Biểu hiện của Gen Nox4 trên tế bào dây chằng nha chu người dưới tác động của hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas Gingivalis

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 1 BIỂU HIỆN CỦA GEN NOX4 TRÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA HỢP CHẤT DUNG GIẢI TẾ BÀO PORPHYROMONAS GINGIVALIS Nguyễn Thu Thuỷ*, Sujiwan Seubbuk**, Rudee Surarit** TÓM TẮT Mở đầu: Porphyromonas gingivalis là vi khuẩn thường được xem là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với viêm nha chu. Gen NOX4 liên quan đến sự sản xuất gốc oxy tự do (ROS) trên tế bào người. Mục tiêu: Đánh giá biểu hiện gen NOX4 trên tế bào dây chằng nha chu người dưới tác động của hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Tế bào dây chằng nha chu người (TBDCNCN) của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM). Sau đó tế bào được cấy vào giếng chứa các nồng độ hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis 20 μM và 50 μM. Thu lại dung dịch tế bào sau 2 giờ và 24 giờ để thực hiện real-time PCR đánh giá biểu hiện gen NOX4. Kết quả: Biểu hiện của NOX4 tăng lên theo thời gian tiếp xúc với P. gingivalis dù ở nồng độ thấp, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Với nồng độ cao hơn, biểu hiện của gen được duy trì ổn định theo thời gian, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở thời điểm sau hai giờ so với thời điểm sau 24 giờ (p>0,05). Kết luận: Dưới tác dụng của hợp chất dung giải tế bào P. gingivalis, biểu hiện gen NOX4 trên tế bào dây chằng nha chu người tăng lên, tác động này thay đổi theo thời gian và phụ thuộc vào nồng độ P. gingivalis. Từ khoá: NOX4, stress oxy hóa, Porphyromonas gingivalis, tế bào dây chằng nha chu người. ABSTRACT EXPRESSION OF NOX4 IN HUMAN PERIODONTAL LIGAMENT CELLS UNDER EFFECT OF PORPHYROMONAS GINGIVALIS LYSATE Nguyen Thu Thuy, Sujiwan Seubbuk, Rudee Surarit * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 2- 2018: 1 - 4 Background: Porphyromonas gingivalis is an important etiologic factor of periodontal diseases. NOX4 gene is related to the production of reative oxygen species (ROS). Objectives: The aim of this study was to investigate the expression of NOX4 in human periodontal ligament cells under the effect of Porphyromonas gingivalis lysate. Materials and methods: Primary human periodontal ligament cells (HPDLF) was cultured in growth media under P. gingivalis lysate treatment in different concentrations for 2 and 24 hours. Following incubation, the expression of NOX4 was evaluated by using Real-time PCR. Results: The expression of NOX4 increased with time of exposure to P. gingivalis, even at low concentrations significantly (p<0.05). At higher concentration, the expression of the gene was stable over time, the difference was not statistically significant between after two hours and after 24 hours (p>0.05). *Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Bộ môn Sinh học miệng, Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Thu Thuỷ ĐT: 01208505265 Email: ngthuthuy20@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 2 Conclusion: Under the effect of P. gingivalis lysate, NOX4 gene expression in HPDLF was increased, which depended on time and P. gingivalis lysate concentration. Key words: NOX4, oxidative stress, Porphyromonas gingivalis, human periodontal ligament cells. MỞ ĐẦU Bệnh nha chu ảnh hưởng đến 10-15% dân số thế giới và là một trong những lý do hàng đầu gây mất răng(1). Viêm nha chu về cơ bản là một bệnh viêm, bắt đầu bằng màng sinh học dưới nướu và thay đổi do phản ứng viêm/miễn dịch cá nhân bất thường(4). Các bạch cầu đa nhân (BCĐN) là những tế bào viêm nguyên phát trong nướu và mô nha chu(11,12). Trong viêm nha chu, BCĐN tự nhiên có khả năng sản xuất các gốc oxy tự do (ROS) được cho là kích hoạt chức năng và do đó làm tăng sản xuất ROS(5). Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các bệnh nha chu mạn tính có liên quan với bạch cầu trung tính phóng thích với sản xuất ROS gia tăng để đáp ứng kích thích thụ thể Fc-gamma(2,7,3,9,10). Porphyromonas gingivalis là vi khuẩn thường được xem là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với viêm nha chu(11). Nghiên cứu này nhằm đánh giá biểu hiện gen NOX4 liên quan đến sự sản xuất ROS trên tế bào dây chằng nha chu người dưới tác động của hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis ở các nồng độ khác nhau. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Tế bào dây chằng nha chu người (TBDCNCN) của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết thanh phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1% kháng sinh. Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy tế bào TBDCNCN của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết thanh phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1% kháng sinh. Cấy chuyển khi mật độ tế bào dày đặc, các tế bào kết dính với nhau. Chuẩn bị TBDCNCN được gieo vào bảng mẫu siêu nhỏ 96 giếng với mật độ 3x103 tế bào/giếng. Các bảng mẫu sau đó được ủ ấm trong máy ủ CO2 (37o C, 5% CO2, độ ẩm 100%) trong 24 giờ để đạt 80% mức bão hoà, sau đó đổi môi trường nuôi cấy sang DMEM không có huyết thanh chứa các nồng độ hợp chất dung giải tế bào Porphyromonas gingivalis 20 µM và 50 µM. H2O2 50 µM dùng làm nhóm chứng dương và môi trường nuôi cấy không huyết thanh dùng làm nhóm chứng âm. Thu lại dung dịch tế bào sau 2 giờ và 24 giờ để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA RNA tổng số được tách chiết bằng Trizol (Invitrogen, Hoa Kỳ) và bộ tách chiết RNA (PureLink RNA Mini Kit, Invitrogen, Hoa Kỳ), với sự loại bỏ DNA bằng DNaseI (On-column PureLink DNase, Invitrogen, Hoa Kỳ). Các mẫu RNA được kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ (Biotek, Hoa Kỳ) trước khi 1 µg RNA tổng được dùng để tổng hợp cDNA bằng bộ tổng hợp cDNA (Invitrogen, Hoa Kỳ). Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Real-time PCR định lượng và phân tích kết quả Tổng thể tích của mỗi phản ứng Real-time PCR định lượng là 22 µl, bao gồm SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn cDNA và một cặp primer thiết kế đặc hiệu cho NOX4. Các phản ứng (lặp lại 3 mẫu cho mỗi thiết kế thí nghiệm) được thực hiện bằng máy Realplex Eppendorf (Đức). Chu trình chạy phản ứng bao gồm 2 phút ở 50°C, 15 phút ở 95°C tiếp theo là 40 chu kỳ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 3 của 90°C (15 giây) và 60°C (1 phút). Để kiểm tra số sản phẩm được khuếch đại ở mỗi phản ứng, phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) được thực hiện bằng cách giữ ở nhiệt độ 95°C trong 15 giây trước khi gia tăng nhiệt đều từ 60°C lên 95°C. Số lượng cDNA cụ thể đã được chuẩn hóa với gen housekeeping 18S và biểu hiện cDNA được tính như biểu hiện tương đối của sự kiểm soát tương ứng. Biểu hiện NOX4 được chuẩn hóa theo biểu hiện gen β-actin. Xử lý thống kê Số liệu được nhập và phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0. Mức ý nghĩa thống kê p ≤ 0,05 và phân tích thống kê bằng test one-way ANOVA và post-hoc test. KẾT QUẢ Bảng 1. Biểu hiện NOX4 sau 2 giờ Dung dịch Tỉ lệ NOX4/ β-actin P 20 μM P. gingivalis 0,15 ± 0,09 p<0,05 1, p>0,05 2 50 μM P. gingivalis 2,11 ± 0,98 p<0,05 1,2 Chứng dương 2,59 ± 0,79 p<0,05 1,2 Chứng âm 0,38 ± 0,11 p<0,05 1 1So sánh giữa các nhóm, test one-way ANOVA 2So sánh với nhóm chứng âm, post-hoc test Bảng 2. Biểu hiện NOX4 sau 24 giờ Dung dịch Tỉ lệ NOX4/ β-actin P 20 μM P. gingivalis 1,73 ± 0,65 p<0,05 1,2 50 μM P. gingivalis 2,87 ± 0,89 p<0,05 1,2 Chứng dương 2,69 ± 0,97 p<0,05 1,2 Chứng âm 0,23 ± 0,15 p<0,05 1 1So sánh giữa các nhóm, test one-way ANOVA 2So sánh với nhóm chứng âm, post-hoc test BÀN LUẬN Nghiên cứu này có cùng kết quả với nghiên cứu của Golz và cộng sự, trong đó tìm thấy biểu hiện NOX4 tăng lên ở TNDCNCN dưới tác dụng kích thích của P. gingivalis(5). Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy ảnh hưởng tác động qua lại giữa NOX4 và hệ thống oxy hóa - kháng oxy hóa trong cơ thể giữ vai trò quan trọng trong việc tạo thành và hủy đi tác dụng của ROS, tác nhân giữ vai trò quan trọng trong cơ chế gây bệnh của các bệnh răng miệng, đặc biệt là bệnh nha chu(10,2). Nghiên cứu này cho thấy biểu hiện của NOX4 tăng lên theo thời gian tiếp xúc với P. gingivalis dù ở nồng độ thấp, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Với nồng độ cao hơn, biểu hiện của gen được duy trì ổn định theo thời gian, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở thời điểm sau hai giờ so với thời điểm sau 24 giờ (p<0,05). Kết quả này phù hợp với nhận định về vai trò của P. gingivalis trong bệnh sinh bệnh nha chu theo Hajishengallis và cộng sự: P. gingivalis là tác nhân chủ yếu trong bệnh sinh và tiến triển viêm của bệnh nha chu(6). Để có thể hiểu rõ hơn về vai trò của ROS và tác động qua lại giữa các tác nhân oxy hóa - kháng oxy hóa trong bệnh sinh bệnh nha chu, cần nhiều nghiên cứu về các gen liên quan và các kỹ thuật nghiên cứu phối hợp trong tương lai. KẾT LUẬN Dưới tác dụng của hợp chất dung giải tế bào P. gingivalis, biểu hiện gen NOX4 trên tế bào dây chằng nha chu người tăng lên, tác động này thay đổi theo thời gian và phụ thuộc vào nồng độ P. gingivalis. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Akalin FA, Işiksal E, Baltacioğlu E, Renda N, Karabulut E (2008). Superoxide dismutase activity in gingiva in type-2 diabetes mellitus patients with chronic periodontitis. Arch Oral Biol, 53: 44-52. 2. Battino M, Bullon P, Wilson M, Newman H (1999). Oxidative injury and inflammatory periodontal diseases: the challenge of anti-oxidants to free radicals and reactive oxygen species. Crit Rev Oral Biol Med, 10: 458-476. 3. Chapple ILC, Brock GR, Milward MR, Ling N, Matthews JB (2007). Compromised GCF total antioxidant capacity in periodontitis: cause or effect? J Clin Periodontol, 34: 103-110. 4. Duarte PM, Napimoga MH, Fagnani EC (2012). The expression of antioxidant enzymes in the gingivae of type 2 diabetics with chronic periodontitis. Arch Oral Biol, 57: 161- 168. 5. Gölz L, Memmert S, Rath-Deschner B, Jäger A, Appel T, Baumgarten G, Götz W, Frede S (2014). LPS from P. gingivalis and hypoxia increases oxidative stress in periodontal ligament fibroblasts and contributes to periodontitis. Mediators Inflamm, 2014:986264. 6. Hajishengallis G, Darveau RP, Curtis MA (2012). The keystone-pathogen hypothesis. Nat Rev Microbiol, 10:717-725. 7. Halliwell B (1999). Antioxidant defense mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning). Free Radic Res, 31: 261- 272. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 4 8. How KY, Song KP, Chan KG (2016). Porphyromonas gingivalis: An overview of periodontopathic pathogen below the gum line. Frontiers in Microbiology, 7: 53. 9. Kim SC, Kim OS, Kim OJ, Kim YJ, Chung HJ (2010). Antioxidant profile of whole saliva after scaling and root planing in periodontal disease. J Periodontal Implant Sci, 40: 164-171. 10. Li S, Tabar SS, Malec V, Eul BG, Klepetko W, Weissmann N, Grimminger F, Seeger W, Rose F, Hänze J (2008). NOX4 regulates ROS levels under normoxic and hypoxic conditions, triggers proliferation, and inhibits apoptosis in pulmonary artery adventitial fibroblasts. Antioxid Redox Signal, 10: 1687- 1698. 11. Surdacka A, Ciężka E, Pioruńska-Stolzmann M (2011). Relation of salivary antioxidant status and cytokine levels to clinical parameters of oral health in pregnant women with diabetes. Arch Oral Biol, 56: 428-436. 12. Trivedi S, Lal N, Mahdi AA, Mittal M, Singh B, Pandey S (2014). Evaluation of antioxidant enzymes activity and malondialdehyde levels in patients with chronic periodontitis and diabetes mellitus. J Periodontol, 85: 713-720. Ngày nhận bài báo: 28/01/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25/02/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018