Biểu hiện và tinh sạch amidase aliphatic từ rhodococcus erythropolis PR4

Nguyễn Hà Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 184(08): 35 - 40 35 BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH AMIDASE ALIPHATIC TỪ Rhodococcus erythropolis PR4 Nguyễn Hà Thu1*, Nguyễn Xuân Vũ1, Phạm Bằng Phương1,2 1Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 2Viện Khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Để phục vụ mục đích nghiên cứu mức độ biểu hiện trong vi khuẩn E. coli BL21 DE3 của gen mã hóa amidase khuếch đại từ DNA hệ gen của vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, chúng tôi đã tiến hành biểu hiện và tinh sạch amidase tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli chủng BL21 DE3. Protein - enzyme amidase ở vi khuẩn này được mã hóa nhờ đoạn gen có kích thước 1038 bp đã được giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111. Sau khi thiết kế mồi và khuếch đại thành công đoạn gen, chúng tôi tiến hành tách dòng trên E. coli DH5α và biểu hiện trên E. coli BL21 DE3 thông qua 2 loại vector tương ứng là pGEM-T và pET28a. Enzyme amidase có kích thước xấp xỉ 38 kDa được biểu hiện tối ưu ở điều kiện nuôi cấy 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 1 mM trong thời gian 4 h. Sử dụng cột sắc ký trao đổi ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD) và cột superdexTM 200 10/300 (GE Healthcare), chúng tôi đã tinh sạch được amidase tái tổ hợp từ dịch chiết tế bào. Từ khóa: Amidase; Escherichia coli; Acrylamide; Enzyme tái tổ hợp; Vector biểu hiện MỞ ĐẦU* Amidase (EC 3.5.1.4) được tìm thấy bởi Mohamed S. và cộng sự vào năm 1994, có kích thước xấp xỉ 44,5 kDa (xác định bằng SDS-PAGE) và điểm đẳng điện được ước tính là pH 4.0. Trình tự aa N-terminal của enzyme này được công bố như sau: M R H G D I T S S P D T V G V A V [7]. Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá trình thủy phân amit giải phóng các axit và amoniac tương ứng [6]. Enzyme này có thể được phân thành hai loại theo đặc tính bề mặt của chúng [2], loại thứ nhất bao gồm các amidase chỉ làm thuỷ phân các amit mạch ngắn, loại thứ hai là các amidase thủy phân chuỗi amit mạch trung bình, acrylamide và heterocyclicamide như isobutyramide và valeroamide [3]. Đến nay, đã có hơn 26 loại amidase có nguồn gốc từ vi khuẩn được sàng lọc và xác định [5]. Hầu hết trong đó, amidase tồn tại ở loại thứ hai. Amidase được ghi nhận là có mặt thường xuyên ở chi Rhodococcus. Theo nghiên cứu gần đây của Z. Xue và cs (2011) [6], amidase tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn * Tel:01643 326153, Email: thunguyenty43@gmail.com Rhodococcus erythropolis, một loài vi khuẩn đặc trưng thuộc nhóm Actinobacteria có khả năng biểu hiện đầy đủ hoạt tính của amidase đặc biệt là khả năng tổng hợp chọn lọc bất đối xứng hiệu quả với một phổ rộng các amit (nổi bật là một số chất gây độc cho tế bào như acetamide, propionamide, acrylamide, và benzamide). Đồng thời trong vi khuẩn này, gen mã hóa amidase có kích thước 1038 bp đã được giải trình tự một cách đầy đủ và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111 từ nucleotide số 543918 đến nucleotide 544955 [7]. Amidase là loại enzyme thương mại có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, cụ thể là trong các quy trình liên quan đến quản lý và xử lý chất thải có chứa acrylamide, mặt khác sau khi thủy phân, amidase tạo ra một số axit cacboxylic và dẫn xuất amit có nhiều ý nghĩa quan trọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp dược phẩm [4]. Do có nhiều tiềm năng quan trọng trong các ngành công nghiệp, amidase đã được đầu tư nghiên cứu rộng rãi ngay từ khi được phát hiện. Nhưng khi nhu cầu ứng dụng trong công nghiệp ngày càng tăng cao thì cần có nhiều Nguyễn Hà Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 184(08): 35 - 40 36 nghiên cứu tập trung và triệt để nhằm nâng cao năng suất và hoạt tính amidase thông qua khuếch đại gen và biểu hiện amidase tái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khuếch đại đoạn gen mã hóa amidase bằng kỹ thuật PCR từ chủng vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, chọn dòng bằng vector pGEM T-easy, biểu hiện qua vector pET28a trong vi khuẩn E.coli và tinh sạch nhờ vào hệ thống sắc ký ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD). VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu: - Mồi: Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen amidase aliphatic (amiE). Trình tự mồi được thiết kế dựa vào trình tự gen amiE của Rhodococcus erythropolis PR4 đã công bố trên ngân hàng gen (Genbank) với với số hiệu ACNO01000111 từ nucleotide số 543918 đến nucleotide 544955, được đặt mua từ công ty Genotech. Hai mồi mỗi đoạn dài 27 bp được thiết kế như sau: Mồi xuôi amiE-F (EcoRI): GAATTC ATG CGA CAC GGT GAC ATC TCC. Mồi ngược amiE-R (SalI): GTCGAC TTA AAC TTC GAT TGT CTT CTC. - Chủng giống Vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4 được phân lập từ nước biển Thái Bình Dương do trung tâm NITE Biological esource Nhật Bản cung cấp. Vi khuẩn E. coli DH5α, JM109 dùng cho tách dòng và E. coli BL21 DE3 PlysS dùng cho biểu hiện do Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên cung cấp. Vector tách dòng pGEM-T easy thương mại được cung cấp bởi Promega; vector biểu hiện pET28a thương mại được cung cấp bởi Novagen. Phương pháp - Khuếch đại và tinh sạch gen Sử dụng bộ kit DNA purification của Promega tách chiết DNA hệ gen của Rhodococcus erythropolis PR4. Khuếch đại gen amiE từ hệ gen của Rhodococcus erythropolis PR4 theo quy trình ExTaq DNA polymerase của Takara Biotech Co. Ltd., Dalian, Trung Quốc. Sản phẩm PCR được tinh sạch qua bộ kit QAEX II gel extraction (Qiagen). - Tách dòng và biểu hiện Gắn nối đoạn gen đã được tinh sạch vào vector tách dòng pGEM T-easy vector nhờ enzyme T4 ligase (ủ trong 22oC trong 1 h). Sản phẩm gắn nối được biến nạp vào E.coli DH5α (JM109) và được cấy trải trên đĩa thạch LB-Amp qua đêm (hoặc trong 16 h). Nuôi lỏng khuẩn lạc và tách chiết plasmid từ dịch nuôi (16 h hoặc qua đêm) bởi bộ kit FavorPrepTM Plasmid extraction mini kit (Favorgen). Sử dụng enzyme giới hạn EcoRI và SalI cắt đoạn gen đã được tách dòng thành công trên vector pGEM T-easy, gắn nối vào vector biểu hiện pET28a và biến nạp vào E.coli BL21 DE3PlysS. Cảm ứng biểu hiện gen trong vi khuẩn E. coli bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi khuẩn isopropyl-β- galactopyranoside (IPTG) với nồng độ 1 mM. - Tinh sạch enzyme amidase tái tổ hợp Chọn dòng vi khuẩn đã biểu hiện thành công gen amiE. Bổ sung 1 mM (IPTG) khi nồng độ OD600 của môi trường nuôi đạt ~ 0,6 nuôi 37 o C trong 4 h để kích hoạt vùng operon của đoạn gen. Sau đó, li tâm dịch khuẩn ở 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào. Phân giải tế bào với Tris buffer (50 mM TrisHCl, 50 mM NaCl, pH 8,0). Sản phẩm sau khi phân giải được thu lại bằng đặt vào màng lọc đường kính 0,22 m và ly tâm 14000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4C. Cho phần dịch chảy qua cột sắc ký trao đổi ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD) với đệm đẩy Tris. Sau đó, sản phẩm sẽ được rửa giải bằng dung dịch đệm với các gradient nồng độ muối NaCl tăng dần hoặc với gradient pH (nhờ sự bổ sung axit lactic pH 4,5). Amidase tiếp tục được tinh sạch bằng cách đưa vào cột superdexTM 200 10/300 (GE Healthcare). Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, sản phẩm đều được kiểm tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật Nguyễn Hà Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 184(08): 35 - 40 37 điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% [1]. Tất cả các bước đều được thực hiện ở 4°C để bảo vệ hoạt tính của enzyme. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách dòng và biểu hiện PR4 amidase - Tách chiết DNA hệ gen của Rhodococcus erythropolis PR4 Rhodococcus erythropolis PR4 được nuôi trong môi trường NBRC 702. Ly tâm dịch nuôi ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu cặn tế bào. Sau đó, tách chiết DNA hệ gen bằng bộ kit do Promega cung cấp. Hình 1. Tách chiết DNA hệ gen của Rhodococcus erythropolis PR4. Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng PR4: DNA hệ gen của Rhodococcus erythropolis PR4 Sau khi tách chiết DNA hệ gen, sản phẩm được kiểm tra bằng cách điện di qua gel agarose 1%. Kết quả điện di thể hiện trên hình 1 cho thấy, DNA hệ gen không bị đứt gãy, đủ điều kiện để sử dụng cho các nghiên cứu về khuếch đại gen. - Khuếch đại gen mã hóa amidase Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi amiE-F và amiE-R để khuếch đại đoạn gen mã hóa amidase ở vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4. Kết quả điện di trên gel agarose 0,8% cho thấy, sản phẩm PCR thu được bằng điện di có kích thước như tính toán lý thuyết khoảng 1 kb (hình 2a). Do có kết quả này phù hợp với kích thước đoạn gen do ngân hàng gen công bố nên sau khi được khuếch đại thành công, đoạn gen được tiến hành tinh sạch và điện di kiểm tra độ tinh sạch (hình 2b). a b Hình 2. Khuếch đại đoạn gen amiE. a. Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng PR4: Sản phẩm PCR khuếch đại amiE. b. Giếng PR4(1,2): Sản phẩm PCR khuếch đại amiE đã tinh sạch - Kết quả tách dòng trên vector pGEM T- easy vector Sản phẩm PCR đã tinh sạch được gắn nối vào vector tách dòng pGEM T-easy (3000 bp) ở 25 o C trong 1 h. Sản phẩm gắn nối được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và cấy trải trên môi trường LB có bổ sung ampicillin, IPTG và X-gal. Hình 3. Kết quả tách chiết plasmid. Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng 1: Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh; giếng 2-8: Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng Sau khi nuôi qua đêm ở 37oC, thu được 23 khuẩn lạc xanh (KLX - gắn nối không thành công) và 88 khuẩn lạc trắng (KLT - gắn nối thành công). Chọn các dòng khuẩn lạc trắng và xanh (đối chứng) nuôi tăng sinh trong LB lỏng để tách chiết plasmid và kiểm tra kích thước vector (hình 3). 4361 bp 2322 bp 2322 bp 2027 bp 564 bp Nguyễn Hà Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 184(08): 35 - 40 38 Hình 4. Sản phẩm cắt các dòng có khả năng mang gen amiE với EcoRI và SalI. Giếng M: Lambda HindIII marker. Giếng 1: Plasmid tách chiết từ KLX; giếng 2, 3: Plasmid tách chiết từ KLT số 1 và 2 được cắt bởi EcoRI và SalI; giếng 4: Sản phẩm PCR khuếch đại amiE đã tinh sạch Những dòng khuẩn lạc cho plasmid có kích thước lớn hơn so với đối chứng tiếp tục được chọn lọc bằng enzyme giới hạn EcoRI và SalI. Kết quả được thể hiện ở hình 4 cho thấy, các dòng khuẩn lạc số 1 và 2 đều cho 2 băng ứng với kích thước lý thuyết lần lượt xấp xỉ là 3000 bp của pGEM T-easy và 1000 bp của amiE. Như vậy đã tách dòng thành công đoạn gen amiE. Hình 5. Đoạn gen amiE thu được sau khi thôi gel và tinh sạch từ vector tách dòng pGEM-amiE. Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng 1 - 4: Đoạn gen amiE thu được từ vector pGEM-amiE Bằng phương pháp thôi gel tinh sạch, thu được đoạn gen amiE (~1000 bp) từ vector tách dòng pGEM-amiE (hình 5 - giếng 1, 2, 3) đủ điều kiện để gắn nối vào vector biểu hiện. - Gắn nối vào vector biểu hiện pET28a Gắn nối đoạn gen amiE vào vector biểu hiện pET28a (5369 bp) ở 16oC trong 16 h (hình 6). Sản phẩm gắn nối được kiểm tra bằng phương pháp điện di so sánh với các đoạn gen đã tách dòng thành công và vector pET28 đã cắt mở vòng bởi EcoRI và SalI. Kết quả hình 6 cho thấy, tất cả các sản phẩm gắn nối (5-8) đều có băng ở kích thước trên 6500 bp (kích thước dự kiến khi gắn nối thành công gen vào vector là 6407 bp). Hình 6. Gắn nối amiE vào pET28a. Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng 1,2: Đoạn gen amiE thu được từ vector pGEM-amiE T-easy; giếng 3, 4: pET28 được cắt mở vòng bởi EcoRI và SalI; giếng 5-8: Sản phẩm gắn nối vào vector pET28a Sản phẩm nghi gắn nối thành công được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli XL1 blue và cấy trải trên đĩa thạch nuôi ở 37oC qua đêm. Các dòng khuẩn lạc được chọn lọc ngẫu nhiên nuôi tăng sinh trong môi trường LB ở 37oC qua đêm, tách chiết plasmid để sàng lọc các dòng mang đoạn gen mong muốn. Kết quả sàng lọc cho thấy, giếng 2, 3, 4 đều cho băng cao hơn so với đối chứng là vector pET28a không gắn gen (hình 7), do đó các plasmid này tiếp tục được kiểm tra sự có mặt của đoạn gen bằng enzyme giới hạn EcoRI và SalI. Hình 7. Plasmid được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc có khả năng mang gen amiE; giếng M: Lambda HindIII marker; giếng 1: pET28a; giếng 2, 3, 4: Plasmid nghi ngờ mang gen amiE 6557 bp 2027 bp 2027 bp 6557 bp 4361 bp 2322 bp 2027 bp 6557 bp Nguyễn Hà Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 184(08): 35 - 40 39 Hình 8 cho thấy, sau khi cắt kiểm tra với 2 enzyme giới hạn, các plasmid nghi ngờ mang gen đều cho 2 băng ở đúng với kích thước lý thuyết tương ứng với 5369 bp của pET28a và 1038 bp của gen amiE. Như vậy, đã gắn nối thành công đoạn gen PR4 amidase vào đúng vị trí trên vector pET28a. Hình 8. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen ở các plasmid có khả năng mang gen. Giếng M: Lambda HindIII marker. Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại amiE đã tinh sạch; giếng 2, 3, 4: Plasmid nghi ngờ mang gen được cắt với EcoRI và SalI; giếng 5: pET28a; giếng 6: pET28a cắt mở vòng với EcoRI và SalI - Biểu hiện amiE trên E.coli BL21 DE3 Chuyển vector biểu hiện pET28-amiE vào tế bào khả biến E.coli BL21 DE3PlysS cấy trải trên đĩa thạch LB nuôi ở 37oC qua đêm và cảm ứng biểu hiện gen bằng việc bổ sung IPTG nồng độ 1 mM nuôi trong 4 h. Qua kết quả điện di SDS-PAGE (hình 9) cho thấy, phân đoạn protein thu được ở điều kiện thích hợp có kích thước khoảng 38 kDa, phân đoạn này không xuất hiện ở mẫu đối chứng không cảm ứng bằng IPTG. Hình 9. Cảm ứng biểu hiện amiE trong tế bào E.coli BL21 DE3. Giếng M: Protein marker low range M3913 Sigma; giếng 1: Đối chứng dương - PR4amiE E.coli BL21 DE3 không bổ sung IPTG; giếng 2-9: Cảm ứng biểu hiện amiE ở E.coli BL21 DE3 bằng IPTG Tinh sạch amidase aliphatic PR4 Hình 10. Protein amidase đã tinh sạch bằng hệ thống sắc ký ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD). Giếng M: Protein marker low range M3913 Sigma; giếng 1: Amidase chưa tinh sạch; giếng 2: Đối chứng dương; giếng 3,4: Amidase đã tinh sạch Amidase sau khi được tinh sạch qua cột sắc ký ion Macro-Prep High Q (BIO-RAD) và kiểm tra bằng SDS-PAGE cho kết quả ở giếng số 3 và 4, một băng duy nhất đúng kích thước xấp xỉ 38 kDa của enzyme (hình 10). KẾT LUẬN Chúng tôi đã thiết kế và khuếch đại thành công đoạn gen amiE từ chủng Rhodococcus erythropolis PR4. Đoạn gen amiE đã được biểu hiện thành công qua vector pET28a trong E.coli và thu nhận được protein amidase tái tổ hợp có độ tinh sạch cao với kích thước tương ứng xấp xỉ 38 kDa. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hames B. D. (1998), Gel electrophoresis of protein – practical approach, School of Biochemistry and Molecular Biology University of Leed LS2 9JT, UK. 2. Fournand D., Arnaud A. (2001), “Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl transfer activity”, J. Appl. Microbiol., 91, pp. 381–393. 3. Ryabchenko L. E., Podchernyaev D. A., Kotlova E. K. and Yanenko A. S. (2006), “Cloning the Amidase Gene from Rhodococcus rhodochrous M8 and Its Expression in Escherichia coli”, Russian Journal of Genetics, Vol. 42, No. 8, pp. 886–892. 2027 bp 6557 bp 45 kDa 36 kDa 38 kDa 38 kDa 36 kDa 45 kDa Nguyễn Hà Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 184(08): 35 - 40 40 4. Mohamed S. Nawaz, Ashraf A. Khan, John E. Seng, Julian E. Leakey, Paul H. Siitonen and Carl E. Cerniglial (1994), “Purification and Characterization of an Amidase from an Acrylamide-Degrading Rhodococcus sp.”, Appl. Environ Microbiol., 60, pp. 3343–3348. 5. Park H. J., Uhm K. N., Kim H. K. (2008), “R- stereoselective amidase from R. erythropolis no. 7 acting on 4-chloro-3-hydro-xybutyramide”, J. Microbiol Biotechnol, 18, pp. 552–559. 6. Zhiquan Xue, Yapeng Chao, Dexian Wang, Meixiang Wang, Shijun Qian (2011), “Over expression of a recombinant amidase in a complex auto-inducing culture: purification, biochemical characterization, and regio- and stereoselectivity”, J. Ind. Microbiol Biotechnol, 38, pp. 1931–1938. 7. Hynek Strnad, Miroslav Patek, Jan Fousek, Juraj Szokol, Pavel Ulbrich, Jan Nesvera, Vaclav Paces, Cestmir Vlceka (2018), Genome Sequence of Rhodococcus erythropolis Strain CCM2595, a Phenol Derivative-Degrading Bacterium, truy cập tại trang genomea.asm.org, truy cập ngày 10/01/2018. SUMMARY PLAN FOR EXPRESSION AND PURIFICATION ALIPHATIC AMIDASE FROM Rhodococcus erythropolis PR4 Nguyen Ha Thu 1* , Nguyen Xuan Vu 1 , Pham Bang Phuong 1,2 1University of Agriculture and Forestry – TNU 2Institute of Life Sciences – TNU In order to investigate the expression level in E. coli BL21 DE3 of gene encoding amidase amplified from Rhodococcus erythropolis PR4 DNA genome, we expressed and purified recombinant amidase from E. coli BL21 DE3. 1038 bp amidase – encoding sequence was published on Gene bank with its accession being ACNO01000111. After designing primer and amplifying successfully gene, we cloned in E. coli DH5α and expressed in E.coli BL21 DE3 based on using pGEM-T và pET28a vectors. Having a mass of approximately 38 kDa, amidase was expressed optimally in E. coli using 1 mM IPTG as an inducer, at 37 o C, for 4 h. We were successful in purification of recombinant enzyme amidase using Macro-Prep High Q (BIO-RAD) and superdexTM 200 10/300 (GE Healthcare) columns. Keywords: Amidase; Escherichia coli; Acrylamide; Recombinant enzyme; Expression vector Ngày nhận bài: 08/5/2018; Ngày phản biện: 05/6/2018; Ngày duyệt đăng: 31/7/2018 * Tel: 01643 326153, Email: thunguyenty43@gmail.com