Báo cáo Về vệ sinh an toàn thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM GVGD: TẠ ĐĂNG KHOA NHÓM THỰC HIỆN: Tăng Văn Tri 0953010779 Võ Đình Trung 0953010806 Nguyễn Thị Vân Thanh 0953010662 Đổng Hoàng Mỹ Trân Dương Thị Hiền Thành Phố HCM , ngày ..... tháng...... năm 2012 MỞ ĐẦU. Rau quả sau khi thu hoạch nếu không nhanh chóng được bảo quản sẽ bị hư hỏng rất nhanh. Phần lớn những hư hỏng xảy ra ở rau quả là do vi sinh vật và emzyme gây nên. Để hạn chế hiện tượng này và làm cho thời gian bảo quản rau quả được nhiều hơn, người ta thường tìm cách ức chế hoạt động của 2 tác nhân này. Có hai phương pháp chủ yếu là: bảo quản lạnh và bảo quản bằng cách nấu (nấu mứt) . Có nhiều loại mứt khác nhau, phân chia theo phương pháp nấu, thành phần nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng. Quả khóm có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp calo lớn, có đủ các loại vitamin ngoại trừ vitamin D, giàu khoáng, nhất là Kali. Khóm là một loại trái cây rất mau thu hoạch, từ khi trồng đến lúc hái trung bình khoảng 12 – 14 tháng, đồng thời cho thu hoạch lớn. Do đó việc bảo quản khóm là điều cần thiết. Hơn nữa sau khi chế biến sản phẩm mứt khóm có những giá trị cảm quan mới. Bài tiểu luận này xin trình bày về quy trình chế biến Jam khóm . A. TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT JAM KHÓM GIỚI THIỆU Nguồn gốc và sự phát triển của cây dứa. Cây khóm (Dứa, Thơm_hình 1.1) có tên khoa học là  Ananas comosus, thuộc họ Bromalia, được gọi chung là cây ăn quả nhiệt đới và quả tạo ra gọi là quả phức. Quả khóm thực ra là trục của bông hoa và các lá bắc mọng nước tụ hợp lại còn quả thật là các mắt khóm. Hình 1.1 Cây Khóm có nguồn gốc Nam Mỹ, mặc dù ít được biết đến về nguồn gốc dứa thuần mà theo Pickergill 1976 M.S. Bertoni (1919) cho rằng có xuất xứ khu vực sông Parana – Paraguay. Những thổ dân của Miền namBrazil và Paraguay đã mang cây dứa đi khắp Nam Nỹ, và cuối cùng đến vùng biển Caribe. Nhà thám hiểm Columbus đã tìm thấy nó ở Ấn độ và mang về Châu âu. Tây Ban Nha đã mang nó tới Philippine, Hawaii(Thế kỷ 19, đầu tiên được trồng rộng rãi vào năm 1886), Zimbabwe và Guam. Cây dứa được trồng thành công ở Châu âu trong nhà kính và những hầm dứa cũng bắt đầu từ đó. Tại Việt Nam, khóm được trồng khá phổ biến, phân bố từ phú thọ đến Kiên Giang, Tiền Giang là tỉnh có sản lượng Khóm đứng đầu đứng đầu cả nước. Phân loại. khóm Victoria ( dứa tây, dứa hoa) có các giống: Hoa Phú Thọ: thuộc nhóm Queen, trồng được nơi đất chua xấu. Lá có nhiều gai và cúng, quả nhỏ, thịt quả vàng đậm. thơm, ít nước, giòn. Na hoa: lá ngắn và to, quả to hơn khóm Phú Thọ, phẩm chất ngon, năng suất cao. Khóm Cayen: lá chỉ có ít gai ở đầu mút lá, lá dài cong lòng máng, khi chưa chín quả màu xanh đen, khi chín chuyển màu ra đồng. Quả nhiều nước, thịt vàng ngà, mắt khóm to và nông, vỏ mọng, thích hợp với đóng hộp. Khóm ta ( Ananas comosus var Spanish_ hình 1.2) là cây chịu bóng tốt, có thể trồng ở dưới tán cây khác. Quả to nhưng vị ít ngọt. Khóm mật ( Ananas comosus sousvar- Singapor Spanish) có quả to, thơm ngon, trồng nhiều Nghệ An và Thanh Hóa. Khóm tây ( Ananas comosus queen) được nhập nội từ 1931, trồng nhiều ở các vùng đồi trung du. Quả bé nhưng thơm, ngọt. Khóm không gai ( Ananas comosus cayenne) được trồng ở Nghệ An, Quảng trị, Lạng sơn. Cây không ưa bóng. Quả to hơn các giống trên.. Hình 1.2. Hình 1.3. Khóm CAYENNE Thành phần dinh dưỡng. Trong quả dứa có nhiều thành phần dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe, lại có mùi vị thơm ngon, rất được ưa chuộng. trong dịch quả dứa chứa nhiều acid hữu cơ, các chất đường, các acid amin, các vitamin B1, B2, C, PP, đặc biệt ở trong cây dứa có chứa nhiều bromelin, là một emzyme có tác dụng thủy phân protein, giúp cho vết thương ở niêm mạc dạ dày chóng thành sẹo. Bảng 1.1 thành phần dinh dưỡng trong quả khóm Thành phần dinh dưỡng có trong 100g khóm Energy 202 kJ ( 48 kcal) Carbohydrates 12,63g Sugars 9,26g Dietary fiber 1,4g Fat 0,12g Protein 0,54g Thiamine (vit. B1) 0,079 mg Riboflavin (vit.B2) 0,031mg Niacin( vit. B3) 0,489mg Pantothenic acid (B5) 0,205 mg Vitamin B6 0,110 mg Vitamin C 36,2mg Calcium 13mg Iron 0,28 mg Potassium 115mg Manganese 0.9 mg Magnesium 12mg Phosphorus 8mg Khóm có chứa Enzym proteolytic, enzym Bromelian, có thể phân hủy protein. Vì vậy, nước dứa thường được sử dụng để ướp và làm mềm thịt. Những ezyme có trong dứa có thể cản trở việc hấp thụ một số thực phẩm như mật ong chúa, món tráng miệng có nguồn gốc Gelatin, nhưng lại bị phân hủy trong khi nấu và quá trình đóng gộp. Lượng của Bromelain trong quả dứa không có ý nghĩa trong y tế, vì hầu hết tập trung ở phần thân cây không ăn được. Thu hoạch và bảo quản. Do những đặc tính của trái khóm nên khi thu muốn bảo quản được trái khóm lâu người trồng phải kết hợp chặt chẽ kỹ thuật thu hoạch và bảo quản trái khóm. Thu hoạch: Độ chín sau thu hoạch: Khóm xuất khẩu quả tươi khi thu hoạch vỏ quả đã chuyển từ màu xanh thẫm sang xanh nhạt, 2 hàng mắt phía cuống đã có kẽ vàng. Khóm cho chế biến công nghiệp có 1-3 hàng mắt phía cuống có màu vàng. Kỹ thuật thu hái: Cắt quả kèm theo đoạn cuống dài 2-3 cm, vết cắt phẳng không làm quả bị dập, gãy cuống, gãy ngọn. Không thu hoạch vào ngày có mưa hoặc nắng gắt. Khi cần lấy chồi ngọn để trồng hoặc bỏ đi đều phải dùng dao cắt, không dược bẻ vì vết lõm vào quả sẽ gây mau thối quả. Bảo quản: Bảo quản ở nơi sản xuất: Thu hoạch xong phải vận chuyển về nơi râm mát, sạch, không chất đống ngoài nắng hoặc mưa. Bảo quản quả tươi xuất khẩu: chọn quả lành, không bị dập, không có rệp sáp, vặt bỏ lá ở gốc quả, cắt bằng cuống cách gốc 2cm. Phân loại, đóng gói đưa vào kho mát, vận chuyển bằng xe lạnh có nhiệt độ 7-8oC, ẩm độ 85-90%. Thời gian từ thu hoạch đến khi đưa vào kho mát không quá 24 giờ vào mùa Hè và 36 giờ vào mùa Xuân. Bảo quản khóm chế biến công nghiệp: Thu hoạch xong, phân loại sơ bộ, chọn quả lành lặn đưa vào kho mát có nhiệt độ 10-12oC đối với dứa còn xanh, 7-8oC đối với dứa bắt đầu chín, ẩm độ trong kho 85-90% có thể bảo quản được 2-3 tuần. Người ta thường chế biến dứa thành những món ăn, nước uống rất ngon và bổ dưỡng như: mứt khóm, mật khóm, sirô khóm… PHÂN LOẠI MỨT. Mứt là sản phẩm chế biến từ nước quả trong, puree, hay miếng quả nấu với nước đường đến độ khô 65 – 70% và được tạo đông bằng pectin, hoặc agar hay hỗn hợp agar và pectin. Sản phẩm mứt quả có đặc điểm nổi bật là vị ngọt mạnh và có hương vị tự nhiên, tinh khiết của quả. Chia làm 3 loại: Mứt Jam( hình 2.1 a): chế biến từ puree quả, có thể dùng riêng một hỗn hợp hoặc nhiều loại quả. Tùy theo độ đặc của sản phẩm mà quy định tỉ lệ đường pha vò puree quả. Người tap ha them pectin hoặc agar để tạo thành dạng khối đông đặc và nhuyễn. Mứt đông (Jelly- hình 2.1 b): chế biến từ nước quả trong với đường, pectin, acid thành sản phẩm có trạng thái đông đặc và trong suốt. Mứt Marmalade (hình 2.1 c): thịt quả ở dạng miếng, có pha hoặc không pha them acid thực phẩm và pectin. Sản phẩm là một khối đông đặc, trong đó kết cấu với nước đường đã kết đông hóa. Dạng mứt này được ưa thích nhất vì có tính chất gần với nguyên liệu quả hơn cả. (a) (b) (c) Hình 2.1. CHẾ BIẾN JAM KHÓM Nguyên liệu: Trái khóm: Là thành phần chính của Jam khóm, nó quyết định đến chất lượng sản phẩm sau cùng và cũng ảnh hưởng đến hàm lượng của các thành phần nguyên liệu khác. Khóm được dùng cho chế biến phải vừa chín, còn tươi và không bị hư hỏng hay sâu bệnh Hình 3.1 trái khóm Bảng .3.1 . Chỉ tiêu về khối lượng quả khóm để sản xuất Jam khóm. Giống Khối lượng quả nhỏ nhất (g) Loại 1 Loại 2 Loại 3 Khóm hoa 550 450 350 Khóm ta 1000 800 500 Khóm tây 1200 900 600 Bảng 3.2 Các chỉ tiêu cảm quan của quả khóm. Các chỉ tiêu Yêu cầu kỹ thuật Hình dáng bên ngoài Hình dáng phát triển tự nhiên, nguyên vẹn chồi ngọn ( trừ khóm ta) và cuốn. Chồi ngọn chiếm 25% so với khối lượng toàn quả. Không dập, xước và gãy cuống, không có vết thối, úng. Không bị lên men và những quả bị sâu bệnh. Trạng thái bên trong Thịt quả cứng chắc, không nhớt, không úng hoặc khô nước, không thâm lõi. Mùi vị Quả khóm bắt đầu có mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt: không được phép có mùi úng, mùi rượu. Độ chín thu hoạch Độ chín 1: Vỏ quả đã chuyển sang màu xanh nhạt, hai hàng mắt phía gốc đã kẻ vàng. Thịt quả không còn nhớt và màu phớt vàng. Độ chín 2: Vỏ quả đã có 1 – 3 hàng mắt, phía gốc chuyển sang màu vàng, thịt quả có màu vàng trên mặt cắt ngang. Độ chín 3: các hàng mắt từ gốc đến ngang nửa quả đã chuyển sang màu vàng, thịt quả có màu vàng. Độ chín 4: các hàng mắt từ gốc đến ngang quá nửa quả (2/3 quả) có màu vàng, thịt quả có màu vàng. Pectin Pectin là thành phần tự nhiên sẵn có trong trái khóm, được hình thành do sự thủy phân protopectin trong quá trình chín của quả khóm. Pectin là thành phần quan trọng để hình thành gel. Một số loại quả có đủ pectin tự nhiên để tạo gel có cấu trúc vững chắc, một số khác đòi hỏi phải bổ sung pectin từ bên ngoài. Loại pectin tạo gel tốt nhất chỉ có mặt trong quả mới chín tới, pectin ở quả chưa chín hoặc chín quá sẽ rất khó tạo gel. Lượng pectin trong khóm thường có hàm lượng rất cao, do đó trong quá trình chế biến Jam khóm ta bổ sung hàm lượng pectin thâp. Pectin ngày nay được sản xuất rộng rãi và được sử dụng như phụ gia trong các sản phẩm cần độ sệt. Pectin thương mại thường được sản xuất từ vỏ quýt, cam và táo với nhiều chỉ tiêu khác nhau. Pectin được sản xuất thành dạng lỏng hoặc sấy khô thành bột để dễ bảo quản. Việc lựa chọn pectin để sử dụng phụ thuộc vào nguyên liêu, mục đích công nghệ và cả quy trình chế biến sản phẩm. khi sử dụng pectin bổ sung cho mức đông ta có các ưu điểm sau: Có thể sử dụng trái khóm chưa chín tới hoặc chín quá để đưa vào sản xuất, việc bổ sung pectin và đường thích hợp có thể khắc phục được độ chín của trái khóm không thích hợp. nhờ đó quá trình sản xuất Jam ít bị phụ thuộc vào mùa vụ. Rút ngắn thời gian nấu trong quá trình chế biến. Chủ đông hơn trong sản xuất. Hiệu quả cao hơn. Điều quan trọng khi sự dụng pectin là cần phải tính toán lượng đường bổ sung cho thích hợp. Acid Acid cũng là thành phần quan trọng trong việc hình thành gel cho sản phẩm. Tuy trong khóm có chứa lượng acid đáng kể, nhưng trong quá trình chế biến cần thêm vào một lượng acid citric để đưa pH xuống từ 3 – 3,5, đây là pH thích hợp cho việc tạo gel của pectin. Bảng 2.3 chỉ tiêu của acid Tên chỉ tiêu Yêu cầu Hình dạng và màu sắc Các tinh thể không màu hay bột trắng không vón cục. đối với acid citric hạng 1 cho phép hơi có ánh vàng, dung dịch acid citric trong nước cất có nồng độ khối lượng 20g/L phải trong suốt. Vị Chua, không có vị lạ. Mùi Dung dịch acid trong nước cất nồng độ 20g/L không có mùi. Cấu trúc Rời và khô. Tạp chất cơ học Không cho phép. Đường: Đường phải có mặt thích hợp so với pectin và acid để tạo gel tốt, thường lượng đường cho vào phải lớn hơn 50% so với khối lượng nguyên liệu. Đường còn góp phần tạo vị ngọt cho sản phẩm và ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình bảo quản. Trong chế biến Jam khóm thường được sử dụng đường cát trắng. các chất tạo ngọt như đường vàng, sorghum không nên sử dụng bởi vì mùi của chúng sẽ che mất mùi của quả và làm cho vị ngọt thay đổi. Có thể thay thế một phần đường bằng sirô đường từ dịch thủy phân tinh bột hoặc mật ong có màu sáng nhưng không được thay thế hoàn toàn vì như vậy sẽ che mất hương tự nhiên của trái khóm và có thể ảnh hưởng đến việc tạo gel. Sản phẩm từ Jam khóm. (a) (b) (c) Hình 1.2: các sản phẩm từ Jam khóm. Jam khóm trong lọ thủy tinh Jam khóm dùng làm nhân trong sản xuất bánh biscuit Jam khóm ăn kẹp với bánh mì Chế biến Jam khóm Quy trình công nghệ. Trái hư, úng Khóm Phân loại Cuốn, chồi, vỏ, cùi, mắt Cắt, gọt Rửa Nghiền, xé Bã Chà Acid citric (30%), đường Phối trộn Pectin ( đã xử lý) Cô đặc Rót lọ Lọ bằng thủy tinh ( đã được xử lý) Dò kim loại Jam khóm Thanh trùng Thuyết minh quy trình công nghệ. 2.2.1. Nguyên liệu Nguyên liệu thu nhận vào xí nghiệp để chế biến cần được chọn sơ bộ về chất lượng và khối lượng. Sau đó được xếp trong kho hoặc trên sân bảo quản theo từng lô riêng cùng chất lượng và cùng thời gian thu nhập. Kho hoặc sân bảo quản cần được che mưa, che nắng, đảm bảo thông thoáng, tránh ảnh hưởng trực tiếp của các yếu tố môi trường đến nguyên liệu. Khi đưa vào chế biến nguyên liệu được lấy theo từng lô. Lô thu nhận trước lấy trước. Các lô thu nhận cùng thời gian lô nào chín hơn cần chế biến trước. Chọn trái khóm vừa chín tới, có mùi thơm và màu sắc sặc sỡ. 2.2.2. lưạ chọn, phân loại ( hình 3.1 (a), (b) ) Mục đích công nghệ: chuẩn bị. Quá trình lựa chọn – phân loại nhằm loại bỏ những trái hư dập, ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm; chọn nguyên liệu có độ chín phù hợp. Các biến đổi của nguyên liệu: nguyên liệu trở nên đồng đều về kích thước và độ chín. Thiết bị: thông thường các nhà sản xuất sử dụng phương pháp thủ công để lựa chọn nguyên liệu đạt yêu cầu. Nguyên liệu được dàn mỏng trên các băng tải phải chậm để công nhân thao tác cắt sửa nguyên liệu ngay trên băng tải. Đối với những trái nhỏ thì không cần khâu cắt gọt và cũng có thể lựa chọn trên máy phân loại theo độ chín. (a) (b) Hình 3.1 (a): tiếp nhận nguyên liệu (b): lựa chọn và phân loại. 2.2.3. Cắt gọt (hình 3.2, 3.3) Mục đích công nghệ: khai thác: quá trình này trước tiên là để loại bỏ những phần không sử dụng được của trái khóm như cuống, bong, vỏ, cùi, mắt. Các biến đổi nguyên liệu: Nguyên liệu bị thay đổi hình dạng và lích thước; lớp vỏ bảo vệ đã bị gọt bỏ, nên tốc độ hô hấp của dứa tăng nhanh, trái sẽ mau bị nhũn. Dịch bào tiết ra trên bề mặt là nguyên nhân tăng cường các phản ứng oxy hóa làm thâm bề mặt quả dứa, và cũng là môi trường tốt cho vi sinh vật hoạt động. vì vậy sau khi cắt gọt, nguyên liệu phải được nhanh chóng đưa qua quá trình xử lý tiếp theo, nhằm tránh hư hỏng sản phẩm. Hình 3.2 hình 3.3 2.2.4 . Rửa ( hình 3.4) Mục đích công nghệ: chuẩn bị Quá trình rửa sẽ làm đất cát, bụi bẩn, vi sinh vật bám vào. Các biến đổi nguyên liệu: nguyên liệu sạch và giảm bớt lượng vi sinh vật trên bề mặt vỏ. Thiết bị: Thường sử dụng thiết bị ngâm rửa xối tưới, dạng băng tải hay dạng tang trống. Yêu cầu của quá trình rửa là thời gian ngâm rửa không kéo dài, nguyên liệu sau khi rửa phải sạch, không bị dập, lượng nước tốn ít nhất. (a) (b) Hình 3.4 (a) rửa khóm (b) thiết bị rửa khóm 2.2.5 Nghiền, xé. Là quá trình phân chia vật thể ra thành nhiều phần tử nhỏ cho phù hợp với yêu cầu sản xuất. để làm nhỏ kích thước nguyên liệu rắn cần thực hiện 1 công để thắng lực liên kết giữa các phần tử của nó. Khi dặt ngoại lực vào vật thể, vật thể sẽ bị phá vỡ làm cho tổng diện tích bề mặt của nguyên liệu mới được tạo thành tăng lên nhiều lần so với bề mặt ban đầu. Mục đích công nghệ: chuẩn bị. Nghiền xé sẽ cắt nhỏ quả khóm, phá vỡ lớp vỏ tế bào, hỗ trợ và làm tăng hiệu suất cho quá trình chà. Các biến đổi nguyên liệu: nguyên liệu thay đổi kích thước, vỏ tế bào bị xé rách; dịch bào và các emzym nội bào thoát ra, các phản ứng hóa sinh xảy ra dễ dàng. Trái cây sau khi xay nghiền cũng là một môi trường tốt cho vi sinh vật hoạt động, từ đó làm hư nguyên liệu qua quá trình nghiền. thiết bị: Vì dịch bào thường có pH trong vùng acid và chứa nhiều loại vitamin nên bộ phận tiếp xúc với nguyên liệu phải được chế tạo bàng inox hay nhựa cứng, tránh bị ăn mòn. Có hai kiểu xay nghiền: nghiền cắt – sử dụng lực cắt để cắt nhỏ nguyên liệu, và nghiền chà – dùng lực ma sát giữa hai đĩa chà để làm nát nguyên liệu. Đối với nguyên liệu là trái cây thường dùng máy ép nghiền cắt, loại máy này thích hợp với nhiều loại nguyên liệu. Máy nghiền chà còn gọi là máy xay keo, thường chỉ dùng cho những nguyên liệu có độ nhớt cao, hay có hàm lượng lipid cao. hình 1.6 thiết bị nghiền 2.2.6 Chà Quá trình chà là dùng lực chà, xát và ép để làm cho khối nguyên liệu đồng nhất hoặc tách riêng phần nguyên liệu không có giá trị dinh dưỡng hay dinh dưỡng thấp. Thùng chà cánh chà vít đưa nguyên liệu sàng chà Hình 2.3 Máy chà nguyên liệu Mục đích công nghệ: khai thác Quá trình chà sẽ phân chia nguyên liệu khóm thành hai phần: puree chứa dịch cùng với thịt trái mịn và bã chà chứa những phần không sử dụng được. Các biến đổi của nguyên liệu: nguyên liệu giảm khối lượng do đã tách bã chà, puree thu được mịn và kích thước đồng đều. Các phản ứng hóa sinh, hoạt động của vi sinh vật đều được tăng cường. Thông số công nghệ: kích thước puree khoảng 0,5 – 0,75mm Thiết bị: Thiết bị chà sử dụng cả lực ma sát lẫn lực ly tâm. Bộ phận chính của thiết bị là một trục và roi đập trong một buồng chà nằm ngang. 2.2.7 phối trộn (Hình 1.7) Phối trộn là quá trình pha trộn giữa hai hay nhiều cấu tử( thành phần) khác nhau để thu được một hỗn hợp (sản phẩm) đáp ứng yêu cầu đã định. Còn đảo trộn là quá trình cơ học nhằm khuấy trộn các thành phần trong hỗn hợp để chúng phân bố đều nhau. Mục đích công nghệ: tạo ra sản phẩm mới: đa số loại sản phẩm thực phẩm không phải từ một nguyên liệu mà gồm 2 hay nhiều loại khác nhau. Chúng được phối trộn nhau để cho sản phẩm có chất lượng đặc trưng. Hình 1.7 thiết bị phối trộn Tăng chất lượng sản phẩm: có một số sản phẩm tồn tại một mình thìkhông tốt lắm về chỉ tiêu cảm quan, nhưng khi bổ sung cho chúng một số thành phần khác mặc dù với khối lượng ít cũng có tác dụng làm tăng chất lượng của sản phẩm lên. Quá trình phối trộn sẽ điều chỉnh thành phần hóa học của sản phẩm. Các biến đổi nguyên liệu: Nguyên liệu chính sẽ được phối trộn các nguyên liệu phụ, phụ gia; do đó thành phần hóa học của hỗn hợp sau khi phối trộn sẽ thay đổi so với nguyên liệu ban đầu. Biến đổi vật lý: thay đổi khối lượng riêng của hỗn hợp có sự thay đổi các chỉ tiêu vật lý khác nhau như độ dẻo, độ trong, độ khúc xạ ánh sáng. thay đổi hệ số dẫn nhiệt, nhiệt dung riêng. Biến đổi trạng thái sản phẩm Thông số công nghệ: Thành phần % trong sản phẩm Dịch puree khóm 50% Nước 49% Acid citric 0.05% Pectin 0.05% Ph = 2,8 – 3 Nhiệt độ: 40 - 600C Thiết bị: Thiết bị phối trộn thường là nồi 2 vỏ, gia nhiệt bằng hơi nước có cành khuấy, xả liệu ở đấy nồi. Vì nguyên liệu đưa vào có hàm lượng chất khô cao nên thường được phối liệu với syrup đường (không sử dụng đường hạt). Các loại phụ gia khác cũng được hòa tan thành dung dịch rồi bơm định lượng vào thiết bị phối trộn 2.2.8. Cô đặc.(hình ) Cô đặc là quá trình nâng cao nồng độ sản phẩm bằng phương pháp bay hơi nước. Mục đích công nghệ: khai thác quá trình cô đặc làm tăng hàm lượng chất khô trong sản phẩm. chuẩn bị: quá trình cô đặc là giai đoạn chuẩn bị để thực hiện quá trình tạo dòng tiếp theo. Biến đổi của nguyên liệu: trong quá trình cô đặc tính chất cơ bản của nguyên liệu thay đổi không ngừng. (hình ) Thay đổi các tính chất vật lý và hóa lý: Tăng Giảm Khối lượng riêng r Hệ số dẫn nhiệt Độ nhớt h Nhiệt dung Tổn thất Hệ số cấp nhiệt Nhiệt độ sôi Hệ số truyền nhiệt Ngoài ra còn dẫn đến hiện tượng như keo tụ protit, phân hủy chất pectin, caramen hóa đường và hàng loạt các biến đổi khác. Các phản ứng hóa học. pH của môi trường thay đổi: thường khi cô đặc thì acid của nguyên liệu tăng do sự phân hủy các amit. Tạo cặn do trong dung dịch có chứa một số muối canxi hữu cơ ít hòa tan. Tăng tổn thất do phân hủy chất cô đặc Tăng màu do phân hủy các sản phẩm cô đặc dưới điều kiện nhiệt độ và pH như caramen, đường khử melanoidin,… Một số vitamin bị phá hủy, nhất là vitamin C. Về sinh học: hạn chế được khả năng hoạt động của vi sinh vật ở nhiệt độ cao. Tiêu diệt được vi sinh vật khi tiến hành cô ở nhiệt độ cao. Thông số công nghệ: Nhiệt độ cô đặc 60 - 800C Nồng độ chất khô: 650Brix Thiết bị: Thiết bị cô đặc thường dùng đối với dịch trái cây thường là thiết bị cô đặc chân không. Việc hạ thấp nhiệt độ là để tránh biến đổi nhiều về mặt cảm quan cho sản phẩm. Kiểu thiết bị thường được sử dụng là thiết bị cô đặc dạng ống chùm.Nguyên liệu đi trong ống tác nhân gia nhiệt là hơi nước, những hợp chất không ngưng tụ được bơm chân không hút ra ngoài, hệ thống ngưng tụ barometer giúp thu hồi một số cấu tử hương, sản phẩm được lấy ra từ đáy thiết bị. 2.2.9 Rót nóng, đóng nắp Mục đích công nghệ: hoàn thiện. Phân chia sản phẩm vào các hộp, tạo ra các đơn vị sản phẩm. Các biến đổi của nguyên liệu: Jam khóm được đựng trong lọ thủy tinh ta cần rót nóng nhằm kết hợp với quá trình bài khí, giúp sản phẩm có cấu trúc tốt hơn, đuổi không khí trong lọ và giảm lượng vi sinh vật trong lọ. Thiết bị rót, đóng gói 2.2.10 Dò kim loại: 2.2.11 Thanh trùng Mục đích công nghệ: bảo quản sản phẩm Các biến đổi nguyên liệu: SẢN PHẨM Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm Jam khóm. Tiêu chuẩn của sản phẩm Jam khóm. Tiêu chuẩn cảm quan: có màu tự nhiên của khóm nấu với đường, trong lọ màu sắc đồng nhất. có mùi tự nhiên của quả khóm nấu với đường, không có mùi vị lạ. Sản phẩm đặc, không bị lỏng, không bị vữa. tiêu chuẩn hóa lý: hàm lượng chất khô 650Brix, pH = 2,8 tiêu chuẩn hóa học. Stt Kim loại Giới hạn cho phép (mg/kg) Dựa theo tiêu chuẩn 1 As 0.1 46/2007/QĐ- BYT 2 Cd 1 46/2007/QĐ- BYT 3 Pb 0.05 46/2007/QĐ- BYT 4 Hg 0.05 46/2007/QĐ- BYT 5 Sn 100 46/2007/QĐ- BYT 6 Cu 10 46/2007/QĐ- BYT 7 Zn 5 46/2007/QĐ- BYT tiêu chuẩn vi sinh bảng 2.4: tiêu chuẩn vi sinh trong Jam khóm Vi sinh vật Giới hạn cho phép trong 1g hay 1ml thực phẩm Dựa theo tiêu chuẩn Tổng số vi khuẩn hiếu khí 100 46/2007/QĐ- BYT Coliform 10 Escherichia Coli 0 Streptococci 0 Ataphuylococcus aureus 0 Streptococci 0 Clostridium perfringens 0 Tổng số bào tử nấm men, mốc 10 3.2 Những vấn đề có thể xảy ra và cách khắc phục. Bảng 3.1 những vấn đề có thể xảy ra và cách khắc phục Sự cố Nguyên nhân Cách ngăn chặn Xuất hiện những tinh thể nhỏ trong suốt 1.Có thể đường không được hòa tan hết trong quá trình nấu 2. Nấu trong thời gian dài dẫn đến việc mất nước 3. đường không hóa tan bám vào dụng cụ rót. 1. thời gian nấu phải chính xác. 2. nên đun nhanh, không để dịch lỏng sôi 3. cẩn thận làm sạch dụng cụ rót trươnc1 khi sử dụng Không có mùi 1. trái khóm chưa chín tới 2. khóm bảo quản quá lâu 3. nơi bảo quản quá nóng 1. dùng trái chín tới, có mùi thơm 2. nên sử dụng trong vòng 1 năm 3. nơi bảo quản phải khô thoáng, tránh ánh sáng. Mưt không trong suốt, bị đục 1.quả còn non 2. khóm được đun quá lâu trước khi lọc 3. dịch quả lẫn thịt quả 4. hỗn hợp được để quá lâu trước khi rót vào chai lọ. 1.nên chọn quả cứng và chín. 2. chỉ nên nấu đến khi thịt quả mềm 3. lọc kỹ dịch quả qua vải lọc, không chà xát vào phần thịt quả 4. nên rót vào chai lọ khi hỗn hợp còn nóng. Nổi bọt có biểu hiện hư hỏng 1. nếu bọt nước di chuyển thì sản phẩm đã bị hư hỏng do độ kín không đươc bảo đảm. 2. nếu bọt nước đứng yên thì đó là do dụng cụ rót đặt quá xa miệng chai, hoặc rót chậm làm cho không khí xâm nhập vào hỗn hợp. 1. sử dụng chai lọ đã qua khử trùng. Tiến hành rót nóng. Kiểm tra bao bì trước khi bảo quản. 2. để dụng cụ rót ở gần miệng chai, tiến hành rót nhanh. Bị lên men. Có dấu hiệu hư hỏng Do bao bì không kín khí nên nấm men phát triển. Kiểm tra kỹ bao bì trước khi đem bảo quản Biến đen trên bề mặt Do phản ứng của các emzym có tự nhiên bên trong quả. Loại bỏ khí bên trong lọ bằng phương pháp nhệt để các phản ứng đó không thể xảy ra. Mốc Không đảm bảo độ kín khí Tiến hành rót nóng. Kiểm tra tốt bao bỉ. 3.3 mô tả sản phẩm Bảng mô tả sản phẩm Jam khóm. Stt Đặc điểm Mô tả sản phẩm 1. Tên sản phẩm Jam khóm 2. Tên nguyên liệu Khóm (Ananas comosus) 3 Vùng thu hoạch Khóm được thu hoạch ở khu vực miền tây Chủ yếu thu hoạch ở An Giang 4 Phương pháp vận chuyển và tiếp nhận nguyên liệu. Nguyên liệu được đại lý chuyển đến nhà máy bằng ghe, được công nhân chuyển lên kho. Chọn trái khóm vừa chín tới, có mùi thơm và màu sắc sặc sỡ Đối với nguyên liệu đã chín vàng đưa vào sản xuất ngay, nguyên liệu còn xanh được chất lên sàn bằng cây, nguyên liệu chất cao khoảng 120cm trữ lại đến khi chín hoặc thiếu nguyên liệu sẽ đưa vào sản xuất. 5 Tóm tắt quy cách thành phẩm Là sản phẩm mức đông được chế biến từ puree khóm, tạo gel mềm bằng pectin hay hỗn hợp pectin – agar. 6 Tiêu chuẩn hóa lý – vi sinh Hóa học: Ar: 1mg/kg As: 1mg/kg Pb: 0,005mg/kg Hg: 0,05mg/kg Cu: 30mg/kg Zn: 40mg/kg Vật Lý: kim loại: mảnh kim loại, ... phi kim: tóc, móng tay... vi sinh: TSVSVHK: 102 Coliform : 10 Escherichia Coli: 0 Staphylococcus aureus: 0 Streptococci: 0 Pseudomonas aeruginosa:0 Clostridium perfringens: 0 Tổng số bào tử nấm men,mốc: 10 7 Thành phần khác Acid citric, pectin, đường 8 Tóm tắt công đoạn chế biến Khóm ® phân loại ® cắt, gọt, gắp mắt ® rửa ® nghiền, xé ® chà ® phối trộn ® cô đặc ® vào lọ ®dò kim loại → thanh trùng ® sản phẩm. 9 Kiểu đóng hộp - Sản phẩm thường được chứa trong lọ thủy tinh trong suốt để có thể thấy được độ đồng nhất của jam - Theo tiêu chuẩn Mỹ, lọ chứa thường có kích cỡ 57g (2oz), 113g (4oz), 227g (8oz), 340g (12oz), 454g (1lb) 10 Điều kiện bảo quản Bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thường 11 Điều kiện phân phối và vận chuyển Sản phẩm được phân phối và vận chuyển ở nhiệt độ thường 12 Hạn sử dụng 24 tháng kể từ ngày sản xuất 13 Yêu cầu dán nhãn Tên thương mại sản phẩm, trọng lượng, kích cỡ, thành phần, điều kiện bảo quản, nơi sản xuất, ngày sản xuất, thời hạn sử dụng, code, logo, hướng dẫn sử dụng... 14 Các điều kiện đặc biệt khác Không có 15 Hướng dẫn sử dụng Sản phẩm dùng ngay, không cần phải sơ chế trước khi sử dụng 16 Đối tượng sử dụng Cho mọi đối tượng 17 Quy định và các yêu cầu tuân thủ Tiêu chuẩn theo yêu cầu khách hàng, theo nước nhập khẩu,TCVN 5603:2008, QĐ 46, TCVN 7078:2008.... Bảng phân tích tất cả các mối nguy có thể có trong sản phẩm. Mối nguy vi sinh là những loài vi sinh khi có trong thực phẩm có thể gây bệnh cho người. Vi sinh vật khi phát triển thường sinh nhiều sản phẩm phụ, một số trong chúng chứa độc tố gây bệnh, làm mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Dựa vào tiêu chuẩn vi sinh đối với sản phẩm đồ hộp. Mối nguy vật lý bao gồm các dị vật có khả năng gây hại thường không có trong thực phẩm. Khi chẳng may ăn phải dị vật, người ăn có thể bị hóc, bị đau hoặc các ảnh hưởng khác có hại đến sức khỏe. Dựa vào kỹ thuật chế biến, điều kiện, trang thiết bị sản xuất xác định mối nguy vật lý trên từng công đoạn có xảy ra hay không, nhà máy kiểm tra mối nguy vật lý là mắt và vỏ khóm. Có thể xảy ra nhiễm hoá học ở bất cứ công đoạn nào trong sản xuất và chế biến thực phẩm. Hoá chất sẽ không nguy hiểm nếu được sử dụng và kiểm soát hợp lý, song nguy cơ tiềm ẩn đối với người tiêu dùng sẽ tăng lên một khi hoá chất không được kiểm soát chặt chẽ hoặc bị lạm dụng. Chia các mối nguy hoá học thành ba nhóm: hoá chất có sẵn trong tự nhiên, hoá chất chủ định bổ sung vào, hoá chất không chủ định hoặc chẳng may nhiễm vào Bảng 5.2 bảng phân tích tất cả các mối nguy MỐI NGUY SINH HỌC Stt MÓI NGUY NGUỒN GỐC ĐẶC ĐIỂM VÔ HOẠT 1 E. coli Nguồn nguyên liệu, đất, nước, nguồn tiêu hóa. Trực khuẩn Gram âm, không tạo bào tử. Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi. Có thể có độc lực. Nhiệt độ thích hợp: 370C. Nhiệt độ tối đa: 400C. pH 7,4 E.coli có cả nội độc tố và ngoại độc tố. Nội độc tố chịu nhiệt. Nội độc tố không chịu nhiệt. Nấu > 650C 2 Campylobacter Nguyên liệu, nguồn nước,đất,rác, bụi Biên độ nhiệt thích hợp: 30 – 450C. Nhiệt độ tối ưu: 420C. pH thích hợp: 5 – 9. pH tối ưu: 6,5 – 7,5. Không phát triển ở nhiệt độ 21oC, 60oC tồn tại trong 6 giây, nhảy cảm với đièu kiện đóng băng, nhảy cảm với muối nồng độ 2,5% đủ hạn chế, chủng trong điều kiện phát triển tối ưu. 3 Staphylococcus aureus Nguyên liệu, nhiễm vào lúc chế biến sản phẩm. Tụ cầu Gram dương, không sinh bào tử. Phát triển dễ ở môi trường thông thường, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi.. Vi khuẩn phát triển châm ở: 12 – 150C. Vi khuẩn phát triển nhanh gấp nhiều lần ở: 20 – 220C. Nhiệt độ tối ưu: 370C. Tạo sắc tố tốt ở 200C Vi khuẩn này rất dễ bị tiêu diệt bởi nhiêt. Loại bỏ độc tố ở nhiệt độ cao 1100C trong 26 phút. 4 Listeria. Hiện tại có 6 loại Listeria: L. monocytogenes L. ivanovii L. innocua L. wels L. seeligeri L. grayi Thực phẩm bị nhiễm bẩn, đất, nước. VK hình que, Gram dương. Sông trông điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí bắt buộc. Di động ở: 20 – 250C. Không di động ở: 370C. Nâng nhiệt > 720C/ 1 phút. 6 Salmonella Nguyên liệu, nước, đất, truyền nhiễm thong qua người. Trực khuẩn Gram âm. Không tạo bào tử. Hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ phát triển: 5 – 450C. Nhiệt độ tối ưu: 370C. pH thích hợp: 6 – 9. pH tối ưu: 7,6. Tiêu diệt vi khuẩn ở 500C trong 1 giờ; ở 700C trong 15 phút và 1000C trong 5 phút. Với pH > 9 hoặc pH < 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt. Ở nồng độ muối 6 – 8%: vi khuẩn phát triển chậm. Ta diệt khuẩn lạc bằng phương pháp Pasteur là tốt nhất. 7 Vibrio cholerae Nguồn nước Hình que cong, gram âm, không có vỏ, không hình thành bao tử, có 1 tiên mao, di động mạnh, hiếu khí, phát triển trong pH 8,5-9,5, nồng độ NaCl 3% (ở nhiệt độ 37%) Nâng nhiệt > 560C / 20 phút. 8 Cl.botulinum Nguyên liệu hoa quả. Phẩy khuẩn, sinh bào tử. Vi khuẩn kỵ khí. Sinh ngoại độc tố. Nhiệt độ thích nghi để phát triển và hình thành độc tố: 15 – 550C. Nhiệt độ tối ưu: 25 -370C. Nhiệt độ tiêu diệt bào tử: 1000C trong 360 phút; 1050C trong 120 phút; 1100C trong 30 phút; 1150C trong 12 phút và 1200C trong 4 phút. Dễ bị tiêu diệt ở pH < 4,5. Nồng độ muối 6 – 10% có thể ức chế sự phát triển của vi sinh vật và sự hình thành độc tố. Độc tố bị mất tác dụng khi bị tác động bởi kiềm và nhiệt độ cao. Nấm mốc: 9 Nấm mốc: Aspergillus flavus Nguồn thức ăn của vật nuôi gây nhiễm trong nguyên liệu sữa. Tiết ra độc tố aflatoxin B1 và M1 Ưa sống 73 nhiệt độ khô. Phát triển nhanh khoảng giữa nhiệt độ 25-42oC.nhiệt độ tối ưu 37oC Đảm bảo nguồn thức ăn không bị nhiễm nấm mốc. Xử lý nhiệt với muối amoni, NaOH, NaClO, H2O2. Sử dụng khí quyển điều chỉnh. Tăng CO2 từ 0,5% đến 100%; O2 giảm từ 5% xuống 1%. Sử dụng biện pháp kiểm soát sinh học ( chất chống nấm). 10 Nấm mốc: Penicillium citricum Nguyên liệu, phụ gia. Khuẩn ty phân nhánh Sinh ra độc tố Citrinin Giảm độ ẩm bàng cách phơi, sấy Bảo quản trong túi ni lông chứa CO2 12 Nấm mốc: Fusarium sporotrichioides. Fusarium culmorum và F. graminearum Nguyên liệu, nước, đất, môi trường xung quanh. Sinh ra độc tố: Trichothecenes loại A bao gồm các loại độc tố khác nhau T-2 toxin, HT-2 toxin, neosolaniol ( NEO) và diacetoxyscirpenol Trichothecenes loại B gồm các loại deoxynivalenol ( “vomitoxin” hoặc DON) và 3-acetyl cùng 15 dẫn xuất của nó. > 700C / 15 phút. 13 Yersinia Thực phẩm bi nhiễm bẩn, đường tiêu hóa Là loại chịu nhiệt, trực khuẩn Gram âm, Nhiệt độ tốt ưu: 25 -320C Đun nhiệt 600C/ 3 phút 14 Vibrio cholerae Sống phổ biến rộng trong thiên nhiên, nước, nguyên liệu. Trực khuẩn ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0,5- 3µm, kỵ khí tùy nghi nhiệt độ phát triển tối ưu: 370C, pH từ 8 -9,5 Đun nóng >550C/ 10 phút. 15 Proteus Trong thiên nhiên, đường tiêu hóa, nước, dụng cụ và từ nguyên liệu thực phẩm trực khuẩn Gram âm, rất di động, nhiệt độ thích hợp: 35 -370C, pH: 7,5 – 7,8 Nâng nhiệt > 850C. 16 Klebsiella pneumoniae Có phổ biến trong thiên nhiên, nước, đất, ký sinh ở đường hô hấp trên người Trực khuẩn ngắn, Gram âm, không động, không sinh bào tử. 17 Nấm men Candida tropicalis Ký sinh ở vỏ và mắt thơm và phát triển độc tố nhanh ở trái bị ủng dập Phần sợi nấm có dạng trong suốt. Có khả năng sinh protease asparatyl và enzyme phospholipase phá hoại cấu trúc thành tế bào và vật chủ 18 Bacillus cereus Trong thiên nhiên va các loại thực phẩm Trực khuẩn gram dương, hiếu khí và kị khí tùy ngghi, bào tử dạng ovan, có khả năng sinh nha bào Nhiệt độ tối ưu 35-40oC Ph thích hợp 7-7,2 19 Aspergillus niger Có trong lạc, và các sản phẩm để lâu như (ngủ cốc, các loại đậu, gia vị) cũng như trong trái cây khô Các tản nấm a.niger có màu nâu sôcôla đến màu đen và mộc nhanh nhất là ở 30oC-37Oc. 20 Pseudommonas Fluoresens Có nhiều trong tiêm mao, nó có một sự trao đổi chất rất linh hoạt Thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhưng một số chủng có khả năng sinh nitrat thay vì oxi Nhiệt độ tối ưu là 25-30oC 21 Staphylococci Không khí, bụi, thực phẩm Hình cầu, gram dương, không di động, không sinh nha bào, thường không có vỏ, hiếu khí hay kị khí tùy nghi,phát triển tốt ở 37oC Kháng sinh nhất là penicillin 22 Streptococcus pneumoniae Thiên nhiên Là cầu khuẩn gram dương, hình ngọn nến,thuộc hiếu khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp 37oC, pH 7,2-7,6 Dễ chết bởi các sát khuẩn thông thường( Phenol.cl2.Hg). nhiệt độ 60oC chết trong 30 phút MỐI NGUY HÓA HỌC STT MỐI NGUY NGUỒN GỐC BIỆN PHÁP PHÒNG NGÙA 1 Các dư lượng thuốc bảo vệ thực vật. Carbendazim Deltamethrin Diazinon Disulfoton Endosufan Ethephon Ethoprophos Fenamiphos Heptachlor Methidathion Có sẵn trong nguồn nguyên liệu Đến khu vực thu hoạch khóm để giám sát,mua sản phẩm từ nơi cho phép thu hoạch của cơ quan chức năng. Chỉ nhận những lô hàng có giấy cam kết của người nuôi không sử dụng kháng sinh cấm và kết quả kiểm tra âm tính. Chỉ nhận những lô hàng có giấy cam kết của người nuôi ngừng sử dụng kháng sinh ít nhất 4 tuần trước khi thu hoạch. 2 Asen (As) Trong nguyên liệu, các hộp đựng thực phẩm. Nguyên liệu nhiễm thuốc trừ sâu Các hộp đựng phải được làm từ nguyên liệu không độc, không gây mùi lạ, không hấp thụ, không thôi nhiễm vào thực phẩm Kiểm soát nguồn nguyên liệu đầu vào 3 Chì (Pb) Từ dụng cụ chứa đựng, bảo quản thực phẩm. Từ các dụng cụ đun nấu thực phẩm. Do nhiễm thuốc trừ sâu hoặc do bao bì Rửa dụng cụ bằng xà phòng và tráng nhiều lần bằng nước sạch, không tiếp xúc với bề mặt đồ chứa đựng thực phẩm khi đã rửa xong. Đổ đầy dung dịch axit axetic 4% (v/v), để 24 giờ tại nhiệt độ phòng (ghi lượng dung dịch trước khi lấy phân tích). Sau 24 giờ quấy đều dung dịch axit axetic 4% và lấy một lượng đủ để phân tích định lượng Sb, As, Cd, Pb. 4 Thủy ngân (Hg) Do thuốc trừ sâu có thủy Do trong quá trình sản xuất clo và hydroxyt natri và thủy ngân bay vào không khí - Thu mua nguyên liệu ở vùng đảm bảo các yêu cầu sau: Phun thuốc được phép sử dụng trên cây trồng đó; sử dụng đúng thuốc, đúng liều lượng, nồng độ và đúng lúc, đúng cách; tuân thủ thời gian cách ly trước khi thu hoạch; nguyên liệu phải được trồng ở những khu vực có kết quả giám sát dư lượng chất độ hại trong nguyên liệu dưới mức cho phép, và cách xa khu công nghiệp, khu vực ô nhiễm, đảm bảo không nhiễm kim loại,… -vệ sinh khu vực nhà xưởng sạch sẽ để giảm chất độc hại trong không khí 5 Đồng (Cu) Trong nguyên liệu, máy móc Nhận nguyên liệu ở những khu vực có kết quả giám sát dư lượng chất độ hại trong nguyên liệu dưới mức cho phép, và cách xa khu công nghiệp, khu vực ô nhiễm, đảm bảo không nhiễm kim loại,… Sử dụng đầu dò kim loại Kiểm soát chắt chẽ khâu rà kim loại Vệ sinh máy móc trước khi sản xuất 6 Kẽm (Zn) Thiết bị máy móc trong quá trình chế biến Có sẵn trong nguyên liệu Thu mua nguyên liệu ở khu vực cách xa khu công nghiệp, khu vực ô nhiễm, đảm bảo không nhiễm kim loại,… Vệ sinh thiết bị trước khi đưa vào sản xuất. Kiểm soát chặt chẽ khâu rà kim loại Loại bỏ các nguyên liệu không đạt tiêu chuẩn trước khi đưa vào chế biến. Thiếc (Sn) Nguyên liệu, nguồn nước. Sử dụng nước sạch, không chứa các chất ô nhiễm khác Nước đưa vào sản xuất phải được xử lí và giữ ở điều kiện thích hợp Nguyên liệu phải được xủ lí trước khi đưa vào sản xuất , thu mua nguyên liệu cách xa khu vực ô nhiễm, khu công nghiệp, đảm bảo không nhiễm kim loại,.. 8 Photpho (P) Có sẵn trong nguyên liệu Có sẵn ở trong đất hoặc được bổ sung thêm 1 khối lượng nhỏ qua công đoạn bón phân (nhất là phân lân), chất phụ gia cho đất (thạch cao, phân chuồng), và hóa chất sử dụng trong công nghiệp (trước đây và hiện nay). Không thu mua nguyên liệu được trồng ở địa điểm có dư lượng hóa chất khó phân hủy Nguyên liệu phải được xủ lí trước khi đưa vào sản xuất , thu mua nguyên liệu cách xa khu vực ô nhiễm, khu công nghiệp, đảm bảo không nhiễm kim loại,.. 9 Megie( Mg) Có sẵn trong nguyên liệu hoăc cây hấp thu qua đất , phân bón. Nguyên liệu phải được xủ lí trước khi đưa vào sản xuất , thu mua nguyên liệu cách xa khu vực ô nhiễm, khu công nghiệp, đảm bảo không nhiễm kim loại,.. Không thu mua nguyên liệu được trồng ở địa điểm có dư lượng hóa chất khó phân hủy 10 Canxi (Ca) Có sẵn trong nguyên liệu Nguyên liệu phải được xủ lí trước khi đưa vào sản xuất , thu mua nguyên liệu cách xa khu vực ô nhiễm, khu công nghiệp, đảm bảo không nhiễm kim loại,.. Không thu mua nguyên liệu được trồng ở địa điểm có dư lượng hóa chất khó phân hủy 11 Citrinin Do nấm mốc penicillium verucosum, Asperfillus tổng hợp nên 1. Sử dụng hóa chất dùng trong bảo quản thực phẩm với lượng phù hợp đảm bảo không gây hại tới sức khỏe, sản phẩm như: S02 và sulfit với hàm lượng 200-300ppm. 2. Không sử dụng nguyên liệu phát hiện có nhiễm VSV, nấm mốc,… 3.Cần loại bỏ các nguyên liệu hư hỏng trước khi đưa vào sử dụng 12 Ochratoxin A Do nấm mốc Aspergillus ochraceus tổng hợp nên 1. Sử dụng hóa chất dùng trong bảo quản thực phẩm với lượng phù hợp đảm bảo không gây hại tới sức khỏe, sản phẩm như:nitrt natri với hàm lượng 120ppm. 2. Không sử dụng nguyên liệu phát hiện có nhiễm VSV, nấm mốc,… 3.Cần loại bỏ các nguyên liệu hư hỏng trước khi đưa vào sử dụng 13 Trichothecenes Do nấm mốc Fusarium tổng hợp 1. Sử dụng hóa chất dùng trong bảo quản thực phẩm với lượng phù hợp đảm bảo không gây hại tới sức khỏe, sản phẩm như: acid benzoic và benzoate 0.1%. 2. Không sử dụng nguyên liệu phát hiện có nhiễm VSV, nấm mốc,… 3.Cần loại bỏ các nguyên liệu hư hỏng trước khi đưa vào sử dụng. 14 Đốc tố do yersinia tiết ra ( enterotoxin) Do Staphylococcus cầu khuẩn gram(+) tạo ra 1. Sử dụng hóa chất dùng trong bảo quản thực phẩm với lượng phù hợp đảm bảo không gây hại tới sức khỏe, sản phẩm như: sử dụng sorbate 5-10% vào sản phẩm 2. Không sử dụng nguyên liệu phát hiện có nhiễm VSV, nấm mốc,… 3. Cần loại bỏ các nguyên liệu hư hỏng trước khi đưa vào sử dụng. 15 Aflatoxin Do nấm mốc Aspegillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspegillus moninus gây ra 1.Sử dụng hóa chất dùng trong bảo quản thực phẩm với lượng phù hợp đảm bảo không gây hại tới sức khỏe, sản phẩm như: acid acetic và muối ace. 2. Không sử dụng nguyên liệu phát hiện có nhiễm VSV, nấm mốc,… 3.Cần loại bỏ các nguyên liệu hư hỏng trước khi đưa vào sử dụng tate 0.15% 16 Ergotamine Do nấm Claviceps purpurea tổng hợp nên 1. Sử dụng hóa chất dùng trong bảo quản thực phẩm với lượng phù hợp đảm bảo không gây hại tới sức khỏe, sản phẩm như: parabens 0.1% 2. Không sử dụng nguyên liệu phát hiện có nhiễm VSV, nấm mốc,… 3.Cần loại bỏ các nguyên liệu hư hỏng trước khi đưa vào sử dụng 17 Trichothecenes Do Fusarium sporotrichioides. Tiết ra. Chuẩn bị và phải đảm bảo nguồn thức ăn không bị nhiễm nấm mốc. Trichothecenes rất bền với các tác động của môi trường và bền với nhiệt, bền vững trong không khí và ánh sáng hàng tuần lễ. Có thể xử lý hoàn toàn Trichothecenes ở 6000C/10 phút trong dung dịch NaOH. Trichothecenes có thể dễ dàng được loại bỏ phần lớn bằng nước. Trichothecenes bị vô hoạt trong dung dịch NaHSO3 3 – 5%. Trichothecenes mất hoạt tính khi kết hợp vói một số chất như bentonit và đất sét trắng. MỐI NGUY VẬT LÝ STT MỐI NGUY NGUỒN GỐC BIỆN PHÁP PHÒNG NGÙA 1 Cát sỏi, Bụi bẩn Hiện diện trên nguyên liệu Công đoạn rửa sẽ loại bỏ. 2 Côn trùng Hiện diện trên nguyên liệu Công đoạn rửa sẽ loại bỏ. 3 Mắt, cuốn, vỏ khóm Lẫn vào trong sản phẩm sau công đoạn cắt, gọt Công đoạn rửa sẽ loại bỏ. 4 Vật lạ trong acid citric, đường, pectin Hiện diện trong nguyên liệu: acid citric, đường, pectin Yêu cầu các chứng nhận từ nhà cung cấp. Giao ước với nhà cung cấp áp dụng các chương trình bảo đảm an toàn và chất lượng thực phẩm. 5 Các mảnh kim loại Từ các thiết bị cắt, gọt, nghiền, xé, chà lẫn vào trong sản phẩm Bảo trì máy móc, duy trì trong tình trạng hoạt động tốt để luôn gắp được tất cả các chai đưa vào. Công đoạn dò kim loại sẽ phát hiện và loại bỏ. 6 Tóc, Lông Từ công nhân Kiểm soát bằng SSOP và GMP 7 Móng tay Từ công nhân Kiểm soát bằng SSOP và GMP 8 Trang sức Từ công nhân Kiểm soát bằng SSOP và GMP 9 Các mảnh thủy tinh Khi thiết bị làm việc với chai, lọ không hoạt động tốt có thể làm vỡ chai, các mảnh thủy tinh có thể văng vào các chai khác nhưng điều này rất hiếm khi xảy ra. Bảo trì máy móc, duy trì trong tình trạng hoạt động tốt để luôn gắp được tất cả các chai đưa vào. Thiết bị kiểm tra phát hiện và loại bỏ. 10 Vật lạ, bụi bẩn trong lọ, nắp lọ Vật lạ, bụi bẩn xuất hiện trong lọ, nắp lọ sau khi tiếp nhận và rữa. Đối với các vật không quan sát được bằng mắt thường cần phải lắp đặt các thiết bị điện tử hỗ trợ. Kiểm soát chặt chẽ các chức năng của máy kịp thời chỉnh sửa hay bảo trì thiết bị. B. KIỂM TRA TỔNG QUAN MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ TRONG JAM KHÓM. Tìm tổng vi sinh vật hiếu khí (phương pháp cốc). Pha loãng mẫu với nước tùy mức độ. Sau đó lấy mẫu trên lại pha loãng tùy mức độ. Từ đó lấy 1ml hay 1 gam mẫu cấy vào thạch thường. Để vào tủ ấm 370C trong 24 – 40 giờ. Đếm số khuẩn lạc và tính toán theo công thức: Trong đó: x: tổng số vi khuẩn trong 1 ml hay 1g sản phẩm a: số lượng khuẩn lạc đếm được 10n: tỉ lệ pha loãng v: lượng đổ thêm vào q: thể tích hay trọng lượng mẫu c: thể tích mẫu cấy vào đĩa petri ví dụ: phải kiểm tra vi sinh trong Jam khóm có trọng lượng 500 gam. Ta pha loãng 500ml nước. Sau đó lấy mẫu và pha loãng ở mức độ 1/100. lấy 1ml mẫu này cấy vào thạch hộp đĩa petri. Nuối cấy 370C trong 24 giờ. Ta đếm được 200 khuẩn lạc. Khi đó tổng số vi khuẩn có trong 100ml mẫu sẽ là: tế bào/1ml Quy trình thực hiện: Mẫu Môi trường Pha loãng Chuẩn bị Gieo cấy ( cấy gạt, đổ hộp) Nuôi cấy Tính kết quả kiểm tra tổng số bào tử của vi sinh vật hiếu khí. Quy trình thực hiện. Môi trường Mẫu Chuẩn bị Đun sôi cách thủy cho đến sôi Gieo cấy (hút 1ml) Nuôi cấy ( 370C, 24 – 48 giờ). III. Staphylococcus aureus 1. Đặc điểm: 1.1 Đặc điểm chung. Stahylococcus aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều trong các thực phẩm như: thịt, trứng, sữa... và trên da, tóc, lông của người và động vật. Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh, được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội, vì có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập. Hình 3.1 Stahylococcus aureus Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1µm, thường không có màng nhầy, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ.Vi khuẩn phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, hiều khí hoặc kỵ khí tùy ý, mọc tốt ở 370C nhưng tạo sắc tốt ở 200C. 1.2 Đặc điểm sinh hóa: Phát triển tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh. Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu. Phản ứng indol, NH3., thủy phân gelatine, đông huyết tương. Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn trơn bóng, đục mờ. Trên môi trường lỏng tế bào ở dạng cặn, vòng nhãn mờ trong ống nghiệm ở bề mặt môi trường Khuẩn lạc của S. aureus Hình 3.2 khuẩn lạc của S.aureus trên môi trường thạch máu 2. Tính chất của Staphylococcus aureus 2.1 Tính chất nuôi cấy: Vi khuẩn phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S.aureus là 18 – 400C, pH=7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 250C, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao. Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35-370C. S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến nên thhường có mặt trong nhóm thực phẩm đã được qua chế biến và nấu chín. 2.2 Tính chất kháng sinh và đề kháng. Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác, chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác. S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase ( beta – lactamase). Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. Ngoài ra, cầu khuẩn S.aureus không có khả năng tạo bào tử như vi khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn. 3. Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus: Laminin và fibronectin tạo thành mạng lưới dày đặc trên bề mặt biểu mô và nội mạc của tế bào kí chủ. Fibrin được tạo từ tiền chất thúc đẩy quá trình đông máu và tổn thương mô. Adhesion tương tác với collagen giúp vi khuẩn bám lên tế bào mô bị hư hỏng, được tìm thấy ở các chủng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp. Vỏ polysaccharide: một số chủng S. aureus có thể tạo vỏ polysaccharide . Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Thành vi khuẩn có techoic acid (TE), lypoteichoic acid (LTA), peptidoglycan (PGN), protein A. Gần đây một số nghiên cứu cho thấy màng S. aureus có thành phần diacullipoprotein (DLP) cũng đóng vai trò quan trọng để kích hoạt các miễn dịch tại chỗ và hệ thống. S. aureus còn có các protein giúp cho việc gắn vào da dễ dàng. Đó là các Clumping protein, Pindin protein.Sự kháng kháng sinh của S. aureus là một đặc điểm rất đáng chú ý. Đa số S. aureus kháng lại peniciline G kháng lại do vi khuẩn này sản xuất được men peniciline A nhờ gen của R.plasmid. Một số còn lại kháng lại được methycilin gọi là methycilin resistance S. aureus (MRSA), do nó tạo ra được các protein gắn vào các vị trí tác động của kháng sinh. Hiện nay, một số rất ít S. aureus còn đề kháng được với Cephulosporin các thế hệ. Kháng sinh còn dùng trong các trường hợp này là vancomycin. 3.1 các loại độc tố. Hemolysis: gồm 4 loại (alpha, beta, gamma, delta), mang bản chất protein gây tan máu beta, tác động khác nhau lên các hồng cầu khác nhau. Có khả năng sinh kháng, gây hoại tử da tại chổ và giết chết súc vật thí nghiệm. Alpha-hemolysis: làm hư hỏng màng tế bào mạnh nhất, có khả năng ức chế thẩm thấu của màng, liên kết với các tế bào nhạy cảm như tiểu cầu, bạch cầu có khả năng phân hủy hồng cầu tổn thương hồng cầu. Alpha hemolysin tiết ra sẽ gắn vào màng của tế bào nhạy cảm, sự gắn kết đó tạo thành một màng đầy nước tạo điều kiện thấm nước không kiểm soát được các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ. Khi các phân tử quan trọng đi qua như ATP, ion thì không thể đảo ngược thẩm thấu dẫn đến phá vỡ thành tế bào gây ra cái chết cho tế bào chủ. Beta-hemolysis: là một trong những exotoxins được sản xuất bởi hầu hết các chủng S.aureus, là protein có khả năng gây thoái hóa sphingomyelin gây ngộ độc cho nhiều tế bào kể cả hồng cầu người. Delta-hemolysis: là một peptide rất nhỏ sản xuất bởi hầu hết các chủng S.aureus, là một protein hoạt động bề mặt và có thể dễ dàng chèn thêm chính nó vào cấu trúc màng kỵ nước và các kênh ion. Gamma-hemolysis: nhạy cảm với các loại hồng cầu của thỏ, cừu, người, chuột, bò, ngựa. Gây ra hoại tử nhẹ ở da thỏ, chuột, có thể gây chết thỏ. Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc TSST ( toxic shack syndrome toxin): thường gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông băng dày, bẩn hoặc những người nhiễm trùng vết thương. Khó phân biệt độc tố này với enterotoxin F. TSST kích thích giải phóng TNF (Tumor neerosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I,II. Cơ chế gây sốc của nó giống như độc tố ruột. Độc tố exfoliatin hay epidermolitic: Là các men phá hủy thượng bì. Men này gây tổn thương da tạo các bọng nước, Gây hội chứng phồng rộp và chốc lở da ở trẻ em. 85% các chủng S.aureus thuộc loại phage nhóm II tạo độc tố này. Nó gồm 2 loại A và B, đều là polypeptide, loại A bền với nhiệt độ 1000C/20 phút, còn loại B thì không. Kháng thể đặc hiệu có tác dụng trung hòa độc tố này. Alpha toxin: bản chất là protein gây tan các bạch cầu đa nhân và tiểu cầu, từ đó gây ra ổ áp xe, hoại tử da và tan máu. Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không có tác dụng chống nhiễm khuẩn. Độc tố bạch cầu (Leucocidin): là nhân tố giết chết bạch cầu của nhiều loại động vật, bản chất là protein, không chịu nhiệt. Tụ cầu gây bệnh có thể bị thực bào như tụ cầu không gây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên trong bạch cầu. Gồm hai mảnh F và S có thể tách rời nhau, trọng lượng phân tử là 32000, 38000 Dalton. Nếu hai mảnh này tách rời nhau thì chúng sẽ mất khả năng gây độc. Chúng gây ra nhiễm trùng da và hoại tử. Ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic): độc tố này tương tự như độc tố sinh mủ của liên cầu. Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyte, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm với nội độc tố như gây shock, hoại tử gan và cơ tim. Gồm 3 loại ký hiệu A, B, C. Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử và về tính đặc hiệu kháng nguyên, giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào. Dung huyết tố (hemolycin staphylolycin): phá hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào. Fribrinolysin (enzyme Staphylokinase): Nhiều chủng của S.aureus thể hiện một hoạt hóa plasminogen gọi là staphylokinase. Nó làm phá hủy fibrin. Là một enzyme đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người trong các cục máu và gây vỡ các cục máu này tạo nên tắc mạch. Cơ chế này giống với Steptokinase, được sử dụng trong y học để điều trị bệnh nhân bị huyết khối động mạch vành. Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ, chống đông với citrate natri và oxalate natri. Coagulase làm dính tơ huyết vào bề mặt vi khuẩn và do đó cản trở sự thực bào. Men này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm và một enzyme vách vi khuẩn giúp S. aureus tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó. Hyaluronidase: men này có khả phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức. Thủy phân axit hyaluronic của mô liên kết. Beta- lactamase: men này phá hủy vòng beta lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Uredopenicilline làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. Độc tố ruột (enterotoxin): Trong đó có SEB (Staphylococcal enterotoxin B ). Do một số chủng tụ cầu vàng tạo thành, đặc biệt lúc phát triển ở nồng độ CO2 lớn (30%) và môi trường đặc vừa. Đây là những loại protein tương đối chịu nhiệt không bị phân hủy bởi sự đun nấu. Nó đề kháng với sự đun sôi trong 30 phút cũng như tác động của enzyme ở ruột. Các độc tố ruột này gây nhiễm khuẩn thức ăn và viêm ruột cấp. Bao gồm 6 loại được ký hiệu từ A-F. Về mặt miễn dịch 6 loại này được phân biệt rõ ràng mặc dù chúng có kháng nguyên chéo về cơ chế gây bệnh, kích thích tạo ra một lượng lớn interleukin I và II. 4. Cơ chế gây bệnh của S.aureus: Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao gồm: Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu. Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. S.aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. Tác nhân gây bệnh như S.aureus mới có khả năng khởi động các quá trình sinh hóa đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ. S.aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase, hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ. Hầu hết các chủng S. aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiên tượng gắn độc này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa, chúng là các receptor cho các đại thực bào. Qúa trình gắn trên giúp S. aureus tránh không bị đại thực bào. Ngoài ra, phần lớn các chủng S. aureus một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. Ước tính khoảng 0,1µg S.aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người. 5. bệnh và các triệu chứng bệnh do s.aureus: S.aureus có mặt ở khắp nơi trong thiên nhiên như: không khí, nước, da, họng, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng…và chỉ gây độc khi hình thành độc tố ruột (Enterotoxin). Những trường hợp nhiễm độc đầu tiên do ăn bánh kẹo gây ra bởi tụ cầu vàng đã được nói đến từ những năm 1901-1914. Ở Việt Nam cũng như trên khắp thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên. Khả năng gây độc chỉ xảy ra khi ăn thức ăn cùng độc tố của vi khuẩn. Còn nếu chỉ ăn vi khuẩn thì không gây ra ngộ độc. Điều đó chứng tỏ, ngộ độc là do độc tố của vi khuẩn được sản xuất ra trong môi trường thức ăn với sự hoạt động của vi khuẩn, độc tố ruột là một loại độc tố mạnh. S.aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: mụn nhọt, chốc lở, viêm da, viêm phổi, viêm não, viêm tủy sương, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng ngoài tim, viêm màng não, áp-xe trong cơ, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẩu. 5.1 Ngộ độc thực phẩm-viêm dạ dày, ruột: Ngộ độc thực phẩm là một căn bệnh của ruột, ngộ độc thực phẩm có thể do ăn uống phải độc tố ruột của S.aureus cư trú trong đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên nhân là do ăn thức ăn bị nhiễm độc tố (105 vi khuẩn/g thức ăn) hoặc do vi khuẩn tăng sinh trong đường ruột (có đến 2-30% số người mang vi khuẩn này trong ruột. S.aureus có thể nhiễm từ môi trường hoặc từ người chế biến sẽ sinh sôi rất nhanh trong thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng thích hợp (thường gặp nhất là các loại thực phẩm giàu protein như: thịt bò muối, đùi lợn muối, xúc xích, kem, sốt, pho mát) và sinh ra độc tố đường ruột, gây ngộ độc. Khả năng trúng độc của cơ thể phụ thuộc vào loại độc tố, số lượng độc tố, khả năng đề kháng của cơ thể. Triệu chứng: các triệu chứng thường xảy ra 2-4 h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc. Triệu chứng ban đầu là sự tiết nước bọt, buồn nôn, nôn mửa và đi ngoài dữ dội, phân có lẫn nước, đau bụng, co rút vùng bụng, tiêu chảy. Triệu chứng thứ cấp là đổ nhiều mồ hôi, ớn lạnh, đau đầu, mất nước. 5.2 Viêm phổi: S.aureus thể xâm nhập vào nhu mô phổi qua hai đường: hít vào đường hô hấp trên hoặc lây lan qua đường máu. Thường sau khi mắc bệnh cúm hoặc ở người suy giảm miễn dịch, tụ cầu vàng theo dịch tiết đường hô hấp trên bị hít vào phổi. Tuy đây là bệnh ít gặp nhưng đó lại là bệnh nhiễm khuẩn nghiêm trọng. Vi khuẩn tạo vỏ bọc dễ xâm nhập vào máu gây nhiễm khuẩn huyết. Viêm phổi thường gồm nhiều ổ, tâm ổ viêm là phế quản hoặc tiểu phế quản viêm hoại tử, xuất huyết. Các ổ viêm này vỡ ra tạo ra các ổ áp-xe. Ở những ca nặng, thành phế nang thường bị phá hủy, không khí vào phế nang bị phá hủy nhưng không thoát ra được, tạo ra các túi khí thành mỏng. Các yếu tố gây nguy cơ mắc bệnh là điều kiện sống kém, sử dụng kháng sinh bừa bãi, bệnh nhân nằm viện lâu ngày làm giảm sức đề kháng của cơ thể tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào đường hô hấp, đồng thời làm giảm chức năng miễn dịch của cơ thể. Triệu chứng: phổ biến là sốt cao, mạch nhanh, thở nhanh, ho, ít gặp ho ra máu. Có thể suy hô hấp, sốc nhiễm khuẩn, nhiễm độc hệ thống, khó thở, hoại tử và hình thành ổ áp-xe. Hai biến chứng hay gặp nhất là tràn dịch màng phổi và mủ màng phổi. 5.3 Hội chứng shock do độc tố: Là căn bệnh gây ra bởi độc tố TSST-1 được tiết ra bởi vi khuẩn S.aureus phát triển trong điều kiện có ít hoặc không có oxy. Bệnh thường gặp ở những phụ nữ trong kỳ kinh nguyệt có dùng băng thấm hút mạnh, các bông này có khả năng gắn các magnesium do đó làm giảm lượng ion này trong âm đạo. Khoảng 20% phụ nữ có mang tụ cầu ở đường âm đạo. Do lượng ion magnesium giảm xuống, vi khuẩn này tăng cường sản xuất các ngoại độc tố gây sốc. Hội chứng Thukydides là thể đặc biệt của hội chứng sốc nhiễm độc. Hội chứng này có thể gặp ở thanh thiếu niên cả hai giới, thường gặp do bội nhiễm tụ cầu sau khi bị cúm. Tỷ lệ tử vong của hội chứng này khá cao trên 50%. Biểu hiện lâm sàng về mặt hô hấp và tiêu hóa rất giống với bệnh dịch hạch do Thurykodides mô tả ở Athen và năm 430 trước công nguyên. Triệu chứng: đột ngột sốt cao, cảm giác mệt mỏi, tiêu chảy toàn nước, nhức đầu, đau cơ, nổi bang ngoài da, có một vài dấu hiệu của sốc, nôn mửa, hạ huyết áp. Có thể có phát ban như bị cháy nắng, lột da, vết đỏ đặc hiệu ngoài từng đám hay lan toàn thân nhanh, có thể có biểu hiện xung huyết, kết mạc, họng đỏ, phù ngoại biên. Thay đổi các chỉ số cận lâm sàng như: urê máu tăng, albumin máu giảm, calcim máu hạ, hạ phosphate máu, tăng creatin phosphakinase, giảm tiểu cầu. Gây ra các rối loạn chức năng thận và cơ tim, quá tải dịch, suy hô hấp ở người lớn. Sau khoảng 1 tuần bệnh nhân bị tróc da vùng thân mình và tứ chi. Di chứng muộn gồm hoại thư ngoại biên, mất móng có thể phục hồi yếu cơ suy nhược, kéo dài và rối loạn tâm thần kinh. Nếu bệnh nặng có thể tử vong ở tỷ lệ khá cao. 5.4 Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe, viêm não, viêm tủy xương: S.aureus từ lâu đã được công nhận là một trong những vi khuẩn quan trọng nhất gây bệnh ở người. Nó là nguyên nhân hàng đầu của nhiễm trùng da và mô mềm, nó cũng có thể gây nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm trùng xương khớp, viêm thần kinh… Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe: những bệnh nhiễm trùng da và các phần phụ chủ yếu là các chân lông và tuyến mồ hôi tạo thành bệnh cảnh áp-xe kinh điển của tụ cầu vàng. Nó tạo fibrin bao bọc ổ áp xe. Các ổ nhiễm trùng này có thể chỉ nhỏ như đầu đinh nếu viêm nang lông và kích thước như quả táo như áp-xe cơ. Mủ của ổ áp-xe do tụ cầu vàng thường có màu vàng, đặc và không hôi. Triệu chứng: trên da hình thành những khu vực thường là màu đỏ, đau và xưng lên, chứa đầy mủ, xung quanh khu vực bị áp xe có thể cảm thấy ấm khi chạm vào. Đối với mô tế bào thì sự nhiễm trùng là ở các lớp cơ bản dưới da, cũng bị sưng đỏ và đau, nổi mụn nhọt và lây nhiễm. Vi khuẩn có thể xâm nhập vào từ những vết cắt, vết cạo hoặc những thương tích nhỏ, có thể xảy ra bất cứ nơi nào trên cơ thể nhưng thường xảy ra trên hai tay và hai chân. Viêm não, viêm tủy xương: Nhiễm trùng các cơ quan bên trong cơ thể có thể do đường nội sinh: từ một ổ nhiễm ngoại vi, vi khuẩn theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác. Chúng đi vào cơ thể qua các vết rách trên da sau chấn thương hoặc trong quá trình phẩu thuật. Triệu chứng: não sau viêm nội tâm mạc, chóng mặt, viêm màng não mủ, tràn mủ dưới màng cứng, viêm tắc tĩnh mạch, viêm xoang, viêm xoang chũm, yếu tay, chân, thay đổi thị giác. Gây sốt tỷ viêm mãn, viêm khớp nhiễm trùng, thường gặp ở khớp gối, hông và khớp cùng chậu, gây viêm mũi cơ. 6. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH. Các phương pháp truyền thống: nguyên tắc: S.aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Môi trường và thuốc thử: Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng để định tính S.aureus hay cũng có thể dùng trong định lượng bằng phương pháp Most Probable Number (MPN). Môi trường thạch Mannitol muối – Mannitol Salt Agar (M35): Nếu không sử dụng môi trường thạch Baird – Parker, ta có thể sử dụng môi trường thạch Mannitol muối. Thành phần chính của môi trường này gồm có peptone, chất chiết từ thịt bò,Mannitol, NaCl và Phenol đỏ. Nồng độ muối trong môi trường khá cao (7,5%) sẽ ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật. Mannitol là nguồn Carbonhydrate duy nhất để vi khuẩn lên men. Trên môi trường thạch Mannitol muối, S. aureus cho khuẩn lạc màu vàng, còn S.epidermidis (không lên men Mannitol) sẽ cho khuẩn lạc màu đỏ. Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay máu bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate. Môi trường cần được pha trước 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. Môi trường thạch Braid Parker Agar (BPA): là môi trường chọn lọc thường sử dụng để phát hiện S.aureus. Môi trường có chứa pepton và chất chiết thịt bò là những thành phần dinh dưỡng cơ bản. Glycine và sodium pyruvate có chức năng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn. Lithium chloride và potassium tellurite được sử dụng để ức chế vi khuẩn Gram âm và làm chậm sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương khác. Lòng đỏ trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng sinh tổng hợp lycithinase của S.aureus. Lưu ý: lòng đỏ trứng và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi đã khử trùng và làm nguội đến khoảng 600C . Tụ cầu sinh tổng hợp coagulase trên môi trường này sẽ có màu đen. Sự sinh tổng hợp lecithinase của vi khuẩn sẽ tạo nên vòng sáng xung quanh các khuẩn lạc. Môi trường dịch thể tim óc-Braid heart infusion broth (M36): thành phần cơ bản của môi trường gồm óc bê, tim bò, peptone, glucose và muối NaCl. Đây là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để thúc đẩy sự sinh trưởng của nhóm vi sinh vật có nhu cầu về dinh dưỡng. Huyết thanh thỏ có bổ sung ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA): được sử dụng để kiểm tra hoạt tính coagulase của vi khuẩn. Huyết thanh thường được cung cấp ở dạng đông khô. EDTA có chức năng như một tác nhân chống đông tụ. Quá trình hoàn nguyên huyết thanh được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất. c. Phương pháp c.1 phân tích định tính S.aureus Ta thực hiện song song với ống đối chứng. Quy trình định tính S.aureus 2ml Mẫu MT: MBS Cấy vào ống nghiệm môi trường MBS. Trộn đều ủ 370C/ 24 giờ Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tương, ủ 370C/ 24 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi, có tâm đen, trong suốt, 1-1,5mm, có vòng sang chung quanh khuẩn lạc Đọc kết quả, Có S.aureus thì có xuất hiện khối đông Cấy khuẩn lạc vào môi trường BHI, ủ 370C/ 24 giờ. c.3 Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ 3 ống lập lại, ủ 37oC, 48giở Chọn ống (+)đục ở mỗi độ pha loãng Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 37oC, 48 giở Chọn khuẩn lạc đặc trưng Cấy vào TSA. ủ 37±1oC, 24 giờ Thử nghiệm ngưng kết coagulase Ghi nhận số coagulase (+)ở mỗi độ pha loãng Tra bảng MPN Mật độ S.areus (MPN/g hay MPN/ml) Trã lên đĩa thạch BPA, ủ 37oC, 24-48 giờ: trãi trên thạch máu, ủ 37oC,24 giờ Đếm khuẩn lạc đặc trưng Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào TSa, ủ 37oC, 24 giờ Lấy 5 khuẩn lạc không đặc tưng cấy vào TSA, ủ 37oC,24 giờ Thử nghiệm ngưng kết coagulase Tỷ lệ khuẩn lạc đặc trưng coagulase (+) Tỷ lệ khuẩn lạc kh ông đặc trưng coagulase (+) M ật đ ộ S.areus (CFU/g hay CFU/ml) đếm khuẩn lạc không đặc trưng Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy ống nồng độ thập phân 10-1, 10-2, 10-3 Bước 1: đồng nhất mẫu. Cân chính xác 10 ± 0.1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa. Mẫu ban đầu Hình 3.3 sơ đồ pha loãng mẫu. Bước 2: phân lập trên môi trường chọn lọc: Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 10C trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu. Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh. Hình 3.4 khuẩn lạc mọc trên MT Baird Parker và MT thạch máu Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc. Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S. Aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này. Bước 3: khẳng định Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 ± 10C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2,4,6,8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. Bước 4 Tính kết quả: Mật độ S.Aureus trong mẫu được tính như sau : Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(NtHt + NaHa)/( F1+F2) Trong đó: F: là độ pha loãng Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng Ht: tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng Ha: tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng. c.4 Định lượng Stayphylococcus aureus bằng phương pháp MPN. Phương pháp này dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ S.aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao Mẫu Đống nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ thập phân 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống nghiệm canh MBS, mỗi nồng độ có 3 ống nghiệm lặp lại, ủ ở 370C/ 48 giờ Chọn ống (+), đục ở mỗi độ pha loãng Ria lên thạch BPA, ủ 370C/ 48 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh (đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng)) Cấy vào TSA,ủ ở 370C/ 24 giờ Thử nghiệm ngưng kết coagulase Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ pha loãng Tra bảng Mật độ S.aureus (MPN/g hoặc MPN/ml) Cách tiến hành và tính kết quả Bước 1: tiến hành pha môi trường Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Bước 3: đống nhất mẫu và pha loãng mẫu Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Bước 4: cấy mẫu vào canh MSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C/ 48 giờ. Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA. Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C/ 48 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng: tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (hình ) Hình 3.5 khuẩn lạc mọc trên BPA Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa Coagulase Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase (hình 3.6) Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các khối đông làm đông huyết tương. Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được dùng cho thử nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử nghiệm ở 370C/ 4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến 24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Hình 3.6 Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) không có sự kết tụ, hỗn hợp vẫn đồng nhất phương pháp hiện đại. Nhược điểm của phương pháp truyền thống là tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, tốn nhiều công sức, tốn kém,…Để khác phục những nhược điểm này, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được phát tìm và thương mại hóa. Các phương pháp này gọi chung là phương pháp hiện đại. Tất cả yêu cầu kỹ thuật có liên quan đến việc chuẩn bị mẫu, định lượng, phát hiện vi sinh vật gây bệnh, phát hiện độc tố,… trong thực phẩm đều được cải tiến theo hai hướng: Hướng thứ 1: cơ giới hóa, công cụ hóa các phương pháp và quy trình kiểm tra, đơn giả hóa hay mini hóa các phương tiện kiểm nghiệm. Hướng thứ 2: nghiên cứu cải tiến nhằm thay thế bước tăng sinh( của phương pháp truyền thống cần nhiều thời gian) bằng bước làm tăng mật độ phân tích( như phương pháp IMS), hay thay thế phương pháp phát hiện ( chẳng hạn thay thế phương pháp tăng sinh, đếm khuẩn lạc cần nhiều thời gian, bằng phương pháp vi sinh trở kháng hay phát quang sinh học) a) .Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaetion) PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn DNA theo luật số mũ. Phản ứng được thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 chu kỳ: Biến tính DNA có tác dụng tách 2 sợi đơn từ sợi khuôn khép, nhiệt độ biến tính khoảng 950C trong 30-60 giây. Bắt cặp hai mồi và hai sợi đơn của khuôn, nhiệt độ khoảng 40-700C, kéo dài 30-60 giây. Bước tổng hợp, kéo dài chuỗi nhiệt độ 720C giúp cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Ưu điểm của phương pháp này là: Thời gian cho kết quả nhanh. Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. Ít tốn kém về mặt nhân sự. Hóa chất dễ tìm kiếm và tồn trữ. Khuyết điểm: Tất cả các tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong kỷ thuật PCR. Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thường thấp, nên cần phải có thêm bước nuôi cấy để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR. Ứng dụng: Dòng hóa các gene hay một đoạn gene, đoạn RNA. Tạo đột biến. Định lượng những khác biệt trong thể gene RT-PCR. Điều tra hình sự. Kiểm tra chất lượng, sự lẫn tạp sinh học. Bảng 1. thành phần hóa chất dùng trong phản ứng PCR Một vài nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gene độc lực của S.aureus. Ở Akineden, 2001 đã dùng kỹ thuật PCR khuếch đại phát hiện gene độc lực của S.aureus trong sữa bò có độc tố ruột A (SEA), SEC, SED, SEG, SEI, SẸ, TSST-1 nhưng không thấy SEB, SEE, SHE và có cả sự hiện diện của hai độc tố màng ngoài là ETA và ETB. Abdulmula E1-Ghodban, 2005 đã khảo xác 63 dòng S.aureus (40 từ nguồn bệnh sốc độc tố và 23 nguồn từ thức ăn) tìm độc tố TSST-1 bằng PCR. Chỉ có 3 dòng được phát hiện có sự hiện diện của TSST-1. L.Chapaval, 2006 khảo xác 132 dòng vi khuẩn được phân lập từ sữa nguyên kem có sự hiện diện của độc tố ruột và TSST-1. a.1 Phương pháp PCR xác định coaguase của S.aureus trong sữa. Vật liệu: 628 mẫu sữa được lấy từ các trang trại nuôi bò ở Murrah. Vi khuẩn kiểm tra: lấy 10 µl sữa từ mỗi mẫu rồi cấy ria 5% đĩa thạch máu cừu và cấy trên đĩa thạch lactose của Mac Conkey sau đó ủ trong 24 giờ ở 370C. Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc : Gram dương, catalase dương tính, oxidase âm tính → xác định là Staphylococcus. ssp. Tụ cầu phân lập được tiếp tục phân loại coalugase (+) và (-) bằng thử nghiệm Citrate trên môi trường huyết tương thỏ (Gibbs và Skinner, 1966). Lấy mẫu coalugase (+) tiếp tục xác định đặc điểm sinh hóa theo thử nghiệm enzyme chịu nhiệt (Faruki và Mumbai, 1986). Sau đó kiểm tra bằng ngưng kết Latex (Staph Latex Test Kit, Himedia , Mumbai) và lên men Mannitol. DNA lấy trực tiếp từ sữa bằng phương pháp Phuektes (2001). Lấy 1,5 ml sữa li tâm với 600 ml đệm NTE. Vorter mẫu và ổn định dịch bằng 100 µl (24% sodium dodecyl sulphate) và giữ trong bể nước (800C, trong 10 phút ). Sau đó cho thêm 12µl protein asek (20mg/ml, Fermentas, USA) và ủ tiếp trong bể nước (560C, 2h). Hút 100µl NaCl 5M và 80µl CTAB-NaCl cho thêm vào ủ (560C, 10 phút ). Sau đó cho thêm PCI (phenol chloroform isoamyl alcohol) và CI (chloroform isoamyl alcohol) cho đến khi mẫu được làm sạch. Thu nhận kết quả ở 1/10 thể tích sodium acetate 3M (pH=5.2) và thêm 2 thể tích ethanol 100% lạnh vào, giữ ở -200C để kết tủa DNA. Sau đó li tâm 15000 vòng/15´ ở 40C để tách ethanol và thu DNA, sau đó rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%, cuối cùng làm khô. Sau đó, DNA được hòa tan trong 50µl đệm TE và giữ ở -200C đến khi sử dụng tiếp. tách DNA từ vi khuẩn nuôi cấy. DNA được tách ra từ những vi khuẩn đã được phân lập trước đó. Những dòng khuẩn lạc riêng rẻ được để qua đêm trong 25µl dung dịch đệm TE và đun sôi đến 990C trong 15 phút sau đó làm lạnh nhanh bằng cách đặt trên băng. Các mẫu kết quả DNA thu được, được bảo quản ở -200C và 5µl của mỗi mẫu được sử dụng để phân tích PCR. Phản ứng PCR thực hiện với MgCl2 , Tap DNA polymerase, mồi. Cặp mồi: F: ACCACAAGGTACTGAATCAACG R: TGCTTTCGATTGTTCGATGC Phản ứng PCR của Martineau et.al (1998): Sử dụng cặp mồi F: AATCTTTGTCGGTACACGATATTCTTCACG. R: CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAACA. PCR được thực hiện trong bể luân nhiệt. DNA phân lập từ chủng S.aureus ATCC25923. Phân tích sản phẩm PCR: sau khi khuếch đại sản phẩm PCR sẽ được chạy trên gel agarose 2% trong đệm 0,5X Tris Borate EDTA (ethidium bromide 0,2µl/ml) Gen 100bp được sử dụng làm mục tiêu. Hiệu điện thế được sử dụng 6,5V và chạy điện di trong 1h. Sử dụng tia UV để xác định sự hiện diện của vi khuẩn. Độ nhạy của mồi được đánh giá bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng khác nhau (CFU/ml) của vi khuẩn. kết quả: Hình 3.7 kết quả điện di Lane 1, 9, 11, 12: 610 bp; Lane 13: Negative control; Lane 5, 6, 8, 10: 740bp; Lane L: 100bp Ladder Lane 2, 7: 870bp; Lane 3: 960 bp; Lane 4: coa negative; Hỗn hợp phản ứng tối ưu hóa của gen coalugase dựa trên thí nghiệm chứa 200µldNTP mix, 1 dung dịch đệm PCR với 10mMTris – HCL, pH = 8,8 , 50nM KCl và 0,8% Nonidet P40); 1,5 mM MgCl2; 20pmol của mỗi mồi; 2,5U Taq DNA polymerase và 200µl DNA được tách chiết từ sữa và 25µl DEPC. Biến tính DNA ở 950C trong 5phút, 36 chu kì. Sau đó ủ ở 550C trong 1 phút và kéo dài ở 720C trong 1 phút. Phản ứng PCR được tối ưu hóa khi nồng độ MgCl2 là 2,5mM. Kiểm tra 628 mẫu sữa thì có 238 mẫu chiếm (37, 89%) các chủng dương tính. Dựa vào đặc điểm gram và haemolysis có 156 mẫu chứa tụ cầu (65,55%). Tụ cầu được phân lập từ các chủng tiếp tục phân thành 128 coalugase (+) (53,78%) và 28 coalugase (-) (11,78%). Trên cơ sở thử nghiệm citrate coalugase huyết tương thỏ các coalugase (+) được phân lập và xác định sinh hóa như S.aureus. S.aureus được phân lập và sàng lọc bằng gen coalugase dựa trên những điều kiện tối ưu của phản ứng PCR thường có độ nhạy 100%. S.aureus được phân lập có sản phẩm khuếch đại có kích thước 108bp. Kết quả: Hình 3.7. Ubiquitous PCR assay for Staphylococcus aureus. Lane 1-4: Staphylococcus aureus Positive samples; Lane 5: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Lane 6: Negative control with Nuclease free water; Lane L: 100bp Ladder; b). Lai phân tử: Phương pháp lai phân tử còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Phương pháp này dùng để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời của hai mạch đôi của chuổi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có nóng chảy tm của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleortide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung được cố định trên một giá thể rắn. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt. Mục đích sử dụng gene trak S.aureus là một phương pháp dùng để phát hiện S.aureus trong thực phẩm. Thử nghiệm DNA hybridization sử dụng đầu dò DNA S.aureus và thiết bị đo màu để phát hiện S.aureus trong thực phẩm sau khi đã làm giàu mẫu. Phương pháp này dùng để định lượng xác định sự hiện diện của S.aureus ở mức độ ô nhiễm > 3 tế bào/g trong mẫu thực phẩm gốc. Một mẫu được xem là không có sự hiện diện của S.aureus nếu giá trị hấp thụ thu được ít hơn hoặc bằng giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thành lập. Một mẫu được xem là có sự hiện diện của S.aureus nếu giá trị hấp thụ thu được lớn hơn giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thiết lập. Thao tác thực hiện: Làm phong phú các mẫu thực phẩm. Lấy 0,5 ml mẫu cho vào 12x0,75 ống nghiệm. Cho 0,1 ml thuốc thử để xử lý sơ bộ mỗi ống và lắc trong 5 giây, sau đó ủ trong bồn nước 370C trong 30 phút. Cho thêm 0,1 ml thuốc thử phân giải vào mỗi ống nghiệm và lắc trong 5 giây. Thay nước và ủ trong bồn nước 370C trong 45 phút. Thêm 0,5 ml mẫu dò S.aureus vào mỗi ống nghiệm. Đặt dipstick vào mẫu, nâng lên, hạ xuống 5 lần để trộn và ủ ở 650C trong 1 giờ. Rửa dipsticks hai lần mỗi lần 1 phút, lần đầu 650C, sau đó ở nhiệt độ phòng. Chuyển tiếp vào ống chứa 0,75 ml enzyme liên kết và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Rữa dipsticks hai lần trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển dipsticks đến ống chứa 0,75ml chất nền tạo màu và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Lấy dipsticks ra và thêm 0,25ml thuốc dừng. Đọc kết quả bằng cách sử dụng Gene Trak quang kế. Đo ở bước sóng 450 nm, mẫu âm tính thì OD 0,1. Để có kết quả chính xác nhất thì có thể thử nghiệm lại các phản ứng sinh hóa. Thuốc thử phân giải là: NaOH 0,75M. Hóa chất rửa: 50mM Tris-HCl (pH=7,5); 2mM EDTA; 100mM NaCl. Chất nền tọa màu: Tetramethylbenzidine, bảo quản ở nhiệt độ 2-80 C. Enzyme liên kết: Antifluorescein antibody, bảo quản ở nhiệt độ 2-80 C. Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate. Thuốc dừng: sulfuric acid 2M. Độ nhạy 1-5gCFU/25g. Thời gian thử 3h (sau khi làm giàu 24h). Các xét nghiệm cho mỗi kit lên đến 98. Hệ thống dò gene trak (Framingham, USA): mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chất phát quang. c). Dùng Bacteriophage để làm Kit thử nhanh MRSA. Kỹ thuật khuếch đại bacteriophage để dò tìm S.aureus và xem thử vi khuẩn này có nhạy cảm hay đề kháng với methicillin hay không. Bộ thử nghiệm này do công ty Microphage sản xuất. Mẫu cấy máu được trộn đều trong hai ống tách rời và đặt trong lò ủ 5 giờ. Sau đó lấy hai ống nghiệm ra và lấy mỗi ống 6 giọt nhỏ vào giấy thử. Một ống tìm xem có S.aureus hay không, ống kia xem vi khuẩn có nhạy cảm hay đề kháng với kháng sinh không. Thử nghiệm nhận diện S.aureus có độ nhạy 93% và tính đặc thù 98%. Thử nghiệm chủng nhạy cảm với methicillin có độ nhạy 99% và đặc thù 99%. Phương pháp là dùng vài giọt mẫu (Jam khóm pha loãng) với dịch cấy có chứa một số lượng nhỏ bacteriophage. Nếu có vi trùng sống hiện diện trong mẫu phân tích thì bacteriophage sẽ xâm nhập vào vi trùng và sẽ sản sinh rất nhanh trong vòng vài tiếng đồng hồ và phóng thích ra môi trường thật nhiều phage. Sự hiện diện của phage sẽ được định bằng immunoassay. Còn nếu muốn xem coi nó có kháng với MRSA thì phải làm 2 thử nghiệm song song. Thử nghiệm một là thử nghiệm để phát hiện có sự hiện diện của vi khuẩn. Thử nghiệm hai cho thuốc kháng sinh vào mẫu có vi khuẩn trước khi đưa vào môi trường có phage. Như vậy nếu có vi khuẩn thì vi khuẩn sẽ bị kháng sinh giết chết hết và khi cho phage vào phage sẽ không sản sinh được. Kết quả âm chứng tỏ vi trùng nhạy thuốc. Ngược lại nếu vi trùng kháng thuốc mạnh mẽ chúng sẽ không bị giết chết bởi thuốc và khi cho vào môi trường cấy có phage, phage sẽ xâm nhập vào vi khuẩn để tăng trưởng sinh sản thật nhiều và cho kết quả dương tính. Có nghĩa là vi khuẩn kháng với thuốc dùng. GIỚI THIỆU SHIGELLA Đặc điểm Shigella là trực khuẩn Gram âm tính, không có lông, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh nha bào. Có khả năng chịu đựng yếu tố ngoại cảnh tương đối tốt tuy nhiên chết khi tiếp xúc trực tiếp với môi trường khô và dưới ánh sáng mặt trời. - Shigella là một trong những vi khuẩn kháng thuốc ở mức độ cao nhất . - Chẩn đoán xác định dựa vào dịch tễ học, hội chứng lỵ, kết quả cấy phân Shigella(+). Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm. Không sinh H2S, Urease âm tính phản ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrat âm tính. Shigella có kháng nguyên thân O, không có kháng nguyên H. Căn cứ vào kháng nguyên O và tính chất sinh hóa, nguời ta chia Shigella ra làm 4 nhóm: Nhóm A (Shigella dysenteriae) Không lên men manitol, có 10 type huyết thanh đuợc ký hiệu bằng các chữ số Ả Rập từ 1 - 10. Các type huyết thanh trong nhóm không có quan hệ về kháng nguyên với nhau và cũng không có quan hệ kháng nguyên với các nhóm khác. Type 1 (Sh.dysenteriae 1) hay còn gọi là trực khuẩn Shiga là type có ngoại độc tố. Nhóm B (Shigella flexneri) Lên men manitol, có 6 type huyết thanh. Các type này có 1 kháng nguyên nhóm chung và mỗi một type huyết thanh lại có 1 kháng nguyên đặc hiệu type. Nhóm C (Shigella boydii) Lên men manitol, có 15 type huyết thanh, mỗi type có kháng nguyên đặc hiệu type. Nhóm D (Shigella sonnei) Lên men manitol, lên men lactose chậm, chỉ có 1 type huyết thanh. Hình thái Shigella có dạng hình que thẳng dài 1-3µm, không có lông, không di động, khôngcó vỏ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm. Hình4.1 Shigella flexneri Hình 4.2. Shigella dưới kính hiển vi Năm 1891, Trực khuẩn Shigella được Grigoriep phân lập gồm nhiều loài khác nhau: Shigelladysenteriae có ngoại độc tố; Shi.flexneri; Shi.boydii; Shi.sonn. Nuôi cấy Như các vi khuẩn đường ruột khác, Shigella là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện nhưng phát triển rất tốt trong điều kiện hiếu khí. Trên môi trường đặc, sau 24h, chúng tạo thành khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, trongvà có đường kính khoảng 2mm. Trên môi trường phân lập có lactose, khuẩn lạc vẫn không màu. Khuẩn lạc của Shigella : Nuôi cấy được trên môi trường hiếu khí cũng như kị khí. Sống được từ 8- 400C; pH=6.5-8.8, thích hợp nhất ở 370C; pH=7-8 nhưng mọc được ở môi trường có pH 6.6-8.8. Trên môi trường lỏng như canh thang, pepton, vi khuẩn mọc sớm và làm đục đều môi trường. Trên môi trường thạch Istrati, SS, sau 24h cho khuẩn lạc có dạng hình chữ S(nhẵn bóng, bờ đều hơi lồi), trong và nhỏ hơn khuẩn lạc của Salmonella. Khuẩn lạc Shigella có đường kính khoảng 2mm. Hình 4.4: Khuẩn lạc Shigella trên: Môi trường EMB. Môi trường MacConkye. Môi trường ENDO. Môi trường Hettoen. Môi trường SS agar. Độc tố của Shigella Các Shigella đều có nội độc tố và một số Shigella có ngoại độc tố. Nội độc tố: bản chất là lypopolysacharide ở thành tế bào vi khuẩn có thể kích thích thành ruột. Đặc điểm: Nội độc tố bao gồm các kháng nguyên O, polysachride lõi và lipid A. Nội độc tố có tính độc mạnh, cấu tạo như kháng nguyên thân, là loại khángnguyên yếu. Tác dụng chủ yếu là gây phản ứng trong ruột. Ngoại độc tố: Độc tố này rất độc, mạnh như độc tố của trực khuẩn uốn ván, có tác dụng đặc hiệu vào hệ thần kinh. Đặc điểm :Shigella dysenteriae tiết độc tố shiga : không bền nhiệt nhưng có tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh trung ương.Độc tố shiga gây tiêu chảy, ức chế tiếp thu đường và các acid amin ở ruột non.Trên hệ thần kinh thì chất độc gây các biểu hiện lâm sàng trầm trọng, có thể tửvong. Shigella flexneri và Shigella sonnei tiết ra Shiga-like toxin có tính chất giốngShiga toxin nhưng ít độc hơn và số lượng ít hơn. Cơ chế gây bệnh của Shigella Tại đường tiêu hóa, Shigella gây tổn thương đại tràng. Shigella (Trực khuẩn lỵ) gây bệnh nhờ khả năng xâm nhập và nội độc tố, Shigella dysenteriae và Shigella flexneri còn có thêm ngoại độc tố. Vi khuẩn bám rồi xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Chúng nhân lên nhanh chóng trong lớp niêm mạc. Vi khuẩn chết giải phóng ra nội độc tố gây xung huyết, xuất tiết, tạo những ổ loét và mảng hoại tử. Nội độc tố còn tác động lên thần kinh giao cảm gây co thắt và tăng nhu động ruột. Những tác động đó làm bệnh nhân đau bụng quặn, buồn đi ngoài và đi ngoài nhiều lần, phân có nhầy lẫn máu.  Ngoại độc tố của Shigella dysenteriae và Shigella flexneri có độc tính với thần kinh trung ương, có thể gây viêm màng não và hôn mê. Tuy nhiên, vi khuẩn chỉ sinh ra ngoại độc tố sau khi đã xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Không có miễn dịch tự nhiên, vai trò bảo vệ chủ yếu dựa vào IgA ở ruột Hình 4.5. Cơ chế gây bệnh của shigella Cách vô hoạt Shigella bị tiêu diệt dưới ánh sáng mặt trời trong vòng 30 phút, ở 600C trong 10-30 phút. Bị chết ngay ở nồng độ phenol 5%. Khả năng gây bệnh cho nguời Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở nguời, đây là một bệnh truyền nhiễm có thể gây thành các vụ dịch địa phương. Thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phân có nhiều mùi nhầy và thuờng có máu. Shigella gây bệnh bằng cơ chế xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số luợng lớn trong tổ chức ruột. Các Shigella dều có nội độc tố. Riêng trực khuẩn Shigella còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein . Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae 01 và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào. Ở Việt Nam, Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn thuờng gặp nhất là nhóm B (Shigella flexneri) và nhóm A (Shigella dysenteriae). Dịch tễ học: Bệnh lây theo đường tiêu hóa, do ăn uống phải các thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Ruồi là vật chủ trung gian truyền bệnh. Nguời lành mang vi khuẩn và nguời bệnh đóng vai trò quan trọng gây dịch. Dịch thuờng xảy ra vào mùa hè. Miễn dịch: Nguời ta cho rằng kháng thể dịch thể không có hiệu lực vì thương tổn của bệnh ở trên bề mặt của ống tiêu hóa. Nguợc lại các miễn dịch tại chỗ ở ruột có thể có một vai trò quan trọng truớc hết là các IgA tiết có trong đuờng ruột và các đại thực bào đuợc hoạt hóa. Phòng bệnh và chữa bệnh Phòng bệnh Chủ yếu là cách ly bệnh nhân, khử trùng phân và nước thải, phát hiện và điều trị người lành mang vi khuẩn, áp dụng các biện pháp vệ sinh và kiểm tra dịch tể đối với nguồn nước, thức ăn... Hiện nay vẫn chưa có vaccine phòng bệnh có hiệu lực như mong muốn... Ðang thử nghiệm dùng vaccine sống giảm độc lực đuờng uống nhằm tạo nên miễn dịch tại chỗ ở ruột. Vaccine sống này chỉ có khả năng bảo vệ đặc hiệu đối với type. Chữa bệnh Dùng kháng sinh dể tiêu diệt vi khuẩn, việc chọn kháng sinh thích hợp dựa vào kết quả kháng sinh đồ. Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, thiếu thận trọng sẽ có nguy cơ làm tăng nhanh các chủng có sức dề kháng đối với kháng sinh và tăng nguy cơ bị loạn khuẩn với tất cả các hậu quả nghiêm trọng của nó. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SHIGELLA Phương pháp cấy phân: 1.1.Thử nghiệm sinh hóa Nguyên tắc: Cấy phân là phương pháp chẩn đoán tốt nhất. Bệnh phẩm cần đuợc lấy sớm truớc khi sử dụng kháng sinh, lấy chỗ phân có biểu hiện bệnh lý (có máu có nhầy) và phải chuyển dến phòng xét nghiệm vi trùng nhanh chóng. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn trên các môi trường thích hợp: môi truờng không có chất ức chế (thạch lactose) và môi truờng có chất ức chế (DCA, SS hoặc Istrati). Xác dịnh vi khuẩn dựa vào các tính chất sinh vật hóa học và làm phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh mẫu của Shigella. Trong bệnh lỵ trực khuẩn, cấy máu không tìm đuợc vi khuẩn. Các bước tiến hành: Phản ứng (+): xuất hiện màu xanh lơ trong 15 giây. Phản ứng (-): không có sự xuất hiện màu xanh trong 15 giây. Dùng que nhỏ hay vòng cấy nhựa bắt một phần khóm trùng và phết lên mẫu giấy có tẩm Oxidase Nhỏ 1 giọt thuốc thử Oxidase lên mẫu giấy thấm Làm thử nghiệm Oxidase cho các khóm cùng mọc trên NA Đọc kết quả một số tính chất sinh hóa Mẫu sau khi cấy vào môi trường SB sẽ cấy sang môi trường MC và XLD một lần nữa để tìm shigella Chạy thử nghiệm sinh hóa: KIA, GAS, H2S, di động, Indol, Citrate, Ure, Methyl red Chọn những khuẩn lạc trong, không màu trên môi trường MC, XLD cấy lên môi trường NA để tìm shigella ủ 370C, 18-24 giờ Môi trường tăng sinh SB Môi trường chọn lọc XLD Môi trường phân lập MC Mẫu bệnh phẩm (+) control: Ps aeruginosa (-) control: E.coli Một số vấn đề khi làm thử nghiệm OxidaseP: Thử nghiệm Oxidase có thể (-) giả khi thử với những khóm trùng bắt từ môi trường lên men Carbonhydrate thạch MC, CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient Agar) và XLD. Môi trường tốt nhất để thử nghiệm Oxidase là Nutrient Agar hay Blood Agar. Vòng cấy Nichrome có thể cho kết quả Oxidase (+) giả. Xanthomonas maltophilia cho Oxidase (-) với phương pháp hiện đang áp dụng trong thí nghiệm, được dùng để đối chứng. Hình 4.6: shigella mọc trên môi trường MC (A) và XLD (B) 1.2.Phương pháp định danh dựa vào API 20E Nguyên tắc: Thử nghiệm API 20E là hệ thống định danh được chuẩn hóa đối với nhóm Enterobacteriaceae sử dụng 21 phản ứng sinh hóa và phân tích kaats quả dựa trên cơ sở dữ liệu và phần mềm máy tính. Các bước tiến hành: Nhỏ 2-3ml nước vào hộp nhựa đặt dãy AP Tra bảng kết quả để cho điểm và so sánh với cơ sở dữ liệu để biện luận kết quả Hòa tan một khóm trùng vào 5ml nước cất Cấy một giọt canh trùng lên hộp thạch NA và ủ kèm với API 20E. Cần nhỏ đầy 3 ô CIP, VP và GEL. Nhỏ 4 giọt đầu vào ADH, LDC, ODC, URE và H2S. Ủ khoảng 35-370C, trong vòng 18-24 giờ Nhỏ thuốc thử vào các giếng theo trình tự sau: VP_1 giọt VP1 rồi 1 giọt VP2. TDA_1 giọt thuốc thử TDA. IND_1 giọt thuốc thử James. NO2_1 giọt NIT1 và 1 giọt NIT2 vào tube GLU Tra bảng kết quả để cho điểm và so sánh với cơ sở dữ liệu để biện luận kết quả. Hình4. 7: dùng API 20E để định danh shigella Phương pháp truyền thống : 2.1.Quy trình phân tích : Buộc chặt túi và đem ủ ở 37oC trong 16- 20 giờ nhất mẫu (không quá 2 phút), đo và chỉnh pH về 7± 0,2 Lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh Tryptone Soya Giai đoạn tăng sinh : Giai đoạn tăng sinh chọn lọc : Ủ ở 37oC trong 16– 20giờ. Chuyển 0,1ml dịch tăng sinh sang môi trường canh tăng sinh GN Sau khi cấy, ủ các đĩa môi trường ở 37oC trong 24- 48h Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn lọc như : XLD, HE và MAC Phân lập : Do Shigella rất nhạy cảm với điều kiện môi trường nuôi cấy, để có thể phát hiện được Shigella với hiệu suất cao nhất nên sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau. 2.2.Kết quả: • Khuẩn lạc Shigella trên môi trường HE : khuẩn lạc có màu xanh nhạt, trong suốt. Hình 4. 8. Shigella trên HE • Khuẩn lạc Shigella trên môi trường MAC : có màu nâu đỏ, trong suốt. • Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Deoxycholate Citrate Agar : có màu đỏ nhạt, môi trường có màu đỏ cam, hơi đục. Hình10. Khuẩn lạc Shigella (Deoxycholate Citrate Agar) Hình 9.Khuẩn lạc Shigella (MAC). • Khuẩn lạc Shigella trên môi trường XLD: có màu đỏ, trong suốt. Hình 11. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường XLD 2.3.Khẳng định bằng phương pháp sinh hóa và huyết thanh : Ủ ở 37oC trong 24h Các dòng nghi ngờ là shigella được cấy vào môi trường TSI Ủ ở 37oC trong 24h Từ các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập, chọn ít nhất 5 khuẩn lạc cấy trên môi trường không chọn lọc (như TSA) Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. Kết quả : Shigella cho phản ứng kiềm trên bề mặt thạch nghiêng và acid ở phần sâu, không sinh hơi và không tạo H2S trong môi trường. Các dòng có phản ứng nhưtrên được thử ghiệm để khẳng định Shigella.Thử nghiệm khẳng định :Các thử nghiệm sinh hóa cần tiến hành để khẳng định Shigella và các đặc trưngsinh hóa của nhóm nay được tóm tắt như dưới đây: Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Simmon Citrate - Arginine Decarboxylase - Lisine decarboxylase  - Urease - Malonate - MR + VP - Salicine - Xylose - Cellobiose - Andonitol-Dulcitol - Inositol - 2.4.Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh : Tiến hành các đối chứng (-) trên nước muối sinh lý Huyết thanh đa giá A, B, C, D từ các dòng được nuôi cấy trên môi trường thạch không chọn lọc Một số Shigella tạo thành kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên K) có thể làm che mất kháng nguyên O và làm cho phản ứng ngưng kết không diễn ra. Vì thế khi không có biểu hiện ngưng kết cần thực hiện việc đun sôi dịch vi khuẩn trong khoảng 30 phút để loại bỏ kháng nguyên bề mặt. Sau đó tiến hành lại thử nghiệm ngưng kết. KẾT LUẬN : Có hay không có Shigella trong 25g mẫu vật. Phương pháp hiện đại : 3.1.Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) vào năm1985, tạo nên một cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học. Chỉ sau 8 năm (1993),K. Mullis đã được trao giải Nobel về hoá học nhờ phát minh này. Nguyên tắc: Bộ công cụ dùng trong xét nghiệm “bộ Kít PCR” với độ nhạy rất cao với các vi khuẩn, cứ trong 25g mẫu thực phẩm có một con vi khuẩn cần tìm thì PCR sẽ phát hiện ra chúng. Điều đặc biệt là các bộ kít không chỉ gọi tên một loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm màchúng có thể phát hiện ra 12 loại vi khuẩn khác nhau như:E.coli, E. coli0157:h7, Salmonella spp, Shigella spp, nấm mốc... Tùy thuộc vào loại thực phẩm và số loại chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát đối với mỗi loại thực phẩm, các quy trình và bộ Kit PCR cho phép xét nghiệm và gọi tên tất cả các vi khuẩn nêu trên trong vòng 24 giờ (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài). Chúng được thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng,chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước... để giúp kiểm tra chính xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không. Kỹ thuật PCR dùng phát hiện shigella được tiến hành trên cặp mồi SHIG khuếch đại cho trình tự 320bp trên plasmid xâm nhiễm đặc hiệu cho shigella và cặp mồi 16S khuếch đại cho trình tự có kích thước 1007bp nằm trong vùng bảo tồn cùa 16SrRNA hiện diện trong mọi loài vi khuẩn Kết quả điện di của 13 chủng Shigella sonnei So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quả chính xác và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít thời gian. Riêng đối với Shigella thì cho phép phát hiện shigella ở mức 10CFU/25g mẫu sau12→14h tăng sinh,cho kết quả sau 24h. 3.2.Kỹ thuật LA (latex agglutination) Nguyên tắc: Ngoài ra dựa trên kỹ thuật phân tích kháng thể dùng trong phát hiện Shigella còncó bộ Kit Wellcolex,bộ kít Bactigen dựa trên kiểu phân tích LA. Được sử dụng từ những năm 1956,xét nghiệm LA rất phổ biến tại các phòng thínghiệm lâm sang,áp dụng để phát hiện hơn 100 bệnh truyền nhiễm Thử nghiệm này dựa trên sự ngưng kết giữa các hạt cao su với các kháng thể huyết thanh.Chẩn đoán xác định Shigella từ các mẫu lâm sàng trong 24h với độ đặc hiệu (>98%) và độ nhạy (100%), hơn nữa thao tác rất đơn giản và dễ sử dụng. Ví dụ : Cơ chế của thử nghiệm LA: Các mẫu thực phẩm cần kiểm tra sau khi được xử lý được pha trộn với hạt cao su đã được phủ một kháng thể hoặc kháng nguyên cụ thể. Nếu mẫu bị nghi ngờ có sự hiện diện của shigella, các hạt cao su sẽ cụm lại với nhau (tựu lại). So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quả chính xác và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít thờigian. Riêng đối với Shigella thì cho phép phát hiện shigella ở mức 10CFU/25g mẫu sau12→14h tăng sinh,cho kết quả sau 24h. Sơ đồ của 1 hạt latex: Vòng tròn màu đen đại diện polystyrene với sulfat và các gốc tự doVòng tròn màu trắng biểu thị nhóm acid sulfonic của bề mặt. Đuôi đại diện hydrocarbon liên kết các phần của hạt Sau thử nghiệm  Nếu thử nghiệm là âm tính, cao su vẫn còn mịn và giữ lại màu sắc ban đầu của nó.  Nếu thử nghiệm dương tính, hạt cao su thay đổi màu sắc khác biệt so với hạt cao su xung quanh. Chú ý : Cần lưu ý Shigella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm, có thể gây cáctriệu chứng bệnh với liều lượng rất thấp 10 tế bào/ g sản phẩm.Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Shigella cần làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập lại.Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa C. ÁP DỤNG CÁC NGUYÊN LÝ TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM VÀO QUY TRÌNH SẢN XUẤT JAM I. CÁC NGUYÊN LÝ TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM. 1. Nguyên lý I. Nguyên lý I. ”hạn chế tối đa sự tiếp xúc của thực phẩm với tác nhân gây hư hỏng” 1.1 Những tác nhân gây hư hỏng. Nguyên nhân nội tại. Do hoạt động chuyển hoá: các thực phẩm nguồn gốc động vật hay thực vật sau khi chấm dứt sự sống vẫn tiếp tục quá trình chuyển hoá phân giải, kết quả của quá trình sẽ làm cho thực phẩm mềm & có mùi vị thơm ngon, tăng cường giá trị tiêu hoá & hấp thu, nhưng cũng tạo môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật làm cho thực phẩm bị tác động dẫn tới ôi thiu.Do hoạt động hô hấp: một số thực phẩm như rau, quả … vẫn tiếp tục quá trình hô hấp, oxy hoá các chất hữu cơ của bản thân để sinh nhiệt, tiếp tục duy trì sự sống. Sự hô hấp làm hao tổn hàm lượng một số chất dinh dưỡng, hình thành các sản phẩm không thuận lợi cho bảo quản thực phẩm. Nguyên nhân bên ngoài: Nguyên lý 1 nhắm đến chủ yếu là các tác nhân bên ngoài, đó là các tác nhân có thể ngăn cản được nếu công nghệ vệ sinh tốt. Nguyên nhân chính làm cho thực phẩm bị biến chất, hư hỏng là do vi sinh vật, kết hợp với các yếu tố khác như oxy, ánh sáng, nhiệt độ, vết kim loại… xúc tiến quá trình hư hỏng nhanh thêm. 2. Nguyên lý II. Nguyên lý II ” không để cho các nguyên nhân gây hư hỏng có điều kiện thuận lợi làm hư nhanh thực phẩm” Nguyên lý này tạo điều kiện không thuận lợi cho các tác nhân gây hư hỏng thực phẩm bằng những biện pháp sau: làm nhanh các tiến trình xử lý chế biến làm khô thực phẩm bảo quản thực phẩm bằng cách tách nước bảo quản thực phẩm bằng áp suất thẩm thấu bảo quản thực phẩm bằng cách sử dụng nhiệt độ thấp bảo quản thực phẩm bằng cách acid hóa môi trường bảo quản thực phẩm bằng chất sát trùng bảo quản thực phẩm bằng chất chống oxy hóa. 3. nguyên lý III. Nguyên lý III ” bảo quản thực phẩm tiêu diệt mầm mống gây hư hỏng thực phẩm”Nguyên lý này nhằm mục đích là tiêu diệt hầu hết các tác nhân gây hư hỏng thực phẩm có trong thực phẩm, tác nhân chủ yếu là vi sinh vật. Các biện pháp: thanh trùng – tiệt trùng bằng nhiệt nhiệt nóng chiếu bức xạ xử lý nhiệt độ cao trong chế biến II. XÂY DỰNG CÁC NGUYÊN LÝ ĐỐI VỚI SẢN PHẨM JAM KHÓM. Bảng Tiếp nhận và bảo quản nguyên liệu Nguyên lý I Chặt đầu cuống, gọt vỏ, gắp mắt Rửa Chà Phối trộn Nghiền, xé Nguyên lý I Nguyên lý I,II Nguyên lý I Nguyên lý I Nguyên lý I,II Cô đặc Nguyên lý I, II Rót lọ Thanh trùng Nguyên lý I, II Nguyên lý I, II Dò kim loại Nguyên lý III 1. Tiếp nhận và bảo quản nguyên liệu_ nguyên lý 1. 1.1. Cơ sở áp dụng nguyên lý. Nguyên liệu đầu vào có những trái khóm bị hư hỏng, bị nhiễm vi sinh vật nhiều vì thế quá trình lựa chọn, phân loại, bảo quản nhằm loại bỏ những trái