Bước đầu sử dụng mô hình nuôi cấy tế bào để đánh giá độc tính tế bào của xi măng nha khoa

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 12 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG MÔ HÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA XI MĂNG NHA KHOA Trần Xuân Vĩnh* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá độc tính lên tế bào gốc trung mô tủy xương người (hBMSCs) của xi măng BiodentineTM bằng phương pháp nuôi cấy tế bào với dịch chiết vật liệu. Đối tượng và phương pháp: hBMSC được cung cấp bởi nhóm vật liệu y sinh thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh. Dịch chiết BiodentineTM được chuẩn bị và pha loãng theo nồng độ 100%, 50%, 25%, 12,5% và 6,25%, sau đó đưa vào đĩa 96 giếng có hBMSCs. Đánh giá độc tính tế bào bằng phương pháp MTT. Kết quả: Dịch chiết BiodentineTM chưa pha loãng (nồng độ 100%) độc với tế bào hBMSCs. Các nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% và 6,25% không còn độc với tế bào. Phần trăm tế bào sống càng tăng khi nồng độ dịch chiết của BiodentineTM càng pha loãng. Kết luận: Từ kết quả thu được, chúng tôi có thể kết luận việc sử mô hình nuôi cấy tế bào với việc pha loãng dịch chiết vật liệu là phù hợp để đánh giá độc tính của vật liệu lên tế bào. Nồng độ 12,5% và 6,25% là nồng độ lý tưởng sử dụng để thực hiện các đánh giá tính tương hợp sinh học khác. Từ khoá: tế bào gốc trung mô tuỷ xương người, BiodentineTM , độc tính tế bào ABSTRACT INITIATIVE STUDY OF CYTOTOXICITY OF DENTAL CEMENT BY CELL CULTURE MODEL Tran Xuan Vinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 2- 2018: 12- 16 Objective: The study was to evaluate the toxicity of BiodentineTM cement to human Bone Marrow Stem Cells (hBMSCs) by cell culture with material extracts. Methods: hBMSCs was produced by Ho Chi Minh City University of Science. BiodentineTM were prepared, diluted at 100%, 50%, 25%, 12.5% and 6.25%, and added to culture insert plates which was placed into 96 wells containing culture cells. Cytotoxicity was assessed using MTT method Results: 100% BiodentineTM extract is toxic to hBMSCs. Diluted concentrations of 50%, 25%, 12.5% and 6.25% are not toxic to the cells. The percentage of cell vitability increases as the concentration of BiodentineTM extract decreases. Conclution: We can conclude that cell culture models with dilution of the material extracts is appropriate to assess the toxicity of the material to the cell. Concentrations of 12.5% or 6.25% are ideal for other biocompability evaluations. Key words: human Bone Marrow Stem Cells, BiodentineTM, Cytotoxicity. MỞ ĐẦU Một vật liệu được coi là “gây độc tế bào” khi nó giải phóng một lượng hoá chất đủ để giết chết tế bào theo cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự ức chế các con đường trao đổi chất chính. Số lượng tế bào bị ảnh hưởng sẽ cho biết liều lượng và độc lực của hoá chất. Thử nghiệm độc tính lên tế bào là một trong các thử nghiệm đầu tiên trong tiến trình đánh giá tương hợp sinh học của một vật liệu. Ba thử nghiệm tế bào chủ yếu được sử dụng là: tiếp xúc trực tiếp, khuếch tán *Bộ môn Nha khoa cơ sở, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược Tp.HCM Tác giả liên lạc: TS. Trần Xuân Vĩnh ĐT: 0946920818 Email: vinhdentist@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 13 qua agar và tách chiết (còn được gọi là pha loãng dịch chiết). Việc lựa chọn thử nghiệm nào là tùy thuộc vào đặc tính của vật liệu, lí do tiến hành thử nghiệm và khuynh hướng sử dụng vật liệu. BiodentineTM là xi măng có thành phần calcium silicate được phát triển nhằm cải thiện những hạn chế của MTA(8). BiodentineTM có thời gian đông cứng ngắn khoảng 12 phút, đặc tính cơ học được cải thiện, dễ thao tác(12) và được dùng trong lĩnh vực chữa răng-nội nha như che tủy trực tiếp, chất thay thế ngà bên dưới vật liệu trámNhiều nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá độc tính của BiodentineTM trên những dòng tế bào khác nhau như nguyên bào sợi tủy răng người(5), tế bào gốc tủy răng người(1,9), tế bào tủy răng chuột(14). Mặc dù BiodentineTM được đề nghị dùng trong điều trị trám ngược, thủng sàn tủy nhưng hiện nay số lượng nghiên cứu đánh giá tác động của BiodentineTM lên vùng quanh chóp còn hạn chế. Năm 2014, Lee B.N. và cộng sự tiến hành đánh giá độc tính của BiodentineTM, MTA và Bioaggregate khi tiếp xúc với tế bào dòng C3H10T1/2(8). Gần đây, có nghiên cứu đánh giá độc tính trên tế bào hBMSCs của BiodentineTM và MM – MTA, MTA(10). Tuy nhiên nghiên cứu này chỉ đánh giá vật liệu độc hay không độc, mà chưa xác định nồng độ gây độc với tế bào hBMSCs. Vì vậy chúng tôi thực hiện đánh giá độc tính của BiodentineTM trên tế bào hBMSCs bằng phương pháp nuôi cấy tế bào với dịch chiết vật liệu có nhiều nồng độ khác nhau. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu In vitro thực hiện trên hBMSC khi tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM . Tạo khối và pha loãng nồng độ dịch chiết Trộn BiodentineTM theo quy định của nhà sản xuất, cho vật liệu vào khuôn (4x1mm), chờ khối vật liệu đông, ngâm khối vật liệu vào môi trường DMEM/F12. Sau 24 giờ thu được dịch chiết. Tỷ lệ diện tích khối vật liệu: thể tích môi trường DMEM/F12 là 300mm2: 1ml (theo tiêu chuẩn ISO 10993-12:2012). Thu được dịch chiết có nồng độ 100% và pha loãng dịch chiết với các nồng độ 50%, 25%, 12,5% và 6,25%. Đánh giá độc tính tế bào bằng phương pháp MTT Cấy hBMSCs (P4) trên đĩa 96 giếng. Mỗi giếng có khoảng 5x103 tế bào. Sau 24 giờ, thay môi trường DMEM/F12 bằng dịch chiết nồng độ 100%, 50%, 25%, 12,5% và 6,25%. Gồm 3 nhóm: nhóm tiếp xúc dịch chiết BiodentineTM và nhóm chứng âm và nhóm chứng dương. Tiến hành xác định % tế bào sống tại các nồng độ dịch chiết. Xử lý và phân tích số liệu Số liệu được nhập và xử lý bằng chương trình Microsoft Excel 2010 với phép kiểm Anova một yếu tố, t-test. KẾT QUẢ Bảng 1. Phần trăm tế bào sống khi tiếp xúc với BiodentineTM (BD), chứng âm và chứng dương theo nồng độ Loại vật liệu Trung bình(± Độ lệch chuẩn) Chưa pha loãng Nồng độ 50% Nồng độ 25% Nồng độ12,5% Nồng độ 6,25% BD 19,500 (±1,162) 70,700 (±3,460) 86,700 (±3,525) 97,500 (±13,011) 100,900 (±2,877) (-) 100,000 (±9,760) 100,000 (±9,760) 100,000 (±9,760) 100,000 (±9,760) 100,000 (±9,760) (+) 4,583 (±0,264) 4,583 (±0,264) 4,583 (±0,264) 4,583 (±0,264) 4,583 (±0,264) BD: BiodentineTM, (-): chứng âm, (+): chứng dương. Dịch chiết BiodentineTM ở nồng độ chưa pha loãng (100%) độc với tế bào hBMSCs (phần trăm tế bào sống <70%). Trong khi đó BiodentineTM nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% và 6,25% không độc với tế bào hBMSCs. Dịch chiết BiodentineTM nồng độ chưa pha loãng (100%), nồng độ pha loãng 50%, 25% có phần trăm tế bào sống thấp hơn nhóm chứng âm, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05). BiodentineTM nồng độ pha loãng 12,5% có phần trăm tế bào sống thấp hơn nhóm chứng âm, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α=0,05). BiodentineTM Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 14 nồng độ pha loãng 6,25% có phần trăm tế bào sống cao hơn nhóm chứng âm, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α=0,05). BD: BiodentineTM. Biểu đồ 1. Phần trăm tế bào sống khi tiếp xúc với dịch chiết BiodentineTM ở các nồng độ khác nhau. Dựa trên phép kiểm t-test và biểu đồ 1 nhận thấy rằng: Phần trăm tế bào sống ở nồng độ 50%, 25%, 12,5% và 6,25% cao hơn so với nồng độ chưa pha loãng, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05). Phần trăm tế bào sống ở nồng độ 25%, 12,5% và 6,25% cao hơn so với phần trăm tế bào sống ở nồng độ 50%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05). Phần trăm tế bào sống ở nồng độ 12,5% cao hơn so với nồng độ 25%, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α=0,05). Tuy nhiên phần trăm tế bào sống ở nồng độ 6,25% cao hơn so với nồng độ 25%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05). Phần trăm tế bào sống ở nồng độ 6,25% cao hơn so với nồng độ 12,5%, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α=0,05). BÀN LUẬN Có nhiều phương pháp khác nhau dùng để đánh giá độc tính của vật liệu lên tế bào. Một số tác giả thực hiện bằng cách cho vật liệu tiếp xúc trực tiếp với tế bào(2,11). Một số tác giả khác đánh giá độc tính tế bào bằng cách cho vật liệu tiếp xúc với tế bào thông qua dịch chiết(6,10).Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đánh giá độc tính của vật liệu lên tế bào dưới dạng dịch chiết bởi 2 lý do: Thứ nhất, chúng tôi thực hiện tạo khối xi măng BiodentineTM, khối này có tỉ trọng cao nên thử nghiệm dịch chiết là phù hợp(13). Thứ hai, chúng tôi dựa trên kết quả nghiên cứu của Camilleri J. và cộng sự (năm 2005). Tác giả này đã đánh giá tương hợp sinh học của các loại MTA và xi măng Portland xám và cho rằng tế bào giảm rõ rệt ở nhóm tiếp xúc trực tiếp so với nhóm tiếp xúc qua dịch chiết(4). Vật liệu mà chúng tôi đánh giá là BiodentineTM có thành phần chính là calcium silicate giống MTA và xi măng Porland(3). Việc pha loãng có nhiều cách khác nhau là pha loãng theo nồng độ, pha loãng theo tỷ lệ thể tích, pha loãng dựa vào hàm lượng vật liệu có trong dịch chiết (lượng vật liệu có trong 1ml dịch chiết, tính bằng đơn vị mg/ml). Để xác định nồng độ dịch chiết chúng tôi tiến hành pha loãng theo nồng độ 100%, 50%, 25%, 12,5% và 6,25%. Dịch chiết được tạo ra phụ thuộc vào tỷ lệ giữa diện tích bề mặt mẫu thử trên 1ml chất chiết(13). Quy trình chiết mẫu được thực hiện dựa trên tiêu chuẩn ISO 10993-12:2012 với diện tích bề mặt mẫu thử trên 1ml chất chiết là 300mm2: 1ml. Chúng tôi thực hiện đánh giá độc tính của BiodentineTM dưới dạng dịch chiết với các nồng độ khác nhau 100%, 50%, 25%, 12,5% và 6,25% lên tế bào hBMSCs. Kết quả cho thấy ở nồng độ chưa pha loãng (100%) thì BiodentineTM độc với tế bào. Từ nồng độ pha loãng 50% thì dịch chiết BiodentineTM không còn độc trên tế bào. Trong khi đó, Margunato S. và cộng sự (2015) nghiên cứu độc tính của Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 15 dịch chiết chưa pha loãng BiodentineTM, MTA, MM – MTA trên tế bào hBMSCs. Kết quả cho thấy sau 24 giờ cả ba dịch chiết trên đều không độc(10). Kết quả này khác với kết quả thu được của chúng tôi. Sự khác nhau này có thể là do nghiên cứu của chúng tôi thực hiện tạo dịch chiết trên khối vật liệu vừa đông cứng hoàn toàn, còn trong nghiên cứu của Margunoto S và cộng sự thực hiện trên mẫu dịch chiết Biodentine™ đông cứng hoàn toàn sau 24 giờ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy BiodentineTM nồng độ chưa pha loãng độc với tế bào hBMSCs, điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lee B.N. và cộng sự (2014). BiodentineTM ở nồng độ chưa pha loãng thì độc với tế bào dòng C3H10T1/2(8). Trong khi đó nhiều nghiên cứu khác cho rằng BiodentineTM nồng độ chưa pha loãng thì không độc với tế bào. Nghiên cứu của Laurent P và cộng sự (2008) kết luận rằng BiodentineTM không gây độc cho nguyên bào sợi tủy răng người ở bất kỳ nồng độ nào(7). Nhóm nghiên cứu của Kucukkaya S. (2016) cho thấy dịch chiết chưa pha loãng của BiodentineTM không gây độc cho nguyên bào sợi dây chằng nha chu(6). Sự khác nhau này có thể là do các nghiên cứu thực hiện trên những dòng tế bào không giống nhau. Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện với tế bào hBMSCs được phân lập trực tiếp từ mẫu xương hàm. Những nghiên cứu đánh giá độc tính lên tế bào sử dụng dịch chiết BiodentineTM được pha loãng theo nhiều cách khác nhau nhưng nhìn chung, khi pha loãng thì chúng không độc với tế bào như nguyên bào sợi tủy răng người, tế bào dòng C3H10T1/2, nguyên bào sợi dây chằng nha chu người(6,7,8).Điều này là hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng phần trăm tế bào sống càng tăng khi nồng độ dịch chiết của BiodentineTM càng pha loãng, nhưng khi nồng độ dịch chiết pha loãng đến một giá trị nhất định thì không có sự khác biệt về phần trăm tế bào sống giữa các nồng độ. Rõ ràng là có sự khác biệt giữa kết quả nghiên cứu in vitro và thực tế ứng dụng lâm sàng. Trên lâm sàng, khi BiodentineTM được sử dụng trong môi trường miệng, chúng tiếp xúc với mô có chứa dịch sinh lý. Dịch sinh lý bao gồm máu, huyết thanh, huyết tương, dịch ngà, dịch nướu là nguồn cung cấp ion phosphate của cơ thể. Dựa trên đặc tính này, nghiên cứu của Gandolfia M.G. và cộng sự (2010) đã chứng minh rằng đặc tính lý hoá của bề mặt calcium silicate thay đổi theo thời gian trong dung dịch đệm phosphate và do đó sẽ dẫn đến thay đổi trên nguyên bào xương(5). Những dịch mô này sẽ pha loãng nồng độ của vật liệu theo thời gian. Điều này khác với thiết kế nghiên cứu in vitro là vật liệu tiếp xúc trực tiếp với tế bào. Độc tính lên tế bào là thử nghiệm bước đầu trong loạt các thử nghiêm để đánh giá tính tương hợp sinh học của vật liệu như sự tăng sinh tế bào, biệt hóa tế bào Vì vậy việc xác định nồng đồ pha loãng mà ở đó vật liệu không còn độc với tế bào là cần thiết. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết BiodentineTM có nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% và 6,25% không độc với tế bào hBMSCs. Như vậy cả bốn nồng độ pha loãng này đều có thể được lựa chọn để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên nồng độ pha loãng 50% và 25% khi tiếp xúc với tế bào hBMSCs có phần trăm tế bào sống thấp hơn so với nhóm chứng âm, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05). Trong khi ở nồng độ pha loãng 12,5% và 6,25% thì phần trăm tế bào sống ở nhóm BiodentineTM không có sự khác biệt so với nhóm chứng âm. Như vậy 12,5% và 6,25% là nồng độ dịch chiết có thể chọn để thực hiện các thử nghiệm tương hợp sinh học tiếp theo sau thử nghiệm độc tính tế bào hBMSCs. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu cho phép chúng tôi kết luận rằng mô hình nuôi cấy tế bào với việc pha loãng dịch chiết vật liệu là phù hợp để đánh giá độc tính của vật liệu lên tế bào. Nồng độ pha loãng 50%, 25%, 12,5% và 6,25% không độc với tế Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 16 bào hBMSCs. Nồng độ pha loãng 12,5% hoặc 6,25% là các nồng độ lý tưởng sử dụng để thực hiện các đánh giá tính tương hợp sinh học khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anto V, Caprio MPD, Ametrano G, Simeone M, Rengo S, Spagnuolo G (2010). "Effect of Mineral Trioxide Aggregate on Mesenchymal Stem Cells", JOE, 36(11), pp.1839-1843. 2. Attik GN, Villat C, Hallay F, Pradelle-Plasse N, Colon P, Grosgogeat B (2014). In vitro biocompatibility of a dentine substitute cement on human MG63 osteoblasts cells: BiodentineTM versus MTA, International Endodontic Journal, 47, pp.1133-1114. 3. Camilleri J (2008). "Characterization of hydration products of mineral trioxide aggregate", International Endodontic Journal, 41, pp.408-417. 4. Camilleri J, Montesin FE, Silviol LD, Pitt Ford TR (2005). "The chemical constitution and biocompatibility of accelerated Portland cement for endodontic use", International Endodontic Journal, 38, pp.834-842. 5. Gandolfia MG, Ciapetti G, Taddei P, Perut F, Tinti A, Cardoso MV, Meerbeek BV, Prati C (2010). "Apatite formation on bioactive calcium-silicate cements for dentistry affects surface topography and human marrow stromal cells proliferation", Dental Materials Journal, 26, pp.974-992. 6. Kucukkaya S, Gorduysus MO, Zeybek ND, MuftuoLlu SF (2016). "In Vitro Cytotoxicity of Calcium Silicate-Based Endodontic Cement as Root-End Filling Materials", Hindawi Publishing Corporation Scientifica, pp.1-6. 7. Laurent P, Camps J, Meo M, Dejou J (2008). "About I Induction of specific cell responses to a Ca(3)SiO(5)-based posterior restorative material‖, Dent Mater, 24, pp.1486-1494. 8. Lee BN, Lee K (2014). Effects of 3 Endodontic Bioactive Cements on Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem Cells, JOE, 40(8), pp1217-22. 9. Luo Z, Li D, Kohli MR, Yu Q, Kim S, He W (2014). "Effect of BiodentineTM on the proliferation, migration and adhesion of human dental pulp stem cells", Journal of dentistry, 42, pp. 490- 497. 10. Margunato S, Tas PN¸ Aydın S, Kazanda K, Fikrettin S (2015). In Vitro Evaluation of ProRoot MTA, Biodentine, and MM- MTA on Human Alveolar Bone Marrow Stem Cells in Terms of Biocompatibility and Mineralization, JOE, 41(10), pp.1646- 1652. 11. Nunez CMC, MClinDent, Bosomworth HJ, Field C, Whitworth JM, Valentine RA (2014). "Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate Induce Similar Cellular Responses in a Fibroblast Cell Line‖, JOE, 40(3), pp.406 -411. 12. Pradelle-Plasse N, Tran XV, Colon P, Laurent P, Aubut V, About I (2009). Emerging trends in biomaterial research. An example of new material: preclinical multicentric studies on a new Ca3SiO5-based dental material. In: Goldberg M (ed) Biocompatibility or cytotoxic effects of dental composites, Oxford, 1, pp.184-203. 13. Trần Lê Bảo Hà, Tô Minh Quân, Đoàn Nguyên Vũ (2014). Công nghệ vật liệu sinh học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. 14. Zanini M, MPhil, Sautier JM, Berdal A, Simon S (2012). "Biodentine Induces Immortalized Murine Pulp Cell Differentiation into Odontoblast-like Cells and Stimulates Biomineralization‖, JOE, 38(9), pp.1220-1226. Ngày nhận bài báo: 08/02/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 18/02/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018