Scientific Thermo Fisher (2015). "Clear rite 3 safety data sheet - Mercedes Medical". URL: https://www.msdsexplorer.com/. 14. Sravya T, Rao GV, Kumari MG, et al (2018). "Evaluation of biosafe alternatives as xylene substitutes in hematoxylin and eosin staining procedure: A comparative pilot study". J Oral Maxillofac Pathol, 22(1):148. Ngày nhận bài báo: 31/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 10/10/2019