Bước đầu nghiên cứu sử dụng tế bào gốc trung mô tạo các mảnh ghép mô công nghệ ứng dụng trong y học tái tạo

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 5 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TẠO CÁC MẢNH GHÉP MÔ CÔNG NGHỆ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC TÁI TẠO Huỳnh Duy Thảo*, Trần Lê Bảo Hà**, Võ Quốc Vũ*, Trần Công Toại* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc hiện nay đang rất phát triển và đạt được nhiều kết quả khả quan, từ các nghiên cứu khoa học cơ bản cho đến các ứng dụng lâm sàng trong y học. Nhiều loại tế bào gốc trong cơ thể đã được nghiên cứu và triển khai ứng dụng. Tuy nhiên, tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô trưởng thành trong cơ thể cho thấy có những ưu điểm nổi bật. Sự kết hợp của tế bào gốc và vật liệu sinh học để tạo ra mô công nghệ nhằm thay thế và tái tạo mô trong cơ thể là xu hướng phát triển rất nhanh và mạnh trong thời gian gần đây. Mục tiêu nghiên cứu: Tạo ra các mảnh ghép từ sự kết hợp của tế bào gốc trung mô với các loại vật liệu như san hô, Gelatin-Alginate và fibrin để tạo ra các mảnh ghép trong điều kiện in vitro. Phương pháp nghiên cứu: Thí nghiệm thực nghiệm mô tả. Mô mỡ người được thu nhận và sử dụng để phân lập tế bào gốc trung mô. Sau đó, tế bào gốc trung mô được sử dụng để tạo mảnh ghép bằng cách kết hợp với các loại vật liệu sinh học. Kết quả: Tế bào gốc trung mô thỏa mãn theo tiêu chí của ISCT. Các mảnh ghép được tạo ra từ tế bào gốc trung mô với khung san hô, khung Gelatin-Alginate và Fibrin. Kết luận: Nhóm nghiên cứu bước đầu đã tạo ra được các mảnh ghép dựa trên công nghê mô, nghiên cứu này chỉ là bước khởi đầu để triển khai những nghiên cứu tiếp theo. Từ khóa: Tế bào gốc trung mô, san hô biển, gelatin-alginate, fibrin, mảnh ghép. ABSTRACT PRELIMINARY STUDIES USING MESENCHYMAL STEM CELLS TO CREATE TISSUE ENGINEERED GRAFTS FOR APPLICATIONS IN REGENERATIVE MEDICINE Huynh Duy Thao, Tran Le Bao Ha, Vo Quoc Vu, Tran Cong Toai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 5 - 13 Background: Research and application of stem cells is now very developed and achieved many positive results, from basic research to clinical applications. Many types of stem cells in the body have been studied and applied in clinical practice. However, the mesenchymal stem cells derived from adult tissues in the body show that there are outstanding advantages. The combination of stem cells and biomaterials to create new kinds of tissue engineering to replace and regenerate tissues in the human body has developed very quickly and effectively in recent times. Objectives: Generate different types of tissue grafts from a combination of mesenchymal stem cells with biomaterials like sea coral, Gelatin-Alginate and fibrin in vitro. Methods: The experiment was performed as described experiments. Human adipose tissue is collected and used to isolate mesenchymal stem cells. Then, mesenchymal stem cells are used to create tissue graft by combining with types of biomaterials. * Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch **Bộ môn Sinh lý Động vật, ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Huỳnh Duy Thảo ĐT: 01693891481 Email: thao_huynhduy@pnt.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 6 Results: Mesenchymal stem cells are identified by the standards of ISCT. The tissue graft made from mesenchymal stem cells with other types of substrates such as coral, Gelatin-Alginate and fibrin. Conclusion: Our research team has succeeded initially to create tissue graft based on tissue engineering technology, this research is only the first step to implement the follow-up study. Keywords: Mesenchymal stem cell, sea coral, gelatin-alginate, fibrin, graft tissue. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc hiện nay đang rất phát triển và đi vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, từ các nghiên cứu khoa học cơ bản cho đến các ứng dụng lâm sàng trong y học. Nhiều loại tế bào gốc trong cơ thể đã được nghiên cứu và triển khai ứng dụng. Tuy nhiên, tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells – MSC) thu nhận từ mô trưởng thành như tủy xương, mô liên kết, tuyến tiêu hóa hoặc các phần phụ của thai như máu cuống rốn, cuống rốn(15) là các tế bào gốc đa tiềm năng, có những ưu điểm nổi bật và hiệu quả trong lĩnh vực công nghệ mô(15,8). Do đó, MSC cần phải có một quy trình thu nhận phù hợp để nhân khốiin vitro trước khi sử dụng với số lượng lớn tế bào(7) . Mô ghép nói riêng và vật liệu cấy ghép nói chung ngày nay được sử dụng khá phổ biến trong y học. Đối với những bệnh lý dẫn đến tổn thương mô, khuyết mô thì việc điều trị có thể sử dụng mô ghép tự thân, mô ghép đồng loại, mô ghép dị loại, các loại vật liệu ghép sinh học để thay thế. Bên cạnh đó, để cải thiện hiệu quả cho các vật liệu ghép các nhà nghiên cứu tìm cách đưa các yếu tố sinh học vào mô ghép như tế bào và các yếu tố hoạt tính sinh học(5,11,9) Trong đó, vai trò của tế bào gốc trung mô hiện tại rất được quan tâm và triển khai nghiên cứu để tạo ra các mô ghép công nghệ. Do đó nhóm nghiên cứu của chúng tôi bước đầu thử nghiệm tạo ra các loại mảnh ghép khác nhau từ sự kết hợp của tế bào gốc trung mô và các loại khung nâng đỡ sinh học khác nhau để đánh giá tiềm năng của các loại mảnh ghép này trong y học tái tạo. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mô mỡ người được thu nhận từ việc chọc hút mỡ trong các quy trình phẫu thuật thẩm mỹ. Mẫu mô được thu nhận từ các người hiến khỏe mạnh, đồng ý hiến mô để tiến hành nghiên cứu và có các xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV và VDRL. San hô tự nhiên (Porites lutea) được thu nhận từ viện Hải Dương Học Nha Trang. Máu ngoại vi dùng để tạo giá thể fibrin từ huyết thanh người. Gelatin và Alginate được thu nhận từ nguồn gốc sinh học để tạo giá thể Gelatin-Alginate (G- A). Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được thiết kế là phương pháp thực nghiệm mô tả. Thu nhận mô mỡ Mẫu mô được thu nhận trong điều kiện vô trùng của phòng mổ. Sau đó, mẫu được vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ Mô mỡ được cho vào các tube 50ml khoảng 20-30ml dịch mô mỡ cho mỗi tube. Sau đó bổ sung hỗn hợp enzyme Dispase-Collagenase vào các tube với tỉ lệ (1 mẫu: 2 enzyme, v/v), mẫu mô được ủ trong enzyme ở nhiệt độ 370C, trong thời gian 90 phút. Sau đó, ly tâm thu nhận phần cặn lắng ở đáy chai. Bổ sung môi trường nuôi cơ bản vào tube và huyền phù phần cặn lắng ở đáy chai. Lọc phần dịch tế bào qua phễu lọc tế bào (cell strainer, BD FalconTM) với đường kính 70 μM. Sau đó thu phần cặn lắng ở đáy chai và bổ sung dung dịch ly giải hồng cầu để loại bỏ hồng cầu còn lẫn tạp. Sau đó, quay li tâm thu phần cặn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 7 lắng, bổ sung môi trường nuôi và đếm mật độ tế bào với dung dịch Trypan blue bằng buồng đếm Neubauer. Tế bào được nuôi trong chai nuôi T- 25 cm2 (Corning) và ủ trong tủ nuôi ở nhiệt độ 370C và 5% CO2. Môi trường được thay mới 3 ngày/ 1lần. Mẫu sẽ được cấy chuyền trong khoảng thời gian từ 7 – 14 ngày từ lúc bắt đầu nuôi cấy(12,8). Định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Để định danh các tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell – MSC) thu nhận từ mô mỡ, chúng tôi đánh giá theo tiêu chí của Hội liệu pháp Tế bào Quốc tế (International Society for Cellular Therapy – ISCT)(11). Chúng tôi sử dụng quy trình nghiên cứu đã được thiết lập để phân lập và định danh MSC(13). Tạo mảnh ghép từ sự kết hợp của MSC với các loại vật liệu sinh học Tạo mô ghép hướng đến tái tạo mô cứng từ san hô và MSC MSC sau khi được nhân khối để làm giàu số lượng sẽ được thu nhận bằng dung dịch Trypsin-EDTA (Gibco). Dịch tế bào sau khi tách sẽ được chuyển lên các giá thể san hô bằng phương pháp quay ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút (lặp lại 5 lần). Trong nghiên cứu này, chúng tôi định hướng phát triển mô ghép thành mô tạo xương. Do đó, mảnh ghép sẽ được nuôi cấy trong môi trường cảm ứng tạo xương gồm DMEM/F12, 10% FBS, 10-7M Dexamethasone, 10mM/ml -Glycerol phosphate, 50ng/ml Ascorbic acid, 10ng/ml FGF9, 10-7M vitamin D2 và kháng sinh(1,18,19). Mảnh ghép sẽ được theo dõi dưới kính hiển vi đảo ngược và vào ngày thứ 21 sẽ được thu nhận và đánh giá bằng các phương pháp nhuộm mô học và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét. Ngoài ra, mảnh ghép sẽ được xử lý trong dung dịch cố định (Neutral Buffer Formalin 10%) để nhuộm Giemsa và H&E nhằm đánh giá cấu trúc và sự phát triển của tế bào bên trong mảnh ghép. Để xác định các nguyên bào xương (thông qua sự hoạt động của enzyme alkaline phosphatase - AP) biệt hóa trên khung san hô từ các MSC, tiến hành nhuộm mảnh ghép với thuốc nhuộm Fast Red violet LB salt (sigma) để đánh giá sự biểu hiện của enzyme này. Đây là một trong những marker được sử dụng phổ biến để định danh cho các nguyên bào xương. Tạo mô ghép hướng đến tái tạo mô mềm từ giá thể G-4A, Fibrin và MSC MSC được thu nhận và chuyển trực tiếp lên 2 loại giá thể là G-A và Fibrin để tạo ra mảnh ghép mô mềm. Giá thể G-A và fibrin được tạo ra theo quy trình nghiên cứu của chúng tôi đã được thiết lập(13,17,7). Trong nghiên cứu này chúng tôi định hướng phát triển mô ghép thành mô tạo mô mở để có thể tái tạo lại các khuyết hỗng mô mềm trên lâm sàng hoặc trong phẫu thuật thẩm mỹ, do đó tế bào phát triển trên 2 loại giá thể này sẽ được nuôi trong môi trường cảm ứng tạo tế bào mỡ gồm DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml), HEPES (15 mm), NaHCO3 (14nM), Biotin (33μm), D-Panto (17 μm), Human insulin (66nM), Triiodo-L- thyronine (1nM), Humantransferrin (10μg/ml), Isobutyl-methylxanthin (0,5 mM), Hydrocortisone (100 nM) và Dexamethasone (0,1 nM)(10,12,14). Mảnh ghép được theo dõi dưới kính hiển vi đảo ngược và vào ngày thứ 21 sẽ được thu nhận và đánh giá bằng các phương pháp nhuộm mô học (H&E) và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét. Ngoài ra, tế bào cũng được nhuộm Oil Red O để đánh giá khả năng biệt hóa của MSC thành tế bào mỡ trên hai loại khung này. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 8 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập và định danh MSC từ mô mỡ Hình 1.Tiềm năng biệt hóa của MSC. (A) Tế bào bám dính, tăng trưởng trong chai cấy tạo thành lớp đơn tế bào (mẫu chứng). (B) MSC cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào xương (được nhuộm với marker alkaline phosphatase). (C) MSC cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ (được nhuộm Oil Red O). (D). MSC cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào sụn (được nhuộm với alcian blue). Kết quả cho thấy các tế bào gốc phân lập từ mô mỡ thỏa mãn tiêu chí biệt hóa theo ISCT. Hình 2. Kết quả phân tích marker dùng để định danh MSC. Các tế bào sau khi phân lập từ mô mỡ bắt đầu xuất hiện và bám dính sau hai ngày nuôi cấy trong môi trường nuôi cơ bản. Các tế bào bám dính riêng lẻ, có hình dạng thon, dài giống với hình thái của nguyên bào sợi. Những tế bào này bám dính trên đáy chai nuôi. Sau một tuần nuôi cấy, các tế bào này tăng trưởng và phát triển mạnh, tạo thành các cụm trên chai nuôi. Sau 14 B C D Alkaline phosphatase staining Oil red O staining Alcian blue staining 10X 10X 10X A 10X Mẫu chứng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 9 ngày nuôi cấy, các tế bào này đạt đến mật độ phù hợp để cấy chuyền (chiếm khoảng 75-80% diện tích bề mặt chai nuôi). Theo tiêu chí của ISCT, các MSC có tiềm năng biệt hóa được thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ in vitro. Kết quả biệt hóa MSC thành các tế bào trên được mô tả trong hình 1. Ngoài ra, MSC cũng phải biểu hiện được các marker đặc hiệu là CD73, CD90 và CD105 cũng như không biểu hiện một số marker âm tính. Kết quả được đánh giá bằng Flow Cytometry. Kết quả cho trong hình 2. Kết quả cho thấy một quần thể tế bào có kiểu hình: CD45NegCD73+CD90+CD105+thỏa mãn tiêu chuẩn của ISCT. Như vậy, với kết quả khảo sát khả năng bám dính, tiềm năng biệt hóa và sự biểu hiện các marker bề mặt cho thấy quần thể tế bào nuôi cấy chính là các tế bào gốc trung mô. Đây là nguồn tế bào gốc rất quan trọng và đầy tiềm năng cho các ứng dụng cơ bản cũng như trên lâm sàng. Tạo mảnh ghép từ sự kết hợp của MSC với các loại vật liệu sinh học Tạo mô ghép hướng đến tái tạo mô cứng từ san hô và MSC Mẫu san hô có mang các MSC sau khi biệt hóa thành nguyên bào xương được xử lý và nhuộm Giemsa, H&E cũng như quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét để đánh giá kết quả. Bên cạnh đó, chúng tôi tiến hành nhuộm khối san hô với thuốc nhuộm Fast Red violet LB salt để đánh giá khả năng MSC biệt hóa thành nguyên bào xương trên khung san hô, nếu các MSC biệt hóa được thành các nguyên bào xương thì các tế bào này sẽ phản ứng lại với thuốc nhuộm và trong bào tương xuất hiện màu hồng, do sự hoạt động của enzyme alkaline phosphatase. Đây là một trong những enzyme được sử dụng phổ biến để định danh cho các nguyên bào xương. Kết quả được mô tả trong hình 3. Tạo mô ghép hướng đến tái tạo mô mềm từ giá thể G-A, Fibrin và MSC Tạo mô ghép từ MSC và giá thể fibrin Các MSC sau khi biệt hóa thành tế bào mỡ trên giá thể fibrin được xử lý và nhuộm H&E cũng như quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét để đánh giá kết quả. Tế bào mở được xác định bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red O. Kết quả được mô tả trong hình 4: Ngoài ra mảnh ghép mô mềm cũng được đánh giá cấu trúc mô học để xem sự phát triển và phân bố của tế bào bên trong mảnh ghép cũng như khảo sát đặc tính bề mặt. Kết quả mô tả trong hình 5. Các MSC sau khi biệt hóa thành tế bào mỡ trên giá thể G-A được xử lý và nhuộm H&E cũng như quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét để đánh giá kết quả. Tế bào mở được xác định bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red O. Kết quả được mô tả trong hình 6. Như vậy, với các loại khung nâng đỡ phù hợp như G-A và Fibrin có thể sử dụng để nuôi cấy các MSC và cảm ứng phát triển trên khung để tạo ra được các mảnh ghép công nghệ theo xu hướng tạo ra các mô mềm. Đây là một trong những mảnh ghép có thể đáp ứng nhu cầu trong các phẫu thuật làm đầy các khuyết hổng mô mềm hoặc trong các phẫu thuật thẩm mỹ dùng để làm đầy mô mềm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 10 Hình 3. Đánh giá khả năng bám dính, phát triển và biệt hóa của các MSC thành nguyên bào xương trên giá thể san hô. (A). Mẫu san hô được được chụp SEM ở kích thước 200µm, không nuôi tế bào. (B) Mẫu san hô chụp SEM (100µm) có mang các MSC đã biệt hóa thành nguyên bào xương, các MSC tạo lớp và phát triển bên trong cũng như phía ngoài các hốc san hô. (C). Nhuộm H&E, tế bào phát triển phân bố bên trong khối san hô. (D). Nhuộm AP, các tế bào dương tính với thuốc nhuộm chứng tỏ biểu hiện được en zyme AP. Điều này cho thấy các MSC đã biệt hóa được thành nguyên bào xương trên giá thể san hô. A C D B Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 11 Hình 4. Kết quả nuôi cấy và cảm ứng biệt hóa MSC thành tế bào tạo mỡ trên khung fibrin. (A). Tế bào cảm ứng thành tế bào tạo mỡ in vitro, quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược (20X). (B). Tế bào được nhuộm Oil red O trực tiếp trên khung fibrin (4X). (C) và (D). Tế bào được nhuộm Oil red O lần lượt ở vật kính (20X) và (40X). Hình 5. Kết quả tạo mảnh ghép mô mềm từ MSC và khung fibrin. (A). Mẫu tế bào phát triển trong khung fibrin in vitro sau 7 ngày nuôi (20X). (B). MSC được cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ phát triển trên khung fibrin được nhuộm H&E tại ngày thứ 7 (20X), kết quả cho thấy tế bào phát triển và phân bố khá đồng đều trong khung fibrin, ngoài ra do MSC cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ nên bào tương tế bào khá rộng do tích trữ mỡ khi làm mô học để lại nhiều khoảng trống. (C). Kết quả chụp SEM đánh giá sự bám dính của tế bào trên khung fibrin. Kết quả quan sát cho thấy tế bào bám dính trên mạng lưới fibrin khá chặt. A B C A C D B Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 12 Tạo mô ghép từ MSC và giá thể fibrin Hình 6. Kết quả tạo mảnh ghép mô mềm từ MSC và khung G-A. (A). Mẫu tế bào phát triển trong khung G-A in vitro sau 7 ngày nuôi (20X). Tế bào được nhuộm Oil Red O để đánh giá sự biệt hóa của MSC thành tế bào mỡ trực tiếp trên khung G-A, kết quả cho thấy có sự hiện diện của tế bào mỡ trong khung fibrin. (B). MSC được cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ phát triển trên khung G-A được nhuộm H&E tại ngày thứ 7 (40X), kết quả cho thấy MSC cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ với bào tương tế bào tích trữ giọt mỡ khá nhiều. (C). Kết quả chụp SEM đánh giá sự bám dính của tế bào trên khung fibrin. Kết quả quan sát cho thấy tế bào bám dính trên mạng lưới G-A khá tốt. KẾT LUẬN Với quần thể tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ đã phân lập và nuôi cấy,chúng tôi đã đánh giá quần thể tế bào này là các tế bào gốc trung mô theo các tiêu chí quốc tế (ISCT). Các MSC thu từ mô mỡ có thể tiến hành nuôi cấy trên các loại giá thể khác nhau. Chúng tôi có thể tạo ra được các mảnh ghép hướng đến phát triển thành mô cứng (mô xương) cũng như mô mềm (mô mỡ). Đây là một trong những bước nghiên cứu đầu tiên trong điều kiện in vitro để nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá in vivo trên các mô hình động vật thực nghiệm. Đây là một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng phát triển của công nghệ mô trên thế giới với mục tiêu là tạo ra được các mảnh ghép công nghệ mô để ứng dụng cụ thể vào trong lĩnh vực y học tái tạo nhằm làm đầy các trường hợp khuyết hổng mô. Các nghiên cứu bước đầu cũng đạt được nhiều kết quả tích cực sẽ là động lực để nhóm nghiên cứu chúng tôi tiếp tục triển khai những nghiên cứu tiếp theo sau này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen F et al (2007), Segmental bone tissue engineering by seeding osteoblast precursor cells into titaniummesh-coral composites scaffolds, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 36: 822-827. 2. Chen F, S Chen, K Tao, X Feng, Y Liu, D Lei, T Mao.(2004). Marrow derived osteoblasts seeded into porous natural coral to prefabricate a vascularized bone graft in the shape of human mandibular ramus: experimental study in rabbits. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 42:532-537. 3. Chen F, Tianqiu M, Kai T, Shujun C, Guicong D, Xiaoming.(2002). Bone graft in the shape of Human mandibular condyle reconstruction via seeding marrow- derived osteoblast into porous coral in a nude mice model. J Oral Maxillofac Surg, 60:1155-1159. 4. Coleman SR (2006). Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plast Reconstr Surg. 118:108S-120S. 5. Gregory CA (2008), Mesenchymal stem cells: from culture to clinic, Stem Cell Repair and Regeneration, Imperial College Press, Singapore, 2: 21-45. 6. Holmes RE (1979), Bone regenaration within a coralline hydroxyapatite implant, Plastic and Reconstructive Surgery, 63:626-633. 7. Huỳnh Duy Thảo (2015), Bước đầu đánh giá hiệu quả keo dán fibrin tự thân điều trị phẫu thuật mộng thịt trong nhãn khoa, Tạp chí Y học TP.HCM, 8. Huỳnh Duy Thảo, Trần Lê Bảo Hà, Lê Thanh Hùng, Võ Quốc Vũ, Hoàng Kc Hương, Thái Trúc Quỳnh, Trần Công Toại. Nghiên cứu quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người hướng đến ứng dụng trong lĩnh vực y học. Y Học TP.HCM, 17(1): 459-466. 9. Jo A (2009). Comparison neural cell differentiation of human adipose mesenchymal stem cells derived from young and old age. Dev Repord. 13:227-237. A B C Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 13 10. Katz AJ, Mesenchymal cell culture: Adipose tissue. In: Atala A, Lanza R (2002) Method of Tissue Engineering. Academic Press San Diego. 11. Le Blanc DM, K, Mueller, I, Slaper-Cortenbach, I, Marini, F, Krause, D, Deans, R, Keating, A, Prockop, D, and Horwitz, E (2006), Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells, The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8(4):315–317 12. Locke M, John Windsor, P. Rod Dunbar (2009), Human adipose-derived stem cell: isolation, characterization and application in surgrey, ANZ Surgrey Journal, 79:235-244. 13. Nguyen Htt, Quan Minh To, Thao Duy Huynh, Toai Cong Tran, Ha Le Bao Tran (2015), gelatin-alginate sponge: a potential scaffold for adipose tissue engineering, european jour nal of biomedical and pharmaceutical sciences, 2(7): 48-53 14. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell. Science; 284:143-147. 15. Sen A et al (2001). Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogenous. J Cell biochem. 81:312-319. 16. Strem BM et al (2005). Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. The Keio journal of medicine, 54:132-141. 17. Thái Trúc Quỳnh, Huỳnh Duy Thảo, Võ Quốc Vũ, Nguyễn Khánh Hòa, Lưu Thị Thu Thảo, Đặng Trần Quân, Trần Công Toại. Nghiên cứu quy trình tạo keo dán từ huyết tương người. Tạp chí Y Học Việt Nam. 2014. 18. Tran Cong Toai, Huynh Duy Thao, Nguyen Phuong Thao, Ciro Gargiulo and Phan Kim Ngoc, et al (2010). In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood. Cell and Tissue Banking. 11:269-280. 19. Tran CT, Ciro Gargiulo, Huynh Duy Thao, Huynh Minh Tuan, Luis Filgueira and D. Michael Strong (2011). Culture and differentiation of osteoblasts on coral scafford from human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell and Tissue Banking. 12:247-261. 20. Trần Giao Hòa, Đỗ Thu Hằng.(2002). Bước đầu đánh giá kết quả lâm sàng việc sử dụng chế phẩm san hô Việt Nam để điều trị sang thương trong xương. Tuyển tập cong trình nghiên cứu khoa học Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP.HCM, 131- 138. 21. Wolter TP, Von Heimburg D, Stoffels I et al (2005). Cryopreservation of mature human adipocytes: In vitro measurement of viability. Ann Plast Surg. 55:408-413. 22. Zaffe D (2005). Some considerations on biomaterials and bone. Micron, 36:583–592. 23. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P. et al (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells, Molecular Biological Cell, 13:4279-4295. Ngày nhận bài báo: 03/08/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/08/2016 Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016