Bảo tồn và nhân giống một số loại lan rừng quý hiếm của tỉnh Gia Lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 15 S Ố 0 6 N Ă M 2 0 19 1. Đặt vấn đề Lan rừng ở Gia Lai rất phong phú và nhiều chủng loại. Trong đó Hoàng thảo (Dendrobium) là chi phổ biến và có giá trị về nhiều mặt. Tam bảo sắc, Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch là ba loài lan rừng đẹp và quý hiếm thuộc chi Dendrobium, nằm trong Sách đỏ Việt Nam. Ngày nay, do nạn phá rừng và khai thác quá mức, ba loại lan này đang mất dần trong tự nhiên. Vì thế nếu không có những biện pháp bảo vệ và nhân giống kịp thời, những loài lan này có nguy cơ tuyệt chủng. Hạt của hoa lan nói chung và của ba loại lan này nói riêng không có nội nhũ nên chỉ có thể nảy mầm nếu có nấm cộng sinh thích hợp nên việc nhân giống trong tự nhiên hết sức khó khăn, nhân giống bằng keiky là phương pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay để nhân giống các loại lan rừng nhưng hệ số nhân thấp. Nuôi cấy mô tế bào thực vật từ lâu đã được lựa chọn là phương pháp hàng đầu để nhân giống các loại cây quý hiếm, khó nhân giống ngoài tự nhiên nhưng vẫn cho số lượng cây giống lớn trong thời gian ngắn và giữ nguyên được những đặc tính quý của các cây bố mẹ. Việc nhân giống thành công các loại lan rừng quý hiếm bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ góp phần bảo tồn các loại lan rừng quý hiếm, đáp ứng nhu cầu thị trường đồng thời giảm áp lực khai thác quá mức các loại lan này trong tự nhiên. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu Các chồi lan rừng được thu hái tại Vườn quốc gia Kon Ka Kinh (huyện Mang Yang, tỉnh Bảo tồn và nhân giống một số loại lan rừng quý hiếm của tỉnh Gia Lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật KS.TRẦN THỊ THÚY, KS.NGÔ LÊ HỒNG DUYÊN Trung tâm Ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Gia Lai Gia Lai). Các cụm lan được lựa chọn làm vật liệu ban đầu phải chứa nhiều chồi (giả hành), các chồi khỏe mạnh, lá dày, không có dấu hiệu sâu bệnh. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và thể chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc: các chồi lan được rửa sạch dưới vòi nước chảy, tách bỏ lá và vảy, sau đó rửa lại với xà phòng loãng trong khoảng 5-10 phút để loại bỏ các chất bẩn bám trên bề mặt. Cắt thành các đoạn có chứa mắt ngủ dài từ 1,5-2cm và đưa vào tủ cấy vô trùng. Tiếp theo các mẫu cấy được khử trùng bằng cồn (ethanol) 70o trong 60 giây, rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng. Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện vô mẫu sử dụng NaOCl 5% để tiếp tục khử trùng ở các thời gian 10, 15 và 20 phút hoặc HgCl2 0,1% ở 5, 7 và 10 phút. Tráng lại mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng. Các mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nuôi cấy khởi đầu để đánh giá hiệu quả khử trùng. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại 5 mẫu/loài/công thức. Các chỉ tiêu theo dõi: (số mẫu sạch) Tỷ lệ mẫu sạch (%) = ——————— (tổng số mẫu) x 100 (số mẫu tái sinh) Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = ——————— (tổng số mẫu) x 100 - Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch và Tam bảo sắc: các chồi lan 4 tuần tuổi ở môi KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT16 T Ạ P C H Í K H O A H Ọ C C Ô N G N G H Ệ V À M Ô I T R Ư Ờ N G trường nuôi cấy khởi động được chuyển sang các môi trường nhân nhanh chồi. Thí nghiệm được bố trí 2 yếu tố theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại (yếu tố A gồm 3 nồng độ BA ký hiệu như sau: B1: 0 mg/L, B2: 0,1 mg/L, B3: 0,3 mg/L; yếu tố B gồm 3 nồng độ Kinetin được ký hiệu như sau: K1: 0 mg/L, K2: 0,1 mg/L, K3: 0,3 mg/L).Mỗi lần lặp lại 5 mẫu/loài/công thức. Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên khả năng tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc BA (mg/L) Kinetin (mg/L) 0 0,1 0,3 0 B1K1 B2K1 B3K1 0,1 B1K2 B2K2 B3K2 0,3 B1K3 B2K3 B3K3 Các chỉ tiêu theo dõi: (Số chồi hình thành) HSN chồi (%) = —————————— (Số chồi ban đầu) x 100 Hình thái chồi - Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA đến khả năng tạo cây lan in vitro hoàn chỉnh: Các chồi invitro của lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc đủ 2-3 lá thật, cao 2-3cm được chuyển sang môi trường tạo rễ với nồng độ NAA theo thí nghiệm (Bảng 2.2). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại 10 mẫu/công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm số rễ trung bình (rễ/ chồi), chất lượng rễ. Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA lên khả năng tạo cây lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc in vitro hoàn chỉnh STT Ký hiệu công thức Nồng độ NAA (mg/L) 1 N1 0 2 N2 0,2 3 N3 0,5 4 N4 0,7 5 N5 1 Tất cả các môi trường nuôi cây được sử dụng môi trường cơ bản là Knuds, bổ sung 20g/l saccarose + 100ml/l nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l agar và các chất kích thích sinh trưởng khác nhau tùy thuộc vào từng giai đoạn nuôi cấy, riêng đối với môi trường tạo cum chồi bổ sung 0,2 mg/l NAA. Môi trường được điều chỉnh pH=5,8, khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25oC, cường độ ánh sáng 2000 lux; thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh của lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch và Tam bảo sắc Các đoạn chồi lan sau khi được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% và NaClO 5% ở các thời gian khác nhau được cấy vào môi trường nuôi cấy khởi động. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả quá trình thực nghiệm được trình bày tại bảng 3.1. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh của lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc CTTN Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) Hạc vỹ Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc Hạc vỹ Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc KT1 NaClO 5% 10 16,67 13,33 10 16,67 13,33 10 KT2 15 63,33 60 60 60 56,67 60 KT3 20 66,67 63,33 60 46,67 46,67 43,33 KT4 HgCl2 0,1% 5 33,33 36,66 30 30 30 30 KT5 7 86,67 83,33 80 60 56,67 56,67 KT6 10 93,33 90 90 23,33 23,33 26,67 Tỷ lệ mẫu sạch ở tất cả các công thức thí nghiệm đều tăng khi thời gian khử trùng tăng. Đối với nhóm công thức khử trùng với HgCl2 0,1% đạt cao nhất đối với lan Hạc Vỹ 93,33% với thời gian khử trùng 10 phút, đối với nhóm công thức NaClO 5% đạt tỷ lệ cao nhất là 66,67% khi khử trùng Hạc vỹ. Tuy nhiên khi sử dụng các chất khử trùng thời gian càng dài thì tỷ lệ mẫu tái sinh càng giảm, điều này có thể thấy rõ nhất khi sử dụng HgCl2 0,1% để khử trùng trong thời gian 10 phút (tỷ lệ mẫu tái sinh ở cả ba loại lan đều dưới 30% dù tỷ lệ mẫu sạch trên 90%). Căn cứ vào kết quả trên có thể chọn công thức khử KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 17 S Ố 0 6 N Ă M 2 0 19trùng là HgCl2 0,1% trong 7 phút và NaClO 5% trong 15 phút. Ở đây cũng có thể thấy sự chênh lệch về tỷ lệ mẫu sạch của ba loại lan khi sử dụng cùng một chất khử trùng ở thời gian giống nhau. Hạc vỹ là loại lan thu được tỷ lệ mẫu sạch lớn nhất, lý do là do cấu tạo hình thái của chồi (giả hành) khác nhau của ba loại lan, dẫn đến hiệu quả khử trùng khác nhau. 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên khả năng tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên khả năng tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc CTTN Hệ số nhân của cụm chồi (%) Hình thái chồi Hạc vỹ Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc Hạc vỹ Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc B1K1 0,9 0,8 0,95 + + + B1K2 2,85 2,9 2,85 + + + B1K3 3,8 3,65 3,75 + + + B2K1 3,35 3,15 3,15 + + + B2K2 3,3 3,2 3, ++ ++ ++ B2K3 3,85 3,7 3,7 ++ ++ ++ B3K1 4,65 4,3 4,45 +++ +++ +++ B3K2 4,8 4,7 4,7 +++ +++ +++ B3K3 5,55 5,3 5,45 +++ +++ +++ Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn màu xanh nhạt, (++): chồi trung bình, kích thước không đồng đều, (+++): chồi mập, màu xanh đậm, kích thước đồng đều Kết quả thực nghiệm sau 3 tuần cho thấy: hệ số nhân nhanh chồi có sự khác biệt rõ ràng ở các công thức thí nghiệm (đạt từ 0,9 đến 5,55 %). Nhìn chung khi bổ sung riêng rẽ Kinetin và BA hệ số nhân chồi thấp hơn so với khi phối hợp chúng với nhau. Ở môi trường sử dụng tổ hợp 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l BA cho hệ số nhân nhanh chồi cao nhất ở cả 3 loại lan (từ 5,3 đến 5,55 %), chất lượng thể chồi tốt, chồi to, mập, đồng đều. 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA kết lên khả năng tạo cây lan in vitro hoàn chỉnh Khi khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng ra rễ đối với 3 loại lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc, chúng tôi nhận thất ở công thức N3 có bổ sung 0,5mg/l NAA cho số rễ nhiều nhất là từ 3,95 - 4,08 rễ/ chồi, và chiều dài rễ trung bình lớn nhất từ 3,2 - 3,25cm. Tuy nhiên ở các công thức thí nghiệm bổ sung NAA nhiều hơn hoặc ít hơn thì cây có số lượng rễ ít hơn và chiều dài rễ cũng ngắn hơn. Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA lên khả năng tạo cây lan in vitro hoàn chỉnh CTTN Số rễ trung bình (rễ/chồi) Chiều dài rễ (cm) Hạc vỹ Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc Hạc vỹ Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc N1 1,58 1,75 1,58 1,8 1,68 1,7 N2 3 3,03 3,05 2,76 2,59 2,65 N3 3,95 3,98 4,08 3,23 3,2 3,25 N4 3,63 3,55 3,55 3,01 2,9 3,1 N4 3,45 3,43 3,4 2,72 2,79 2,81 4. Kết luận - Khử trùng chồi (giả hành) lan Hạc vỹ, Tam bảo sắc, Hoàng thảo ngọc thạch bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút và khử trùng bằng NaClO 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và mẫu tái sinh cao nhất (mẫu tái sinh đạt trên 55%). - Môi trường Knuds bổ sung 20g/l saccarose + 100ml nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l agar + 0,3 mg/l BA + 0,3 mg/l Kinetin cho hệ số nhân nhanh chồi đạt cao nhất (từ 5,3-5,55%), chất lượng chồi tốt, chồi to, mập. - Môi trường Knuds bổ sung 20g/l saccarose + 100ml nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l agar + 0,5mg/l NAA cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt cao nhất (từ 3,95 - 4,08 rễ/ chồi), chiều dài rễ lớn nhất (từ 3,2 - 3,25cm)./. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001).Vi nhân giống phong lan Dendrobium trên quy mô công nghiệp. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 1,1-9. 2. Nguyễn Thị Quỳnh Trang, Vũ Thị Kim Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013). Nhân giống in vitro lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum). Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp,3,16-21. 3. Asghar S, Ahmad T, Ahmad Hafiz I et al (2011). In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var. Emma white. African journal of Biotechnology, 10(16), 3097-3103.