Các phương pháp tách chiết dna và rna

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VÀ RNA DNA chứa thông tin di truyền của sinh vật. Do đó mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid (NA) đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. DNA gồm các loại: DNA bộ gen, DNA ty thể, DNA lục lạp, DNA plasmid, DNA phage. Tuỳ kích thước DNA, loại tế bào mà chọn phương pháp tách chiết khác nhau để đảm bảo chiết được DNA tinh khiết và có hiệu suất cao. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết NA là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các NA cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase, RNase). A.Dụng cụ và hoá chất: A.1 Dụng cụ: ¯Eppendorf: là ống đựng nhỏ bằng nhựa polyethylen hay polypropylen chịu được nhiệt độ khử trùng (1atm, 121oC, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20oC) và một số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0.2, 0.3, 0.5, 1.5, 2ml. (hãng Eppendorf, hãng BioRad…) ¯Micropipet (pipetman): là loại pipet có thể chỉnh được thể tích cần lấy dùng để hút dung dịch thể tích nhỏ, độ chính xác cao. Micropipet có nhiều cỡ: Loại Micropipet Đầu tip tương ứng 0.1->1, 1->10 0.1->10 (màu trắng) 10->100, 10->200 10->200 (màu vàng) 100->1000 100->1000 (màu xanh) Cấu tạo micropipet thay đổi tuỳ theo kiểu thiết kế nhưng nhìn chung gồm: cần bơm, ngàm tựa, bộ phận đẩy tip, bộ phận điều chỉnh thể tích, số chỉ thể tích được chọn, đầu hút (nơi gắn tip). Khi sử dụng cần chú ý: Phải gắn chặt tip vào đầu hút nếu không sẽ bị mắc sai số. Không để pipet tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hoá chất. Không để pipet gần đèn cồn. Không điều chỉnh dưới ngưỡng thể tích tối thiểu và trên ngưỡng thể tích tối đa. Các đầu tip cần cho vào hộp giá (rack), đậy nắp và hấp cao áp tiệt trùng và chỉ được sử dụng một lần để tránh sự tạp nhiễm. A.2 Trang thiết bị thông dụng: ¯Bồn ủ nhiệt, tủ định ôn: sử dụng trong các phản ứng cần nhiệt độ ổn định thường có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ, cài đặt thời gian. ¯Tủ hút khí độc: dùng trong các thí nghiệm có hóa chất bay hơi độc như: phenol, chloroform, ethidium bromide… ¯Tủ cấy vô trùng: sử dụng trong các phản ứng cần có sự vô trùng. Tủ phải luôn được giữ sạch, khử trùng bề mặt bằng cồn, trước và sau khi sử dụng tủ cần được thanh trùng bên trong bằng đèn tử ngoại (UV) ít nhất 15 phút. ¯Nồi hấp tiệt trùng: dùng để khử trùng các hoá chất và dụng cụ cần thiết. ¯Tủ lạnh: gồm có tủ mát và tủ âm sâu (-20oC và -70oC) dùng để bảo quản hoá chất, mẫu. ¯Máy đo PH: dùng xác định pH của các dung dịch. ¯Máy Vortex: dùng để đồng nhất hoá mẫu hoặc dung dịch. ¯Máy ly tâm (centrifuge): dùng để phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong cùng một dung dịch. Khi sử dụng khối lượng mẫu phải đồng đều và đặt đối xứng qua trục máy. Chỉ mở nắp khi máy ngưng hoàn toàn. Nguyên tắc: các phần tử khác nhau trong một dung dịch sẽ lắng với vận tốc khác nhau khi chịu tác động của lực li tâm. Tuỳ thuộc vào khối lượng và tỉ trọng của các phân tử vật chất mà ngưới ta chia làm 2 loại ly tâm: Ly tâm phân đoạn: dùng phân tách các phần tử vật chất khác nhau dựa vào khối lượng của chúng. Vận tốc lắng của các phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng và lực ma sát của các phần tử với dung dịch ly tâm. Để phân tách thành công các phân tử có trong một dung dịch cần phải có lực ly tâm và thời gian ly tâm thích hợp. Ly tâm đẳng tỷ trọng: phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng của chúng. Phương pháp này rất hiệu quả, cho các phân đoạn phân tách thuần khiết. Ống ly tâm chứa một cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ trên xuống đáy ống tạo nên gradient tỉ trọng. Các phần tử sẽ lắng trong quá trình ly tâm và nằm trong vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với nó. Saccharose và Glycerol được dùng khi phân tách các bào quan, Cesium chloride (CsCl) được dùng để phân tách protein và NA. A.3 Hoá chất: ¯Những điều cần chú ý: - Tất cả các dung dịch hoá chất và nước cần phải được tiệt trùng bằng nồi hấp hoặc lọc qua màng lọc vi khuẩn. Nếu cần cũng nên bảo quản đông lạnh bởi vì vi khuẩn và nấm phát triển là nguyên nhân phát sinh nuclease. (tuỳ theo khuyến cáo mà các hoá chất được bảo quản ở nhiệt độ phòng, tủ lạnh (4oC) hay tủ âm sâu (-20oC). - Để đề phòng tạp nhiễm giữa các nguyên liệu và các dung dịch hoá chất nên sử dụng đầu pipet và ống nghiệm một lần rồi vứt bỏ. - Hoá chất ở dạng các dung dịch nếu bảo quản ở dạng kéo dài hoặc lặp đi lặp lại việc giải đông thường biến tính. Vì vậy, nên chia thành lượng nhỏ sử dụng hết trong một, hai ba lần và bào quản ở -20oC hoặc -70oC. Ví dụ dithiothreitol,… - Người thao tác phải mang găng tay khi tiếp xúc bình đựng hoá chất. - Một vài dung dịch đệm được sử dụng trong các thí nghiệm với cùng thành phần có trong dung dịch đó nhưng với những nồng độ khác nhau, vì vậy cần phải chuẩn bị những dung dịch gốc đậm đặc để có thể pha loãng khi cần. ¯Dung dịch gốc: - Tris-HCl 1M (pH 7.5): hoà tan 121.1g trong nước cất. Thêm nước để được 1 lít dung dịch. Điều chỉnh pH đến 7.5, phân phối vào lọ và hấp khử trùng. Chú ý: nếu màu dung dịch đã chuyển sang màu vàng ta nên bỏ đi và chuẩn bị hoá chất mới. - NaCl 5M: hoà tan 292.2g NaCl trong nước cất. thêm nước để được 1 lit dung dịch. Phân phối vào lọ và hấp khử trùng. - EDTA 0.5M (Ethylene diamin tetra acetat (pH 8.0): hoà tan 186.1g EDTA.2H2O vào nước cất, vừa khuấy từ vừa thêm NaOH tinh thể để điều chỉnh pH đến 8.0 rồi thêm nước để được 1 lít dung dịch. Phân phối vào lọ và hấp khử trùng. Chú ý: EDTA sẽ không hoà tan vào dung dịch nếu pH không đạt ở mức 8.0 - SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate): hoà tan 100g SDS trong nước cất. Nung nóng đến 68oC để hoà tan dung dịch. Điều chỉnh pH đến 7.2 bằng cách thêm HCl. Thêm nước để được 1 lít dung dịch. Chú ý: sử dụng khẩu trang khi cân SDS và dọn dẹp khu vực đã cân cùng với cái cân sau khi sử dụng vì tinh thể SDS khuếch tán rất dễ dàng. Không cần phải khử trùng SDS 10%. - NaOH 10N: hoà tan 200gNaOH trong 500 ml nước cất. Bảo quản trong lọ chất dẻo. - Sodium acetate 3M (pH 5.2): hoà tan 81.62g trisodium acetate vào 200 ml nước cất. Dung dịch sẽ có pH 5.2 - Kalium acetate 5M pH 4.8: lấy 29.5 ml acid acetic băng, thêm KOH đậm đặc để chỉnh đến pH 4.8, thêm nước vừa đủ 100 ml. Không hấp tiệt trùng, bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Sarkosyl 20%(w/v) (N-lauroysarkosyl): hoà tan 20g N- lauroysackosyl trong nứơc cất (tăng nhiệt độ để giúp hoà tan). Thêm nước đến 100ml và hấp khử trùng bảo quản ở nhiệt độ phòng. Dung dịch có màu vàng nhạt. -RNase 10mg/ml: hoà tan 10mg/ml RNase trong TE, đun sôi 10 để diệt DNase. Chia thành các thánh phần nhỏ và bảo quản ở -20oC. - Phenol đệm: Đun khoảng 100g phenol (tinh khiết, mới) trên bếp cách thuỷ 65oC cho chảy. Rót thận trọng phenol đã chảy vào becher 250ml có chứa sẵn 100mg 8-hydroxyquinoline, thêm 100ml Tris-base 50mM (không chỉnh pH). Đậy bằng giấy nhôm, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng. Để yên cho phân lớp. Loại bỏ pha trên (pha nước, lưu ý pha hữu cơ chứa phenol có màu vàng) càng nhiều càng tốt. Thêm 500ml Tris-HCl 50mM, pH 8, và lặp lại bước trên đến khi pha phenol đạt đến pH 8 (đo bằng giấy). Thêm 100 ml Tris-HCl 50mM, pH 8 hoặc đệm TE. Bảo quản ở 4oC được 2 tháng trong chai nâu hay chai bọc giấy nhôm. Sử dụng: trộn với chloroform với tỷ lệ 1/1 hoặc với chloroform –iso amyl alcol theo tỷ lệ 25/24/1. Chú ý: phenol và chloroform đều có tính rất độc. Cần mang bao tay và tránh hít hơi bay ra. Phenol dễ cháy và làm phỏng da tay. Cần giữ lại tất cả những dụng cụ có dính phenol và vứt bỏ an toàn. - Ethidium bromide 1000X (5mg/ml): 0.1 g Ethidium bromide trong 20 ml nước cất. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ bọc giấy nhôm để tránh ánh sáng. Chú ý: hoá chất này rất độc có thể gây ung thư. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế trong tủ hút khí độc. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Lysozyme: 20mg/ml trong nước cất. Lọc tiệt trùng và chia thành các phần nhỏ (250ul), bảo quản ở -20oC. - Protein K 20mg/ml. Pha dung dịch mẹ 20mg/ml trong dung dịch gồm Tris-HCl pH7.5 10mM và NaCl 10mM. B Nguyên tắc chung: Quá trình tách chiết DNA trải qua 3 giai đoạn: ¯Giai đoạn 1: phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học. Tuỳ từng loại tế bào, có cấu tạo thành và và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hay phối hợp. Ví dụ: đối với tế bào thực vật thường ta nghiền tế bào trong nitơ lỏng để phá vỡ vách tế bào hoặc dùng các chất tẩy để phá màng tế bào. Còn đối với tế bào vi khuẩn người ta thường dùng lyzozyme và EDTA để phân giải màng. ¯Giai đoạn 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipit, polysaccharide…) chủ yếu là protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol hoặc phenol/chloroform (1:1) sau đó bằng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcolhol (24:1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hoà tan NA vì thế sau khi ly tâm protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước có chứa NA và pha phenol/chloroform. Pha nước có chứa NA sẽ được thu nhận lại. Chiết xuất bằng phenol: Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết suất DNA như sau: - Tuy ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80oC) nhưng khi lẫn với 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa và các phân tử nước vây quanh. - Khi pha hỗn hợp này với dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị thuỷ nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị thuỷ của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị thuỷ (của gốc amino acid) ra ngoài. Các nhóm kị thuỷ này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau. Trong khi đó DNA vẫn là chất tan trong nước và có thể hút sang ống chứa khác. Phenol có ưu điểm có thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên không cần khuấy trộn nhiều cũng có thể làm biến tính protein (vì khuấy trộn nhiều có thể làm đứt gẫy DNA). Trong khi đó sử dụng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcolhol thì phải trộn đảo kĩ vì các chất này không tan trong nước. Tuy nhiên nhiều lúc cần phải loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi dung dịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng chloroform hoặc ether. Sử dụng cả hai loại dung môi hữu cơ thường cho hiệu quả cao hơn. Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kị thuỷ của phenol tăng lên và làm tăng hiệu quả biến tính protein. ¯Giai đoạn 3: tủa NA. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận NA dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của các enzyme, mặt khác để có thể hoà tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông dụng là: ]Tủa trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2.5:1), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu như toàn bộ NA đều tủa trong các điều kiện nêu trên. ]Tủa trong isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp tủa trong ethanol là không cần sự hiện diện của muối (1:1). Các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đó chúng bị loại ra. Trong cả hai phương pháp, NA sẽ được thu nhận lại bằng li tâm. Sau đó cặn tủa phải được rứa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Tiếp theo nó sẽ được hoà tan trong nước khử ion hoặc dung dịch đệm để bảo quản. Kết tủa bằng ethanol: - Cho 2.5 lần ethanol vào dung dịch DNA có chứa sodium acetate và NaCl nồng độ 0.2M trở lên, trộn đều rồi cho vào buồng lạnh -20 hoặc -70oC để kết tủa. Có thể thay NaCl bằng sodium phosphate với lượng rất nhỏ cũng có thể kết tủa DNA.Tuy nhiên nếu dùng muối này thì cần phải thẩm tích để loại bỏ muối này. - Duy trì nhiệt độ thấp (khoảng 10-15 phút ở -70oC, hoặc khoảng 1-12giờ ở -20oC. - Quay ly tâm ở 15 phút ở 4oC với tốc độ 15000 v/ph để tâp trung kết tủa. Trước khi ly tâm có thể thấy kết tủa trắng trong ống nghiệm, khi đó chỉ cần ly tâm nhẹ 3000 v/ph ở 4oC trong vòng 10phút cũng đủ tập trung kết tủa. Thậm chí có thể dùng móc thuỷ tinh móc riêng phần tủa DNA dưới dạng sợi trắng khỏi dịch ethanol nếu hàm lượng DNA đủ lớn. - Bỏ nước mặt, để loại bỏ muối, cần thêm (khoảng hai lần thể tích mẫu) ethanol 70% vào ống, lại ly tâm rót bỏ ethanol. Nếu nhiều DNA thì có thể nhúng móc mang DNA vào lọ chứa ethanol 70% một ít phút, lượng muối trong DNA sẽ giảm. - Sấy khô hoặc hong khô ống chứa DNA rồi thêm dung dịch đệm TE hoặc nước cất để có dung dịch DNA với nồng độ thích hợp. Chú ý: có thể thay ethanol bằng isopropanol với lượng nhỏ hơn (lượng tương đương với dịch DNA) khi cần kết tủa DNA trong dịch khá lớn với ống không thể thêm 2.5 lần thể tích ethanol. Tuy nhiên sau đó nên kết tủa lại với ethanol vì khó làm khô isopropanol, ít hoà tan muối và chỉ dùng isopropanol khi thật cần thiết vì có mùi khó chịu. Kết tủa bằng butanol: Thêm vào dịch DNA một lượng tương đương n-butanol, trộn đều rồi ly tâm nhẹ. Hút bỏ butanol rồ thêm vào lượng butanol khác và lặp lại thao tác trên. Hút bỏ butanol rồi thêm vào một lượng tương đương ethyl ether so với lượng dịch còn lại. Quay ly tâm rồi hút bỏ ether (ether sẽ chiết xuất butanol khỏi dịch). Loại bỏ vết ether còn lại bằng cách bơm không khí (tốt hơn là nitơ) qua ống hút Pasteur vào trong ống nghiệm để làm khô mẫu. Cũng có thể dùng buồng áp suất thấp (buồng chân không) để làm bay hơi ether. Hoà tan DNA vào TE hoặc nước cất. Phương pháp sử dụng cột (DEAE-cellulose column) Cột DEAE- cellulose có thể được chế từ pipet loại 1 ml hoặc ống hút Pasteur. Trước tiên lấy một ống sạch, nhét vào chỗ thắt của ống một lượng nhỏ bông đã loại dầu mỡ, hấp cao áp tiệt trùng. Cho lên lớp bông khoảng 0.2 ml Sephadex50 đã tiệt trùng, rồi cho lên đó khoảng 0.1 ml DE 52 cũng đã tiệt trùng (hai chất liệu được hoà riêng trong nước rồi hấp cao áp). Cho dịch DNA chảy qua ống để hấp phụ DNA , dịch qua lần đầu được rót cho đi qua cột lần nữa. Rửa cột bằng dung dịch đệm với một lượng gấp mấy lần thể tích cột, chứa Tris-HCl (pH 7.5) 10mM, NaCl 50mM và EDTA 1mM. Dung xuất bằng dung dịch đệm nêu trên nhưng với nồng độ NaCl cao hơn, chứa Tris-HCl (pH 7.5) 10mM, NaCl 1.0M và EDTA 1mM. Kết tủa bằng ethanol. Thẩm tích Ngâm ống thẩm tích (túi thẩm tích, có thể mua được từ một số hãng) trong nước chứa EDTA khoảng 50mM rồi đun sôi trong 10 phút. Thay nước cất mấy lần, quấy để rửa sạch. Để nước cất vậy mà hấp khử trùng 10 phút, rồi bảo quản ở 4oC. Tuyệt đối không để màng (ống) thẩm tích bị khô nước. Thực hiện thẩm tích. Cho mẫu dịch nguyên liệu vào ống thẩm tích, kẹp chặt hoặc buộc chặt hai đầu, cho vào bình (chậu) chứa khoảng 500-1000 lần thể tích dung dịch đệm. Ngoại dịch này có thể cần phải thay trong trường hợp thẩm tích phenol trong DNA trong khi cần kéo dài thời gian thẩm tích đến 48 giờ. Nếu thẩm tích CsCl khỏi DNA plasmid thì cần khoảng 4 giờ. C. Phương pháp ly trích DNA ở thực vật: Nguyên tắc: Chiết tách DNA bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó khăn là phải phá vách tế bào rất cứng và phải loại các polisaccharide. Việc tách chiết DNA thực vật có nguyên tắc chung đó là: - Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối, chày, sứ) để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần bên trong tế bào. - Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng nhân, giải phóng DNA. - Sử dụng các hoá chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ DNA khỏi sự phân huỷ bởi các enzyme nuclease nội bào. - Sử dụng các hoá chất như chloroform, isoamyl alcohol, phenol…để loại protein và các tạp chất ra khỏi DNA. - Thu hồi DNA bằng cách kết tủa DNA trong cồn, hoặc isopropanol, sau đó li tâm thu lấy kết tủa DNA. - Hoà tan DNA bằng nước cất hoặc dung dịch đệm. - Loại bỏ RNA bàng cách sử dụng men RNase Thực tế, những phức hợp polysaccharides và phenol khác nhau ở nhiều dạng thực vật, vì thế sẽ có những phương pháp ly trích khác nhau phù hợp cho từng dạng đó. Ví dụ, mô thực vật có một lượng lớn phức hợp của phenol thì ta sẽ thêm vào dung dịch ly trích những tác nhân làm giảm hoặc hoà tan phức hợp đó. Phương pháp dùng CATB: Là phương pháp ly trích sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB. Đây là phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng nhất khi ly trích DNA từ thực vật cho phép thu được một lượng DNA tinh sạch lớn, DNA có thể được tách ra từ trong những thành phần có nhiều phức hợp polysaccharide và protein bằng sự thay đổi nồng độ muối trong dung dịch. Nguyên tắc Ly trích DNA sử dụng CTAB (cyltrimethylammornium bromide), dung dịch đệm có thành phần chính là Tris – HCL, EDTA, CTAB và NaCl. Vai trò của các chất sử dụng: - DNA ổn định khi tính acid của dung dịch ở pH 8.0. Do trong mẫu có nhiều acid hữu cơ trong không bào và giữa các khe hở tế bào, vì thế các acid đó làm thay đổi pH dung dịch gây tổn hại đến phân tử DNA. Dung dịch Tris-HCl sẽ đáp ứng để ngăn chặn sự giảm nhanh pH. - Ngoài ra, Mg2+ sẽ kích hoạt men DNase làm phân huỷ DNA, vì thế sẽ làm giảm lượng DNA trong mẫu. EDTA là một chelate và hấp thụ những ion dương đó bằng cách tạo phức. - CTAB là một ion dương có hoạt tính bề mặt, nó sẽ tạo phức với DNA là ion âm trong dung dịch. Khi nồng độ muối trong dung dịch lớn hơn 0.7M, phức hợp DNA-CTAB được hoà tan trong dung dịch. Và khi nồng độ muối trong dung dịch nhỏ hơn 0.7M thì phức hợp DNA-CTAB sẽ được tủa. NaCl thêm vào để điều khiển nồng độ muối trong dung dịch. Và như thế, mercaptoethanol và PVP thường thêm vào dung dịch ly trích để bảo vệ DNA. - Hơn thế nữa, phenol và chloroform được thêm vào để biến tính các phần tử tạp như protein và sắc tố. Isoamylalcohol loại bỏ bọt và ngăn cản sự tạo bọt trong dung dịch khi trộn và ổn định 2 pha nước và phenol hoặc chloroform sau ly tâm. Khi mẫu được ly tâm, trong eppendorf sẽ phân tách thành ba lớp. Lớp thứ nhất là dung dịch DNA, lớp giữa là những cặn bã và protein, lớp cuối cùng là phenol hoặc chloroform. - Isopropanol thêm vào để phân tách thu nhận DNA. Vì đặc tính của DNA thường tủa trong dung dịch isopropanol hoặc ethanol khi có sự tồn tại của những ion dương Na+, K+. Trong trường hợp này, RNA không được tủa do nó bị thoái hoá thành nucleoside triphosphate. DNA tủa được rửa bằng dung dịch ethanol 70% để loại bỏ CTAB và NaCl. Bởi vì, DNA không hoà tan được trong ethanol nên nó được giữ ở trạng thái kết tủa. Sodium acetate, potassium acetate hoặc ammonium acetate được thêm vào để tủa và hồi tính lại DNA. - Sơ đồ: D.Phương pháp ly trích DNA từ nấm: Mục đích - Ý nghĩa Đa số các loài nấm thường được phân biệt dựa vào hình thái phát triển, hình dạng đặc trưng, kích thước bào tử, môi trường chọn lọc hay tính chất sinh hoá. Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác định chính xác tên loài, những đặc điểm di truyền của cá thể và quần thể. Trên cơ sở đó tạo nên tiền đề cho phương pháp định danh bằng phân tử, các nghiên cứu sâu hơn về gen, hệ enzyme hay protein. Từ những mục đích đó, vật liệu ban đầu không thể thiếu được đó là ly trích được DNA tổng số của nấm. Sau đây là phương pháp ly trích DNA từ nấm đơn giản và thường sử dụng trong phòng thí nghiệm. Phương pháp Nghiền mẫu Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng thật mịn, và trong quá trình nghiền nitơ được bổ sung liên tục. Mẫu nghiền tránh tạp nhiễm và phải đồng nhất nhau về lượng để thuận tiện trong quá trình ly trích. Mẫu nghiền xong cho vào eppendorf 1.5 ml (1/2 thể tích), eppendorf đựng mẫu phải giữ trong nitơ lỏng hay trong tủ -80oC. Qui trình ly trích Phần bột nấm được cho vào eppendorf 1.5 ml (1/2 thể tích) và thêm vào đó 500 ul lysis buffer. Trộn đều bằng máy vortex, đem mẫu ủ trong bồn warter bath ở 65oC khoảng 1 – 2 giờ. Lấy mẫu ra và thêm 300 ul dung dịch phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), trộn đều nhẹ bằng máy vortex khoảng 30 giây. Ly tâm mẫu 13500 vòng/10 phút/4oC. Hút khoảng 450 ul phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorf 1.5 ml mới. Lặp lại bước 2, nhưng thay bằng dung dịch chloroform / isoamyl alcohol(24:1). Thêm 0.6 thể tích isopropanol và 0.03 thể tích sodium acetate vào eppendorf 1.5 ml trên, đảo eppendorf thật nhẹ nhàng khoảng 8 – 10 lần. Đem mẫu ủ ở -20oC trong 30 phút. Ly tâm mẫu 13500 vòng/5 phút/ 4oC. Loại bỏ phần dung dịch bên trên, thu lấy phần kết tủa bên dưới và rửa lại kết tủa bằng ethanol 70%, ly tâm 13500 vòng/5 phút/4oC. Làm khô mẫu tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng. Hoà tan phần tủa trong 100 ul dung dịch TE 1X. Trữ mẫu ở 4oC. Một số điều cần lưu ý Chú ý trong thao tác Các chất sử dụng phải được vô trùng , bàn thí nghiệm và tay luôn được giữ sạch. Tránh thao tác mạnh có thể làm tổn hại đến DNA. Chú ý: SDS và ammonium acetate không được khử trùng trong nồi hấp. Lượng mẫu ly trích So sánh lượng mẫu trong Protocol với lượng mẫu thực tế, nếu lượng mẫu thực tế lớn gấp đôi thì phải tăng thể tích các chất lên gấp đôi, thời gian ly tâm và thời gian ủ không thay đổi. Tuy nhiên, khi làm với lượng mẫu nhiều thì ảnh hưởng đến quá trình ly tâm, thao tác cẩn thận và mức độ trộn của dung dịch kém. Tuổi mẫu Mẫu sử dụng cho ly trích tốt nhất ở giai đoạn còn trẻ, có nghĩa là tế bào đang ở giai đoạn trưởng thành, các quá trình sinh lý, sinh hóa hoàn chỉnh. Nghiền mẫu - Cẩn thận khi thao tác với nitơ lỏng - Mẫu phải được nghiền thật mịn - Tránh tạp giữa các mẫu trong quá trình nghiền - Mẫu nghiền được lấy và trữ trong tủ âm sâu không quá 2 tuần Tốc độ và thời gian ly tâm Không cần điều chỉnh tốc độ và thời gian ly tâm chính xác sau khi trộn mẫu với chloroform và isoamylalchohol hoặc hồi tính lại DNA tủa. Ngoài ra, không cần thiết ly tâm ở tốc độ cao khi ở tốc độ ấy không có sự phân tách. Sản lượng DNA thu được Phụ thuộc vào đối tượng ly trích Phụ thuộc vào thao tác thí nghiệm Phụ thuộc vào phương pháp ly trích E.Phương pháp ly trích DNA ở động vật: Nguyên tắc: Có thể tách chiết DNA từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước bọt, mô cơ, lông, tóc (còn nguyên chân tóc, chân lông) và các loại mô khác. Có nhiều phưong pháp tách chiết khác nhau. Tuy vậy tách chiết DNA có một nguyên tắc chung là: Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang. Phá vỡ tế bào, màng và phân huỷ protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân. Tách DNA ra khỏi đệm và bảo quản DNA ở 4oC. Các bước tiến hành: Tuỳ theo các nguyên liệu khác nhau mà ta có thể áp dụng một số bước tiến hành khác nhau: a)Tách chiết DNA từ mô động vật: Bước 1: Cắt mô thành từng miếng nhỏ. Nghiền mô trong nitơ lỏng để thành bột mịn. Cho mẫu vào ống nghiệm chờ nitơ bay hết. Cho khoảng 100mg mẫu vào ống eppendorf loại 1.5ml. Bước 2: thêm 500ul đệm STE (0.1M NaCl, 0.05M Tris-HCl (pH 7.5), 0.001M EDTA). Hoà trộn nhẹ nhàng. Bổ sung 12ul protease K (nồng độ 10mg/ml) và 37ul SDS 10%. Trộn đều hỗn hợp, ủ ở 55oC trong 2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Bước 3: thêm 1 lượng dung dịch PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol với tỷ lệ 25:24:1) bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút. Bước 4: chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch. Lặp lại bước 3 và 4 một lần nữa. Bước 5: thêm một lượng dung dịch CI (chloroform: isoamyl alcohol với tỷ lệ 24:1)bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút. Chuyển phần dịch nổi sang ống eppendorf sạch. Bước 6: thêm một lượng Sodium acetate 3M (NaOAc) bằng 1/10 lượng mẫu và một lượng cồn ethylic 95% bằng 2.5 lần lượng mẫu ở -20oC ít nhất trong 2 giờ, hoặc qua đêm. Ly tâm 9000 vòng/10 phút. Bước 7: rửa sạch bằng cồn ethylic 70%. Hút sạch ethylic. Bước 8: hoà tan kết tủa bằng 500ul dung dịch TE 1X, bảo quản ở 4oC. b) Tách chiết DNA từ máu bằng chelex: Bước 1: lấy 100ul máu tươi, hoặc 1 miếng giáy thấm, hoặc vải đã thấm máu, kích thước 0.5 x 0.5cm cho vào ống eppendorf. Bước 2: thêm 1ml đệm chiết PBS (137mM NaCl; 2.7mM KCl; 10mM Na2HPO4; 2mM KH2PO4) lắc đều, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Ly tâm 14000 vòng/5 phút. Thu kết tủa. Lặp lại bước 2 khoảng 2-3 lần. Bước 3: Thêm 150ul Chelex, bảo quản ở nhiệt độ 4oC đến -20oC. c) Tách chiết DNA từ máu nhờ muối: Bước 1: lấy khoảng 0.1ml máu tĩnh mạch cho vào eppendorf có chứa 25 ul EDTA 0.4M, lắc đều. Bước 2: thêm vào eppendorf đệm phá hồng cầu (1mM NH4HCO3, 115mM NH4Cl). Ly tâm 500 vòng/ phút. Thu kết tủa, loại bỏ phần dịch nổi phía trên. Bước 3: thêm vào ống 200ul đệm phá bạch cầu (100mM Tris-HCl pH 7.6; 40mM EDTA; 50mM NaCl; 0.2% SDS; 0.05% Sodium azide). Lắc đều. Bước 4: thêm 20ul protein K (10mg/ml). Ủ ở 50oC trong 2 giờ. Bước 5: thêm 80ul NaCl bão hoà 6M. Lắc mạnh bằng vortex. Ly tâm 5000 vòng/10 phút, thu dịch nổi phía trên cho vào eppendorf sạch. Bước 6: kết tủa DNA bằng cồn Ethanol tuyệt đối. Bước 7: hoà tan kết tủa bằng dung dịch TE 1X. Bảo quản ở 4oC đến -20oC. F. Phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn: DNA vi khuẩn gồm 3 loại: Total cell DNA: là DNA tổng thể từ việc nuôi cấy vi khuẩn. DNA plasmid: việc chuẩn bị DNA plasmid từ nuôi cấy vi khuẩn theo những bước tương tự cơ bản như việc tinh khiết total cell DNA, nhưng điểm quan trọng là tại vài giai đoạn, DNA plasmid phải được phân chia từ một số lượng lớn DNA tế bào cùng tồn tại trong tế bào. DNA phage: được sử dụng trong kỹ thuật cloning phage. DNA phage nhìn chung được chuẩn bị từ các hạt bacterriophage hơn từ việc ly trích từ tế bào nhiễm. Tuy nhiên, cần có những kỹ thuật đặc biệt để phá vỡ lớp vỏ phage. Một ngoại lệ là dạng sao mã mạch đôi của M13 được chuẩn bị từ các tế bào E.coli dường như giống với plasmid vi khuẩn. ¯Việc chuẩn bị total cell DNA. Quy trình của sự chuẩn bị DNA total từ việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn có thể được phân chia thành 4 giai đoạn Nuôi cấy tế bào vi khuẩn tăng sinh khối và thu hoạch Phá vỡ tế bào để giải phóng các thành phần bên trong. Phần trích của tế bào được xử lý để rút các thành phần, thu nhận DNA Cô đặc dung dịch DNA thu được 1. Tăng sinh khối và thu hoạch vi khuẩn: Hầu hết các vi sinh vật có thể tăng trưởng trong môi trường lỏng (môi trường canh) không quá khó khăn. Môi trường nuôi cấy phải cung cấp một hỗn hợp cân bằng chất dinh dưỡng thiết yếu trong dung dịch quy định cho phép vi khuẩn sinh trưởng và phân chia hiệu quả. 2.Chuẩn bị dịch trích tế bào: Tế bào vi khuẩn được bọc bên trong lớp màng cytoplasmic và bao xung quanh bởi thành tế bào cứng. Ở nhiều loài, như E.coli, thành tế bào là lớp màng bên ngoài thứ hai. Để giải phóng các thành phần tế bào phải phá hủy tất cả các lớp chắn bên ngoài. Kỹ thuật phá vỡ tế bào vi khuẩn có thể chia thành 2 phương pháp cơ bản, cơ học và hóa học. Phá vỡ tế bào được tiến hành bằng việc phơi sáng cho các tác nhân hóa học tác động lên toàn bộ các lớp bảo vệ. Phương pháp hóa học cũng thường xuyên được sử dụng với các tế bào vi khuẩn. Việc sử dụng các hóa chất phụ thuộc vào loại vi khuẩn, nhưng với E.coli và các vi khuẩn có quan hệ gần, việc làm suy yếu thành tế bào được tiến hành bằng lysozyme hay EDTA hoặc là phức hợp của cả hai. Lysozyme là enzyme có trong lòng trắng trứng và trong chất tiết như nước mắt, nước bọt, nó thuỷ phân các thành phần trùng hợp của màng tế bào. Mặt khác, EDTA, tạo phức với ion Mg là yếu tố cần thiết bảo quản cấu trúc bên ngoài của màng tế bào, cũng như ngăn chặn enzyme nuclease có thể phân hủy DNA. Trong nhiều trường hợp, chỉ với EDTA hay lysozyme là đủ để phân giải tế bào vi khuẩn, nhưng thông thường người ta còn thêm vào đó chất tẩy như sodium dodecyl sulphate (SDS). Chất tẩy tham gia vào quá trình thông qua việc rút các phân tử lipid và vì vậy gây ra sự phá hủy màng tế bào. Thu hoạch tế bào vi khuẩn bằng máy ly tâm. Máy ly tâm (Quay ở 8000 r.p.m trong 10 phút) Dịch vi khuẩn Lớp lắng tế bào vi khuẩn Chuẩn bị dịch trích tế bào. Phá hủy tế bào. Dịch trích tế bào Màng tế bào Phân hủy màng tế bào Ly tâm dịch trích tế bòa để tách các cặn không hòa tan được.Mảnh vỡ tế bào DNA, RNA, protein Dịch trích tế bào Ly tâm Khi đã có những tế bào bị phá hủy, bước cuối cùng của việc chuẩn bị dịch chiết tế bào là loại bỏ các mảnh không hòa tan. Các thành phần như các mảnh vỡ của thành tế bào được chiết lắng qua ly tâm, còn lại dịch chiết tế bào sạch. 3.Tinh khiết DNA từ dịch chiết tế bào: Ngoài DNA, dịch chiết tế bào vi khuẩn còn chứa protein và RNA. Để loại protein từ dịch chiết tế bào ta cho phenol hoặc hỗn hợp tỉ lệ 1:1 phenol và cloroform. Với nhiều dịch chiết tế bào, thành phần protein quá nhiều đến nỗi việc trích chiết bằng phenol không đủ để tinh sạch hoàn toàn NA. Vấn đề này được giải quyết bằng việc xử lý phenol nhiều lần nhưng có điều không mong muốn là sau mỗi lần trộn và các bước ly tâm sẽ gây đứt gãy các phân tử DNA. Phương pháp xử lý dịch chiết tế bào là dùng protease như Pronase hay Proteinase K trước khi xử lý phenol. Các enzyme này phá gãy các polypeptide thành những đơn vị nhỏ hơn, để dễ dàng hơn trong phân tách phenol. Sau đó ta dùng enzyme ribonuclease phân hủy nhanh chóng các phân tử RNA thành các đơn vị nhỏ ribonucleotide. 4.Cô đặc mẫu DNA: Thông thường sự chuẩn bị thành công thường tạo ra được dung dịch đặc DNA mà không cần phải tiến hành cô đặc thêm. Tuy nhiên, khi thu được dịch loãng, điều quan trọng là tìm phương pháp để cô đặc DNA. Phương pháp cô đặc DNA được sử dụng phổ biến là sự kết tủa bằng ethanol. Trong môi trường muối (chính xác là các cation hóa trị I như Na+), tại nhiệt độ -20oC hoặc thấp hơn. Ethanol nguyên chất kết tủa một cách hiệu quả các NA khi ly tâm ở tốc độ cao. Với dịch đặc DNA, ethanol được tách lớp ở phần trên của mẫu, các phân tử DNA tủa ở mặt tiếp xúc. Người ta thường sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch ethanol và dung dịch DNA, khuấy đũa trong dung dịch, các phân tử DNA sẽ bám chặt vào đũa và được kéo ra khỏi dung dịch ở dạng sợi dài. Sau đó hòa tan lại vào trong một dung tích nước hoặc dung dịch đệm thích hợp. Tủa ethanol có một tiến bộ là tách rời dung dịch và các thành phần NA. Thu hồi DNA nhờ tủa Ethanol. Ethanol nguyên chất được tách lớp lên phần trên của dịch cô đặc DNA. Các sợi DNA được tách ra từ đũa thủy tinh. Để dịch cô đặc ít nhất, ethanol được thêm vào (với tỉ lệ 2,5 thể tích ethanol nguyên chất trong một thể tích dung dịch DNA) và thu DNA tủa bằng phương pháp ly tâm. ¯Chuẩn bị DNA plasmid: Việc tinh sạch các plasmid từ dịch vi khuẩn gồm các bước tương tự như việc chuẩn bị total cell DNA. Dịch tế bào có chứa plasmid tăng trưởng trong môi trường lỏng, thu hoạch và chuẩn bị dịch trích tế bào. Dịch trích được xử lý để loại protein, RNA và tủa DNA bằng phương pháp tủa Ethanol. Tuy nhiên, có một điểm khác nhau cơ bản giữa tinh sạch plasmid và chuẩn bị total cell DNA là: trong chuẩn bị plasmid, phải tách DNA plasmid từ một lượng lớn DNA NST vi khuẩn cùng tồn tại trong tế bào. Việc phân tách hai loại DNA rất khó khăn nhưng rất cần thiết đối với các plasmid được sử dụng trong kỹ thuật cloning. Sự hiện diện một lượng ít nhất DNA NST tạp nhiễm trong kỹ thuật cloning cũng dễ dàng dẫn đến một kết quả không mong muốn. Có nhiều phương pháp để loại bỏ DNA NST trong quá trình tinh sạch plasmid, và việc sử dụng từng phương pháp riêng lẽ hay kết hợp các phương pháp với nhau đều có thể phân lập được DNA plasmid rất tinh sạch. Các phương pháp đó dựa trên những đặc điểm khác nhau cơ bản giữa DNA plasmid và DNA vi khuẩn,chủ yếu là dựa vào kích cỡ. Plasmid lớn nhất chỉ bằng 8% kích cỡ của DNA NST E.coli. Do đó, các kỹ thuật phân tách các phân tử DNA nhỏ từ các phân tử lớn vì vậy mà tinh sạch các DNA plasmid một cách hiệu quả. Ngoài kích cỡ, DNA NST và plasmid còn khác nhau về hình thể. Các plasmid của tế bào vi khuẩn có dạng vòng, nhưng trong quá trình chuẩn bị dịch trích tế bào, DNA plasmid bị bẻ gãy thành các mảnh dạng sợi. Ứng dụng phương pháp phân tách các plasmid dạng vòng từ các phân tử dạng sợi sẽ thu được các phân tử plasmid tinh sạch. a) Sự phân chia dựa vào kích thước: Xử lý bằng EDTA và lysozyme với sự có mặt của đường sucrose. Tế bào bị mất vách nhưng vẫn còn màng tế bào. Sự phân giải màng tế bào được kích ứng bằng cách thêm vào những chất tẩy không mang ion như Triton X-100 (những chất tẩy ion như SDS sẽ làm DNA NST bị gãy). Với phương pháp này số lượng DNA bị gãy sẽ ít vì thế sự ly tâm sẽ tạo dịch tan trong suốt bao gồm toàn bộ plasmid. Vì những đoạn DNA NST này rất lớn, lớn hơn nhiều so với plasmid, và dính vào màng tế bào vi khuẩn sau đó có thể loại bỏ cùng với những mảnh vỡ tế bào bằng ly tâm.Tiến trình này được thực hiện đối với E.coli và những loài thân thuộc với nó. Dịch tan này vẫn còn 1 ít DNA tế bào. Hơn nữa nếu plasmid là phân tử lớn, nó có thể hòa tan với mảnh vỡ tế bào. Sự phân chia theo kích thước sẽ bị thiếu DNA plasmid. Vì thế ta cần quan tâm đến những phương pháp khác nhau để loại bỏ sự nhiễm DNA vi khuẩn. b)Sự phân tách dựa trên cấu hình: Phương pháp này quan tâm tới sự khác nhau giữa cấu hình của plasmid và DNA NST. Sự khác nhau này được dùng để phân tách 2 loại DNA này. Ta cần nhìn nhận chặt chẽ hơn về toàn bộ cấu hình plasmid. Sẽ không chính xác khi nói plasmid có cấu hình dạng vòng, bởi vì vòng DNA này có thể bị biến đổi bởi nhân tố nào đó tạo thành một dạng hoàn toàn khác. Hầu hết plasmid tồn tại trong tế bào dưới dạng siêu xoắn. Dạng siêu xoắn này được biến đổi từ DNA sợi đôi, bền vững trong suốt quá trình sao chép của plasmid nhờ enzyme topoisomerase. Cấu hình xoắn này chỉ được duy trì nếu cả hai sợi polynucleotide vẫn còn nguyên vẹn, dạng này được gọi là covalently-closed-circular (ccc) DNA. Nếu 1 trong 2 sợi bị gãy, dạng siêu xoắn sẽ trở lại dạng bình thường, dạng linh hoạt, gọi là open-circular. Như vậy plasmid có cấu hình thay đổi. Dạng siêu xoắn quan trọng trong việc chuẩn bị plasmid bởi vì phân tử siêu xoắn có thể được phân tách dễ dàng từ DNA sợi đôi bình thường. Để làm điều này hai phương pháp được dùng phổ biến . Cả hai phương pháp có thể tinh sạch DNA plasmid từ chất chiết tế bào thô sơ. ²Sự biến tính bằng kiềm: Vấn đề cơ bản của kỹ thuật này là có một khoảng pH nhỏ mà ở đó DNA sợi đôi bình thường bị biến tính, trong khi plasmid siêu xoắn thì không. Nếu bổ sung dung dịch hydroxide vào chất chiết tế bào hay dịch tan sạch thì pH tăng đến 12-12.5, pH cao này làm đứt nối hydrogen trong phân tử DNA bình thường, sau đó 2 sợi polynucleotide tách ra, nếu thêm acid vào pH giảm còn 7. Những sợi DNA của vi khuẩn đã biến tính quấn lại với nhau thành một đám rối. Hỗn hợp này đem ly tâm để tách DNA plasmid, DNA plasmid nổi lên trên, phân tử DNA thẳng lắng dứơi đáy ống nghiệm. Một thuận lợi của phương pháp này là (đặc biệt là làm tan tế bào bằng SDS và trung hòa bằng dd acetate Natri) thì hầu hết protein hay RNA cũng không hòa tan và có thể loại bỏ bằng ly tâm. Sự xử lý với chất chiết phenol và ribonuclease có thể không cần đến nếu phương pháp biến tính bằng dung dịch kiềm được sử dụng. ²Phương pháp ly tâm trong gradient nồng độ nhờ Ethidiumbromide-Cesium Chloride: Gradient nồng độ được tạo ra bằng cách ly tâm dd CsCl với tốc độ cao. Gradient được tạo ra bởi vì với lực ly tâm lớn kéo các ion Cs+ và Cl- về phía đáy ống nghiệm. Sự di chuyển xuống này được cân bằng bằng khuyếch tán. Vì thế mật độ gradient được thiết lập với mật độ CsCl cao ở phía đáy ống nghiệm. Những đại phân tử hiện diện trong dd CsCl khi ly tâm sẽ tạo một dãy tách biệt theo gradient, các dãy phân tử riêng biệt này hiện diện ở đâu tùy thuộc vào mật độ nổi của nó. DNA có mật độ nổi khoảng 1.7g/cm3 và vì thế sẽ di chuyển đến điểm nổi có mật độ CsCl là 1.7g/cm3. Trái lại protein có độ nổi thấp hơn và vì thế nổi lên trên đỉnh ống nghiệm, RNA thì lắng dưới đáy. Ly tâm đẳng tỷ trọng có thể phân tách DNA, RNA, protein thay thế việc xử lý với phenol và ribonuclease để tinh sạch DNA. Quan trọng hơn là phương pháp này với sự hiện diện của EtBr có thể được dùng để tách DNA siêu xoắn khỏi DNA bình thường. EtBr kết hợp với DNA bằng cách xen vào giữa các cặp base làm cho một phần sợi DNA tháo xoắn và dài ra (mỗi cặp > 3.4Ao). Sự tháo xoắn này làm giảm mật độ nổi 0.125g/cm3 đối với DNA thẳng. Tuy nhiên DNA siêu xoắn không có đầu tận cùng tự do, có rất ít đoạn duỗi ra và chỉ kết hợp với một lượng giới hạn ETBr. Mật độ nổi của phân tử siêu xoắn chỉ giảm 0.085g/cm3. Kết quả là phân tử siêu xoắn tạo thành dãy trong gradient ETBr-CsCl ở vị trí khác với DNA vòng và thẳng. Ly tâm đẳng tỷ trọng với EtBr-CsCl là phương pháp hiệu quả cho việc thu DNA plasmid sạch. Khi một dịch tan sạch được tạo ra từ phương pháp này, dãy plasmid ở vị trí phân biệt với DNA thẳng của vi khuẩn, phần protein thì nổi lên trên đỉnh, RNA lắng dưới đáy. Vị trí của DNA plasmid có thể được nhìn thấy bằng chiếu bức xạ tia cực tím lên thành ống nghiệm. Tia này làm cho EtBr đã kết dính phát huỳnh quang. DNA plasmid đựơc lấy ra bằng cách dùng ống tiêm đâm vào vị trí mẫu trên ống nghiệm. EtBr đã kết hợp với DNA plasmid được lấy ra bằng n-butanol. Lắc hỗn hợp DNA plasmid với n-butanol sẽ phân hai lớp EtBr và DNA. Sau đó tách CsCl bằng sự thẩm tích. DNA plasmid đựợc đựng trong ống thẩm tích và đặt ống này trong dd buffer. CsCl sẽ thẩm tích vào buffer. Sự khuyếch đại plasmid: Sự chuẩn bị DNA plasmid có trở ngại là tỷ lệ DNA plasmid thì ít hơn so với tổng DNA trong tế bào vi khuẩn. Năng suất DNA từ việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn cũng không cao. Vì thế cần phải khuyếch đại DNA plasmid. Sự khuyếch đại này nhằm vào việc tăng số lượng bản sao DNA plasmid. Một vài DNA plasmid có số lượng bản sao lớn (20 hoặc hơn), đây là đặc tính có lợi cho sự khuếch đại. Trong điều kiện để khuếch đại DNA plasmid DNA thẳng của vi khuẩn không thể sao chép và sự tổng hợp protein bị ức chế. Nuôi cấy tế bào chuẩn bị cho sự tinh sạch DNA plasmid. Sau khi thỏa mãn mật độ tế bào đạt được, chất ức chế tổng hợp protein được thêm vào (chloramphenicol) và ủ trong 12 giờ. Trong suốt thời gian này plasmid tiếp tục được sao chép trong khi sự sao chép của DNA thẳng và tổng hợp protein bị ức chế. Kết quả là khoảng vài ngàn bản sao plasmid được tạo thành . Sự khuếch đại này là phương pháp có hiệu quả để nâng cao số lượng bản sao DNA plasmid. ¯Sự chuẩn bị DNA phage: Sự khác nhau cơ bản giữa sự chuẩn bị DNA phage và sự chuẩn bị tổng DNA tế bào và DNA plasmid là nguyên liệu ban đầu để tinh sạch phage không phải là chất chiết tế bào. Ta có thể thu được một lượng lớn hạt thực khuẩn thể trong dịch ngoại bào từ việc nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp nhiễm. Khi ly tâm môi trường nuôi cấy này, vi khuẩn lắng xuống đáy ta thu được hạt phage trong dịch huyền phù. Tách các hạt phage khỏi dịch huyền phù, DNA của chúng được tách bằng cách khử protein để loại bỏ vỏ capsid. Phương pháp này thì nhanh hơn phương pháp chuẩn bị tổng DNA tế bào và DNA plasmid. Khó khăn chính, đặc biệt đối với phage lamda là trong nuôi cấy phải đạt mật độ phage lamda đủ cao (số hạt phage /1 ml môi trường nuôi cấy). Thực tế mật độ phage lamda hợp lý tối đa là 10 10/ml. Tuy nhiên với mật độ này lượng DNA phage thu được cũng rất thấp chỉ 500ng DNA. Vì vậy thể tích nuôi cấy phải đạt 500 -1000ml để thu được luợng DNA phage mong muốn. Phát triển việc nuôi cấy để đạt mật độ lamda cao: Phát triển việc nuôi cấy với dung tích lớn không là vấn đề (có thể nuôi cấy 50 lit hay lớn hơn trong công nghệ sinh học). Nhưng để đạt mật độ phage tối đa thì cần vài kỹ năng. Đối với phương pháp này, tế bào vi khuẩn đóng vai trò chính, phage lamda xâm nhiễm vào DNA vi khuẩn tạo dạng prophage. Trong trường hợp này mật độ phage vô cùng thấp, muốn đạt mật độ phage lamda cao ta cần phải kích ứng để phage đi vào giai đoạn sinh tan, kết quả tế bào vi khuẩn chết và phóng thích các hạt phage vào môi trường. Ta có thể kiểm soát chúng thông qua gen cI (gen này nằm trên vùng đột biến nhạy cảm với nhiệt của phage). Gen này làm nhiệm vụ giúp phage liên kết với DNA tế bào chủ. Gen cI hoạt động tốt ở 30 oC . Bình thường sự tiềm tan có thể xảy ra, nhưng ở 42oC gen cI bị bất hoạt và sự tiềm tan không xảy ra.Sự cảm ứng tiềm tan của gen cI bằng cách tăng nhiệt độ từ 30oC-42oC. Gen cI xâm nhiễm vào DNA của Ecoli để sản xuất phage ngoại bào. Ở 30oC, không cảm ứng tế bào nhân đôi. Ở 42oC, nhiệt độ cảm ứng tạo genome phage lamda mong muốn, phage này qua quá trình phân chia, tổng hợp, đóng gói và phóng thích ra ngoài. Sự chuẩn bị phage lamda có khả năng tiềm tan: Mặc dù hầu hết phage lamda có tính tiềm tan, nhiều vector tạo dòng được tạo ra từ phage lamda, bằng cách loại bỏ gen cI và một vài gen khác vì thế sự tiềm tan không xảy ra. Những vector này không thể tiềm tan vào genome vi khuẩn, chúng chỉ xâm nhiễm vào tế bào bằng chu trình sinh tan. Để đạt mật độ phage cao ta bổ sung phage vào giai đọan tế bào phát triển thích hợp. + Nếu bổ sung phage vào khi số tế bào còn thấp phage sẽ giết chết tế bào, mật độ phage sẽ ít. + Nếu bổ sung phage khi mật độ tế bào quá cao, sự nuôi cấy sẽ không hoàn tất vẫn còn lượng tế bào dư, mật độ phage sẽ ít. +Thích hợp nhất là khi nuôi vi khuẩn ở mức nào đó thì cho phage vào ở mức đó, tạo sự cân bằng, việc nuôi cấy sẽ phát triển tốt, mật độ phage cao. Để xử lý vấn đề này tốt thì cần kỹ năng và kinh nghiệm. Thu nhận phage từ việc nuôi cấy nhiễm: Những tế bào vi khuẩn tan và tế bào còn nguyên còn sót lại có thể loại bỏ khỏi dịch huyền phù bằng ly tâm. Vấn đề là ta phải giảm thể tích dịch huyền phù còn 5ml hay ít hơn, để dể kiểm soát lượng DNA, ta làm như sau: Khử protein phage bằng PEG (là hợp chất polyme chuỗi dài) + NaCl + H2O hấp thụ. Các chất này làm các hạt phage dính lại với nhau. Sau đó ly tâm với tốc độ cao các hạt phage cùng với mảnh vỡ tế bào vẫn còn sót lai sau ly tâm sẽ lắng xuống đáy. Loại bỏ phần dịch lơ lửng ta được lượng phage với thể tích mong muốn. Sự tinh sạch DNA phage từ các hạt phage thu được ở trên: Sự khử protein nhờ PEG đôi khi chứa đủ lượng DNA phage, nhưng DNA phage thường xen lẫn với phần chất thu được nên lượng phage thu được ở trên có thể chứa các mãnh vỡ vi khuẩn, có thể là DNA tế bào không mong muốn .Ta có thể sau đó ly tâm tinh sạch các hạt phage bằng CsCl với phương pháp ly tâm độ đậm gradient. Các hạt phage trong gradient CsCl có mật độ 1.45-1.50g/cm3. Việc lấy phage giống như lấy DNA đã mô tả trước đây. Loại bỏ CsCl bằng sự thẩm tích để được phage sạch. DNA có thể được chiết bằng xử lý phenol và protease để làm tan vỏ protein của phage. Sự tinh sạch DNA M13 gây ra một vài vấn đề: Sự khác nhau giữa M13 và lamda là một thuận lợi để nhà sinh học phân tử chuẩn bị DNA M13. Sợi đôi M13 giống như một số plasmid có số lượng bản sao lớn thì dễ dàng tinh sạch bằng phương pháp tinh sạch plasmid. Chuẩn bị chất chiết tế bào từ tế bào đã nhiễm M13, các bản sao của M13 được tách khỏi DNA vi khuẩn bằng ly tâm đẳng tỷ trọng EtBr-CsCl. DNA sợi đơn của M13 được chứa trong vỏ protein của M13. Thuận lợi hơn so với lamda là M13 dễ đạt được mật độ cao, sự tiềm tan không xảy ra. Để đạt được mật độ M13 cao ta cần tăng số lượng tế bào bị nhiễm lên. Mật đô M13 có thể đạt 1012/ml và cao hơn nữa một cách dễ dàng nếu không dùng chất ức chế đặc biệt. Mật độ M13 cao có ý nghĩa trong việc chuẩn bị DNA sợi đơn của M13 từ việc nuôi cấy chỉ một thể tích nhỏ 5 ml hay ít hơn. Trong trường hợp này không có sự tiềm tan, không có vấn đề với mảnh vỡ tế bào còn sót lại trong dịch huyền phù. Thường thì ly tâm gradient CsCl thì cần thiết đối với phage lamda nhưng không cần thiết đối với M13. Tóm lại, chuẩn bị sợi đơn DNA M13 liên quan đến việc nuôi cấy nhiễm với thể tích nhỏ, ly tâm để loại bỏ tế bào vi khuẩn, tủa phage M13 với PEG, dùng phenol để loại bỏ vỏ protein, tủa bằng ethanol để thu DNA. Sự chuẩn bị DNA M13 của vi khuẩn qua các giai đoạn sau: Nuôi cấy tế bào bị nhiễm. Ly tâm loại bỏ tế bào. Tế bào lắng dưới đáy, M13 còn lại trong dịch huyền phù. Thêm PEG vào dịch huyền phù, ly tâm để tủa M13. Phage M13 lơ lửng trong buffer. Thêm phenol loại bỏ vỏ protein thu được dịch DNA M13 Thêm ethanol để tủa DNA M13, DNA lắng dưới đáy. Thu được DNA M13 trong thể tích nhỏ. G.Phương pháp tách chiết RNA: ¯Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi RNase. Hơn nữa, RNase lại có mặt ở khắp nơi (có rất nhiều trên ngón tay của người thao tác,…), có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân thừơng dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt ở 90oC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase). Vì những lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hoá chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay hoá chất, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần. Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với DNA: Tế bào, mô được nghiền trong một dung dịch gồm một chất tẩy mạnh (SDS, sacrosyl) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thyocyanate), một chất khư (2- mercaptoethanol). Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA. Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol-chloroform và ly tâm. RNA hoà tan trong pha nước được tủa bằng ethanol và được thu nhận lại qua ly tâm. RNA có thể được bảo quản trên 1 năm dưới dạng tủa trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -70oC trong nước có chứa RNAsine (một chất ức chế RNase). ¯Tách chiết tRNA, mRNA, rRNA: Khoảng 80% tổng số RNA của tế bào là rRNA, 15% là tRNA. Các RNA này có kích thước và trình tự xác định có thể tách chiết dễ dàng bằng các kĩ thuật như ly tâm, điện di,…Riêng mRNA chiếm khoảng 5% tổng số RNA tế bào, lại có kích thước và trình tự vô cùng đa dạng. Tuy nhiên chúng có đặc điểm chung là có cấu trúc đuôi polyA (có thể lên tới 100A). Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung A-T của NA người ta có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc kí ái lực oligodT-cellulose. Dựa vào nguyên tắc trên, hiện nay trên thương trường xuất hiện những bộ kit (bộ mẫu thử) sử dụng các viên bi từ có mang oligodT trên bề mặt. Sau khi các mRNA bám lên bề mặt các viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodT, các viên bi này được thu nhận qua ly tâm, mRNA sẽ được tách khỏi các viên bi bằng cách rửa trong dung dịch đệm có hàm lượng muối thấp và giữ lại. Kĩ thuật này cho phép thu nhận mRNA cả những mẫu có khối lượng rất nhỏ. Sau đó quá trình tinh sạch, các NA có thể đươc tinh sạch nhờ một số kĩ thuật như siêu ly tâm, sắc kí hay điên di. Triển vọng về kết quả nghiên cứu thành công hạt nano-carbon từ bọc silica của TS. Nguyễn Chánh Khê Lần đầu tiên tại Việt Nam, quy trình xét nghiệm sinh học phân tử phát hiện và định lượng virus bằng công nghệ nano-carbon từ đã được thử nghiệm thành công bởi nhóm nghiên cứu của TS. BS. Phạm Hùng Vân, giảng viên bộ môn vi sinh, khoa y, Đại học y dược TP.HCM. Có được kết quả này là nhờ vào việc làm chủ công nghệ chế tạo các hạt nano-carbon từ bọc silica của TS. Nguyễn Chánh Khê (Trung tâm công nghệ cao TP.HCM) để ứng dụng vào công nghệ tách chiết nucleic acid. Kết quả này đã mở ra nhiều triển vọng mới cho lĩnh vực công nghệ sinh học của Việt Nam. Vai trò của hạt từ bọc silica Để thực hiện xét nghiệm PCR hay RT-PCR phát hiện, định lượng tác nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng có mặt trong các mẫu thử (bệnh phẩm) thì khâu tách chiết nucleic acid từ các mẫu thử là một khâu rất quan trọng. Tùy thuộc vào tác nhân vi sinh vật, nucleic acid đích là DNA hay RNA, và tùy thuộc vào mẫu thử mà người làm xét nghiệm có thể chọn phương pháp tách chiết nucleic acid thích hợp. Trong nhiều phương pháp tách chiết nucleic acid được các phòng thí nghiệm PCR chẩn đoán sử dụng hiện nay, phương pháp BOOM là được lựa chọn nhiều nhất vì có thể sử dụng cho cả nucleic acid đích là DNA hay RNA và cho nhiều loại bệnh phẩm khác nhau (phương pháp này được René BOOM, Trung tâm hàn lâm y học, Đại học Amsterdam - Hà Lan phát minh vào năm 1989). Phương pháp BOOM hoạt động dựa trên nguyên tắc là trong môi trường chaotropic, nucleic acid có khả năng bám lên hạt silica nhờ đó mà nucleic acid được tách chiết ra từ mẫu thử. Mặc dù đây là phương pháp khá đơn giản và hiệu quả nhưng vẫn chưa thể tự động hóa vì trong khi thao tác phải có nhiều lần ly tâm dịch tách chiết để thu hồi silica. Chính vì vậy nhiều hãng sản xuất đã nghiên cứu cải tiến phương pháp BOOM, đưa ra các phương pháp tách chiết nucleic acid đơn giản hơn mà vẫn đạt hiệu quả cao. Cải tiến đầu tiên là thay vì phải dùng dung dịch các hạt silica, người ta đã chế tạo các màng lọc xốp bằng silica nhờ vậy mà có thể tách chiết được nucleic acid bằng cách dùng ly tâm hay bơm hút chân không để đẩy dịch tách chiết mẫu thử đi qua lọc xốp silica này. Một cải tiến nữa là chế tạo các hạt từ bọc silica, và như vậy là có thể dùng các hạt từ bọc silica này để tách chiết nucleic acid từ các dịch tách chiết mẫu thử. Đột phá hơn nữa là phương pháp dùng hạt từ bọc silica có thể tự động hóa được trên các máy thao tác mẫu mà phương pháp BOOM cổ điển hay phương pháp dùng màng lọc silica không thể áp dụng được. Có thể nói dù công nghệ hạt từ bọc silica là một công nghệ rất ưu việt ứng dụng tách chiết nucleic acid, tuy nhiên hiện nay chỉ có một số hãng đưa ra được các bộ thuốc thử tách chiết nucleic acid dựa trên công nghệ hạt từ bọc silica. Lý do của hạn chế này là vì chỉ có một vài nhà sản xuất nắm được công nghệ nguồn sản xuất hạt từ bọc silica, và các hãng sản xuất thuốc thử tách chiết nucleic acid phải dựa vào nguồn cung cấp của các nhà sản xuất hạt từ bọc silica này Làm chủ công nghệ chế tạo hạt nano- carbon từ bọc silica Mới đây tại Việt Nam, vào cuối năm 2007 vừa qua nhóm nghiên cứu của chúng tôi có làm việc với TS. Nguyễn Chánh Khê ở khu công nghệ cao TP.HCM (TS. Khê là người rất am hiểu về công nghệ nano-carbon), nội dung làm việc xoay quanh chủ đề “ứng dụng công nghệ nano-carbon vào sản xuất các hạt nano-carbon từ bọc silica”. Ngày 16/2/2008 TS. Nguyễn Chánh Khê và nhóm nghiên cứu của mình đã giao cho chúng tôi 9 loại nano-carbon từ để thử nghiệm. Chúng tôi đã chọn 6 loại để thử vì đây là các loại nano-carbon từ có bọc silica. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tập trung thực hiện các nội dung: chọn các thuốc thử, quy trình, đối tượng để thử nghiệm khả năng tách chiết DNA, RNA của các loại hạt nano-carbon từ... Kết quả cho thấy tất cả 6 loại hạt nano-carbon từ bọc silica của TS. Nguyễn Chánh Khê sau khi đã được rửa sạch nhiều lần bằng nước miliQ (nước khử ion tuyệt đối tinh sạch) đều có khả năng tách chiết và tinh sạch được DNA. Với kết quả thành công đầu tiên này, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm khả năng tách chiết DNA của các hạt nano-carbon từ trên đối tượng mẫu thử thật là huyết thanh bệnh nhân đã xác định dương tính virus viêm gan B (là virus DNA). Chúng tôi thấy 6 loại hạt nano-carbon từ này đều có khả năng tách chiết DNA vi sinh vật từ mẫu thử thật với hiệu quả như nhau. Thử nghiệm khả năng tách chiết RNA trên mẫu thật huyết thanh bệnh nhân đã xác định dương tính virus viêm gan C (là virus RNA), chúng tôi ghi nhận 2 loại hạt nano-carbon từ (có ký hiệu 200428-95-5 và 200428-95-7) là có khả năng tách chiết được RNA, các loại hạt nano-carbon từ còn lại thì không có khả năng này. Chúng tôi tiếp tục thử nghiệm thêm hiệu quả tách chiết RNA của 2 loại hạt nano-carbon từ (có ký hiệu 200428-95-5 và 200428-95-7), trên 5 mẫu huyết thanh đã xác định dương tính HCV, và ghi nhận được 2 loại hạt nano-carbon từ này cho hiệu quả tách chiết RNA vi sinh vật từ mẫu thử rất tốt. Qua các kết quả thử nghiệm nói trên, chúng tôi cho rằng nhóm nghiên cứu của TS. Nguyễn Chánh Khê đã làm chủ được công nghệ chế tạo các hạt nano-carbon từ bọc silica để ứng dụng vào công nghệ tách chiết nucleic acid. Kết quả nghiên cứu thành công này của TS. Khê đã giúp các nhà khoa học (trong lĩnh vực công nghệ sinh học) trong nước thêm nhiều thuận lợi vì đơn giản hơn, nhưng lại tăng hiệu quả trong công nghệ tách chiết nucleic acid các tác nhân vi sinh vật đích có mặt trong các mẫu thử để phát hiện và định lượng bằng xét nghiệm PCR định tính hay định lượng. Đây cũng là cơ sở để các nhà nghiên cứu về công nghệ sinh học trong nước có thể tiếp cận được công nghệ tự động hóa khâu tách chiết nucleic acid đích - một khâu khó tự động hóa nhất trong xét nghiệm PCR, mà cho đến hiện nay chỉ có Roche Diagnostic là làm chủ được nhờ có công nghệ hạt từ bọc silica. Ứng dụng của hạt nano- carbon từ bọc silica Hạt nano-carbon từ bọc silica áp dụng trong tách chiết DNA, RNA còn có nhiều khả năng ứng dụng khác như áp dụng trong xét nghiệm dấu vân tay, phát hiện quan hệ huyết thống, truy tìm tông tích, phát hiện thủ phạm và cả trong công nghệ giải trình tự (tinh sạch sản phẩm giải trình tự). Đây cũng là những nội dung mà nhóm nghiên cứu chúng tôi đang triển khai thực hiện, dựa trên các hạt nano-carbon từ bọc silica do TS. Nguyễn Chánh Khê và nhóm cộng sự nghiên cứu chế tạo. Thành công của kết quả nghiên cứu các hạt nano-carbon từ bọc silica còn mở một triển vọng khác là: thương mại. Hiện nay chúng tôi phải đặt mua các bộ thuốc thử tách chiết nucleic acid bằng công nghệ hạt từ bọc silica với giá khá cao: 4.000 USD/50 ml. Lý do của sự đắt giá này chính là ở chỗ có rất ít nhà sản xuất nắm được công nghệ nguồn để sản xuất hạt từ bọc silica. Ở Việt Nam, hiện nay theo chúng tôi, nhóm nghiên cứu của TS. Nguyễn Chánh Khê đã làm chủ được công nghệ nguồn này, với nhiều khác biệt so với các sản phẩm hiện có mặt trên thị trường thế giới đó là sử dụng hạt nano-carbon từ bọc silica chứ không phải là các hạt sắt nhiễm từ bọc silica. Chính vì vậy mà các hạt nano-carbon từ bọc silica của TS. Nguyễn Chánh Khê chế tạo, sau khi rửa sạch thì không cần phải bảo quản lạnh mà chỉ cần bảo quản ở nhiệt độ thường, vẫn không bị mất hoạt tính. TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN (Trường đại học y dược TP.HCM) Tài liệu tham khảo: Sinh học phân tử - HỒ HUỲNH THUỲ DƯƠNG- Nhà xuất bản giáo dục. Thực tập sinh học phân tử lớp DH06SH Công nghệ sinh học-tập 4-Kĩ thuật di truyền. Công nghệ gen-GSTS Đái Duy Ban-NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. Giáo trình thực tập sinh học phân tử trường đại học y dược TPHCM Giáo trình sinh học phân tử.pdf www. Google.com